DE19932032C2 - Vorrichtung zur Mikro-Dissektion von Gewebe - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zur Mikro-Dissektion von Gewebe mit einer feinen Nadel, die in einer bezüglich der drei Raumachsen verfahrbaren Aufnahme angeordnet ist und deren Spitze mit der Aufnahme in das zu trennende Gewebe hinein und relativ dazu bewegbar ist, wobei die Nadel mit einem Schwingantrieb gekoppelt ist, der die Nadel in longitudinale und/oder transversale Schwingungen mit vorwählbarer Amplitude und Frequenz versetzt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Mikro-Dissektion von Gewebe nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Gattungsgemäße Verfahren werden z. B. in Verbindung mit der molekularbiologischen Tumordiagnostik eingesetzt, bei der die DNA oder RNA von Zellen in Tumorgewebsschnitten analysiert wird. Das Vorhandensein z. B. bestimmter DNA-Sequenzen läßt Rückschlüsse auf die Art des Tumors und (soweit hierüber bereits statistische Daten vorliegen) über den Verlauf der Krankheit zu.

Allerdings enthalten Tumorgewebsschnitte nicht ausschließlich Tumorzellen. In aller Regel sind in solchen Schnitten einzelne Bereiche verdächtiger (d. h. tumoröser) Zellen in ansonsten gesundes Zellgewebe eingebettet. Wird der gesamte Schnitt molekularbiologisch untersucht, so besteht die Gefahr, daß die DNA der Tumorzellen mengenmäßig gegenüber der DNA der anderen Zellen soweit zurücktritt, daß ein Nachweis von bestimmten Tumorzell-DNA- Sequenzen nicht mehr oder nicht mehr mit ausreichender Sicherheit möglich ist.

Man ist daher dazu übergegangen, aus solchen Tumorgewebsschnitten die unter dem Mikroskop identifizierbaren tumorösen Gewebsbereiche bzw. Zellen mittels Mikro-Dissektion herauszulösen und nur diese weiter aufzuarbeiten.

Es sind z. Zt. unterschiedliche Techniken zur Mikro-Dissektion von Gewebe bekannt. Eine Möglichkeit besteht z. B. darin, den interessierenden Gewebebereich mittels UV-Laserstrahlung von dem übrigen Gewebe des Schnittes zu trennen und dann mittels z. B. Aspiration zur weiteren Aufarbeitung zu entfernen. Eine weitere bekannte Möglichkeit besteht darin, eine Spezialfolie auf dem Schnitt anzuordnen und diese mittels Infrarotlaserstrahlung im Bereich des Gewebebereiches mit dessen Oberfläche "zu verkleben". Der Gewebebereich haftet nach Verkleben so fest an der Folie, daß er zusammen mit dieser von dem Gewebeschnitt entfernt werden kann. Beide Verfahren sind allerdings relativ aufwendig.

Bei einem anderen gattungsgemäßen Verfahren wird das interessierende Gewebe mit dem ggf. angeschliffenen Ende einer Stahlkanüle, die mit einem üblichen Manipulator bewegt wird, aus dem Schnitt herausgekratzt und die abgetrennten Gewebebereiche mittels einer Aspirations- oder Klebkanüle zur weiteren Aufarbeitung entfernt. Hierfür grundsätzlich geeignete Vorrichtungen sind aus der DE 40 04 198 A1, EP 0 577 084 A2, US 5 063 791 und US 4 619 899 bekannt. Bekannt ist auch, anstelle einer Stahlkanüle eine fein ausgezogene Glaskanüle zu verwenden, deren Spitze ggf. gebrochen oder auf andere Weise geschärft ist. Das Arbeiten mit den beschriebenen "Kratz"-kanülen stellt sich sehr mühselig dar. Es besteht darüber hinaus die Gefahr, daß der Schnitt unkontrolliert zerreißt.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Mikro- Dissektion zu schaffen, das eine bequemere und sicherere Gewebetrennung ermöglicht und das darüber hinaus relativ kostengünstig zu verwirklichen ist.

Gelöst wird diese Aufgabe mit einem Verfahren, das die Merkmale des Anspruches 1 aufweist. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird, wie aus dem Stand der Technik bekannt, eine feine Nadel zur Mikro-Dissektion benutzt, die in einer bezüglich der 3 Raumachsen verfahrbaren Aufnahme eines üblichen Manipulators angeordnet ist.

Ein für das Verfahren einsetzbarer Manipulator weist in seiner einfachsten Ausgestaltung nur die bezüglich aller 3 Raumachsen verfahrbare Aufnahme auf. Üblicherweise aber nicht zwingend ist die verfahrbare Aufnahme mit einem Mikroskop verbunden dergestalt, daß mit dem freien Ende eines in der Aufnahme gehaltenen Instruments an einem auf dem Mikroskoptisch angeordneten Objekt unter optischer Kontrolle gearbeitet werden kann.

