DE2038700A1

DE2038700A1 - Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen

Info

Publication number: DE2038700A1
Application number: DE19702038700
Authority: DE
Inventors: Hajime Kawaharada; Yoshimitsu Mekata; Kenji Suzuki; Kiyoshi Watanabe; Hirohisa Yano
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1970-03-03
Filing date: 1970-07-29
Publication date: 1971-09-23
Also published as: DE2038700B2; IT1051555B; FR2083778A5; JPS4937273B1; NL7010337A; DK125866B; CA925037A; GB1288666A; BE753754A

Description

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Kanegafuchi PIagaku Kogyo Kabushikl Kaisha, Osaka, Japan ·

Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gemischten Züchtung einerj Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefe und einer Kohlenwasser- j stoffe nicht assimilierenden Hefe unter aeroben Bedingungen in einem Züchtungsmedium, das Erdöl-Kohlenwasserstoffe enthält. Das Verfahren führt zu einer wirksameren Assirailierung der Erdöl-Koh lenwasserstoffe, wobei Hefezellen mit erhöhter Ausbeute und mit erhöhtem Gehalt an Rohprotein produziert werden.

In den letzten Jahren hat das Schlagwort "Eiweisa aus Erdöl" welt weite Aufmerksamkeit erlangt, und zahlreiche Arbeiten über Erdöl -Protein und Verfahren zu seiner kommerzleiLen Auenutzung Bind im Gange, da miteinem ernsthaften Nahrungsmangel für die Menschheit in der Zukunft gerechnet werden muss. Bis heute bestanden jedoch erhebliche Schwierigkeiten vom Standpunkt sowohl der Rohmaterialien als auch der Produktionskosten aus· Ein geeignetes Züchtungsverfahren zur kommerziellen Gewinnung von Eiweiss aus Erdöl unter Verwendung von η-Paraffinen wird daher dringend benötigt.

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In der Annahme, dass eine Verminderung der Produktionskosten von Hefezellen unter Verwendung von Erdöl die wichtigste Voraussetzung zur kommerziellen Erzeugung von Eiweiss aus Erdöl ist, wurden im Rahmen der Erfindung zahlreiche Untersuchungen mit einer Reihe von Hefen aus Standardkulturen sowie auch mit solchen, die aus Bodenproben isoliert worden waren, durchgeführt, um die Ausbeute und den Proteingeiialt der erhaltenen Zellen zu erhöhen. Es wurde nun gefanden, dass einige Arten von Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefen, die zu den Gattungen Candida, Zygosaccharomyces und anderen gehören, im Gemisch mit einigen Hefearten, die keine Kohlenwasserstoffe assimilieren und zu den Gattungen Trichosporon, Rhodotorula und anderen gehören, in Gegenwart von Erdöl-Kohlenwasserstoffen gezüchtet werden können, und. dass als Ergebnis die Ausbeute und der Gealt an Rohprotein der erhaltenen Zellen erheblich erhöht werden können.

Spezielle Beispiele für Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefen, die gemäss der Erfindung verwendet werden, sind Torulopsis xylinus, Candida novellus ATCC Nr. 20275 (vgl. die von der Anmelderin eingereichte Patentanmeldung "Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Hefezellen" - K 951 - ), Candid* tropicaliß, Candida j guilliermondii, Candida rugosa, Candida parapeiloels, Candida : lipolytica, Pichia miso mogii und Zygosaccharorayoea tikumaeneis. j Die erfindungsgemäss anzuwendenden Kohlenwasserstoffe aeeimilie- ^: renden Hefearten sind Jedoch nicht auf die oben angegebenen Arten beschränkt, sondern umfassen sowohl Variations- oder Mutationsstamme derselben als auch sämtliche Stämme, die aus natürlichen j Proben isoliert wurden und zu anderen Arten gehören.

Spezielle Beispiele für Hefen, die keine Kohlenwasserstoffe assimilieren, und die gemSss der Erfindung angewendet werden können, sind Hefen, die zur Familie Cryptococcaceae gehören, z.B. Trichoeporon pullulans, Trichosporon cutaneum» Candida utilis, Rhodotorula rubra, Rhodotorula minuta, Torulopsla peeudaerla, sowie solche, die zu anderen Familien gehören« z.B. Debaryoityces hansenii. Die Hefen, die keine Kohlenwasserstoffe assimilieren und

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gemäss der Erfindung angewendet werden können, sind jedoch nicht auf die oben genannten Arten beschränkt, sondern umfassen wohl i Variationen und Mutationen derselben als auch solche, die zu
anderen Arten gehören.

