DE2044305C3 - Hydrolysenbeständiges Gemisch aus einem Phosphorsäuremonoarylester und dessen Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz und Mittel zur Bestimmung von Phosphatase - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein hydrolysenbeständiges Gemisch aus einem Phosphorsäuremonoarylester und dessen Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, wobei der Arylrest ein Phenyl- oder p-Nitrophenylrest ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch Gefriertrocknung einer den pH-Wert 1 bis 4 aufweisenden wäßrigen Lösung von Phenyl- bzw. p-Nitrophenyldihydrogenphosphat, oder dessen Ammonium- oder (Erd)Alkalimetallsalz bei einer Temperatür von etwa 20° bis 30⁰C und einem Druck von etwa 70 bis 25 Mikron während 48 bis 96 Stunden erhalten wurde und nach Zusatz des bei der Gefriertrocknung entfernten Wassers einen pH-Wert von 1 bis 4 ergibt.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Bestimmung von Phosphatase, bestehend aus einem Gemisch eines Monoarylesters der Phosphorsäure und dessen Salzen und einem Puffer, sowie gegebenenfalls einem inerten festen Trägerstoff.

Es ist bekannt, Phosphorsäure-, p-Nitrophenyl- und Phenylester in der Biochemie als Substrate in Tests zur Bestimmung von Phosphatase, d. h. Phosphormonoesterase, in verschiedenen Flüssigkeiten zu verwenden. Da die in Milch vorhandenen Bakterien durch Hitzeeinwirkung schneller zerstört werden als die alkalische Phosphatase, verwendet man die Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in Milchproben als Test auf die Wirksamkeit der Pasteurisierung. Es ist ferner bekannt, daß bei verschiedenen Krankheitszuständen, wie insbesondere bei Carcinomen, mit erhöhter osteoplastischer Aktivität im Knochengewebe verbundenen Krankheiten und bei obstruktiven, infiltrativen und parenchymalen Krankheiten von Leber und Galle eine Veränderung des Phosphatase-Spiegels in verschiedenen Körperflüssigkeiten auftritt. Die Bestimmung der Phosphatase kann dann als diagnostisches Mittel dienen. Ferner kann die Anwesenheit von Phosphatase auf die Anwesenheit bestimmter Arten von Körperflüssigkeiten, z. B. Samenflüssigkeit hinweisen. Im allgemeinen gründet die Brauchbarkeit der Phosphorsäuremonoarylester zur Bestimmung von Phosphatase auf der Tatsache, daß Phosphatase die Hydrolyse von Phosphorsäurearylestern wie -monophenyiester und -mono-p-nitrophenylester, katalysiert Die Hydrolyse kann wie folgt dargestellt werden:

Il

RO—P-OH (freie Säure)
OH

POJ +

Ii

^RO- Ρ—Ο"-

OH
(monoionisch)

₊ Ii

^RO-P-O"

H I
O"

(diionisch)

Phosphatase katalysiert die letzte Stufe der obigen Hydrolyse. Unter der Bezeichnung »Phosphorsäure-pnitrophenylester« und »Phosphorsäurephenylester« sollen im vorliegenden die freie Säure, die monoionische Form sowie die diionische Form des Phosphorsäuremonoesters gemäß obigen Formeln verstanden werden. Die Quelle für den p-Nitrophenylester oder Phenylester ist entweder die freie Säure ROH2PO3 oder ein Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetall^ davon.

Die Phosphatasen werden allgemein in »saure« oder »alkalische« eingeteilt, wobei damit der optimale pH-Wert, bei welchem sie gemessen werden, angezeigt wird. Das übliche Verfahren zur Bestimmung von saurer oder alkalischer Phosphatase besteht in der Inkubierung eines Phosphorsäuremonoesters, wie des p-Nitrophenyl- oder Phenylmonoesters in geeignet gepuffertem Medium mit einer Probe der auf die Anwesenheit von Phosphatase zu untersuchenden Flüssigkeit Man läßt die zuvor dargestellte Hydrolysenreaktion ablaufen, und dann wird das Gemisch entweder auf anorganisches Phosphat oder die Gegenwart des freien organischen Alkohols ROH entsprechend dem organischen Anteil des Phosphorsäureesters analysiert, um die vorhandene Phosphatasemenge zu ermitteln.

