DE19836382C2

DE19836382C2 - Neues Tiermodell zur Entstehung und Therapie von Diabetes Mellitus

Info

Publication number: DE19836382C2
Application number: DE19836382A
Authority: DE
Inventors: Heiko Peters; Rudolf Balling; Anja Volz; Burkhard Goeke; Eckhard Wolf
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2000-12-07
Anticipated expiration: 2018-08-12
Also published as: EP0979872A1; DE19836382A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht humanes, transge nes Säugetier, das sich als Tiermodell zur Erforschung von Dia betes und zur Entwicklung neuer Therapien von Diabetes eignet und rekombinante DNA, die zur Herstellung des transgenen, nicht humanen Säugetiers eingesetzt wird, diese rekombinante DNA ent haltende Vektoren und Zellinien sowie ein Verfahren zur Her stellung des transgenen, nicht humanen Säugetiers.

Diabetes

Die Aufrechterhaltung einer konstanten Glukosekonzentration des Blutes ist für die Vitalität des menschlichen Organismus von essentieller Bedeutung. Sie wird durch fein abgestimmte Regula tionsmechanismen gesteuert, wobei der durch Insulin vermittel ten Glukoseaufnahme der Körperzellen eine zentrale Rolle zu kommt. Diabetes entsteht, wenn die Bauchspeicheldrüse entweder kein bzw. zuwenig Insulin produziert, oder die durch Insulin vermittelte Glukoseaufnahme der Körperzellen gestört ist. Dia betes mellitus ist als die häufigste vererbbare Stoffwechsel krankheit ein großes medizinisches und volkswirtschaftliches Problem. Über 200 Millionen Menschen sind weltweit an Diabetes mellitus Typ II erkrankt. Die Morbidität des Diabetes mellitus beträgt 2-3%.

Über die molekularen Mechanismen der Entstehung von Diabetes ist bislang wenig bekannt. Man geht davon aus, daß die Ursachen polyfaktoriell sind und neben genetischen Veränderungen auch Eß- und Lebensgewohnheiten umfassen. Gegenwärtig werden in der medizinischen Grundlagenforschung große Anstrengungen unternom men, die molekularen Vorgänge bei der Entstehung von Diabetes zu verstehen.

Eine ideale Vorausetzung für die erfolgreiche Entwicklung von Verfahren zur Diagnose, Behandlung und Prävention von Diabetes beim Menschen ist die Verfügbarkeit von Tiermodellen, in denen einzelne Komponenten aus der gesamten Pathologie der Entstehung von Diabetes gezielt untersucht werden können. Kann beispiels weise im Tiermodell gezeigt werden, daß die funktionelle Inak tivierung eines einzigen Proteins zur Entstehung von Diabetes führen kann, müssen Veränderungen (Mutationen, Aktivitätsver lust, Aktivitätsveränderungen etc.) dieses Proteins auch bei der Entstehung von Diabetes des Menschen in Betracht gezogen werden. Die Identifizierung eines pathogenen Mechanismus für die Diabetes-Entstehung im Tiermodell schafft somit die Voraus setzung für die Entwicklung neuer Therapeutika. Darüber hinaus kann dieses Tiermodell in idealer Weise als Testsystem zur Überprüfung bereits angewendeter, aber auch neu entwickelter Therapeutika integriert werden.

Die Funktion von GIP

GIP (Glucose-dependent insulinotropic (insulin-releasing) poly peptide; ältere Bezeichnung: gastric inhibitory peptide) ist ein Peptidhormon, das nach oraler Glukoseaufnahme von endokri nen Darmzellen freigesetzt wird und die Glukose-induzierte In sulinsekretion und -produktion verstärkt. GIP gelangt nach Nah rungsaufnahme über das Blut zu den Beta-Zellen des endokrinen Pankreas, wo es vom GIP-Rezeptor gebunden wird. Der GIP-Rezep tor leitet nach der Bindung des Hormons eine Signalkaskade in der Beta-Zelle ein, die zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration führt (cAMP: cyklisches Adenosinmono phosphat). cAMP ist ein sekundärer Botenstoff, der über weitere Zwischenschritte schließlich in den Beta-Zellen des endokrinen Pankreas sowohl die Freisetzung von Insulin als auch die Trans kription des Insulin-Gens aktiviert (Abb. 8).