Es ist vorgesehen, daß die zur Mikro-Dissektion eingesetzte Nadel mit einem Schwingantrieb gekoppelt ist, der die Nadel in longitudinale und/oder transversale Schwingungen mit vorwählbarer Frequenz und Amplitude versetzen kann.

Im Betrieb wird der freie Endbereich der schwingenden Nadel mit der verfahrbaren Aufnahme gezielt in Kontakt mit ausgewählten Bereichen des Gewebes gebracht und zertrennt bzw. zertrümmert diese.

Die Kopplung einer Nadel mit einem Schwingantrieb ist bisher nur in Verbindung mit handgehaltenen Operationsinstrumenten, insbesondere zur Entfernung von Katrakten im Auge bekannt. Solche Instrumente werden unter anderem in der US 3 589 363, US 4 634 420, US 5 505 693, US 4 428 748, US 3 857 387, US 3 990 452, US 4 425 115 und US 4 493 698 beschrieben.

Abhängig von der Schwingungsrichtung der Nadel kann das erfindungsgemäße Verfahren grundsätzlich in zwei unterschiedlichen Varianten betrieben werden.

In der ersten Variante wird die Nadel von dem Schwingantrieb in longitudinale Schwingungen versetzt, dann zur Dissektion entlang des Randes des interessierenden Gewebebereichs geführt, wobei dieser als Ganzes aus dem Gewebeschnitt herauslöst wird. Bei dieser Variante des Verfahrens wird die Frequenz der Nadel so gewählt, daß möglichst nur longitudinale Schwingungen auftreten und transversale Resonanzschwingungen vermieden werden.

In der zweiten Variante des Verfahrens werden Nadel und Schwingantrieb so gekoppelt, daß die Nadel transversal schwingt. In diesem Fall wird der Gewebebereich nicht entlang einer Linie freigeschnitten. Es wird vielmehr mit dem Ende der transversal schwingenden Nadel der interessierende Gewebebereich stückweise flächig herausgekratzt. Mit dieser Variante lassen sich insbesondere mehrere kleine Gewebebereich schneller aus einem Gewebeschnitt herauslösen, als dies mit der ersten Variante möglich ist.

Die erste und zweite Variante setzen dabei allerdings nicht zwingend eine unterschiedlich gerichtete Kopplung von Schwingantrieb und Nadel voraus. Es ist auch denkbar, die Nadel in longitudinale Schwingungen zu versetzen und die Frequenz gezielt so zu wählen, daß neben einer longitudinalen Grundschwingung (mit ggf. sehr geringer Amplitude) im Spitzenbereich der Nadel transversale Resonanzschwingungen auftreten, womit dann ebenfalls ein Betrieb in der oben beschriebenen zweiten Variante möglich ist.

Bei der ersten Variante kann das in einem Stück abgetrennte Gewebe z. B. mittels Aspiration oder auch mittels einer Klebekanüle aus dem Schnitt entfernt werden. Bei der zweiten Variante wird vorzugsweise die über dem Gewebeschnitt befindliche Flüssigkeit zusammen mit den herausgelösten Gewebebruchstücken von dem Schnitt abgesaugt und gesammelt.

Bei entsprechend eingestellter Schwingfrequenz und Amplitude ist die Nadel bei beiden Varianten ohne weiteres in Lage, mit ihrer Spitze in übliches Gewebe einzudringen und dieses zu zertrümmern bzw. zerteilen.

Da Gewebeschnitte in aller Regel sehr dünn sind, reicht bei der ersten Variante in den meisten Fällen eine Amplitude, die im Mikrometerbereich liegt. Wird das Verfahren gemäß der zweiten Variante angewendet, so sollte eine Amplitude für die Transversalschwingung der Nadel gewählt werden, die deutlich unterhalb des Durchmessers des herauszutrennenden Gewebebereichs liegt, um eine möglichst saubere Präparation zu ermöglichen.

Die Frequenz sollte vorzugsweise, um akustische Beeinträchtigungen des Bedieners zu vermeiden, außerhalb des Hörbereiches, also z. B. im Ultraschallbereich gewählt werden. Grundsätzlich reicht aber eine Frequenz aus, bei der sichergestellt ist, daß der Spitzenbereich der Nadel so schnell in dem Gewebe schwingt, daß keine die Dissektion störende mechanische Beanspruchung der direkt angrenzenden Gewebebereiche eintritt. Mit anderen Worten die Frequenz sollte so eingestellt werden, daß die nur seitlich in Kontakt mit der bewegten Nadel kommenden Gewebebereiche nicht oder nur unwesentlich von dieser mitbewegt werden. Auf diese Weise ist sichergestellt, daß tatsächlich nur der gerade gewünschte Gewebebereich von der Nadelspitze zertrümmert bzw. zertrennt wird, und ein Abreißen bzw. Ablösen benachbarter Bereiche vermieden wird.

