JP6238397B2 - 細胞空間分画装置および微細構造刃 - Google Patents

Description

本発明は、細胞空間分画装置および微細構造刃に関する。さらに詳しくは、細胞を空間的に区画化して切断する細胞空間分画装置、およびそれに用いられる微細構造刃に関する。

細胞を切断する装置として、マイクロマニピュレータやレーザーを用いた装置が知られている。例えば、特許文献１に記載の細胞切断装置は、マイクロナイフで細胞を切断する装置である。また、特許文献２に記載の切断装置は、マイクロ流体チップの流路に細胞を流過させて細胞を切断する装置である。

これらの装置を操作するには高度な技術を要するため、熟練したオペレータを必要とする。また、細胞を一個ずつ切断する必要があり効率的でない、細胞内部の位置情報を保持できない、細胞の特定部位の取得ができないという問題がある。

特開２０１０−２６１７５７号公報 特開２００９−１４２２５１号公報

本発明は上記事情に鑑み、細胞内部の位置情報を保持しつつ細胞を空間的に区画化できる細胞空間分画装置および微細構造刃を提供することを目的とする。

第１発明の細胞空間分画装置は、対象の細胞を空間的に区画化して切断する刃構造を有する微細構造刃と、前記微細構造刃を前記細胞に押圧する押圧手段と、を備え、前記刃構造は、複数の区画を形成する刃からなり、一の該区画を形成する刃のうち対向する少なくとも２つの刃の間隔が、前記細胞よりも小さく、かつ、前記間隔が２〜１０μｍであることを特徴とする。
第２発明の細胞空間分画装置は、第１発明において、前記微細構造刃は、板状の基部と、該基部上に形成された刃構造部とからなり、前記基部には、前記刃構造部の各区画に薬液投与孔が形成されていることを特徴とする。
第３発明の細胞空間分画装置は、第１発明において、前記微細構造刃は、板状の基部と、該基部上に形成された刃構造部とからなり、前記基部には、前記微細構造刃の表裏に圧力差を生じさせるための孔が、前記刃構造部の各区画に形成されていることを特徴とする。
第４発明の細胞空間分画装置は、第１発明から第３発明において、前記細胞を保持する基板と、前記微細構造刃と前記基板との間に電気パルスを流す電気パルス付与手段と、を備えることを特徴とする。
第５発明の細胞空間分画装置は、第１、第２、第３または第４発明において、前記細胞は基板に保持されたゲル体中に固定されていることを特徴とする。
第６発明の微細構造刃は、対象の細胞を空間的に区画化して切断する刃構造を有し、前記刃構造は、複数の区画を形成する刃からなり、一の該区画を形成する刃のうち対向する少なくとも２つの刃の間隔が、前記細胞よりも小さく、かつ、前記間隔が２〜１０μｍであることを特徴とする。

第１発明によれば、微細構造刃を細胞に押圧することで、１つの細胞をこの細胞よりも微細な区画に切断して、細胞内部の位置情報を保持しつつ細胞を空間的に区画化できる。
第２発明によれば、基部に薬液投与孔が形成されているので、その孔を通して区画化された細胞に薬液等を投与して処理を施すことができる。
第３発明によれば、微細構造刃の表側と裏側に圧力差を生じさせて、区画化された細胞を微細構造刃に引き付け保持できる。
第４発明によれば、電気パルスにより細胞膜を破壊でき、切断抵抗が低くなる。そのため、細胞を潰すことなく区画化でき、細胞内部の正確な位置情報を保持できる。
第５発明によれば、細胞がゲル体中に固定されているので、作業中に細胞が移動することがなく、所望の位置で細胞を区画化できる。
第６発明によれば、微細構造刃を細胞に押圧することで、１つの細胞をこの細胞よりも微細な区画に切断して、細胞内部の位置情報を保持しつつ細胞を空間的に区画化できる。

本発明の第１実施形態に係る細胞空間分画装置の説明図である。 微細構造刃の縦断面図である。 微細構造刃の平面図であり、（Ａ）はスリット状、（Ｂ）は格子状、（Ｃ）はハニカム状の刃構造を示す。 基板の縦断面図である。 空間分画方法の説明図であり、（Ａ）は微細構造刃の押圧前、（Ｂ）は微細構造刃の押圧後である。 本発明の第２実施形態に係る細胞空間分画装置の微細構造刃部分の縦断面図である。 本発明の第３実施形態に係る細胞空間分画装置の微細構造刃部分の縦断面図であり、（Ａ）は細胞を吸引した状態、（Ｂ）は微細構造刃を反転させた状態を示す。 本発明の第４実施形態に係る細胞空間分画装置の微細構造刃部分の縦断面図である。 本発明の第５実施形態に係る細胞空間分画装置の微細構造刃部分の縦断面図である。 空間分画の説明図である。 作製した微細構造刃のSEM画像であり、（Ａ）は全体、（Ｂ）は（Ａ）の破線部分の拡大である。 （Ａ）はスリット状微細構造刃で空間分画した細胞の画像、（Ｂ）は（Ａ）における一点鎖線上の蛍光輝度を示すグラフである。 （Ａ）は空間分画前の細胞の画像であり、（Ｂ）は格子状微細構造刃で空間分画した細胞の画像である。

つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
（空間分画）
本発明に係る細胞空間分画装置は、細胞を二次元空間的に区画化して切断する装置である。図１０に示すように、単一の細胞Ｃを例えば格子状に区画化して切断する。以下、細胞Ｃを二次元空間的に区画化して切断する処理を「空間分画」と称する。また、区画化の最小単位の領域を「区画」と称する。

このように細胞Ｃを空間分画することにより、細胞内部の位置情報と関連付けて種々の測定ができる。また、細胞Ｃの一部分の極小領域を回収したり、核や細胞質等の細胞小器官を採取したり、細胞核・細胞質移植に利用したりすることもできる。区画形状は格子状に限られず、目的に合わせてスリット状やハニカム状等種々の形状を選択できる。また、区画寸法も目的に合わせて種々の寸法に設定できる。

（第１実施形態）
図１に示すように、本発明の第１実施形態に係る細胞空間分画装置１は、細胞Ｃを切断する微細構造刃１０と、細胞Ｃを保持する基板２０と、微細構造刃１０を細胞Ｃに押圧する押圧手段３０とを備える。また、細胞Ｃを測定するための測定手段として、基板２０の下方に顕微鏡Ｍが設置されている。

図２に示すように、微細構造刃１０は、板状の基部１１と、基部１１上に形成された刃構造部１２とからなる。刃構造部１２は、基部１１上に垂直に立った刃からなり、この刃によって所定の区画形状、寸法の刃構造が形成されている。図３（Ａ）に示すように、刃構造部１２は平面視においてスリット状の刃構造を有している。後述のごとく、微細構造刃１０を細胞Ｃに押圧することで、細胞Ｃを空間的に区画化して切断できる。そのため、刃構造部１２は、対象の細胞Ｃよりも微細な構造を有している。例えば、刃構造部１２の全体寸法は約200μm四方であり、刃の高さａは約10μm、刃の幅ｂは200〜1,000nm、区画幅（刃と刃の間の幅）ｃは2〜10μmである。このような微細構造を有する微細構造刃１０は、シリコンエッチング等の半導体加工技術を用いて作成できる。

なお、刃構造部１２の各寸法は、対象の細胞Ｃの大きさや、求める区画寸法等により適宜設定すればよい。また、刃構造部１２は細胞Ｃを空間的に区画化して切断する刃構造を有していればよく、スリット状（図３（Ａ））のほか、格子状（図３（Ｂ））やハニカム状（図３（Ｃ））等、求める区画形状に合わせて種々の形状を採用できる。

図４に示すように、基板２０はガラス板２１と、ガラス板２１上に形成された皿部２２とからなる。皿部２２内にはゲル体２３が保持されており、ゲル体２３中に細胞Ｃが固定されている。ゲル体２３としては、コラーゲンゲル、アガロースゲル、アルギン酸ゲル等を用いることができる。

このような基板２０は、例えば以下の手順で作成できる。まず、ガラス板２１の表面にPDMS（ジメチルポリシロキサン）等の樹脂をコーティングし、その樹脂層の表面に周囲を囲うようにPDMS等の樹脂をボンディグして側壁を形成し皿部２２とする。つぎに、皿部２２の内部にコラーゲンゲル等をコーティングし、そのゲル層の表面に細胞Ｃを配置する。さらに、皿部２２の内部にコラーゲンゲル等をコーティングして細胞Ｃを埋没させ、ゲル体２３中に細胞Ｃを固定する。

なお、基板２０は細胞Ｃを保持できればよく、培養ディッシュ等の容器に培養液等の液体を満たし、その中に細胞Ｃを配置してもよい。本実施形態のように基板２０の下方に顕微鏡Ｍを設置する場合には、基板２０が透明である必要がある。

図１に戻り、本実施形態の押圧手段３０はＺ軸ステージであり、その台座３１の底面に微細構造刃１０が固定されている。台座３１は昇降可能であり、台座３１の下方に基板２０が配置されている。微細構造刃１０は刃構造部１２が基板２０と対向するように、すなわち下方を向くように固定されている。なお、押圧手段３０はＺ軸ステージに限定されず、微細構造刃１０を細胞Ｃに押圧できる構成であれば、どのような構成のものを用いてもよい。また、微細構造刃１０の押圧力を測定するために荷重センサを設けてもよい。