Obwohl eine Reihe von Tiermodellen für Diabetes entwickelt wur den (db/db mouse: Zask et al., 1990; Roe et al., 1994; ob/ob mouse: Gettys et al., 1995; NZO-mouse: Andrikopoulos et al., 1993; NSY-mouse: Ueda et al., 1995), bieten diese Modelle bis lang nicht die Möglichkeit, die Rolle eines defekten GIP-Rezep tors bei der Entstehung von Diabetes zu klären.

Klinische Studien haben gezeigt, daß die Verabreichung von GLP-1 (Glucagon like peptide) bei Patienten mit Diabetes melli tus Typ II die Insulinfreisetzung teilweise wiederherstellen kann. Interessanterweise sind bei diesen Versuchen dagegen ex terne Gaben von GIP wirkungslos. Neben der Tatsache, daß Typ II Diabetiker normale oder sogar erhöhte GIP-Plasmaspiegel aufwei sen (Fehmann et al., 1995), legen diese Befunde die Annahme nahe, daß Mutationen bzw. Aktivitätsverluste des GIP-Rezeptors eine mögliche Ursache für die Entstehung von Diabetes mellitus Typ II sind. Ein funktioneller Zusammenhang zwischen einem ver änderten GIP-Rezeptor und der Entwicklung von Diabetes konnte jedoch bislang nicht gezeigt werden.

Die Rolle des GIP-Rezeptors

Der GIP-Rezeptor gehört zu einer Familie von Zelloberflächen- Rezeptoren, die als G-Protein gekoppelte Rezeptoren bezeichnet werden. Alle Mitglieder dieser Familie sind in der Zellmembran verankert und strukturell ähnlich aufgebaut: Sie besitzen au ßerhalb der Zelle Proteindomänen, die für die Bindung des Hor mons wichtig sind. Die Zellmembran wird durch sieben Domänen des Rezeptors durchzogen, die jeweils durch kurze Protein schleifen voneinander getrennt sind. Von diesen Proteinschlei fen ist u. a. die dritte intrazelluläre Schleife von besonderer Bedeutung, da bei verwandten Rezeptoren bereits gezeigt werden konnte, daß an diese Schleife G-Proteine binden können. G-Pro teine sind heterodimere Proteine, die in ihrer inaktiven Form das Nukleotid GDP (Guanosindiphosphat) binden und mit den G- Protein gekoppelten Rezeptoren assoziiert sind. Die Stimulation des Rezeptors durch seinen Ligand führt zu einer Konforma tionsänderung des gebundenen G-Proteins, wodurch die Affinität des G-Proteins zu GDP herabgesetzt wird und dieses durch GTP (Guanosintriphosphat)ausgetauscht wird. Daraufhin dissoziiert eine der drei Untereinheiten des G-Proteins ab und aktiviert bzw. inhibiert verschiedene Effektormoleküle, wie beispielswei se die Adenylatcyclase der Beta-Zelle.

Die cDNAs des GIP-Rezeptorgens sind inzwischen von der Ratte, vom Hamster, und vom Menschen isoliert und sequenziert worden. Ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigen zueinander ca. 80% Homologie. Der humane GIP-Rezeptor bindet GIP mit einer Affini tät von Kd = 1,13 × 10-8 M und zeigt keine Bindung zu verwandten Peptiden (Volz et al. 1995). Zur funktionellen Charakterisie rung des humanen GIP-Rezeptors wurde die cDNA durch Transfek tion in CHL-Zellen zur Expression gebracht. Nach Stimulation der transfizierten Zellen mit GIP konnte gezeigt werden, daß der Spiegel von cAMP, das die Signaltransduktion vermittelt, erhöht ist (Volz et al., 1995).

Die cDNA des GIP-Rezeptors des Menschen diente als Grundlage der Experimente, deren Ergebnisse im folgenden beschrieben wer den.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Tiermodells, um die Entstehung, Therapie und die Spätfol gen von Diabetes mellitus, insbesondere Typ II, zu untersuchen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine rekombinante DNA bereitgestellt wird, umfassend einen Promotor, der in den β-Zellen des endokrinen Pankreas exprimierbar ist, eine Sequenz, die für ein GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon kodiert, das befähigt ist, das Peptidhormon GIP zu binden, ohne eine Signaltransduktion zu initiieren, eine Terminationssequenz und eine Polyadenylierungssequenz, wobei die DNA bei Expression in einem geeigneten Wirt einen Diabetes- Phänotyp bewirkt.

