DE60023691T2 - T-bet zusammensetzungen und deren verwendungsmethoden - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Zellen des Immunsystems ändern die Muster der Genexpression als Antwort auf extrazelluläre und intrazelluläre Signale. Eine Gruppe von als Cytokine oder Lymphokine bezeichneten Polypeptiden, die eine Reihe biologischer Aktivitäten in verschiedenen Zelltypen beeinflussen, gehört zu den wichtigsten dieser Signale. Obwohl zahlreiche Zelltypen im Immunsystem Cytokine sezernieren, ist der T-Helfer (Th)-Lymphocyt die Hauptquelle für diese Polypeptide. Vor mehr als einem Jahrzehnt wurde festgestellt, dass sich Th-Zellen durch T-Zellrezeptor-Beteiligung zu zwei unterschiedlichen Subsets, Th1 und Th2, differenzieren, die beide durch ihre unterschiedlichen funktionellen Fähigkeiten und durch einzigartige Cytokin-Profile definiert sind (Paul und Seder; 1994, Cell 76, 241-251; Mosmann und Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Mosmann et al., 1986. J. Immunol. 136, 2348-2357; Snapper und Paul, 1987, Science 236, 944-947). Th1-Zellen vermitteln verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen und Makrophagenaktivierung, während Th2-Zellen die B-Zellen unterstützen und kritisch für allergische Reaktionen sind (Mosmann und Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Paul und Seder, 1994, Cell 76, 241-251; Arthur und Mason, 1986, J. Exp. Med. 163, 774-786; Paliard et al., 1988, J. Immunol. 141, 849-855; Finkelman et al., 1988, J. Immunol. 141, 2335-2341). Die Anhaltspunkte, dass Th1-Zellen die zellvermittelte Immunität steuerten, während die Th2-Zellen zu humoralen Reaktionen beitrugen, passten gut zu den Beobachtungen, dass ein Organismus als Reaktion auf Pathogene meist entweder eine zellvermittelte oder eine humorale Reaktion, aber nicht beide, vorbereitet. Diese funktionellen Unterschiede zwischen den Th-Subsets lassen sich am einfachsten durch die Aktivitäten der Cytokine selbst erklären. IFN-γ ist das Signatur-Cytokin der Th1-Zellen, obwohl die Th1-Zellen auch IL-2, TNF und LT produzieren. Das entsprechende Signatur-Cytokin für die Th2-Zellen ist IL-4. Die Th2-Zellen sezernieren auch IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 und IL-13.
  • Bei der Begegnung mit einem Antigen führt die naive CD4+ T-Helfer-Präkursor (Thp)-Zelle ein genetisches Programm aus, das sie letztlich entlang einer Th1- oder Th2-Linie führt. Zwar ist klar, dass eine Polarisation durch Manipulation der Antigen- und Costimulationssignale, d.h. der „Stärke des Signals", das vom Thp empfangen wird, erreicht werden kann (Constant und Bottomly, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15, 297-322), doch die wirksamsten Induktoren für Effektor-Th-Zellen sind zweifellos die Cytokine selbst. IL-4 fördert die Th2-Differenzierung und blockiert gleichzeitig die Th1-Entwicklung – ein Effekt, der über den Stat6-Signalpfad vermittelt wird. Somit können Mäuse, denen IL-4 oder Stat6 fehlt, keine Th2-Zellen entwickeln (Kopf et al., 1993. Nature 362. 245-248; Kuhn et al., 1991, Science 254, 707-710; Kaplan et al., 1996, Immunity 4. 313-319; Shimoda et al., 1996, Nature 380, 630-633; Takeda et al., 1996, Nature 380. 627-630). Im Gegensatz dazu sind IL-12, IL-18 und IFN-γ die für die Entwicklung von Th1-Zellen kritischen Cytokine (Hsieh et al., 1993, Science 260, 547-549; Okamura et al., 1995. Nature 378, 88-91; Gu et al., 1997, Science 275, 206-209; Meraz et al., 1996, Cell 84. 431-442; Magram et al., 1996, Immunity 4, 471-481). IFN-γ, das über den Stat1-Pfad wirkt (Meraz et al., 1996, Cell 84, 431-442), und IL-12, das über den Stat-4-Signalpfad wirkt (Jacobson et al., 1995, J. Exp. Med. 181, 1755-1762), fördern zusammen die Differenzierung der Th1-Zellen und blockieren die Bindung an die Th2-Linie (Szabo et al., 1995, Immunity 2, 665-675; Szabo et al., 1997, J. Exp. Med. 185:817-824). Mäuse, denen IL-12 oder Stat4 fehlt, weisen keine Th1-Zellen auf (Magram et al., 1996, Immunity 4, 471-481; Takeda et al., 1996, Nature 380, 627-630; Shimoda et al., 1996, Nature 380, 630-633). Ein weiteres, wichtiges Th1-induzierendes Cytokin ist IL-18, dessen Rezeptor mit der IL-1-Rezeptorenfamilie verwandt ist (Cerretti et al., 1992, Science 256, 97-100). Mäuse, denen IL-18 fehlt, zeigen defiziente in vivo-Th1-Reaktionen (Takeda et al., 1998, Immunity 8, 383-390), und sowohl IL-12 als auch IL-18 regulieren die IFN-γ-Expression (Barbulescu et al., 1998, Eur. J. Immunol. 27, 1098-1107; Robinson et al., 1997, Immunity 7, 571-581; Ahn et al., 1997. J. Immunol. 159, 2125-2131). Die Cytokine selbst bilden dann ein System aus positiver und negativer Rückkopplung, das die Th-Polarisation steuert (Powrie und Coffman, 1993, Immunol. Today 14, 270-274; Scott, 1991, J. Immunol. 147, 3149; Maggi et al., 1992. J. Immunol. 148, 2142; Parronchi et al., 1992, J. Immunol. 149, 2977; Fargeas et al., 1992. Eur. J. Immunol. 149, 2977; Manetti et al., 1993, J. Exp. Med. 177,1199; Trinchieri, 1993, Immunol. Today 14, 335-338; Macatonia et al., 1993, Immunol. 5, 1119; Seder et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10188-10192; Wu et al., 1993, J. Immunol. 151, 1938; Hsieh et al., 1993, Science 260, 547-549) (besprochen von: Seder und Paul. 1994, in Annual Review of Immunology, Nr. 12, 635-673; Paul und Seder, 1994, Cell 76, 241-251; O'Garra, 1998, Immunity 8, 275-283).