Als jede der Konlenwasserstoffe assimilierenden Hefearten einzeln' unter aeroben Bedingungen 48 Stunden lang in einem Züchtungmedium mit der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung gezüchtet wurde, ergab sich ein Assimilationsgrad von etwa uO bis 95 % und in den erhaltenen Zellen ein Gehalt an Rohprotein von 35 bis 55 %, Als
jedoch die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe im Gemisch mit einer keine Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefe, z.B. Tri-Cxiosporon pullulans ( mit einem Einimpf-Verhältnis von 1 ι 1) ; aerob 48 Stunden lang in demselben Züchtungsmedium gezüchtet wurde, betrug der Ass inflations gÄi etwa 90 bis 110 % und der Gehalt an ; Rohprotein in den Zellen etwa 55 bis 65 %· I

Mit der Bezeichnung "Einimpf-Verhältnis" oder "Miechungs-Verhält-! nis^M, wie eie hier verwendet werden, wird das Verhältnis der Koh-j lenwasserstoffe assimilierenden Hefe zu der mit ihr zu vermischen! den, keine Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefe bezeichnet.

Tabelle 1	Harnstoff	5.0 g
75 £ige PhosphorsMure	2,? ad
Kaliumchlorid	2.0 g
Magnesiumsulfat	2,0 g
Zinksulfat	0,03 g
Eisen-II-sulfat	0,1 g
Hefeextrakt	1.0 g
Leitungswasser	1 Liter
pH-Wert	5.0

Anmerkung:

1. n«f&rafftn wurde in einerMenge von 0,5 s& pro 30 ad den

Züchtungec**diu«e nach der Sterilisation liinzitgegeto«ii»

Bad or!gi_NAL

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2. Diejenige Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, wurde eingeimpft, nachdem sie in einem Malzextraktmedium ' anstelle des Paraffinmediums vorgezüchtet und gründlich

mit Wasser gewaschen worden war. !

Die Assimilationswirksamkeit und der Gehalt an Rohprotein in den erhaltenen Hafezellen können also durch eine gemischte Kultur von' Kohlenwasserstoffe assimilierenden Hefen mit solchen, aie keine Kohlenwasserstoffe assimilieren, merklich erhöht werden. Bei der gemischten Kultur der beiden Arten von Stämmen oxydiert die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe das η-Paraffin zu wasserlöslichen Stoffwechselprodukten, Fettsäuren, organischen Säuren, Vitaminen usw., während diejenige Hefe, die keine Kohlenwasser- ■ stoffe assimiliert, durch Ausnutzung dieser Stoffwechselprodukte , und Vitamine ( insbesondere Vitamin B₁ ) wächst. Andererseits produziert der Stamm, der keine Kohlenwmsserstoffe assimiliert, j eine wacnsturnsfördernde Substanz, die von dem Kohlenwasserstoffe assimilierenden Stamm benötigt wird. Es wird angenommen, dass sie einander ergänzend wachsen, und dass dieser synergistische Effekt die ausgezeichneten erfindungsgemässen Ergebnisse hervor- j ruft. Das charakteristische Merkmal der Erfindung besteht darin, [ dass Stämme, die keine Kohlenwasserstoffe zu assimilieren vermögerj, unter Ausnutzung von Stoffwechselprodukten wachsen, welche von Kohlenwasserstoffe assimilierenden Stänmen produziert worden sind, wobei nicht nur eine verbesserte Assimilationswirksamkeit sondern auch eine Verminderung des biochemischen Sauerstoffbedarfes und des chemischen Sauerstoffbedarfes in der Abfallflüssigkeit erreicht werden.

Das Rohmaterial gemäss der Erfindung, die Erdöl-Kohlenwasserstoff« sind geradkettlge, aliphatische Kohlenwasserstoffe ( η-Paraffine ) mit 9 bis 50 Kohlenstoffatomen pro Molekül oder Erdölfraktionen, die reich an geradkettigeB, aliphatischen Kohlenwasserstoffen sind

Erfindungsgemäss wird ein wässriges Züchtungsraedium verwendet, in

welchem neben den Erdöl· Kohlenwasserstoffen eine anorganische odex

organische Stickstoffquelle« 2«B. Ammoniak, Ammoniumeulfat, Ammo-

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niumchlorid oder Harnstoff, eine Phosphorsäurequelle, ζ «Β. Phosphorsäure, Monokaliumphosphat oder Dlkaliumphosphat, ein anorganic sches Salz, z.B. ein Kalium-, Magnesium-, Eisen- oder Zinksalz wig Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Eisen-II-sulfat oder · Eisen-III-sulfat, und gegebenenfalls ein organisches Salz wie j Eisenzltrat oder Ammoniumacetat erforderlich sind. Weiterhin kön- : nen Maisquellflüssigkeit, Hefeextrax oder Pepton hinzugegeben ^! werden, um das Wachstum der Hefen zu beschleunigen. Die Züchtung
erfordert keine speziellen Bedingungen. Der pH-Wert des,Züchtungs4 mediums beträgt 2,5 bis 6,0. Die Züchtung wird bei einer Tempera-^j tür von 25 bis 40° C, vorzugsweise 27 bis 35° C durchgeführt. 'Die Konzentration der Erdöl-Kohlenwasserstoffe liegt normalerweise i im Bereich von 0,01 bis 1 %, Vorzugsweise wird das ZMchtungsmediun mit einem Gas, das freien Sauerstoff enthült, während der Züchtung