Da das Ausmaß der Hydrolyse tatsächlich der bestimmende Faktor des Phosphatasetests ist, ist es wichtig, daß die Reaktionsteilnehmer vor dem Test im wesentlichen unhydrolysiert vorliegen. Im Fall von Stoffen, die zur Absorption von Feuchtigkeit neigen, ist deren Anwendung in wasserfreier Form angezeigt, um eine Inhibierung von Enzymaktivität durch die eine solche Hydratation begleitende partielle Hydrolyse zu vermeiden.

Obgleich Phosphorsäure-p-nitrophenyl- und -pheny! ester als besonders geeignete Substrate bei der Phosphatasebestimmung bekannt waren, wurde ihre Brauchbarkeit in dieser Hinsicht durch ihre Neigung zur Hydratation mit nachfolgender Hydrolyse eingeschränkt. Die Hydrolyseempfindlichkeit von beispielsweise des Dinatriumsalzes von Phosphorsäure-p-nitrophenylester in saurem Medium ist aus J. Biol. Chem. Bd. 196, S. 175 (1952), und der US-PS 34 25 912 (Spalte 1, Absatz 1) bekanntgeworden.

Es wurde daher nach einem Phosphorsäuremonophenyl- und Phosphorsäuremono-p-nitrophenylester ge-

sucht, der hydrolysenbeständig ist und eine längere Lagerzeit w>r Verwendung in einem Phosphatasetest ermöglicht Die GB-PS 8 63 739 betrifft eine diagnostische Zubereitung zur halbquantitativen Bestimmung von Alkaliphosphatase im Serum, jedoch nicht die Herstellung von Phosphorsäuremonophenyl- oder -p-nitrophenylestern. Weder zeigen diese Veröffentlichungen, welche Verfahrensbedingungen bei der Herstellung von hydrolysebeständigen Phosphorsäureestern vor und/oder während einer Gefriertrocknung ίο einzuhalten sind, noch legen sie solche, wie sie erfindungsgemäß angewandt werden, nahe. Im Gegenteil, in J. Amer. Chem. Soo, a. a. O. ist offenbart, daß die Hydrolysengeschwindigkeit u.a. von Phosphorsäuremonophenylester in einem Zwischenbereich des pH-Wertes von > 1 und <8, insbesondere bei pH ca. 3-4 (vgL Fig.1), am größten ist, während bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Phosphorsäuremonoarylester und Salze gerade in einem Bereich von pH 1—4 gearbeitet wird.

Während in dieser Druckschrift Phosphorsäuremonophenylester bei einem pH-Wert von 1 als stabil und über ca. 8 als völlig stabil offenbart wurde, wurde im Gegensatz hierzu unerwarteterweise gefunden, daß gefriergetrockneter Phosphorsäuremonophenylester bei pH-Werten über 4 und unter 1 eine wesentliche Hydrolyse eingeht

Die überraschenderweise verbesserte Hydrolysenbeständigkeit des erfindungsgemäßen Gemisches wurde in saurem Medium gegenüber unter anderen Gefriertrocknungsbedingungen hergestellten entsprechenden Vergleichssubstanzen an Hand des Dinatriumsalzes des Phosphorsäuremono-p-nitrophenyiesters in Versuchen nachgewiesen.