  • In den letzten Jahren wurden bei der Identifikation der Transkriptionsfaktoren, die den Übergang von einer Thp-Zelle zu einer Th2-Zelle steuern, deutliche Fortschritte gemacht, was durch die Fähigkeit solcher Faktoren zur Steuerung der IL4-Produktion deutlich wird, wie dies von Glimcher und Singh, 1999, Cell 96, 13-23; Szabo et al. 1997, Current Opinions in Immunology 9, 776-781, besprochen ist. Es wurde gezeigt, dass die Bereitstellung dreier unterschiedlicher Proteine, d.h. des c-Maf-Proto-Onkogens, des Transkriptionsfaktors: Nuklearfaktor Aktivierter T-Zellen (NFAT), und eines neuen Kern-Antigens, des NFAT-Interaktionsproteins 45 kD (NIP45), einer Nicht-T-Zelle die Fähigkeit verleiht, endogenes IL-4 zu produzieren (Hodge et al., 1996, Science 274, 1903-1905; Ho et al., 1998, J. Exp. Med. 188:1859-1866). Diese und andere Faktoren, wie GATA-3 (Zheng und Flavell, 1997. Cell 89, 587-596) und Stat6, können eindeutig die Produktion von IL-4 und damit die Entwicklung von Th2-Zellen, sowohl in vitro als auch in vivo, steuern.
  • Im Gegensatz dazu ist wenig über die molekulare Grundlage der Th1-Differenzierung bekannt. Beispielsweise sind die einzigen bekannten Transkriptionsfaktoren, deren Fehlen zu einer Unfähigkeit zur Erzeugung von Th1-Zellen führt, Stat4 (Thierfelder et al., 1996, Nature 382, 171-174; Kaplan et al., 1996, Nature 382, 174-177) und IRF-1 (Lohoff et al., 1997, Immunity: 681-689; Taki et al., 1997, Immunity 6:673-679), die beide nicht Th1-spezifisch sind. Kürzlich wurde berichtet, dass das Ets-Familienmitglied ERM, das durch IL-12 in Stat4-abhängiger Weise induziert wird, Th1-spezifisch ist, die Produktion von Th1-Cytokinen aber nicht beeinflusst (Ouyang et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3888). Das Fehlen von Th1-Zellen in Stat4-defizienten Mäusen ist rangiert nach der Unfähigkeit von IL-12, das Th1-Programm zu steuern, während das Fehlen von Th1-Zellen in IRF-1-defizienten Mäusen vermutlich durch seinen direkten Effekt auf die Steuerung der Transkription des IL-12-Gens bedingt ist (Lohoff et al., 1997, Immunity 6:681-689; Taki et al., 1997, Immunity 6:673-679). Einige der Signalpfade stromaufwärts solcher putativen, Th1-spezifischen Regulierungsfaktoren werden jedoch allmählich aufgeklärt. Die p38-Kinase ist ein solches Signalmolekül, wie sich durch die Fähigkeit der konstitutiv aktivierten MAP-Kinase Kinase 6 (MKK6) zur Steigerung der IFN-γ-Produktion zeigt. Umgekehrt verringert eine Überexprimierung einer dominant-negativen p38 MAP-Kinase oder eine gezielte Störung von Jnk2 oder Jnk1 die Th1-Antworten (Rincón et al., 1998. EMBO J. 17, 2817-2829; Yang et al., 1998, Immunity 9, 575-585; Dong et al., 1998, Science 282, 2092-2095). Der JNK-Signalpfad könnte die Th-Entwicklung über eine direkte Wirkung auf die Transkription des IFN-γ-Gens beeinflussen, was jedoch nicht erwiesen ist. Beispielsweise sind die ATF-2- und AP-1-Transkriptionsfaktoren beide Substrate von JNK-Kinasen, und diese Faktoren sowie die NFκB- und Stat4-Proteine binden bekanntlich an Stellen im IFN-γ-Promoter (Zhang et al., 1998. Immunol. 161, 6105-6112; Ye et al., 1996. Mol. Cell. Biol. 16:4744; Barbulescu et al., 1997, Eur. J. Immunol. 27, 1098-1107: Sica et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 30412-30420). Die Produktion von IFN-γ erfolgt jedoch bei Mäusen, denen ATF-2 fehlt, normal. Da Cytokine für die Entwicklung von Th1- und Th2-Zellen und damit zur Bestimmung, ob eine Immunantwort vorwiegend zellulär oder humoral sein wird, kritisch sind, wären Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren der Produktion von Th1- und/oder Th2-Cytokinen von enormem Nutzen für eine Modulation der Immunantwort.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung neuer Zusammensetzungen, die eine Förderung des Th1-Phänotyps in naiven T-Helfer-Präkursorzellen (Thp) bewirken, indem sie sowohl Th1-zellgenetische Programme initiieren als auch die Gegenprogramme in Th2-Zellen unterdrücken. Insbesondere werden gemäß dieser Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die T-bet und isoliertes T-bet-Protein codieren. T-bet (T-Box, exprimiert in T-Zellen) ist ein neues Mitglied der T-Box- Familie von Transkriptionsfaktoren, deren Gründungsmitglied das Brachyurie-Gen ist. T-bet wird selektiv in Thymocyten und Th1-Zellen konstitutiv exprimiert. T-bet ist der erste Th1-spezifische Transkriptionsfaktor, der das interferon-gamma-Gen transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten primären T-Zellen induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenken kann. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung dieser neuen T-bet-Zusammensetzungen bereit.
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die ein T-bet-Protein codiert, bei dem es sich um einen Th1-spezifischen Transkriptionsfaktor handelt, der das Interferon-gamma-Gen transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten primären T-Zellen induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenken, die Interferon-gamma-Produktion erhöhen und die IL-2-Produktion unterdrücken kann, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 umfasst oder wobei die Nukleotidsequenz mit dem Komplement der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegeben ist, in 6 x SSC bei 45°C hybridisiert, gefolgt von einer oder mehreren Wäschen in 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, oder wobei die Nukleotidsequenz mindestens 70% Nukleotidübereinstimmung mit mindestens 700 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID NO: 1 aufweist, oder wobei die Nukleotidsequenz mindestens 70% Nukleotidübereinstimmung mit mindestens 500 benachbarten Nukleotiden der SEQ ID NO: 3 aufweist.
  • Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuremoleküle, die T-bet codieren, können in einen Vektor, wie z. B. einen Expressionsvektor, aufgenommen werden, und dieser Vektor kann in eine Wirtszelle eingeführt werden. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen eines T-bet-Proteins durch Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle (die einen T-bet-Expressionsvektor trägt) in einem geeigneten Medium, bis ein T-bet-Protein hergestellt ist, bereit. Das Verfahren kann ferner das Isolieren des T-bet-Proteins aus dem Medium oder der Wirtszelle umfassen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein isoliertes T-bet-Protein gemäß der Erfindung, das die von SEQ ID NO: 1 oder 3 codierte Aminosäuresequenz umfasst. Vorzugsweise umfasst das T-bet-Protein die tue Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4. Bei anderen Ausführungsformen weist das Protein mindestens 70% Aminosäureübereinstimmung, bevorzugter 80% Aminosäureübereinstimmung und noch bevorzugter 90% Aminosäureübereinstimmung mit der in SEQ ID NO: 1 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz auf.
