DE2045590A1 - Verfahren zur Herstellung eines trockenen Vitamin B tief 12 Konzentrats von hohem Proteingehalt - Google Patents

Description

CATENI ANWÄLTE

PROF.DR.DR.J.REITSTÖTTER O Π / C C Q Π

DR.-ING. W. BUNTE I U k Ό b Q U

DR. K. G. LÖSCH

0-8 MÜHCHEN 13, BAUtRSTR. 22

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES TROCKENEN VIIAMlN Β_χ2« KONZENTRATS VON HOHEM PROTEINGEHALT

Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Vitamin B₁₂ und anderen mikrobiolofisch aktiven Cobalamine aus den solche Wirkstoffe enthaltenden yermentatlonsflttssigkeiten in der Form eines sowohl zur Herstellung von kristallinem Vitamin B₁₂* ^{ale aucht zur} Herstellung eines Vitamin B₁₂, andere biologisch aktive Cobalamine und Wachstumsfaktoren, sowie grosso Mengen von Proteinen enthaltenden tfuttermltttlzuaatsee geeigneten Konzentrats.

15s ist bekannt, dass die Herstellung von Vitamin B₁₂ und von Vitarain-B₁₂~haitigen Präparaten im allgemeinen der-

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art erfolgt, dass man in den z.B. durch Fermentation mit Methanobakterien oder Propionibakterien gewonnenen Fermentationsflüssigkeiten die BakterienkSrper aufschliesst und dadurch das In den BakterienkiJrpem angesammelte Vitamin B₁₂ freisetzt und in ein flüssiges Medium bringt, dann aus diesem Medium das Vitamin B₁₂ 4urch Einengen, oder Adsorption in ein kleineres Volumen übertrögt xmH das auf diese Weise erhaltene Konzentrat durch weitere Reinigungsoperationen auf kristallines Vitamin B₁₂ aufarbeitet oder aus dem' erwähnten Konzentrat Futtermittelzueatz-Praparate herstellt. Die derartigen Verfahren haben aber den ernsten Nachteil, dass man das Vitamin B₁₂, welches ursprünglich in den etwa 1 $> der Fenaentationsflüssigkeit ausmachenden Bakterienkörpern eingeschlossen erhalten wurde, bei der AufSchliessung in ein grosses Flüssigkeitsvoluraen überträgt, woher es dann durch komplizierte und verlustvolle Einengungeoperationen wieder in ein Koneentrat von kleinem Volumen übergeführt werden muss, um das Vitamin B₁₂ herausgewirmen zu können. Dieser Fachteil ist besonders im Fall des Futtermittelzusatz -Präparate schwerwiegend, da der im Vergleich sum kristallinen Vitamin B₁₂ viel niedrigere Preis dieser Produkte die Kosten der erwähnten Einengungsoperationen nicht decken kann«

Ua diesen Nachteil zu ellminieren, hat man schon Verfahre» eingeführt, nach welchen man die in der Fermentati oneflfleaigkeit erhaltene Mikroorganiemenmaese durch die Zugabe voa verschiedenen eiwelBskoagulierenden oder niederachlagbildenden Stoffen, bzw. von flokkulierenden oder adsorbierenden Zusätzen, durch die geeignete Einstellung des pH-Werte oder durch ähnliche Massnahmen fällt, die auf diese Weiae erhaltene Biomasse durch Filtrieren» Dekantieren oder Zentrifugieren abtrennt und die so erhaltene Masse von relativ kleinem Volumen zum Vitamin-B₁₂-Kon8entrat (zur Herstellung von kristallinem Vitamin B₁₂ oder eventuell von vitamin-Bjg-haltigen Futtermittelzueatz-Präparaten) auf-

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arbeitet.