Die Herstellung des Gemisches gemäß der Erfindung kann einfach dadurch erfolgen, daß man zunächst Phosphorsäuremonophenyiester bxw. -p-nitrophenylester oder ein Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz davon in solchen Mengen mischt daß man eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von 1 bis 4, vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 1, erhält Eine Lösung mit einem pH-Wert im angegebenen Bereich kann auch erhalten werden, indem man eine gewisse Menge dieser Verbindungen in Wasser löst und den pH-Wert der resultierenden Lösung einstellt Ein besonders bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man eine bestimmte Wassermenge auf einen pH-Wert im gewünschten Bereich einstellt und dieser angesäuerten Lösung eine solche Menge an den zuvor genannten Verbindungen zugibt die sich im wäßrig-sauren Medium löst, ohne den pH-Wert wesentlich vom gewünschten Wert abzubringen. Zum Einstellen des pH-Wertes können im allgemeinen beliebige Säuren ausreichender Stärke verwendet werden. Soll das Endprodukt jedoch in einem Phosphatasetest zur Verwendung kommen, so lollten Säuren mit Anionen, die die enzymatische Wirkung stören können, wie z. B. Phosphorsäure oder Schwefelsäure, nicht verwendet werden. Die Gefriertrocknung wird in einem Gefriertrockner bei etwa 20 bis 30⁰C während 48 bis 96 Stunden, und besonders bevorzugt bei etwa 25° C während etwa 48 bis 72 Stunden, durchgeführt. Geeignete Drucke liegen bei ca. 70 bis 25 Mikron; besonders bevorzugt wird der Druck bei etwa 25 Mikron gehalten. Es ist bekannt, daß Gefriertrock- (,₅ nungstemperaturen und -drucke voneinander abhängen, wobei niedrigere Temperaturen höhere Drucke bedin- opn Wird die Gefriertrocknung bei höheren oder niedrigeren Temperaturen durchgeführt, so müssen ein Stabilitätsverlust als Ergebnis der Neigung zur Hydrolyse bei höheren Temperaturen und Feuchtigkeitsgehalten, hingegen längere Trocknungszeiten bei niedrigeren Temperaturen in Kauf genommen werden. Als besonders günstig erwies sich ein Feuchtigkeitsgehalt der Matrix von etwa 3%, da man hierbei eine gute Stabilität erzielt

Der pH-Wert der zu gefriertrocknenden Lösung ist kritisch. Wie bereits erwähnt, muß dieser Wert zwischen 1 und 4 liegen, wobei Werte von etwa 1 bevorzugt werden. Wird die Gefriertrocknung z. B. bei pH 5 durchgeführt so beobachtet man nach dem Lagern des gefriergetrockneten Materials während 22 Stunden bei 40⁰C eine unannehmbare Veränderung der Absorption bei etwa 400 Millimikron von etwa 0,09 auf etwa 0,4. Nicht hydrolysierteo Material zeigt praktisch keine Absorption, bzw. weniger als 0,1, nach Wiederzusatz von etwa 400 Volurnteilen Wasser, die im Gemisch vor der Gefriertrocknung vorlagen. Bei einer Gefriertrocknung bei pH 8 lag die Absorption direkt nach der Gefriertrocknung bereits bei 03 und nach 22 Stunden bei 40° C bei 0,94. Beide Werte sind nicht tolerierbar. Bei einer Gefriertrocknung bei pH 12 betrug die Absorption direkt danach 0,74 und nach 22 Stunden bei 40^cC mehr als 1Λ

Die Hydrolysenbeständigkeit des erfindungsgemäß gefriergetrockneten Produktes ist besonders überraschend im Hinblick auf die bekannte Tatsache, daß wäßrige Lösungen von Phosphorsäuremonoalkyl- und -arylestern bei einem pH-Wert von ca. 7 oder mehr, eine minimale oder praktisch keine Hydrolyse zeigen, während in der Regel die stärkste Hydrolyse bei pH-Werten von praktisch 0 bis 6 beobachtet wird, wobei die maximale Geschwindigkeit bei etwa pH 4 liegt Demgegenüber liegen bei den erfindungsgemäßen Produkten und bei der Gefriertrocknung umgekehrte Verhältnisse vor.

Das nach obigem Verfahren erhaltene erfindungsgemäße gefriergetrocknete Produk» liegt in trockenem Zustand vor und kann daher in Behälter verpackt werden, die leicht zu handhaben, zu lagern (z. B. bei 5° C, vorzugsweise in Abwesenheit von Licht) und zu gebrauchen sind. Jeder Behälter kann ferner eine solche Produktmenge enthalten, die genau für eine bestimmte Anzahl von Phosphatasebestimmungen oder für eine einzige Phosphatasebestimmung ausreicht. Zur Durchführung einer derartigen Phosphatasebestimmung kann der Inhalt eines Behälters mit einer Standardgröße mit einer vorbestimmten Menge einer Pufferlösung vermischt werden unter Bildung eines flüssigen Reagens, mit dem die Bestimmung ausgeführt wird. Zur Bestimmung der Phosphataseaktivität muß man einen sauren oder alkalischen Puffer verwenden, je nachdem, ob eine saure oder alkalische Phosphatase zu bestimmen ist. Der Puffer ist so auszuwählen, daß man einen pH- und einen pK-Wert etwa entsprechend dem pH-Wert, der die maximale Geschwindigkeit der Enzymreaktion erlaubt, erhält Ein geeigneter Puffer für alkalische Phosphatase ist beispielsweise 2-Amino-2-methyl-1-propanol, während Citratpuffer (siehe Beispiel 7) einen geeigneten Puffer für saure Phosphatase darstellt. Aus dem gefriergetrockneten Produkt können auch Tabletten, Pillen oder andere Formkörper hergestellt werden, die bei der Verwendung zur Phosphatasebestimmung vorteilhaft sind.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ferner auf einem inerten, festen Trägermaterial zur