  • Fusionsproteine, die ein T-bet-Protein umfassen, das mit einem anderen Polypeptid als T-bet operabel verknüpft ist, sind ebenfalls von der Erfindung erfasst, wie auch Antikörper, die spezifisch ein T-bet-Protein binden. Die Antikörper können z. B. polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Bei einer Ausführungsform sind die Antikörper mit einer detektierbaren Substanz gekoppelt.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein nicht-menschliches, transgenes Lebewesen, das Zellen enthält, die ein Transgen tragen, welches ein T-bet-Protein codiert, das von einem isolierten Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung codiert wird.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Detektieren des Vorliegens einer T-bet-mRNA oder eines T-bet-Proteins in einer biologischen Probe, die (das) Th1 codiert oder ein Th1-spezifischer Transkriptionsfaktor gemäß der Erfindung ist, umfassend das Kontaktieren der biologischen Probe mit einer (einem) markierten Nukleinsäuresonde oder Antikörper, so dass das Vorliegen von T-bet in der biologischen Probe detektiert wird.
  • Wiederum ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Expression oder Aktivität eines T-bet-Proteins gemäß der Erfindung stimuliert oder inhibiert, umfassend
    das Bereitstellen einer Indikatorzusammensetzung, die das T-bet-Protein aufweist,
    Kontaktieren der Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung in vitro, und
    Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins in der Indikatorzusammensetzung, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, welche die Expression oder Aktivität des T-bet-Proteins stimuliert oder inhibiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorzusammensetzung ein T-bet-Protein und ein DNA-Molekül, an welches das T-bet-Protein bindet, und die Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins wird durch Bewertung der Bindung des T-bet-Proteins an das DNA-Molekül mit und ohne die Testverbindung bestimmt. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Indikatorzusammensetzung eine Zelle, die ein T-bet-Protein und ein Reporter-Gen umfasst, das auf das T-bet-Protein anspricht, und die Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins wird durch Bewertung der Expression des Reporter-Gens in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung bestimmt. Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Bestimmens der Wirkung der Testverbindung auf eine Immunantwort, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die eine Immunantwort moduliert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A zeigt ein Nukleotidsequenz-Alignment von Maus- und Menschen-T-bet. Das Alignment wurde mit dem Programm ALIGN hergestellt. 1B zeigt ein Aminosäuresequenz-Alignment von Maus- und Menschen-T-bet, das mit dem Lipman Pearson Protein-Alignment-Programm hergestellt wurde. Die T-Box-Sequenz ist fett dargestellt. Tyrosin-Phosphorylierungsstellen sind unterstrichen. Die Kernlokalisierungsstelle ist mit Pfeilen markiert.
  • Die 2A und B zeigen, dass T-bet an Konsens-T-Box-Stellen mit funktionell wichtigen Domänen, die sowohl zu 5'- als auch an 3'-Regionen kartiert sind, bindet und diese transaktiviert.
  • 3A zeigt, dass T-bet vorzugsweise in doppelt-negativen Thymocyten exprimiert wird. Bild B zeigt, dass die T-bet-Expression bei einer Untersuchung von Th-Klonen auf Th1-Zellen beschränkt ist. Bild C zeigt eine Western Blot-Analyse von T-bet. Bild D zeigt eine FACS-Analyse der T-bet-Expression.
  • Die 4A und B zeigen, dass die T-bet-Expression mit der IFN-γ-Induzierung in NK- und B-Zellen zusammenhängt.
  • 5 zeigt, dass T-bet das IFN-γ-Gen in Th-Zellen transaktiviert.
  • 6 zeigt, dass die retrovirale Gentransduktion von T-bet die IFN-gamma-Produktion verringert/erhöht und die IL-2-Produktion unterdrückt.
  • 7 zeigt, dass T-bet in primären T-Zellen IFN-γ aktiviert und die IL-2-Produktion unterdrückt.
  • 8 zeigt, dass T-bet in sich entwickelnden Th2-Zellen IFN-gamma induziert und die IL-4-Produktion inhibiert.
  • 9 zeigt, dass T-bet polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenkt. Eine Th-Verschiebung wurde wie oben ausgeführt, und retrovirale Infektionen wurden am 9. Tag der Kultivierung vorgenommen.
  • 10 zeigt, dass T-bet polarisierte Tc2-Zellen auf den Tc1-Pfad umlenkt. CD8+ T-Zellen wurden mittels MoFlo gereinigt und unter Th2-Verschiebungsbedingungen wie oben kultiviert, und am 8. Tag der Kultivierung wurden retrovirale Transduktionen durchgeführt.
  • 11 zeigt, dass T-bet Tyrosin-phosphoryliert ist.
  • 12 zeigt die Aktivität einer dominant-negativen T-bet-Mutante.
  • 13 zeigt, dass Mutationen des T-Box-Elementes des IL-2-Promoters die IL-2-Promoter-Aktivität verringern.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf T-bet-Zusammensetzungen, wie isolierte Nukleinsäuremoleküle, die T-bet codieren, und isolierte T-bet-Proteine, sowie auf Verfahren zu deren Verwendung.
  • Zum besseren Verständnis der Erfindung werden zunächst bestimmte Begriffe definiert.
  • So wie er hier verwendet wird, umfasst der Begriff „T-bet-Moleküle" T-bet-Nukleinsäuremoleküle, die strukturelle Merkmale mit den in SEQ ID No: 1 und 3 gezeigten Nukleinsäuremolekülen gemeinsam haben, und T-bet-Proteine, welche die unterscheidenden strukturellen und Funktionsmerkmale mit den in SEQ ID No: 2 und 4 gezeigten T-bet-Proteinen gemeinsam haben. Die T-bet-Proteine sind Mitglieder der T-Box-Familie von Proteinen und teilen eine gewisse Aminosäuresequenz-Homologie mit Brachyurie, Tbx1-6, T-brain-I (Tbr-I). T-Box-Proteine umfassen eine T-Box-Domäne, die an einer T-Box-Bindungsstelle an DNA bindet. Weitere Struktur- und Funktions-Merkmale von T-bet-Proteinen sind nachfolgend angegeben.
  • Der Begriff „Nukleinsäuremolekül" soll, so wie er hier verwendet wird, DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) umfassen. Das Nukleinsäuremolekül kann einsträngig oder doppelsträngig sein, ist vorzugsweise jedoch doppelsträngige DNA.