Diese Verfahren haben den Zweck, die das Vitamin B₁₂ und andere wertvolle Stoffe enthaltende Mikroorganiamenaasse durch die Fällung auf ein möglichst kleines Volumen einzuengen. Diese Methode des Einengens kenn in Fall von Herstellung von kristallinem Vitamin B₁₂ vorteilhaft sein, da bei der Auf Schliessung des Wirkstoffes aus kleinerem Volumen auch die mit dem Einengen aus groasen Volumina notwendig verbundenen Verluste und der Arbeitsb.edarf des Verfahrens vermindert werden} wenn man aber auch vitamin-B-jp-haltige Futtermittelzusätze herstellen will, dann treten neben den erwähnten Vorteilen auch Nachteile auf, da die zur fällung verwendeten Chemikalien oder Adsorbenten aus den Futtermittelzusatz-Präparaten nicht in wirtschaftlicher Weise entf3rnt werden können, ihr Verbleiben im fertigen !Produkt aber aus Gesichtspunkten der Fütterung unerwünscht ist, weil die toxischen oder für die Tiere gesundheitsschädlichen Chemikalien (z.B. die zur Fällung der Biweisstoffe verwendeten Schwermetallsalze) das Produkt zur Fütterung»«wecke völlig unbrauchbar machen, aber auch die nicht toxischen, inerten Fällungsmittel oder Adeorbenten überflüssige und manchmal auch schädliche, unverdauliche Ballaststoffe in der Futtermittelzusatz-Präparaten bilden.

Es wurde nun gefunden, dass man die Konzentrierung des Vitamins B₁₂ zu kleinen Volumina sehr vorteilhaft durchführen und ein in erster Linie zur Herstellung von Futtermittelzusatz-Präparaten vorzüglich geeignetes, aber auch zur Gewinnung von kristallinem Vitamin B^g gut verwendbares, von unverdaulichen Ballaststoffen freies und sogar weitere wertvolle Eiweiss-Nährstoff« enthaltendes Konzentrat herstellen kann, wenn man die durch mit Methanobakterien oder mit Propionibakterien ausgeführte B^g-Pexnientätion erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten mit kleinen Mengen von biologisch verwertbaren Adsorbentstoffen, d.h. mit der wässrigen Suspension von solchen Stoffen biologischer Herkunft

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versetzt, welche Teilchen mit grosser positiver Ladung haben und dadurch die in der Fermentationsflüssigkeit anwesenden und das erzeugte Vitamin B₁₂ enthaltenden kleinen (1 - 3;n grosse) Bakterienkörper von negativer Ladung durch elektrostatische und Gravitations-Wirkung adsorbieren können. Die Zugabe von solchen organischen Adsorbentstoffen ermöglicht und fördert auf diese Weise die Abtrennung bzw. Separierung der vitaminhaltigen Bakterienkörper ermöglicht somit eine praktisch vollständige Konzentrierung des Vitamin-B., «-Gekalts in eine wässrige s'og. Biomasse.

Unter "biologisch verwertbaren Adsorbentstoffen" werden im Sinn der vorliegenden Erfindung solche, hauptsächlich aus Eiweisstoffen oder aus Kohlenhydraten bestehende organische Stoffe von zellartiger oder körniger Struktur verstanden, welche für die den Futtermittelzusatz verzehrenden Tiere verdaulich und nicht toxisch sind und auch an eich einen Nährwert und/oder andere physiologisch vorteilhafte Eigenschaften besitzen. Als solche biologisch verwertbare Adsorbentstoffe können z.B. Stärkemilch, Hefemilch, eingeengte Myaelieneuspeneionen von anderen Pilsen und ähnliche, von toxischen Stoffen freie, verdauliche Zellensuspeneionen natürlicher Herkunft verwendet werden. Nach unseren Versuchen können diese biologisch verwertbaren Adsorbentstoffe in Mengen von 0,01 - 5,0 #, vorteilhaft 0,01 - 1,0 96 zur Fermentationsflüssigkeit zugesetzt werden. Diese Prozentsätze beziehen sich jeweils auf den Trockensubstanzgehalt des verwendeten Adsorbentstoffes.