Haftung gebracht werden. Beispielsweise kann man die Zusammensetzung auf Splitter, Stäbchen oder Streifen aus Holzfasern, einschließlich Papier, ferner auf Glas, Metall oder Kunststoff aufbringea Besonders bevorzugt werden saugfähige Materialien wie Papier, Holzfasern oddgL beliebiger Form, die leicht eine Lösung des erfindungsgemäßen gefriergetrockneten Materials absorbieren.

Wie bereits erwähnt können der Phosphorsäuremonopheoyl- und -mono-p-nitrophenylester entweder als solcher (freie Säureform) als Ausgangsmaterialien dienen; wegen der besseren Zugänglichkeit werden jedoch im allgemeinen deren Ammonium-, Alkalimetalloder Erdalkalimetallsalze bevorzugt Insbesondere zweckmäßig sind die Alkalimetallsalze, wie z.B. das ,5 Lithium- und Kaliumsalz und insbesondere das Natriumsalz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein gefriergetrocknetes Produkt gemäß der Erfindung aus dem Dinatriumsalz des Phosphorsäuremono-p-nitrophenylesters durch Lösen d^:eser Substanz in wäßrig-saurem Medium mit einem pH-Wert von 1 und anschließende Gefriertrocknung dieser Lösung unter den zuvor genannten Bedingungen erhalten. Das Produkt ergibt bei Zusatz einer Wassermenge, die der während der Gefriertrocknung entfernten Menge entspricht einen pH-Wert von 1.

Die freie Säureform kann nach Standardverfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Behandeln eines Alkalimetallsalzes mit einem Kationenaustauscherharz in Säureform. Die Ammonium-, Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze können durch Zusatz eines Überschusses des jeweiligen Hydroxids zu einer Lösung des freien Phosphorsäuremonoesters unter anschließendem Abdunsten des Lösungsmittels, oder durch Ionenaustausch, beispielsweise unter Verwendung des leicht zugänglichen Natriumsalzes als Ausgangsmaterial, erhalten werden.

In den folgenden Beispielen beziehen sich Prozentangaben auf das Gewicht, falls keine andere Angabe gemacht wird. Materialmengen sind in Gewichtsteilen angegeben, falls keine zusätzliche Angabe gemacht wird. Das Verhältnis von Gewichtsteilen zu Volumenteilen entspricht dem Verhältnis von Gramm zu Millimeter.

Beispiel 1

100 Volumenteile einer Lösung vom pH 10,43 mit 9,075 Teilen Dinatriumsalz des Phosphorsäuremono-pnitrophenylesters in entionisiertem Wasser wurden in 20 Proben von jeweils 5 Volumenteilen unterteilt. Zu 6 dieser Proben wurde so viel Salzsäure zugegeben, daß pH-Werte von 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 bzw. 4,0 eingestellt wurden. Nach der pH-Wert-Einstellung wurde die Lösung durch Zusatz von entionisiertem Wasser auf 6,75 Volumenteile verdünnt. Von jeder Lösung eines bestimmten pH-Wertes wurden jeweils 0,45 Volumenteile in 6 verschiedene Reagensgläser geschüttet, und die Gläser wurden mit Gummistopfen versehen, die die Öffnung der Reagensgläser zur Hälfte bedeckten.