  • So wie es hier verwendet wird, bezieht sich ein „isoliertes Nukleinsäuremolekül" auf ein Nukleinsäuremolekül, das frei von Gensequenzen ist, die natürlicherweise die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus flankieren, aus dem die Nukleinsäure stammt (d. h. genetische Sequenzen, die benachbart dem Gen für das isolierte Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA des Organismus angeordnet sind, aus dem die Nukleinsäure stammt). Beispielsweise enthält ein isoliertes T-bet-Nukleinsäuremolekül bei verschiedenen Ausführungsformen typischerweise weniger als etwa 10 kb Nukleotidsequenzen, welche natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle flankieren, aus der die Nukleinsäure stammt, und enthält noch bevorzugter weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der natürlicherweise flankierenden Nukleotidsequenzen. Ein „isoliertes" T-bet-Nukleinsäuremolekül kann jedoch mit anderen Nukleotidsequenzen verknüpft sein, welche die T-bet-Sequenzen in genomischer DNA normalerweise nicht flankieren (z. B. können die T-bet-Nukleotidsequenzen mit Vektorsequenzen verknüpft sein). Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie z. B. ein cDNA-Molekül, auch frei von anderem Zellmaterial sein.
  • Es ist jedoch nicht notwendig, dass das T-bet-Nukleinsäure-Molekül frei von anderem Zellmaterial ist, um als „isoliert" betrachtet zu werden (z. B. würde ein T-bet-DNA-Molekül, das von anderer Säugetier- DNA getrennt und in eine Bakterienzelle insertiert wird, immer noch als „isoliert" betrachtet werden).
  • So wie er hier verwendet wird, soll der Ausdruck „hybridisiert unter sehr strengen Bedingungen" Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen mit wesentlicher gegenseitiger Homologie (z. B. typischerweise mehr als 70% Homologie) stabil miteinander hybridisiert bleiben. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für sehr strenge Bedingungen ist eine Hybridisierung in einem Hybridisierungspuffer, der 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) enthält, bei einer Temperatur von etwa 45°C für mehrere Stunden bis über Nacht, gefolgt von einer oder mehreren Wäschen in einem Waschpuffer, der 0,2X SSC und 0,1% SDS enthält, bei einer Temperatur von etwa 50-65°C.
  • Der Begriff „Prozent (%) Übereinstimmung", wie er im Zusammenhang mit Nukleotid- und Aminosäuresequenzen verwendet wird (z. B. wenn es heisst, eine Aminosäuresequenz sei zu X% mit einer anderen Aminosäuresequenz identisch), bezieht sich auf den Prozentsatz identischer Reste, welche die beiden Sequenzen gemeinsam haben, wenn sie optimal ausgerichtet sind. Um die prozentuale Übereinstimmung zweier Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen zum Zwecke des optimalen Vergleichs ausgerichtet (z. B. können in eine Sequenz Gaps oder Lücken für ein optimales Alignment mit der anderen Sequenz eingebracht werden). Dann werden die Reste an entsprechenden Positionen verglichen, und wenn eine Position in einer Sequenz vom gleichen Rest eingenommen wird, wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Übereinstimmung zwischen zwei Sequenzen hängt daher von der Anzahl identischer Positionen ab, die zwei Sequenzen gemeinsam sind (d. h., % Übereinstimmung = Anzahl identischer Positionen/Gesamtzahl der Positionen × 100).
  • Dem Fachmann bekannte Computer-Algorithmen können zum optimalen Ausrichten und Vergleichen zweier Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen verwendet werden, um die prozentuale Übereinstimmung zwischen den beiden Sequenzen zu definieren. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modifiziert gemäß Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Ein solcher Algorithmus ist in die Programme NBLAST und XBLAST von Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10, integriert. Um Gap-Alignments zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie dies bei Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25 (17):3389-3402, beschrieben ist. Bei Anwendung der Programme BLAST und Gapped BLAST können die Standardparameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden, siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Beispielsweise wurden die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit der Standard-Blastn-Matrix 1-3 mit folgendermaßen gesetzten Gap Penalties verwendet: Existance 5 und Extension 2. Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen wurden mit folgenden Standardeinstellungen geblastet: die Blosum62-Matrix mit Gap Penalties, die bei Existance 11 und Extension 1 gesetzt waren.
  • Ein weiteres bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen eingesetzt wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller, CABIOS (1989).
  • Ein solcher Algorithmus ist in das Programm ALIGN (Version 2.0) integriert, das zum GCG Sequenz Alignment-Softwarepaket gehört. Bei Anwendung des Programms ALIGN zum Vergleich von Aminosäuresequenzen kann eine PAM 120-Gewichtsresttabelle, ein Gap-Längen-Penalty von 12 und ein Gap Penalty von 4 verwendet werden. Bei Verwendung mehrerer Programme zum Vergleich von Sequenzen wird das Programm, das ein optimales Alignment (d. h. die höchste prozentuale Übereinstimmung zwischen den beiden Sequenzen) ergibt, für Vergleichszwecke verwendet.
  • Ein „natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül bezieht sich gemäß der vorliegenden Verwendung auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer in der Natur vorkommenden Nukleotidsequenz (das z. B. ein natürliches Protein codiert).
  • Gemäß der vorliegenden Verwendung umfasst eine „gegenläufige" Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer „gleichläufigen" Nukleinsäure ist, welche ein Protein codiert, z. B. komplementär zum Codierungsstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls, komplementär zu einer mRNA-Sequenz oder komplementär zum Codierungsstrang eines Gens. Daher kann eine gegenläufige Nukleinsäure eine Wasserstoffbindung mit einer gleichläufigen Nukleinsäure eingehen.
  • Der Begriff „Codierungsregion" bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf Regionen einer Nukleotidsequenz, die Codone umfassen, welche zu Aminosäureresten translatiert werden, während sich der Begriff „Nicht-Codierungsregion" auf Regionen einer Nukleotidsequenz bezieht, die nicht zu Aminosäuren translatiert werden (z. B. 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
  • So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft ist, zu transportieren. Eine Art eines Vektors ist ein „Plasmid", was sich auf einen kreisförmigen, doppelsträngigen DNA-Loop bezieht, in den zusätzliche DNA-Segmente eingebunden werden können. Eine andere Art eines Vektors ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom eingebunden werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle befähigt, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden bei Einführung in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem sind gewisse Vektoren in der Lage, die Expression von Genen zu steuern, mit denen sie operabel verknüpft sind. Solche Vektoren werden hier als „rekombinante Expressionsvektoren" oder einfach als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen für rekombinante DNA-Techniken nutzbare Expressionsvektoren häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung sind „Plasmid" und „Vektor" austauschbar verwendbar, da ein Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), umfassen, die entsprechende Funktionen erfüllen.