Erfindungsgemäß konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß es möglich ist, ein GIP-Rezeptor-Protein oder ein aktives Fragment hiervon zu schaffen, das zwar das Peptidhormon GIP zu binden vermag, jedoch keine Signaltransduktion mehr initiieren kann. Dies wird dadurch erreicht, daß in das GIP-Rezeptorprotein, das aktive Fragment hiervon bzw. in die hierfür kodierende DNA eine oder mehrere Deletionen, Additionen und/oder eine oder mehrere Basenaustausche eingeführt werden, so daß durch diese Muta tion(en) zwar eine Bindung von GIP ermöglicht wird, die hier durch üblicherweise initiierte Signaltransduktion (Anstieg der cAMP-Konzentration) jedoch nicht mehr stattfindet.

Die Beibehaltung der Bindungsfähigkeit von GIP an das GIP-Re zeptor-Protein bei gleichzeitig fehlender Signalweiterleitung wurde erfindungsgemäß durch Einführen von Mutationen in die dritte intrazelluläre Schleife, die vermutlich an der G-Pro tein-Bindung beteiligt ist, erreicht. Hierzu können bevorzugt die Aminosäuren 321 bis 328 deletiert und die Aminosäure in der Position 342 ausgetauscht werden, wobei hier bevorzugt ein Aus tausch des Alanins durch Glutaminsäure stattfindet. Dies ist jedoch nur eine Möglichkeit, um das erfindungsgemäße GIP-Rezep tor-Protein oder ein aktives Fragment hiervon mit der Fähigkeit zur Bindung des GIP-Peptidhormons ohne Initiation der Signal transduktion zu schaffen. Es können auch andere Mutationen, z. B. Deletionen, Insertionen, Additionen und/oder Basenaustau sche durchgeführt werden, die zum gewünschten Ergebnis führen. Der Durchschnittsfachmann wird dies, ausgehend von der vorlie genden Erfindung, im Rahmen seines Fachwissens und Fachkönnens durchführen können.

Die oben angegebenen Sequenzpositionen beziehen sich auf die in Volz et al. veröffentlichte Sequenz des GIP-Rezeptors. Auf die se Veröffentlichung wird hier vollinhaltlich Bezug genommen.

Der erfindungsgemäß in der rekombinanten DNA eingesetzte Promo tor ist ein Insulin-Promotor. Selbstverständlich können auch andere, dem Fachmann zur Verfügung stehende Promotoren einge setzt werden, die geeignet sind, die GIP-Rezeptor-Proteinse quenz oder ein aktives Fragment hiervon in den β-Zellen des endokrinen Pankreas zu exprimieren. Bei der für das GIP-Rezep tor-Protein oder ein aktives Fragment hiervon kodierenden Se quenz handelt es sich entweder um eine genomische DNA oder eine cDNA aus einem beliebigen Säugerorganismus, bevorzugt aus Men schen.

In der vorliegenden Ausführungsform wurde die für das GIP-Re zeptor-Protein kodierende Sequenz in den RIP1-Vektor kloniert, der in der Veröffentlichung von Hanahan beschrieben ist. Auf diese Veröffentlichung wird hier vollinhaltlich Bezug genommen. Es können auch andere Vektoren eingesetzt werden, die eine zellspezifische Expression des Rezeptorproteins in den β-Zellen des Pankreas erlauben.

Von der Erfindung umfaßt werden auch Vektoren, die die rekom binante DNA der Erfindung enthalten, eukaryontische oder proka ryontische Zellinien, enthaltend eine rekombinante DNA oder einen Vektor der vorliegenden Erfindung sowie das rekombinante GIP-Rezeptor-Protein oder ein aktives Fragment hiervon und die hierfür kodierende DNA, die so abgeändert wurden, daß das Pep tidhormon GIP zu binden vermag, das vom Hormon ausgelöste Si gnal jedoch nicht mehr weitergeleitet wird.

Von der Erfindung umfaßt werden auch transgene, nicht mensch liche Säugetiere, die die oben beschriebene rekombinante DNA enthalten und das rekombinante GIP-Rezeptor-Protein exprimieren sowie das rekombinante GIP-Rezeptor-Protein.