Bei der Separation werden dann die vitamin-B^g-^¹" tigen Bakterienkörper durch die Teilchen des biologisch verwertbaren Adsorbentstoffes mitgerissen und dadurch wird ein leichtes und schnelles Sedimentieren der ganzen Biomasse erreicht; auf die Weise wird aus der ursprünglich 1 i» Trockensubstanz enthaltenden Fermentationsflüssigkeit eine praktisch die vollständige B₁₂-Aktivität derselben enthaltende wässrige Biomasse von 15 - 20 # Trockensubstanz-

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gehalt erhalten, welche neben den aus der Fermentationsflüssigkeit stammenden Vitamin.B₁₂, Wachstumsfaktoren und Bakterien-Körper-Eiweisstoffen auch die ebenfalls wertvolle organischen Stoffe des biologischen Adsorbentstoffes enthält, Biese durch Sedimentieren, Dekantiaren, vorteilhaft durch Separieren bzw. Zentrifugieren abgetrennte Biomasse kann dann in dazu geeigneten Vorrichtungen, z.B. in einem Drehtrommel-Trockner getrocknet werden und so wird ein trockenes, lagerfähiges Präparat von hohem Vitamin B₁₂- und Eiweissgehalt erhalten, welches als Futtermittelzusatz verwendet bzw. unmittelbar in Verkehr gebracht werden kann.

Das auf obige Weise erhaltene Produkt kann aber auch zur Gewinnung von Vitamin B₁₂ von zu humantherapeutischen Zwecken geeigneter Qualität verarbeitet werden. Zu diesem Zweck wird das trockene Pulver in 70 $-igen Methanol durch die Zugabe von z.B. 50-96 #-iger, zweckmässig 70 $-iger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8-9 gestellt und bei 4Or-5O°C 30-40 Minuten gerührt, wobei das Vitamin B₁₂ sich im Methanol auflöst. Diese Extraktion kann vorteilhaft in Anwesenheit von 0,01 bis 0,5 # Ammoniumrhodanid, Benzaldehyd-cyanhydrin oder Ammoniumformiat durchgeführt werden. Die Lösung wird dann durch Dekantieren bzw. Filtrieren abgetrennt und verdampft und das als Verdampfungsrückstand erhaltene rohe Vitamin B₁₂ in den üblichen Weise, z.B. durch Adsorption an einer mit Brockmann'schem Aluminiumoxyd gefüllten Säule gereinigt und in kristalline Form gebracht.

Die Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von zur Verwendung als Futtermittelzusatz bzw. zur Gewinnung von kristallinem Vitamin B₁₂ geeigneten trockenen Vitamin B₁₂-Konzentraten von hohem Eiweissgehalt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man zu der durch Fermentation mit z.B. Methanobakterien oder Propionibakterien erhaltenen, vitamin-B₁₂-haltigen Fermentationsflüssigkeit biologisch verwertbare Adsorbentstoffe, zweckmässig Hefezellen-, Pilzmycelien- oder Stärke-Suspension in «engen von 0,ol - 5,0 #, zweokmässig von

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O₁Ol - 1,0 io zusetzt, dann den suspendierten Feststoff durch Sedimentieren, Dekantieren, bzw. Separieren und/ /oder Zentrifugieren abtrennt und trocknet. Das auf dies j V/eise erhaltene trockene pulverförmige Produkt kann in dieser Form unmittelbar oder nach dem Vermischen mit an sich bekannten anderen Nährstoffen oder Futtermitteln als vitamin-B^g- und eiweisshaltiger Futtermittelzusatz verwendet werden, es kann aber - als' Vitamin B,„ in grossen Mengen und in leicht gewinnbarer Form enthaltendes Konzentrat sehr vorteilhaft zur Gewinnung von kristallinem Vitamin B^₂ verarbeitet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zeigt gegenüber den zur Gewinnung von Vitamin B₁₂ und/oder zur Herstellung von vitajnin-B, „-haltigen Futtermittelzusatz-Präparaten zur ,Zeit verwendeten bzw. bekannten Verfahren die folgenden Vorteile:

1. Das neue Verfahren ist wesentlich einfacher als die zur Zeit angewendete, Aufkochen, Filtrieren, Fällen und andere mühsame und verlustreiche Operationen beanspruchende Technologie.