  • So wie er hier verwendet wird, soll sich der Begriff „Wirtszelle" auf eine Zelle beziehen, in die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wie z. B. ein rekombinanter Expressionsvektor gemäß der Erfindung, eingeführt wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hier austauschbar verwendet. Es versteht sich, dass diese Begriffe sich nicht nur auf die jeweilige Subjektzelle, sondern auch auf die Nachkommen oder die möglichen Nachkommen einer solchen Zelle, beziehen. Da in nachfolgenden Generationen durch Mutation oder Umwelteinflüsse gewisse Modifikationen auftreten können, müssen diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Mutterzelle identisch sein, fallen aber dennoch unter den Umfang des Begriffes in seiner vorliegenden Verwendung.
  • Gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich der Begriff „transgenes Lebewesen" auf ein nicht-menschliches Lebewesen, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter eine Maus, wobei eine oder mehrere der Zellen des Lebewesens ein „Transgen" enthält (enthalten). Der Begriff „Transgen" bezieht sich auf exogene DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Lebewesen entwickelt und die im Genom des reifen Lebewesens bleibt, beispielsweise zur Steuerung der Expression eines codierten Genproduktes in einem oder mehreren Zelltyp(en) oder Gewebe(n) des transgenen Lebewesens.
  • So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „homologes, rekombinantes Lebewesen" auf einen Typ eines transgenen, nicht-menschlichen Lebewesens, vorzugsweise eines Säugetiers, noch bevorzugter einer Maus, in der ein endogenes Gen durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül, das in eine Zelle des Lebewesens, z. B. eine Embryonenzelle, eingeführt wurde, vor der Entwicklung des Lebewesens verändert wurde.
  • Gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich ein „isoliertes Protein" auf ein Protein, das im wesentlichen frei von anderen Proteinen, Zellmaterial und Kulturmedium ist, wenn es aus Zellen isoliert oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Präkursoren oder anderen chemischen Substanzen ist, wenn es chemisch synthetisiert wird.
  • So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „Antikörper" Immunglobulin-Moleküle und immunologisch aktive Abschnitte von Immunglobulin-Molekülen enthalten, d. h. Moleküle, die eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die an ein Antigen, wie z. B. Fab- und F(ab')2-Fragmente, spezifisch bindet (damit immunreagiert). Die Begriffe „monoklonale Antikörper" und „monoklonale Antikörperzusammensetzung" beziehen sich, so wie sie hier verwendet werden, auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art einer Antigen-Bindungsstelle enthalten, die zu einer Immunreaktion mit einem bestimmten Epitop eines Antigens befähigt ist, während sich die Begriffe „polyklonale Antikörper" und „polyklonale Antikörperzusammensetzung" auf eine Population von Antikörpermolekülen beziehen, die mehrere Arten von Antigen-Bindungsstellen aufweisen, welche zur Interaktion mit einem bestimmten Antigen befähigt sind. Monoklonale Antikörperzusammensetzungen zeigen daher typischerweise eine Einzelbindungsaffinität gegenüber einem bestimmten Antigen, mit dem sie eine Immunreaktion eingehen.
  • Es gibt eine bekannte und klare Entsprechung zwischen der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins und den Nukleotidsequenzen, die das Protein codieren können, wie dies durch den genetischen Code (siehe unten) definiert ist. Ebenso gibt es eine bekannte und klare Entsprechung zwischen der Nukleotidsequenz eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls und der Aminosäuresequenz, die von diesem Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie dies durch den genetischen Code definiert ist. GENETISCHER CODE
    Alanin (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
    Arginin (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG,
    CGT
    Asparagin (Asn, N) AAC, AAT
    Asparaginsäure (Asp, D) GAC, GAT
    Cystein (Cys, C) TGC, TGT
    Glutaminsäure (Glu, E) GAA, GAG
    Glutamin (Gln, Q) CAA, CAG
    Glycin (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
    Histidin (His, H) CAC, CAT
    Isoleucin (Ile, I) ATA, ATC, ATT
    Leucin (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
    Lysin (Lys, K) AAA, AAG
    Methionin (Met, M) ATG
    Phenylalanin (Phe, F) TTC, TTT
    Prolin (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
    Serin (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
    Threonin (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
    Tryptophan (Trp, W) TGG
    Tyrosin (Tyr, Y) TAC, TAT
    Valin (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
    Terminationssignal (Ende) TAA, TAG, TGA
  • Ein wichtiges und hinlänglich bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz, wodurch für die meisten Aminosäuren, die zur Herstellung von Proteinen verwendet werden, mehr als ein codierendes Nukleotid-Triplett eingesetzt werden kann (siehe oben). Daher kann eine Reihe unterschiedlicher Nukleotidsequenzen eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren. Solche Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent betrachtet, da sie zur Herstellung der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen führen (obwohl bestimmte Organismen manche Sequenzen effizienter translatieren können als andere). Zudem ist gelegentlich eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in einer bestimmten Nukleotidsequenz vorzufinden. Solche Methylierungen beeinträchtigen die Codierungsbeziehung zwischen dem Trinukleotid-Codon und der entsprechenden Aminosäure nicht.
  • Angesichts der vorstehenden Ausführungen kann die Nukleotidsequenz eines DNA- oder RNA-Moleküls, das ein erfindungsgemäßes T-bet-Protein (oder einen Teil davon) codiert, dazu verwendet werden, die T-bet-Aminosäuresequenz herzuleiten, wobei der genetische Code zur Translation des DNA- oder RNA-Moleküls zu einer Aminosäuresequenz verwendet wird. Ebenso lassen sich für eine beliebige T-bet-Aminosäuresequenz entsprechende Nukleotidsequenzen, die das T-bet-Protein codieren können, aus dem genetischen Code herleiten (der aufgrund seiner Redundanz mehrere Nukleinsäuresequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz erzeugt). Somit sollte die vorliegende Beschreibung und/oder Offenbarung einer T-bet-Nukleotidsequenz so verstanden werden, dass sie auch die Beschreibung und/oder Offenbarung der von der Nukleotidsequenz codierten Aminosäuresequenz beinhaltet.
  • Gleichermaßen ist die vorliegende Beschreibung und/oder Offenbarung einer T-bet-Aminosäuresequenz so zu verstehen, dass sie auch eine Beschreibung und/oder Offenbarung aller möglichen Nukleotidsequenzen beinhaltet, welche die Aminosäuresequenz codieren können.