つぎに、細胞空間分画装置１を用いた細胞Ｃの空間分画方法を説明する。
まず、図５（Ａ）に示すように、細胞Ｃを保持する基板２０を微細構造刃１０の下方に配置する。つぎに、図５（Ｂ）に示すように、押圧手段３０で微細構造刃１０を下降させ、微細構造刃１０を細胞Ｃに押圧する。そうすると、刃構造部１２により細胞Ｃを切断でき、細胞内部の位置情報を保持しつつ細胞Ｃを空間的に区画化できる。また、細胞Ｃがゲル体２３中に固定されているので、作業中に細胞Ｃが移動することがなく、所望の位置で細胞Ｃを区画化できる。

微細構造刃１０が細胞Ｃに刺さっている状態、あるいは微細構造刃１０を引き上げて細胞Ｃと離間した状態で、顕微鏡Ｍ等の測定手段で細胞Ｃを測定する。なお、細胞Ｃの一部分の極小領域を回収したり、核や細胞質等の細胞小器官を採取したり、細胞核・細胞質移植に利用したりすることも可能である。

（第２実施形態）
図６に示すように、本発明の第２実施形態に係る細胞空間分画装置２は、微細構造刃１０の基部１１に表裏に通ずる孔１３が形成された構成である。この孔１３は刃構造部１２の各区画（刃で囲まれた領域）に形成されている。その余の構成は第１実施形態の細胞空間分画装置１と同様であるので、同一部材に同一符号を付して説明を省略する。

微細構造刃１０の基部１１に孔１３が形成されているので、微細構造刃１０を細胞Ｃに刺した状態でも、微細構造刃１０の裏側（基部１１側）から孔１３を通して区画化された細胞Ｃに薬液等を投与して処理を施すことができる。

例えば、孔１３を通してトリプシンを投与することにより、細胞Ｃと基板２０とを接着している細胞表面のタンパク質を破壊して、細胞Ｃを基板２０から剥がすことができる（トリプシン処理）。トリプシン処理を施すことで、細胞Ｃが溶液中に浮かんだ状態になり、区画化された細胞Ｃの一部分を回収できる。

また、細胞Ｃを空間分画したそのままの状態で処理を施し、細胞Ｃを測定することもできる。例えば、まず孔１３を通して界面活性剤や消化酵素を導入して細胞膜や細胞内の不要な構造を破壊し、細胞Ｃ内部の計測したいターゲット分子を溶液中に拡散させる（抽出操作）。つぎに、ターゲット分子に特異的に結合する蛍光性や化学発光性等のマーカー分子を孔１３を通して導入し、ターゲット分子をラベルして検出可能な状態にする（検出処理）。その後、センサ等でターゲット分子を検出する。

図７（Ａ）に示すように、基部１１に孔１３が形成されているので、微細構造刃１０の表側（刃構造部１２側）と裏側（基部１１側）に圧力差を生じさせることもできる。微細構造刃１０の表側を高圧、裏側を低圧とすれば、区画化された細胞Ｃを微細構造刃１０に引き付け保持できる。圧力差を生じさせるには、微細構造刃１０を流体中に入れ、微細構造刃１０の一方の側から流体を流すか、吸引すればよい。

細胞Ｃを微細構造刃１０に保持したまま引き上げることができ、そのまま微細構造刃１０を表裏反転させることもできる（図７（Ｂ）参照）。この状態で、微細構造刃１０の表側から光ピンセット等のマニピュレータにより、区画化された細胞Ｃの一部分を回収できる。

（第３実施形態）
図８に示すように、本発明の第３実施形態に係る細胞空間分画装置３は、微細構造刃１０を超音波振動させる超音波振動子４０を備える構成である。超音波振動子４０としては、圧電素子等種々の振動子を用いることができる。超音波振動子４０により微細構造刃１０を超音波振動させることができればよく、微細構造刃１０に直接設けられてもよいし、押圧手段３０を介して間接的に設けられてもよい。その余の構成は第１実施形態の細胞空間分画装置１と同様であるので、同一部材に同一符号を付して説明を省略する。

このような構成であるので、細胞Ｃを空間分画するにあたり、微細構造刃１０の超音波振動により細胞膜を破壊でき、切断抵抗が低くなる。そのため、細胞Ｃを潰すことなく区画化でき、細胞内部の正確な位置情報を保持できる。

（第４実施形態）
図９に示すように、本発明の第４実施形態に係る細胞空間分画装置４は、微細構造刃１０と基板２０との間に電気パルスを流す電気パルス付与手段５０を備える構成である。電気パルス付与手段５０は、電源や電気パルスを生成する回路等から構成される。シリコンで形成された微細構造刃１０は電気を通すことができる。また、基板２０はITO（酸化インジウムスズ）等で形成することで電気を通すことができる。その余の構成は第１実施形態の細胞空間分画装置１と同様であるので、同一部材に同一符号を付して説明を省略する。