Bei der Nadel kann es sich um eine vorzugsweise geätzte Stahlnadel handeln. Die Nadel kann aber auch aus Glas, Hartmetall oder auch Wolfram bestehen. Es ist auch möglich, die Nadel an ihrem Ende mit einem Schliff zu versehen. Es hat sich allerdings herausgestellt, daß die distale Kontur der Nadel für die Umsetzung der Erfindung relativ unerheblich ist. Der Begriff Nadel ist daher im Rahmen der Erfindung nicht zu eng auszulegen. Darunter soll im wesentlichen jedes feine langgestreckte Instrument fallen mit einem Endbereich, dessen Abmessungen und Kontur ein Eindringen in das zu untersuchende Gewebe ermöglichen. Insbesondere bei der oben erwähnten zweiten Variante muß die Nadel nicht zwingend in einer Spitze auslaufen, sondern kann auch eine transversale Abschlußkante aufweisen, die ggf ein leichteres Herausschaben der Gewebstücke ermöglicht.

Zur Erzeugung der Schwingung kann ein üblicher Schwingantrieb verwendet werden. Denkbar ist z. B., daß der Antrieb elektrodynamisch erfolgt. Vorzugsweise wird allerdings zur Erzeugung der Schwingung ein Piezo-Element eingesetzt.

Der Schwingantrieb wird bevorzugt an der in den drei Raumachsen verfahrbaren Aufnahme angeordnet, und die Nadel dann in Abhängigkeit mit der gewünschten Schwingungsrichtung entsprechend mit dem Antrieb gekoppelt.

Eine weitere Ausgestaltung des Verfahrens betrifft die optimale Positionierung der Nadel während der Dissektion. Es versteht sich, daß die Nadel bei beiden Varianten mit ihrer Spitze möglichst tief in das Gewebe eindringen muß, wobei allerdings vermieden werden sollte, daß die Spitze die Oberfläche des den Schnitt tragenden in aller Regel aus Glas bestehenden Objekträgers berührt. In diesem Zusammenhang sieht daher eine Ausgestaltung einen Sensor vor, der in der Lage ist, die optimale Position der Nadel zu ermitteln. Denkbar ist z. B., daß es sich um einen in dem Schwingantrieb angeordneten Schwingungssensor handelt. Bei Einsatz eines solchen Sensors würde die Nadel zunächst so positioniert, daß sie mit ihrer Spitze den Objektträger berührt und dann soweit nach oben verfahren, bis der Schwingungssensor freie Schwingung anzeigt, was dann einer optimale Position entspräche. Eine andere Möglichkeit wäre, z. B. im Bereich der den Gewebeschnitt aufnehmenden Auflage einen akustischen Sensor anzuordnen, der die Berührung des Objektträgers durch die Nadelspitze registriert und dann entsprechend die Position einstellt.

Im folgenden soll das Verfahren anhand einer Abbildung näher erläutert werden.

Die Abbildung zeigt eine Vorrichtung 10 für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Mikro-Dissektion. Die Vorrichtung beinhaltet eine Auflage 11 für einen Objektträger 12, auf dem ein Gewebeschnitt 13 angeordnet ist. Aus dem Gewebeschnitt 13 soll ein Bereich 19 entlang einer Linie 14 mittels Mikro- Dissektion herausgetrennt werden. Der Schnitt 13 ist partiell insbesondere in dem durch die Linie 14 begrenzten Bereich 19 mit einer Flüssigkeit 15 überschichtet. Bevorzugt wird eine Flüssigkeit gewählt, die einerseits die erforderliche optische Durchlässigkeit besitzt und andererseits z. B. Substanzen enthält, die im Hinblich auf die nachfolgende Aufarbeitung gezielt ausgewählt sind. Denkbar ist z. B. in der Flüssigkeit RNase-hemmende Substanzen wie chaotrope Salze oder dergleichen vorzusehen. Bei der Flüssigkeit kann es sich natürlich auch um destilliertes Wasser oder Kochsalzlösung oder auch organische Lösungsmittel handeln, um nur einige weitere mögliche Beispiele zu nennen.