  • Brachyurie oder T ist das Gründungsmitglied einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine DNA-Bindungsdomäne mit 200 Aminosäuren gemeinsam ist, die als T-Box bezeichnet wird (besprochen in: Smith, 1997; Papaioannou. 1997; Meisler, 1997). Die Brachyurie (Griechisch für „kurzer Schwanz")-Mutation wurde erstmals 1927 für heterozygote, mutierte Lebewesen beschrieben, die einen kurzen, leicht gecknickten Schwanz hatten (Herrmann et al., 1990). Die aminoterminale Hälfte (Aminosäuren 1-229) des Brachyurie-T-Box-Proteins enthält eine konservierte Domäne, die als T-Box bekannt ist und erwiesenermaßen eine sequenzenpezifische DNA-Bindungsaktivität zeigt (Kispert, A. & Herrmann, B. G. 1993. EMBO J. 12:3211; Papapetrou, C., et al. 1997. FEBS Lett. 409:201; Kispert. A., et al. 1995. EMBO J. 14:4763). Die C-terminale Hälfte enthält zwei Paare von Transaktivierungs- und Unterdrückungsdomänen. Die Sequenzähnlichkeit zwischen der T-Box-Region bei orthologen Spezien kann bis zu 99% betragen und liegt bei 40-70% zwischen nicht-orthologen Genen. Die T-Box-Domäne wurde kürzlich mit DNA cokristallisiert und zeigt eine neue sequenzenpezifische DNA-Erkennungsarchitektur, bei der das Protein sowohl in den Major Grooves als auch in den Minor Grooves in Kontakt mit der DNA tritt (Müller, C. W. & Herrmann, B. G. 1997. Nature 389,884).
  • Eine Hefe-Ein-Hybrid-Vorgehensweise wurde verwendet, um Th-1-spezifische Transkriptionsfaktoren zu identifizieren. Hefezellen wurden dazu gebracht, ein IL-2-Promoter-Reportergen-Konstrukt zu exprimieren, und wurden mit einer cDNA-Bank transformiert, die aus einem Anti-CD3-aktivierten Th1-Zellklon hergestellt worden war. Eine Untersuchung des IL-2-Promoters zeigt einen hervorragende T-Box-Bindungsstelle bei –240 bis –220, nur 5' von der NFκB-Stelle. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben, wurde T-bet in einem Hefe-Ein-Hybrid-Screening-Assay aufgrund seiner Fähigkeit, an den IL-2-Promoter zu binden, isoliert.
  • Die Nukleotidsequenz, welche Maus-T-bet codiert, ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt. Maus-T-bet ist ein 530 Aminosäuren aufweisendes Protein mit einer 190 Aminosäuren langen T-Box-Domäne, die sich bei den Resten 136-326 befindet. Die Aminosäuresequenz von Maus-T-bet ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Nachdem die Maus-T-bet-Sequenz wie hier beschrieben kloniert wurde, war es möglich, die Sequenz des menschlichen Orthologs von T-bet aus Nukleinsäurefragmenten zusammen zu stellen, von denen vorher nicht bekannt war, dass sie irgendein bekanntes Protein codieren. Die Nukleotidsequenz von menschlichem T-bet ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Menschliches T-bet ist ein 535 Aminosäuren aufweisendes Protein mit einer 190 Aminosäuren langen T-Box-Domäne, die sich bei den Resten 138-327 befindet. Das menschliche T-bet-Gen kartiert an Chromosom 17. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen zweier Mitglieder (Mensch und Maus) der T-bet-Familie der Proteine sind in 1 und in SEQ ID No: 1-4 gezeigt.
  • Die erfindungsgemäßen T-bet-Proteine weisen eine Homologie zu T-Box-Proteinen auf. Es gibt nun acht T-Box-Gene in der Maus, die keine Brachyurie aufweisen. Dazu gehören Tbx 1-6, T-Brain-1 (Tbr-1) und nun T-bet, jeweils mit einem bestimmten und üblicherweise komplexen Expressionsmuster. Beispielsweise ist die T-Brain-1-Expression weitgehend auf bestimmte Domänen innerhalb des Zerebralcortex beschränkt (Bulfone. A., et al. 1995. Neuron 15, 63). T-bet ähnelt der Sequenz nach am meisten Tbr-1. Von der T-Box abgesehen, weisen die erfindungsgemäßen T-bet-Proteine keine Ähnlichkeit mit anderen T-Box-Proteinen auf.
  • T-bet ist ein T-Box-Protein, das nur in T-Zellen exprimiert wird und von der Sequenz her Tbr-1 am ähnlichsten ist. Auch andere Spezien exprimieren Brachyurie-artige Gene. Zu diesen Wirbeltier-Spezien gehören Krallenfrosch, Zebrafisch, Huhn und Mensch (Rao, 1994; Horb und Thomsen, 1997; Conlon et al., 1996; Ryan et al., 1996; Schulte-Merker et al., 1994; Edwards et al., 1996; Morrison et al., 1996: Law et al., 1995; Cambell et al., 1998) sowie entferntere Spezien, wie Amphioxus, Seescheide, Stachelschirmling, Caenorhabditis elegans, Drosophila und andere Insekten (Holland et al., 1995). Diese Gene sind sowohl hinsichtlich ihrer Sequenz als auch ihres Expressionsmusters konserviert.
  • T-bet ist insofern einzigartig, als es das einzige Tyrosin-phosphorylierte T-Box-Protein ist. Es gibt zwei Konsen-Tyrosinphosphorylierungsstellen bei aa328-336 und 526-534 für menschliches T-bet sowie bei 327-335 und 521-529 für Maus-T-bet. Auch eine Kernlokalisierungssequenz ist bei den Aminosäuren 498-501 von menschlichem T-bet und 493-496 von Maus-T-bet vorhanden. Bei Kartierungsversuchen werden zwei Transaktivierungsdomänen, 5' und 3', der T-Box-Domäne, lokalisiert. Die hier gezeigten Daten demonstrieren, dass T-Bet an einer Konsens-T-Box-Stelle (die durch Zielortselektion in vitro als 5'-GGGAATTTCACACCTAGGTGTGAAATTCCC-3' definiert ist) und an einer T-Box-Stelle im IL-2-Promoter bindet. T-bet wird nur im Thymus und im peripheren Lymphsystem exprimiert. In der Peripherie wird T-bet nur in Th1-Zellen exprimiert, wo es sowohl als Reaktion auf eine TcR-Stimulierung als auch auf IL-12 induziert wird. Im Thymus sind die T-bet-Mengen in den DN- und Rag2-/-Thymocyten am größten.