Die erfindungsgemäß erzeugten transgenen, nicht menschlichen Säugetiere dienen als Modellsystem zur Untersuchung der Entste hung, Therapie und Spätfolgen von Diabetes mellitus, insbeson dere Diabetes mellitus Typ II.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Abbildungen und von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Die Erfindung ist je doch nicht auf das vorliegende Beispiel beschränkt. Im Rahmen der vorliegenden Patentansprüche kann das konkrete Ausführungs beispiel abgeändert werden, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Die anliegenden Abbildungen zeigen:

Abb. 1A-B: Vereinfachte Darstellung der Aminosäuresequenz des humanen GIP-Rezeptors und dessen Anordnung in der Plasmamembran.

Abb. 2A-B: Bindung von GIP nach Transfektion des mutierten GIP-Rezeptors in CHL-Zellen (Abb. 2A); Abwesen heit der Signaltransduktion nach Stimulation der so veränderten CHL-Zellen mit GIP (vergl. Abb. 2B).

Abb. 3: Struktur des RIP1-Vektors

Abb. 4A-B: Genotypisierungen von potentiell transgenen Mäu sen.

Abb. 5: Entwicklung der Glukosurie in den transgenen Mauslinien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B.

Abb. 6: Erhöhte Glukosekonzentration im Blut der trans genen Mauslinien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B.

Abb. 7A-B: Gestörte Glukosetoleranz in männlichen Mäusen der transgenen Mauslinie GIPR^dn-C.

Abb. 8: Vereinfachte Darstellung der Aktivierung der Insulinsekretion und der Transkription des Insu lingens durch die Wirkung der Peptidhormone GIP und GLP-1.

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein neues, transgenes, nicht humanes Säugetier (bevorzugt Maus) bereit, das als Folge einer pankreasspezifischen Expression eines funktionell inakti ven GIP-Rezeptors in den ersten sechs Lebensmonaten eine schwe re Form von Diabetes entwickelt. Diese transgenen Mäuse bieten erstmals die Möglichkeit, die Rolle eines defekten GIP-Rezep tors bei der Entstehung von Diabetes zu klären. Da sich in die sem Mausmodell der Diabetes bereits in den ersten zwei Lebens wochen manifestiert, können neben den langfristigen Auswirkun gen auch die Auswirkungen von Diabetes in der juvenilen Phase der Entwicklung untersucht werden. Die transgenen Mäuse stellen darüberhinaus ein in dieser Form einzigartiges Tiermodell be reit, an dem Verfahren entwickelt werden können, die auf eine Therapie von Diabetes abzielen.

Basis für die vorliegende Erfindung ist die Erzeugung transge ner Mauslinien, die einen dominant negativen GIP-Rezeptor unter der Kontrolle des Insulin-Promotors in den Beta-Zellen des en dokrinen Pankreas exprimieren. Als Folge dieser Expression ent wickeln diese transgenen Mäuse in den ersten zwei Lebensmonaten einen schweren Diabetes.

"Dominant" heißt, daß das mutierte Rezeptorprotein in einer so hohen Menge exprimiert wird, daß dem endogenen GIP-Rezeptor kein GIP-Hormon zur Bindung zur Verfügung steht. Dies wird da durch erreicht, daß der verwendete Insulinpromotor wesentlich stärker ist als der in den Wirtszellen aktive, endogene Promo tor. "Negativ" heißt, daß durch die fehlende Signaltransduktion des mutierten GIP-Rezeptors das GIP-Hormon keine Wirkung in den beta-Zellen entfalten kann.

Gezielte Mutagenese des humanen GIP-Rezeptors und funktioneller Test in Zellkultur

Wir haben durch gezielte Mutagenese einen veränderten GIP-Re zeptor kloniert, der das Peptidhormon GIP bindet, jedoch keine Signaltransduktion einleiten kann. In der dritten intrazellu lären Schleife des Rezeptors wurden 8 Aminosäuren (Pos. 321-3- 28) deletiert und außerdem eine Aminosäure ausgetauscht (Ala zu Glu an Pos. 342; siehe Abb. 1). In der Familie der Sieben- Transmembran-Rezeptoren ist diese dritte intrazelluläre Schleife, die an der G-Protein-Bindung beteiligt ist, für die Signaltransduktion essentiell (Lefkowitz et al., 1988, Venter et al., 1989).