ο ' belüftet. Die Temperatur des Züchtungsmediums liqgt zwischen 25 C : und 40° C. Das Vermischen der beiden Arten von Stämmen wird zu j Beginn der Züchtung durchgeführt, jedoch ist es auch möglich, j einen der Stämme im Verlaufe des Fermentationsprozesses einzu- \ impfen. Das Mischungsverhältnis, das entsprechend den verwendeten' Stämmen und den Züchtungsbedingungen variiert werden kann, liegt i im allgemeinen innerhalb des in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Bereichen.

Die Erfindung wirdweiterhin durch die nachfolgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung Jedoch nicht einschränken sollen.

Beispiel 1

Die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe Candida brumptii und
verschiedene Hefen, die keine Kohlenwasserstoffe assimilieren und in Tabelle 2 angegeben sind, wurden gemeinsam gezüchtet. In 500
ml-Kolben wurden 30 ml des in Tabelle 1 aufgeführten Züchtungsmediuras eingegossen« Eine in Bierwürze vorgezüchtete Hefe wurde
nach dem Waschen mit Wasser so eingeimpft, dassjsleh eine Zeil·*
konzentration von etwa 1 χ Kr/ml ergab, Die Züchtung wurde 48
Stunden lang unter Schütteln bei 23° C durchgeführt. Die Auebeute

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und der Gehalt an Rohprotein der Hefezellen wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Gemeinsame Züchtung von Candida brumptii mit Hefen, die keine Kohlenwasserstoffe assimilieren

Hefeart, die keine
Kohlenwasserstoffe
assimiliert

keine

Candida utilis Torulopsis pseudaer-ia Di-baryomyces hansenii
TrlKonopsis variabilis

Zellausbeute Rohproteingehalt {%) (Si)

32,3	53,5
99,5	55,5
103,2	56,1
107,7	54,9
93,3	54,7

Beispiel 2

, Die Hefe Rhodotorüla rubra, die keine Kohlenwasserstoffe assiml- j i liert, und verschiedene Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefen, ! die in Tabelle 3 angegeben sind« wurden gemeinsam gezüchtet. Die Züchtungsbedingungen entsprachen denjenigen von Beispiel l.'Die ι Ergebnisse sind In Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Gemeinsame Züchtung von Rhodotorüla fribra mit Hefen, die Kohlenstoffe assimilieren

Hefeart, die Kohlenwasserstoffe

assimiliert

Candida troplcalls Candida parapsllosls

einzelne Züchtung

Zellaus- Rohprobeute teinge-{%) halt (%)

gemeinsame Züchtung

Zellausbeute
(*)

Rohproteinge halt (#

91,3 51,2 70,6 46,8

1 ΰ 3 3 3 3 / U S £f I

108,6 55,7

90,9

50,1

Torulopsis magnoliae Torulopsis xyllnus josacoharomyces

maensis

Zygos ac charomyces sake

Pichia miso Tabelle 3 (Fortsetzung)

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75,8	48,3	87,2	52,6
69,1	50,5	85,8	55,5
88,2	49,7	106,5	51,2
72,3	45,7	92,1	50,0
81,6	41,1	101,3	48,3

¹ Beispiel 3

Die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe Candida guilliermondii und die Hefe Trichosporon cutaneu», die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, wurden aerob %8 Stunden lang indem in Tabelle 1 ge- j . zeigten Züchtungsmedium gezüchtet. Die erhaltene Vorkultur der ; ; beiden Stamme wurde in Verhältnissen von 100 : Oj 90 : 10, 80 s20 j ; bzw. 70 : 30 vermischt· Jede der Mischungen wurde in einer Menge ' ! von 10 % in Id Liter eines Hauptzüchtungsmediums alt der in Tabel-j j le 1 angegebenen Zusammensetzung, das eich in einem 30-Liter Jar-J Fermenter befand, eingeimpft. Die eingeimpften Gemische wurden unter Rühren mit 100 -rpra bei 33° C einer ansatzweisen Züchtung unterworfen, wobei alt 30 Litern pro Minute belüftet wurde. Die für dieses Beispiel Terwendeten Kohlenwasserstoffe bestanden aus n-Paraffinen mit eine« spezifischen Gewicht von 0,792/4⁰C, einer Reinheit von 99,7 Gew.-j< η-Paraffin und 0,025 Gew.-5t eines aromatischen Kohlenwasserstoff·«* Die Ausbeute und dar Gehalt an n-Paraf fin der Hefe zellen sind In der folgenden Tabelle 4 gezeigt.