Oberhalb der Auflage 11 ist ein Mikroskop angeordnet, von dem in dieser Abbildung nur ein Objektiv 16 dargestellt ist.

Dabei ist zur Mikro-Dissektion des von der Linie 14 begrenzten Gewebebereichs 19 eine mit einer feinen Spitze 17 ausgestattete Nadel 18 vorgesehen, die mit einem nur schematisch angedeuteten Schwingantrieb 20 gekoppelt ist, der die Nadel 18 in Pfeilrichtung in longitudinale Schwingungen versetzt. Der Schwingantrieb 20 ist seinerseits an einer Aufnahme 21 angeordnet, die bezüglich der drei Raumachsen verfahrbar ist.

Mittels der verfahrbaren Aufnahme 21 wird die Nadelspitze 17 so in bzw. an dem Rand 14 des herauszulösenden Gewebebereiches 19 positioniert, daß bei Schwingung eine Durchtrennung des Gewebes eintritt. Die Nadelspitze 17 muß dann lediglich mit der Aufnahme 21 entlang des Randes 14 des Gewebebereiches 19 geführt werden, wodurch dieser dann von dem übrigen Gewebe getrennt wird.

Der freigelegte Gewebebereich 19 kann dann mittels einer nur schematisch angedeuteten Aspirationskapillare 22, die z. B. ebenfalls in einer verfahrbaren Aufnahme angeordnet sein kann aus dem Schnitt 13 zur weiteren Verarbeitung entfernt werden.

Es ist dabei relativ unerheblich, in welchem Winkel die Nadel zu dem Gewebe angeordnet wird. Als vorteilhaft hat sich ein Winkel von ca. 45°-60° erwiesen. Andere Winkel bringen jedoch auch das gewünschte Ergebnis, wobei möglicherweise nur eine etwas längere Bearbeitungszeit in Kauf genommen werden muß.

Wie oben ausgeführt kann die exakte Positionierung der schwingenden Nadelspitze 17 mittels der Aufnahme 21 über einen Sensor automatisiert werden. Dieser Sensor könnte z. B. mit dem Schwingantrieb 20 gekoppelt sein oder aber auch auf der Auflage 11 positioniert werden.

Die Abbildung zeigt die oben angesprochene erste Variante des Verfahrens bei der der Gewebereich 19 in einem Stück aus dem gezeigten Gewebeschnitt 13 herausgelöst wird. Bei dieser Variante wird bevorzugt die Schwingfrequenz der Nadel so eingestellt, daß keine Transversalschwingungen auftreten. Nur so läßt sich ein möglichst schmaler Schnitt entlang der den Gewebebereich 19 begrenzenden Linie 14 durch das Gewebe führen.

Denkbar ist natürlich auch, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens in einer anderen Ausführung mit einer transversal schwingend angetriebenen Nadel auszustatten bzw., die Frequenz bei der in der Abbildung dargestellten Vorrichtung so einzustellen, daß neben den primär erzeugten longitudinalen Schwingungen auch transversale Resonanzschwingungen im Spitzenbereich der Nadel auftreten. Geeignet ist diese zweite Betriebsvariante insbesondere für die Dissektion in Gewebeschnitten, die mehrere kleine verdächtige Gewebebereiche enthalten. Diese Gewebebereiche lassen sich mit der transversal schwingenden Spitze bequem stückweise aus dem Schnitt herauslösen, wobei sich die Stücke in der Flüssigkeit 15 sammeln und mit dieser in einfacher Weise mit der Kapillare 22 abgesaugt und aufgefangen werden können.

Claims (6)

1. Verfahren zur Mikro-Dissektion von in Form eines flächigen Schnitts auf einem Träger fixierten Gewebeproben mit einer feinen Nadel, die in einer bezüglich der drei Raumachsen verfahrbaren Aufnahme angeordnet ist und deren Spitze mit der Aufnahme relativ zu dem zu trennenden Gewebe bewegt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Nadel (18) von einem Schwingantrieb (20) in longitudinale und/oder transversale Schwingungen versetzt wird, wobei die Amplitude und die Frequenz gezielt gewählt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Frequenz so gewählt wird, dass sie im Ultraschallbereich liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Schwingantrieb und die Nadel zur Erzeugung einer longitudinalen Schwingung gekoppelt werden, wobei die Frequenz im Betrieb so gewählt wird, daß zusätzlich zu den longitudinalen Schwingungen auch transversale Resonanzschwingungen im Bereich der Spitze (17) der Nadel (18) auftreten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nadel verwendet wird, die aus Stahl besteht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als Schwingantrieb ein Piezo-Element verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sensor verwendet wird, der die optimale Position der Nadelspitze (17) während des Betriebs ermittelt.