2. Die im gegenwärtigen Verfahren verwendeten, geräumigen und kostspieligen Vorrichtungen, wie Wärmeaufschliessungsreaktoren, Filterpressen usw. werden nicht benötigt; die im Betrieb schon zur Verfügung stehenden solchen Vorrichtungen können für andere Zwecke eingesetzt werden.

3. Das neue Verfahren ermöglicht die gegenüber dem gegenwärtigen Verfahren wirtschaftlichere Herstellung einej grosse Mengen von verdaulichen Eiweisstoffen und Vitamin B₁, bzw. anderen Wachstumsfaktoren enthaltenden stabilen, haltbaren Futtermittelzusatz-Präparats von hohem Nährwert, gutem Geschmack, Geruch und Aussehen.

4. Dasselbe Produkt, welches unmittelbar als fertiger Futtermittelzusatz verwendbar ist, kann ohne Veränderung des Verfahrene als Ausgangsstoff der Herstellung von kristal

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linem Vitamin B₁₂ verwendet werden, wodurch das Verfahren flexibel und in beliebigen Mengenverhältnissen, bei minimalen Erfordernissen an Vorrichtungen, Arbeitskräften und Materialen auf beide Produtkionszweige eingestellt werden kann.

. 5. Das Verfahren liefert einen technologisch vorteilhaft weiterverarbeitbaren Ausgangsstoff zur Herstellung von Vitamin B₁₂. . '

6. Das Verfahren kann in gleich vorteilhafter Wei se zur Aufarbeitung der durch mit Methanobakterien oder mit Propionibakterien, unter Anwendung von beliebigen ί

Ausgangsstoffen und Nährstoffen durchgeführten Fermentationen erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten angewendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht·

Beispiel 1:

10 Liter durch Methanobakterien-Fermentation erhaltene Fermentationsflüssigkeit, deren papierchromatographisch gemessener Gesamtgehalt an Vitamin B₁₂ und mikrobiologisch aktivem Faktor III 82 000 mcg/io Liter war, wurden mit in 400 ml Wasser suspendierter 60 g Hefe (Saccharomyces cerevieiae) von 30 i» Trockensubstanzgehalt und mit in 100 ml Wasser suspendierter 20 g Kartoffelstärke lebhaft vermischt. Dann wurde das Gemisch 1-2 Minuten lang mit 5000 ü/min zentrifugiert. Es wurden 452 g Niederschlag erhalten; dieser wurde an Platten ausgebraJfcet, im Trockenschrank bei 120⁰C getrocknet, zerkleinert und gemahlen und dann gesiebt. Es wurden auf diese Weise 92,0 g trockenes Endprodukt erhalten.

Ig von diesem trockenen Pulver wurde in 100 ml Wasser suspendiert, die Suspension auf pH as 4,8 - 5»2 eingestellt und 10 Minuten gekocht. Dann wurde die Suspension zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und in der Flüs-

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eigkeit wurde die Gesamtmenge der mikrobiologisch aktiven Cobalaminen papierchromatographisch bestimmt. Der gefundene Wert war 680 mog; somit enthielt das 92,0 g wiegende Endprodukt insgesamt 62 320 meg Wirkstoff, was einer 86 #- igen Ausbeute entspricht,

Beispiel 2:

10 Liter FermentationsflÜBsigkelt einer mit Propio·*· nibabterium shermaiinii durchgeführten Fermentation, deren Vitamin B^g-Gehalt 100 000 mcg/Liter war, wurden mit den in Beispiel i angegebenen Mengen von Hefe und Stärke versetzt; in der dort beschriebenen Weise wurden 405 g feuchter Niederschlag erhalten. Das Aufarbeiten und die Bestimmung des Oobalamingehalts erfolgte wie in Beispiel 1; es wurden 81,0 g hellgraues Produkt von 890 mcg/g Vitamin B-,₂-Gehalt erhalten; der Gesamtgehalt des 81,0 g wiegenden Produkts, war also 72 000 meg, was einer Ausbeute von 72 % entspricht.