Diese Reagensgläser wurden in den Gefriertrockner auf Gestelle von etwa -40 bis etwa -50°C gestellt. Nachdem die Flüssigkeit erstarrt war, wurde ein Vakuum bis zu etwa 2GO Mikron angelegt. Dann wurde der Kondensator gekühlt und die Gestelle wurden auf ^₅ etwa 20⁰C erwärmt (bei dieser Temperatur betrug der Druck in der Kammer etwa 50 Mikron, die Temperatur im Kondensator etwa -50⁰C). Die Reagensgläser wurden unter den genannten Bedingungen danach 72 bis 96 Stunden lang gefriergetrocknet Dann wurde Stickstoff bis zur Erreichung eines Druckes von i27 Torr in die Kammer eingeführt Die Reagensgläser wurden dann im Gefriertrockner mit Stopfen verschlossen. Nach dem Entfernen aus dem Gefriertrockner wurde nochmals eine Aluminiumfolie über die Stopfen gestülpt Bei Wiederherstellung von Lösungen wurde keine merkliche Abweichung von dem vor der Gefrietrocknung gemessenen pH-Wert beobachtet

Beispiel 2

Etwa 20 Gewichtsteile Wasser wurden mit wäßriger Salzsäure auf pH 1,1 ±0,05 eingestellt Zu dieser Lösung wurden 032 Teile Dinatriumsalz des Phosphorsäuremono-p-nitrophenylesters zugegeben. Die resultierende Lösung besaß einen pH von 1,4. Ein Volumenteil dieser Lösung wurde in ein Reagensgias pipettiert und nach dem Verfahren des Beispiels 1 gefriergetrocknet, wobei jedoch die Regaltemperatur etwa 20 bis 30° C betrug und die Dauer der Gefriertrocknung 48 bis 72 Stunden ausmachte. Das resultierende gefriergetrocknete Material zeigte beim Wiederzusatz des Wassers keine merkliche Absorption bei etwa 400 mu.

Beispiel 3

100 Volumenteile einer Lösung, die 2 Teile Dikaliumsalz des Phosphorsäuremonophenylesters in entionisiertem Wasser enthielt wurden in 6 Portionen unterteilt Jeder Portion wurde genügend Salzsäure zur Erzielung der folgenden pH-Werte 1,0, 1,5. 2,0, 3,0 bzw. 4,0 zugesetzt Nach der pH-Wert-Einstellung wurden die Reagensgläser wie im Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt, wobei man ein beständiges gefriergetrocknetes Material erhielt.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt wobei jedoch an Stelle des Dinatriumsalzes eine äquivalente Menge des entsprechenden Salzes verwendet wurde. Das gefriergetrocknete Produkt zeigte nach Wiederzusatz des Wassers keine merkliche Veränderung der Absorption bei etwa 400 mu.

Beispiel 5

Beispiel 2 wurde wiederholt jedoch unter Ersatz des Dinatriumsalzes durch eine äquivalente Menge des entsprechenden Diammoniumsalzes.

Beispiel 6

Herstellung eines Präparates zur Bestimmung von alkalischer Phosphatase.

1. Puffer

130 ml 0,84molarer 2-Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer vom pH etwa 10,2.

2. Phosphorsäureestersubstrat

Reagensgläser mit jeweils 0,84 Mikromol des gefriergetrockneten Dinatriumsalzes des Phosphorsäuremono-p-nitrophenylesters, hergestellt gemäß Beispiel 2, und 0,0105 Mikromol Magnesiumchlorid, gelagert bei Kühlschranktemperaturen.

21 ml des Puffers wurden in ein das Phosphorsäureestersubstrat enthaltendes Reagensglas unter Mischen eingeführt. Das so erhaltene Reagens ist unter Kühlung mindestens 2 Monate lang haltbar.

0,5 ml dieser Lösung wurden dann in zwei verschiedene Küvetten eingeführt, und diese wurden 5 Minuten lang in ein Wasserbad von 37°C eingetaucht. In eine Küvette wurden unter Mischen 0,02 ml der auf Phosphatase zu testenden Probe, z. B. Milch, Serum oder Plasma, zugegeben. Die weitere Küvette diente als Blindprobe. Die Küvetten wurden genau 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 5 ml 0,05 n-Natriumhydroxidlösung unter Mischen in die Küvetten gegeben. Die Küvette mit der Blindprobe erhielt dann ι ο 0,02 nl zu testendes Material.