Einimpf-Verhältnis

100 : 0

90 t 10

80 : 20

70 1 30

Tabelle 4 Zellausbeute {%)

92,5 107,8 109,2 110,6

Rohproteingehalt (50 53,5 58,9 60,3 59,8

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Beispiel 4

Candida rugosa und Trichosporon pullulans als Einsaatlculturen wurden in den Verhältnissen 100:0, 70:30 bzw. 30:70 vermischt, und jedes der Gemische wurde in ein Hauptzüchtungsmedium in der in Beispiel 1 angegebenen Weise eingeimpft. Die HauptZüchtung wurde kontinuierlich unter Verwendung eines Jar-Fermenters, der 16 Liter der Kulturflüssigkeit enthielt, unter Rühren mit 1000 rpm bei 33° C durchgeführt, wobei mit 20 Litern pro Minute belüftet wurde. Nach 68 Stunden wurden der Assimilationsgrad und der Gehalt an Rohprotein der Zellen ermittelt; die Ergebnisse slud in Tabelle 5 verzeichnet.

Mischungsverhältnis der Einsaatkulturen

100	: 0
70	: 30
30	: 70

Tabelle 5	,9
	,6
Zellausbeute (*>	,3
94
109
114

Gehalt an Rohprotein

54,2 59,8 60,3

- Patentansprüche -

Claims

K 950 Patentansprüche :

1. Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen unter Verwendung von Erdöl-Kohlenwasserstoffen« dadurch gekennzeichnet, dass man eine Kohlenwassejdboffe assimilierende Hefe und eine Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen unter Verwendung von Erdöl-Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoff quelle gemeinsam züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe eine zur Gattung Candida gehörende Art 1st.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine der Arten Candida novellu·, Candida troploalle, Candida guilliermondii, Candida rugosa, Candida parapsilosis oder Candida lipolytica verwendet·

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gVenazeiohnet, dass die Kohlenwasserstoffe assimilerende Hefe einer zur Gattung Torulopsis»gehörende Art ist.

TÜSTTi/ÖSW

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Art Torulopsis xylinus ist.

' 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe eine zur Gattung Pichia gehörende Art ist.

7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Art Pichia miso mogii ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die * Kohlenwasserstoffe assimilierende Hefe eine zur Gattung Zygosaccharomyces gehörende Art ist«

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Art Zygosaccharomyces tikumaensis ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, eine zur Familie Cryptococcaceae gehörende Art ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass di*

Art zur Gattung Trlchosporon gehört. <

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die^;

Art Trichosporon pullulana oder Trichosporon cutaneum ist. j

13· Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ^! die Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, zur ! Gattung Candida gehört. j

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass dl# Art Candida utilis ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, eine zur Gattung Rhodotorula gehörende Art ist.

3AD ORIGINAL

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16. Verfahren nach Ansprucri 15* dadurch gekennzeichnet, dass die Art Riiodotorula rubra oder Rhodotorula minuta 1st.

17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass . die Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, eine - _: zur Gattung Torulopsis gehörende Art ist. >

15, Verfahren nach Anspruch VJ, dadurch gekennzeichnet, dass die Art Torulopsis pseudäerla ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe, die keine Kohlenwasserstoffe assimiliert, eine zur Gattung Debaryomyces gehörende,Art ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19* dadurch gekennzeichnet, dass ^! die Art Debaryomyces hanaenii ist. . <

21.. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ! der Erdöl-KoHenwasserstoff ein geradkettiger, aliphatischer \ Kohlenwasserstoff (η-Paraffin) mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomeni pro Molekül oder dhe Erdölfraktion reich an geradkettigen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen 1st. ,

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass das j wässrige Nährmediua Stickstoffverbindungen, Phosphorverbinduni gen und Salze von K, Mg, Fe und Zn enthält.

2>. Verfahren nach Anspruch 1* dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Närhmedium mit eines das, das freien Sauerstoff enthält, belüftet wird, während sein pH-Wert bei 3,5 bis 6,0 gehalten wird.

24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des wässrigen Nährmediums 25 bis 40° C beträgt.

25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu dem wässrigen Nährmedium eine wachstumsbeschleunigende

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Substanz hinzugefügt wird, die Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt oder Pepton sein kann.

26. Verfahren nach Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Erdöl-Kohlenwasserstoffes in dem wässrigen Nährmedium bei o,01 bis 1 % gehalten wird.

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