Nach Transfektion in CHL-Zellen zeigt der mutierte GIP-Rezeptor spezifische Bindung von GIP (Kd = 0,35 × 10-9 M); er bindet GIP also mit etwa der gleichen Affinität wie der Wildtyp-Rezeptor (Kd = 0,22 × 10-9 M, siehe Abb. 2A). Nach Stimulation mit GIP konnte in diesen Zellen keine Erhöhung des cAMP-Spiegels gemes sen werden (siehe Abb. 2B). Eine starke Überexpression des mu tierten GIP-Rezeptors in den Beta-Zellen des endokrinen Pankre as in vivo sollte demnach zu einer Inaktivierung des endogenen GIP-Rezeptors führen, da sämtliches verfügbares GIP-Hormon vom mutierten Rezeptor gebunden wird.

Expression des funktionell inaktiven GIP-Rezeptor in den Beta- Zellen des endokrinen Pankreas transgener Mäuse

Um eine β-Zell spezifische Expression des funktionell inaktiven GIP-Rezeptor zu erreichen, wurde die cDNA des mutierten GIP- Rezeptors hinter den Insulinpromotor des RIP1-Vektors (Hana han, 1985) kloniert (siehe Abb. 3). Dieses Konstrukt wurde für die Erzeugung von transgenen Mäusen verwendet. Mit Hilfe des RIP1-Vektors gelang in transgenen Mäusen bereits erfolgreich die Expression verschiedener Gene in den beta-Zellen des endo krinen Pankreas (Hanahan, 1985; Kato et al., 1994).

Transgene Mäuse, die den funktionell inaktiven GIP-Rezeptor in den Beta-Zellen des endokrinen Pankreas exprimieren, wurden durch bekannte Techniken hergestellt. Zunächst wurden 3-4 Mona te alte Weibchen superovoliert. Dazu wurde den Tieren 5 I. U. PMSG (0,15 ml pregnant mare's serum gonadotropin pro Maus) in die Bauchhöhle injiziert. 48 Stunden später erhielten die Tiere eine Injektion von 5 I. U. HCG (0,15 ml humanes Gonadotropin pro Maus). Anschließend wurden die Tiere über Nacht verpaart und am nächsten Tag durch cervikale Dislokation getötet. Aus den Ei leitern wurden die befruchteten Eizellen isoliert. Unter einem Mikroskop wurde dann das DNA-Konstrukt in einen der Pronuklei befruchteter Eizellen injiziert.

Nach erfolgter Mikroinjektion wurden die befruchteten Eizellen unter Narkose in den Eileiter zyklussynchroner scheinträchtiger Weibchen (Fostermäuse) überführt, die die sich daraus entwic kelnden Embryonen austragen und aufziehen. Der Embryotransfer erfolgt unter Narkose (0,5 ml Hypnodil pro Maus). Im narkoti sierten Zustand wurde an der Fostermaus auf der Rückseite ent sprechend der Lage der Ovarien ein 0,5 cm langer Haut- und Fas zienschnitt angebracht, die Ovarien mit den Tuben, bzw. dem Uterus etwas abgehoben und die Präimplantationsembryonen mit einer ausgezogenen Pasteurpipette transferiert. Der Wundver schluß erfolgt mit "Autoclips" (Wundklammern).

Potentiell transgene Tiere wurden im Alter von 3-4 Wochen am Ohr markiert und am Schwanz biopsiert, um die Transgenität zu überprüfen. Transgene Tiere wurden dann mit normalen Mäusen verpaart, um eine Linie zu etablieren. Der Nachwuchs aus diesen Paarungen wird dann ebenfalls im Alter von 3-4 Wochen am Ohr markiert und zur Bestimmung der Transgenität am Schwanz biop siert.

Insgesamt wurden 13 individuelle transgene Linien hergestellt. Die Transgenität wurde durch zwei unabhängige PCR-Analysen überprüft (siehe Abb. 4).

Es ist bekannt, daß ein gegebenes DNA-Expressionskonstrukt in unabhängig erzeugten, transgenen Mauslinien nicht jeweils gleichstark exprimiert wird. Vielmehr ist die Expressionsstärke eines DNA-Abschnittes, der in das Genom integriert ist, sowohl vom Integrationsort als auch von der Anzahl der integrierten DNA-Kopien abhängig. Drei unabhängig etablierte transgene Maus linien, GIPR^dn-A, GIPR^dn-B, und GIPR^dn-C (Glucose-dependent Insu linotropic Peptide Receptor, dominant negative), die sich durch einen unterschiedlich starken Phänotyp auszeichneten, wurden näher untersucht.