このような構成であるので、細胞Ｃを空間分画するにあたり、電気パルスにより細胞膜を破壊でき、切断抵抗が低くなる。そのため、細胞Ｃを潰すことなく区画化でき、細胞内部の正確な位置情報を保持できる。

つぎに、実施例を説明する。
（微細構造刃の作製）
シリコンエッチングにより微細構造刃を作製した。作製した微細構造刃のSEM画像を図１１に示す。一枚のシリコン基板に、スリット状、格子状、ハニカム状の３種類の形状の微細構造刃を作製した。各微細構造刃の全体寸法は200μm四方である。また、刃の高さは10μm、刃の幅は292±22nmである。スリット状および格子状の微細構造刃の区画幅は5.04±0.07μmである。

図１１に示すように、シリコンエッチングにより、所望の区画形状、寸法を有する微細構造刃を作製できることが確認された。

（スリット状微細構造刃）
作製したスリット状の微細構造刃を用いて細胞を空間分画した。対象の細胞として培養Hela細胞を用い、コラーゲンゲルで基板に固定した。微細構造刃を細胞に押圧した後、微細構造刃を引き上げて細胞と離間した状態で、基板上の細胞を顕微鏡を用いて観察した。

顕微鏡により得られた細胞の画像を図１２（Ａ）に示す。なお、細胞は細胞染色用蛍光標識試薬を用いて細胞質を染色している。また、図１２（Ａ）における一点鎖線上の蛍光輝度を示すグラフを図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ｂ）において、ギャップＩの幅は1075±350nm、ギャップIIの幅は347±31nmであった。ギャップＩは、微細構造刃の刃の幅（292nm）よりも広い。これは、微細構造刃１０を引き上げて観察しているため、区画化された細胞の一部分が横にズレたためと考えられる。一方、ギャップIIは刃の幅と同程度である。以上より、スリット状の微細構造刃を用いて、細胞をスリット状に空間分画できることが確認された。

（格子状微細構造刃）
作製した格子状の微細構造刃を用いて複数の細胞を一度に空間分画した。空間分画前の細胞の画像を図１３（Ａ）に示す。また、空間分画後の細胞の画像を図１３（Ｂ）に示す。なお、細胞は細胞染色用蛍光標識試薬を用いて細胞質を染色している。

図１３より、細胞が格子状に切断されていることがわかる。これより、格子状の微細構造刃を用いて、細胞を格子状に空間分画できることが確認された。

本発明に係る細胞空間分画装置は、物質局在解析、単一細胞計測等の細胞計測の前処理に利用できる。また、核分離、核移植、細胞質移植等のクローン技術に利用できる。さらに、細胞初期化誘導、細胞分化誘導、細胞機能改変等の再生医療に利用できる。

１ 細胞空間分画装置
１０ 微細構造刃
１１ 基部
１２ 刃構造部
２０ 基板
３０ 押圧手段

Claims (6)

1. 対象の細胞を空間的に区画化して切断する刃構造を有する微細構造刃と、
   前記微細構造刃を前記細胞に押圧する押圧手段と、を備え、
   前記刃構造は、複数の区画を形成する刃からなり、一の該区画を形成する刃のうち対向する少なくとも２つの刃の間隔が、前記細胞よりも小さく、かつ、前記間隔が２〜１０μｍである、
   ことを特徴とする細胞空間分画装置。
2. 前記微細構造刃は、板状の基部と、該基部上に形成された刃構造部とからなり、
   前記基部には、前記刃構造部の各区画に薬液投与孔が形成されている
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞空間分画装置。
3. 前記微細構造刃は、板状の基部と、該基部上に形成された刃構造部とからなり、
   前記基部には、前記微細構造刃の表裏に圧力差を生じさせるための孔が、前記刃構造部の各区画に形成されている
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞空間分画装置。
4. 前記細胞を保持する基板と、
   前記微細構造刃と前記基板との間に電気パルスを流す電気パルス付与手段と、を備える
   ことを特徴とする請求項１、２または３記載の細胞空間分画装置。
5. 前記細胞は基板に保持されたゲル体中に固定されている
   ことを特徴とする請求項１、２、３または４記載の細胞空間分画装置。
6. 対象の細胞を空間的に区画化して切断する刃構造を有し、前記刃構造は、複数の区画を形成する刃からなり、一の該区画を形成する刃のうち対向する少なくとも２つの刃の間隔が、前記細胞よりも小さく、かつ、前記間隔が２〜１０μｍである、
   ことを特徴とする微細構造刃。