Mit bekannten p-Nitrophenolkonzentrationen, zweckmäßig 10 ml mit 0,36 Mikromol, wurden dann Standardlösungen hergestellt. Die Intensität der in den Testproben und den Vergleichs- bzw. Blindproben entwickelten Färbung wurde bei sämtlichen Wellenlängen zwischen 400 und 420 Millimikron in einem Colorimeter oder Spektrophotometer bestimmt, welches für die Absorption von Wasser auf 0 eingestellt worden war. Auch die Werte der Standardlösungen bei den einzelnen Wellenlängen wurden bestimmt. Die Absorption der Testprobe berechnet sich durch Subtraktion der Absorption der Blindprobe von der Absorption der Testprobe. Die tatsächliche Absorption wird verglichen mit den beim Standard ermittelten Werten und daraus läßt sich die Menge an Phosphatase in der Probe bestimmen.

, Beispie 1 7

Herstellung eines Präparates zur Bestimmung saurer Phosphatase.

1. Puffer

Ein 0,22molarer Citratpuffer vom pH 4,8 wird hergestellt durch Lösen von 42 g Zitronensäure in 400 ml 1-n wäßriger Natriumhydroxidlösung und Verdünnen der Lösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml.

2. Phosphorsäureestersubstrat

3 g Dinatriumsalz des Phosphorsäuremonophenylesters hergestellt gemäß Beispiel 3, werden in 250 ml Puffer gemäß 1. gelöst.

Die Verwendung dieses Präparates kann in der zur Bestimmung von saurer Phosphatase in üblicher Weise erfolgen: Ein Gemisch aus 1 ml des Phosphorsäureestersubstrates, 1 ml des Citratpuffers und 0,2 ml der auf saure Phosphatase zu testenden Probe wird bei 37° C genau 5 Minuten lang inkubiert. Dann wird die Reaktion aogestoppt, und das Gemisch wird durch Zusatz von 0,375-n wäßriger Hydroxidlösung alkalisch gestellt. Diesem Gemisch wird dann 1 ml gepufferter Aminoantipyrinlösung unter Rühren zugesetzt (diese Lösung kann hergestellt werden durch Mischen von 15 g 4-Aminoantipyrin, 30 g Natriumcarbonat und 30 g Natriumbicarbonat und Verdünnen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml). Dann erfolgt Zusatz von 1 ml gepufferter Kaliumferricyanidlösung (diese Lösung wird hergestellt durch Verdünnen eines Gemisches aus 40 g Kaliumferricyanid, 20 g Natriumcarbonat und 30 g Natriumbicarbonat mit destilliertem Wasser auf 1000 ml), wobei eine rote Lösung gebildet wird, deren Absorption bei 505 ΐημ gemessen wird. Zum Vergleich arbeitet man mit einer Probe, die dem Inkubierungsgemisch entspricht, jedoch keine Testprobe enthält.

Die Menge an während der Inkubierung freigesetztem Phenol kann durch Vergleich mit Standardgemischen ermittelt werden, und damit die Aktivität der sauren Phosphatase in der Testprobe. Ebenso kann auch zum Vergleich mit einer sauren Phosphatase bekanter Aktivität gearbeitet werden.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Hydrolysenbeständiges Gemisch aus einem Phosphorsäuremonoarylester und dessen Ammonium-, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, wobei der Arylrest ein Phenyl- oder p-Nitrophenylrest ist, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Gefriertrocknung einer den pH-Wert 1 bis 4 aufweisenden wäßrigen Lösung von Phenyl- bzw. ι ο p-Nitrophenyldihydrogenphosphat oder dessen Ammonium- oder (Erd)AlkalimetaUsalz bei einer Temperatur von etwa 20° bis 30⁰C und einem Druck von etwa 70 bis 25 Mikron während 48 bis 96 Stunden erhalten wurde und nach Zusatz des bei der Gefriertrocknung entfernten Wassers einen pH-Wert von 1 bis 4 ergibt

2. Gemisch aus Phosphorsäuremono-p-nitrophenylester und dessen Salz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Zusatz des während der Gefriertrocknung entfernten Wassers einen pH-Wert; von 1 ergibt

3. Mittel zur Bestimmung von Phosphatase, bestehend aus einem Gemisch eines Monoarylesters der Phosphorsäure und dessen Salzen gemäß Anspruch 1 und einem Puffer, sowie gegebenenfalls einem inerten festen Trägerstoff.