Bestimmung der Glukosekonzentration im Urin und im Blut

Transgene Männchen der Mauslinien GIPR^dn-A, -B, -C wurden mit Wildtyp-Weibchen verpaart. Von den Nachkommen aus diesen Ver paarungen wurde in wöchentlichen Abständen Urin gewonnen und dessen Glukosekonzentration näherungsweise bestimmt. Glukose wird im Urin nachweisbar, wenn die Konzentration im Blut einen kritischen Schwellenwert überschreitet und durch eine Überbe anspruchung der Niere die vollständige Rückresorption nicht mehr gewährleistet ist. Etwa 50 µl Urin wurden auf einen Urin meßstreifen (Combur10TestÊM, Boehringer Mannheim) aufgetropft und der Meßwert (mg/dl) nach einer Minute abgelesen. Nach Ab schluß der Meßreihe wurden die Mäuse zur Feststellung des Geno typs an der Schwanzspitze biopsiert.

Alle Nachkommen der Mauslinien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B zeigen das Phänomen der Polydipsie (abnorm erhöhte Wasseraufnahme) und entwickeln eine schwere Glukosurie, wobei die 100%ige Penetranz dieses Phänotyp in der Mauslinie GIPR^dn-A etwas später eintritt als in der Mauslinie GIPR^dn-B (siehe Abb. 5). In der Linie GIPR^dn-C konnte dagegen keine Glukosurie festgestellt werden. Interessanterweise kann die Glukosurie in der Linie GIPR^dn-B durch die Verabreichung einer kohlenhydratarmen Diät therapiert werden, während dies in der Linie GIPR^dn-A nicht möglich ist (ohne Abbildung). Adulte Mäuse der Linien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B zeigten neben der Glukosurie weitere pathologische Auffällig keiten. Die Obduktion ergab zum einen, daß der Darm abnorm stark gefüllt war und zum anderen, daß Fettkörper weitgehend fehlten.

Bestimmung der Glukosekonzentration des Blutes (nüchtern und postprandial)

Zur Bestimmung der Glukosekonzentration des Blutes wurden transgene Mäuse (Linie GIPR^dn-A und GIPR^dn-B) und Kontrollmäuse verschiedenen Alters für 18 Stunden fasten gelassen. An schließend wurde aus der Schwanzvene 5 µl Blut entnommen und die Glukosekonzentration bestimmt (Nüchtern-Wert). Danach wurde den Mäusen für 6 Stunden Futter ad libitum gegeben und anschließend die Glukosekonzentration erneut bestimmt (postprandialer Wert). Diese Untersuchungen zeigen, daß selbst die Nüchternwerte in den transgenen Mäusen bereits 5 Wochen nach der Geburt über denen der Kontrollmäuse liegen (Abb. 6). Entsprechendes gilt für die postprandialen Werte. In den ersten Lebensmonaten ver schlechtert sich die Fähigkeit zur Glukoseaufnahme in den transgenen Mäusen weiter. Die nach 5-6 Monaten gewonnene Meß reihe zeigt, daß vor allem die postprandialen Werte gegenüber den zum früheren Zeitpunkt gewonnenen Werten deutlich erhöht sind. Aus diesen Ergebnissen läßt sich schließen, daß sich die Insuffizienz der Glukoseaufnahme in den transgenen Mauslinien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B sukzessive manifestiert.

Oraler Glukosetoleranztest

Eine schwache Expression des Transgens kann dazu führen, daß zirkulierendes GIP nicht vollständig vom dominant negativen GIP-Rezeptor, sondern teilweise auch vom endogen exprimierten GIP-Rezeptor gebunden wird. In diesem Fall wäre der endogene GIP-Rezeptor nur teilweise inaktiviert. Um zu überprüfen, ob die transgenen Mäuse der Linie GIPR^dn-C, in der keine Glukosurie festgestellt werden konnte, dennoch eine gestörte Fähigkeit zur Glukoseaufnahme besitzen, wurde ein oraler Glukosetoleranztest (Scrocchi et al. 1996) durchgeführt. Dazu wurden adulte Mäuse für 18 Stunden fasten gelassen und anschließend die Glukosekon zentration des Blutes bestimmt. Danach wurde eine 1 M Glukoselö sung (250 µl/30 g Körpergewicht) per Knopfsonde in den Magen der Versuchstiere gegeben und nachfolgend zu verschiedenen Zeit punkten die Glukosekonzentration des Blutes bestimmt. Diese Untersuchung ergab den überraschenden Befund, daß männliche Nachkommen der Mauslinie GIPRdn-C eine gestörte Glukosetoleranz zeigten, während die Meßwerte der weiblichen Nachkommen denen der Kontrollen ähnelten (Abb. 7).