  • Diese Daten zeigen, dass die selektive Expression von T-bet, einem neuen T-Box-Familienmitglied, für die gewebespezifische IFN-γ-Expression. verantwortlich ist. T-bet wird nur in Th1-Zellen, und nicht in Th2-Zellen, exprimiert und in ersteren nach Übertragung von Signalen durch den T-Zellrezeptor induziert. Die Expression von T-bet korreliert mit der IFN-γ-Expression in Th1-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen, und T-bet ist ein potenter Transaktivator des IFN-γ-Gens. Am überzeugendsten ist, dass die retroviral vermittelte Transduktion von Thp-, Th1- und polarisierten Th2- und Tc2-Zellen mit T-bet zu einer beeindruckenden Induktion der IFN-γ-Expression führt. Dies geht mit einer Unterdrückung sowohl der IL-2- als auch der IL-4-Produktion einher. Somit geht die Funktion von T-bet über die einfache Steuerung der IFN-γ-Gentranskription hinaus. T-bet wandelt sowohl polarisierte Effektor-Th2-Zellen als auch polarisierte Tc2-Zellen jeweils in die entsprechenden Th1- und Tc1-Subsets um. Zusammen genommen zeigen diese Daten, dass T-bet für das genetische Programm verantwortlich ist, das die Entwicklung der Th1-Linie aus naiven Thp-Zellen initiiert und sowohl durch Initiieren genetischer Th1-Programme als auch durch Unterdrücken der entsprechenden Programme in Th2-Zellen wirkt.
  • Verschiedene Aspekte der Erfindung werden in den folgenden Unterabschnitten in weiteren Einzelheiten beschrieben:
  • 1. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
  • Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte Nukleinsäuremoleküle, die T-bet codieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Nukleotidsequenz. Bei einer anderen Ausführungsform weist ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mindestens etwa 700 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 1 oder mindestens etwa 500 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 3 auf. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mindestens etwa 800, mindestens etwa 1000, mindestens etwa 1200, mindestens etwa 1400 oder mindestens etwa 1600 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 1. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül mindestens etwa 600, mindestens etwa 800, mindestens etwa 1000, mindestens etwa 1200 oder mindestens etwa 1400 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 3.
  • Bei anderen Ausführungsformen weist das Nukleinsäuremolekül mindestens 70% Übereinstimmung, bevorzugter 80% Übereinstimmung und noch bevorzugter 90% Übereinstimmung mit einem Nukleinsäuremolekül auf, das mindestens etwa 700, mindestens etwa 800, mindestens etwa 1000, mindestens etwa 1200, mindestens etwa 1400 oder mindestens etwa 1600 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 1 umfasst. Bei anderen Ausführungsformen weist das Nukleinsäuremolekül mindestens 70% Übereinstimmung, bevorzugter 80% Übereinstimmung und noch bevorzugter 90% Nukleotidübereinstimmung mit einem Nukleinsäuremolekül auf, das mindestens etwa 600, mindestens etwa 800, mindestens etwa 1000, mindestens etwa 1200, oder mindestens etwa 1400 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 3 umfasst.
  • Nukleinsäuremoleküle, die sich aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes von SEQ ID NO: 1 oder 3 unterscheiden und somit das gleiche T-bet-Protein codieren, das auch von SEQ ID NO: 1 und 3 codiert wird, sind von der Erfindung erfasst. Daher hat gemäß einer anderen Ausführungsform ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 gezeigten Aminosäuresequenz codiert.
  • Zudem können Nukleinsäuremoleküle, die T-bet-Proteine codieren, aus anderen Quellen mit üblichen molekularbiologischen Verfahren isoliert und deren Sequenzinformation hier bereitgestellt werden. Beispielsweise kann eine T-bet-DNA aus einer menschlichen Genom-DNA-Bank isoliert werden, wobei SEQ ID NO: 1 oder 3 ganz oder teilweise als Hybridisierungssonde und übliche Hybridisierungsverfahren verwendet werden (wie sie z. B. in Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben sind). Zudem kann ein Nukleinsäuremolekül, das ein T-bet-Gen vollständig oder teilweise umfasst, durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern isoliert werden, die ausgehend von der Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 entwickelt wurden. Beispielsweise kann mRNA aus Zellen (z. B. durch das Guanidin-Thiocyanat-Gewinnungsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) isoliert und cDNA mittels reverser Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotid-Primer für die PCR-Amplifikation können ausgehend von der in SEQ ID NO: 1 oder 3 gezeigten Nukleotidsequenz entwickelt werden. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ genomischer DNA als Template und von entsprechenden Oligonukleotid-Primern nach üblichen PCR-Amplifikationsverfahren amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
  • Ferner können Oligonukleotide, die einer T-bet-Nukleotidsequenz entsprechen, mit üblichen Syntheseverfahren, z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers, hergestellt werden.
  • Für den Fachmann ist ersichtlich, dass neben der T-bet-Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 und 3 gezeigt ist, DNA-Sequenz-Polymorphismen, die zu geringfügigen Veränderungen der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen von T-bet führen, innerhalb einer Population existieren können. Ein derartiger genetischer Polymorphismus im T-bet-Gen kann unter Individuen innerhalb einer Population aufgrund einer natürlichen Allelvariation existieren. Solche natürlichen Allelvariationen können typischerweise zu 1-2% Varianz in der Nukleotidsequenz eines Gens führen. Diese Nukleotidvariationen und die resultierenden Aminosäure-Polymorphismen in T-bet, die von der natürlichen Allelvariation herrühren und die funktionelle Aktivität von T-bet nicht verändern, sollen samt und sonders unter den Schutzumfang der Erfindung fallen.
  • Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten der erfindungsgemäßen T-bet-DNAs entsprechen, können aufgrund ihrer Homologie zu den hier beschriebenen T-bet-Nukleinsäuremolekülen isoliert werden, indem die menschliche DNA oder ein Teil davon als Hybridisierungssonde gemäß üblichen Hybridisierungsverfahren unter sehr stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet wird. Somit hybridisiert bei einer weiteren Ausführungsform ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül unter sehr stringenten Bedingungen an ein zweites Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 aufweist. Vorzugsweise hybridisiert ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül unter sehr stringenten Bedingungen an die Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3. Bei einer Ausführungsform ist ein solches Nukleinsäuremolekül mindestens etwa 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300, 1400, 1500 oder 1600 Nukleotide lang. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst ein solches Nukleinsäuremolekül mindestens etwa 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300, 1400, 1500 oder 1600 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 1 oder mindestens etwa 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 oder 1500 benachbarte Nukleotide der SEQ ID NO: 3. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül entspricht bevorzugt einer natürlich vorkommenden Allelvariante eines T-bet-Nukleinsäuremoleküls.
  • Für den Fachmann ist ersichtlich, dass neben natürlich vorkommenden Allelvarianten der T-bet-Sequenz, die in der Population existieren können, geringfügige Änderungen durch Mutation in die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 eingebracht werden können, was zu Änderungen der Aminosäuresequenz des codierten Proteins führt, ohne die funktionelle Aktivität des T-bet-Proteins zu verändern. Beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht-essentiellen" Aminosäureresten führen, an der Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 vorgenommen werden. Ein „nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der gegenüber der Wildtyp-Sequenz von T-bet (z. B. der Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3) verändert werden kann, ohne die funktionelle Aktivität von T-bet zu verändern, wie z. B. dessen Fähigkeit, mit DNA zu interagieren, oder dessen Fähigkeit, die Transkription aus einem IFN-gamma-Promoter zu verstärken, während ein „essentieller" Aminosäurerest für die funktionelle Aktivität erforderlich ist.