Beispiel 3s

Durch Aufarbeiten von 10 Liter Methanobakterien-FermentationsflOssigkeit in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden 87,5 g trockenes Endprodut erhalten, mit 50 700 g Gesamtgehalt an Vitamin B₁₂. Dieses pulverförmige Produkt wurde in einem 1 Liter Rundkolben mit 450 ml 70, igemMethanol intensiv vermischt, der pH-Wert wurde mit iger Natronlauge auf 8,5-9,0 gestellt, das Gemisch wurde mit 1,0 g Ammoniumrhodanid versetzt und am Wasserbad, unter stetigem lebhaftem Rühren, unter einem Rückflusskühler 35-40 Minuten bei 40-5O⁰C gehalten. Nach Beendigung der Extraktion und nach 10-15 Minuten Sedimentieren wurde die klare rotgefärbte Lösung in einen 500 ml Nutschkolben dekantiert, der Niederschlag auf den Filter gebracht und die im Niederschlag noch verbliebene Lösung unter Wasserstrahlvakuum zur Hauptmenge der Lösung gesogen. Nach dem Abnutschen wurde der Niederschlag am Nutschfiter noch mit insgesamt 50-60 ml

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7O?£-igem Methanol In kleinen Portionen nachgewasohen·

Eg wurden insgesamt 530 ml JPiltrat erhalten. Die * Lösung vpirde durch Einengen im Vakuum von Methanol befreit; ea blieben 150 ml wässrige Lösung zurück, deren papierchromatographisch ermittelte Gesamtgehalt an Vitamin B™ 35 490 mcg war. Ausbeute 70 $>»

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Claims (6)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von zur Verwendung als Futtermittelzusatz bzw. zur Gewinnung von kristallinem Vitamin B,« geeigneten trockenen Vitamin Β-,ρ-Konzentraten von hohem Biweissgehalt, dadurch gekennzeichn e t, dass man zu der durch Fermentation mit z.B. Methanobakterien oder Propionibakterien erhaltenen, vitamin-B-jphaltigen Fermentationsflüssigkeit biologisch verwertbare Adsorbentstoffe, zweckmässig Hefezellen-, Pilzmycelien- oder Stärke-Suspension in Mengen von 0,01 - 5,0 56, zweckmässig von 0,01 - 1,0 i» zusetzt, dann den suspendierten Feststoff durch Sedimentieren, Dekantieren, bzw. Separieren und/oder Zentrifugieren abtrennt und trocknet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man (auf das Gewicht der Trockensubstanz berechnet) 0,01 bis 1,0 i» Hefe als biologisch verwertbaren Adsorbent verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η ητ zeichnet, dass man (auf das Gewicht der Trockensubstanz berechnet) 0,01 bis 1,0 $> Stärke als biologisch verwertbaren Adsorbent verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η-zeichnet, dass man eine insgesamt (auf das Gewicht der TrockeneubstanB berechnet) 0,01 bis 1,0 J6 Hefe und Stärke, zweckmässig Kartoffelstärke enthaltende wässrige Suspension als biologisch verwertbaren Adsorbent zur Fermentationsflüssigkeit zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem erhaltenen trockenen pulverförmigen Konzentrat mit einem die Eiweisstoffe koagulierenden Lösungsmittel, vorteilhaft mit 5O-96yk-igem Methanol das Vitarain B,_? extrahiert und aus der Lösung das Vitamin B₁₂ in an sich bekannter Weise gewinnt.

6. Verfahren nach Annpruch 5, dadurch g e k e η η -

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zeichnet, dass man die Extraktion von Vitamin Bj.« bei 25 bis 5O⁰C, zweckmässig in Anwesenheit von O,öl bis 0,5 i* Ammoniumrhodanid, Benzaldehyd-eyanhydrin oder Ammoniumformiat durchführt.

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