Histopathologische Untersuchungen

Verschiedene Organe aus adulten Mäusen der transgenen Linien GIPRdn-A und GIPRdn-B wurden histopathologisch untersucht. Im Pankreas der transgenen Mäuse ist die Anzahl der Langer hans'schen Inseln deutlich verringert. Darüberhinaus sind die vorhandenen Inseln gegenüber denen von Kontrollmäusen kleiner. Die Lebern der transgenen Mäuse zeigen abnorme Anreicherungen von Glykogen. In den Glumeroli der Nieren konnte die Anwesen heit von prall mit Glykogen gefüllten Zellen - sogenannte Ar manni-Ebstein-Zellen nachgewiesen werden. Die pathologischen Befunde bestätigten, daß die transgenen Mauslinien GIPR^dn-A und GIPR^dn-B eine schwere Form von Diabetes mellitus entwickeln.

Literatur

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Claims

1. Rekombinante DNA, umfassend einen Promotor, der in den β- Zellen des endokrinen Pankreas exprimierbar ist, eine Se quenz, die für ein GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon kodiert, das befähigt ist, das Peptidhor mon GIP zu binden, ohne eine Signaltransduktion zu initi ieren, eine Terminationssequenz und eine Polyadenylie rungssequenz, wobei die DNA bei Expression in einem geeig neten Wirt einen Diabetes-Phänotyp bewirkt.

2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon in der dritten intrazellulären Schleife, so mutiert ist, daß eine Bindung von GIP an den GIP-Rezeptor möglich ist, ohne eine Signaltransduktion zu initiieren.

3. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon durch eine oder mehrere Deletionen und/oder Addi tionen und/oder durch einen oder mehrere Basenaustausche so mutiert ist, daß eine Bindung von GIP möglich ist, ohne eine Signaltransduktion zu initiieren.

4. Rekombinante DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon eine Deletion in den Aminosäuren 321-328 und einen Aminosäureaustausch in der Position 342 enthält.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß an der Position 342 Alanin durch Glutaminsäure ausge tauscht wurde.

6. Rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Insulin-Promotor ist.

7. Rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die für das GIP-Rezeptorprotein kodierende Sequenz oder ein aktives Fragment dieser Sequenz genomische DNA oder cDNA ist.

8. Rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA den RIP1-Vektor umfaßt, enthal tend, in funktioneller Verbindung, eine GIP-Rezeptorpro tein-Sequenz oder ein aktives Fragment hiervon, die so verändert ist, daß das Peptidhormon GIP an den GIP-Rezep tor bindet, ohne eine Signaltransduktion zu initiieren.

9. Rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die für das GIP-Rezeptorprotein kodierenden Sequenzen oder aktive Fragmente hiervon in Säugerzellen exprimierbar sind.

10. Vektor, umfassend eine rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

11. Eukaryontische oder prokaryontische Zellinie, enthaltend eine rekombinante DNA oder einen Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

12. Rekombinantes GIP-Rezeptorprotein oder aktives Fragment hiervon und hierfür kodierende DNA, dadurch gekennzeichnet, daß das GIP-Rezeptorprotein oder ein aktives Fragment hiervon oder die hierfür kodierende DNA so verändert wur de, daß das GIP-Peptidhormon bindet, ohne eine Signal transduktion zu initiieren.

13. Transgenes, nicht menschliches Säugetier, enthaltend eine rekombinante DNA nach einem oder mehreren der vorhergehen den Ansprüche.

14. Transgenes, nicht menschliches Säugetier nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Nager ist.

15. Transgenes, nicht menschliches Säugetier nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Nager eine Maus oder eine Ratte ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines transgenen, nicht mensch lichen Säugetiers nach einem oder mehreren der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 in ein nicht menschliches Säugetier in der Weise eingeführt wird, daß ein transgenes, nicht menschliches Säugetier mit der Fähigkeit zur Entwicklung eines Diabetes-Phänotyps entsteht.

17. Verwendung eines transgenen, nicht menschlichen Säugetiers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche als Modellsystem zur Untersuchung der Entstehung, Therapie und Spätfolgen von Diabetes mellitus.