  • Daher bezieht sich ein weiterer Aspekt der Erfindung auf Nukleinsäuremoleküle, die T-bet-Proteine codieren, welche Änderungen der Aminosäurereste aufweisen, die für die T-bet-Aktivität nicht essentiell sind. Diese T-bet-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4, behalten jedoch die T-bet-Aktivität bei. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine nicht-natürliche Variante eines T-bet-Proteins codiert, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 so erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Mutationen können mittels üblicher Verfahren, wie der gerichteten Mutagenese und der PCR-vermittelten Mutagenese, in SEQ ID NO: 1 oder 3 eingebracht werden. Vorzugsweie werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren nicht-essentiellen Aminosäureresten vorgenommen. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Stand der Technik definiert, einschließlich basischer Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladener polarer Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolarer Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigter Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischer Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Dabei wird ein nicht-essentieller Aminosäurerest in T-bet vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt.
  • Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform Mutationen entlang der gesamten T-bet-Codierungssequenz oder eines Teils davon zufällig eingebracht werden, z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf ihre Fähigkeit zur Bindung an DNA und/oder zur Aktivierung der Transkription untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, welche die funktionelle Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese kann das codierte, mutierte T-bet-Protein in einer Wirtszelle rekombinant exprimiert und die funktionelle Aktivität des mutierten Proteins mit dem Fachmann zur Verfügung stehenden Assays zur Bestimmung der T-bet-Aktivität bestimmt werden (z. B. durch Bestimmung der Fähigkeit des Proteins, an ein T-Box-Bindungselement zu binden, das in der DNA vorhanden ist, oder durch Bestimmung der Fähigkeit des Proteins, einen Th1- oder Th2-Phänotyp in einer T-Zelle zu modulieren).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte Nukleinsäuremoleküle, die gegenläufig zum Codierungsstrang einer (eines) T-bet-mRNA oder -Gens sind. Eine gegenläufige Nukleinsäure gemäß der Erfindung kann zu einem ganzen T-bet-Codierungsstrang oder nur zu einem Teil davon komplementär sein. Bei einer Ausführungsform ist ein gegenläufiges Nukleinsäuremolekül gegenläufig zu einer Codierungsregion des Codierungsstrangs einer T-bet codierenden Nukleotidsequenz, die ausschließlich in der T-bet-Familie der Proteine oder ausschließlich in einer T-bet-Sequenz einer bestimmten Spezies vorliegt. Bei einer anderen Ausführungsform ist das gegenläufige Nukleinsäuremolekül gegenläufig zu einer nicht-codierenden Region des Codierungsstrangs einer T-bet codierenden Nukleotidsequenz, die ausschließlich in der T-bet-Familie der Proteine oder ausschließlich in einer T-bet-Sequenz einer bestimmten Spezies vorliegt. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein gegenläufiges Molekül gemäß der Erfindung mindestens etwa 700 benachbarte Nukleotide des Nicht-Codierungsstrangs der SEQ ID NO: 1, bevorzugter mindestens 800, 1000, 1200, 1400 oder 1600 benachbarte Nukleotide des Nicht-Codierungsstrangs der SEQ ID NO: 1 oder mindestens etwa 500 benachbarte Nukleotide des Nicht-Codierungsstrangs der SEQ ID NO: 3, noch bevorzugter mindestens 600, 800, 1000, 1200 oder 1400 benachbarte Nukleotide des Nicht-Codierungsstrangs der SEQ ID NO: 3.
  • Angesichts der hier offenbarten Codierungsstrangsequenzen, die T-bet codieren, (z. B. SEQ ID NO: 1 und 3) können gegenläufige Nukleinsäuren gemäß der Erfindung nach den Regeln der Basenpaarung von Watson und Crick gestaltet werden. Das gegenläufige Nukleinsäuremolekül kann komplementär zur gesamten Codierungsregion der T-bet-mRNA oder alternativ dazu ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Codierungs- oder Nicht-Codierungsregion der T-bet-mRNA gegenläufig ist. Beispielsweise kann das gegenläufige Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, welche die Translationsanfangsstelle der T-bet-mRNA umgibt. Ein gegenläufiges Oligonukleotid kann beispielsweise etwa 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine gegenläufige Nukleinsäure gemäß der Erfindung kann durch chemische Synthese und enzymatische Verknüpfungsreaktionen mittels dem Fachmann bekannter Verfahren konstruiert werden. Beispielsweise kann eine gegenläufige Nukleinsäure (z. B. ein gegenläufiges Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide chemisch synthetisiert werden, oder es können verschiedentlich modifizierte Nukleotide, die zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität der zwischen den gegenläufigen und den gleichgerichteten Nukleinsäuren gebildeten Duplex ausgelegt sind, z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide, verwendet werden. Alternativ kann die gegenläufige Nukleinsäure biologisch, unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäure in gegenläufiger Ausrichtung subkloniert wurde (d. h. von der eingesetzten Nukleinsäure transkribierte RNA wird eine gegenläufige Ausrichtung zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure haben, wie dies im nachfolgenden Unterabschnitt weiter beschrieben ist).
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist eine gegenläufige Nukleinsäure gemäß der Erfindung ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die in der Lage sind, eine einsträngige Nukleinsäure, wie z. B. eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, abzuspalten. Ein Ribozym mit Spezifität für eine T-bet-codierende Nukleinsäure kann ausgehend von der Nukleotidsequenz eines hier offenbarten T-bet-Gens gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, bei dem die Basissequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Basissequenz ist, die in einer T-bet-codierenden mRNA abgespalten werden soll, siehe z. B. Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071, und Cech et al., US-Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann T-bet-mRNA dazu verwendet werden, eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen, siehe beispielsweise Bartel, D. und Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411-1418.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte Nukleinsäuremoleküle, die T-bet-Fusionsproteine codieren. Diese Nukleinsäuremoleküle, die mindestens eine erste, ein T-bet-Protein, -Polypeptid oder -Peptid codierende Nukleotidsequenz aufweisen, die mit einer zweiten ein T-bet-Protein, -Polypeptid oder -Peptid codierenden Nukleotidsequenz operabel verknüpft ist, können mit üblichen rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden. T-bet-Fusionsproteine sind nachfolgend im Unterabschnitt III in weiteren Einzelheiten beschrieben.
  • II. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Vektoren, vorzugsweise rekombinante Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, welche T-bet (oder einen Teil davon) codiert. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeigneten Form, d.h., die rekombinanten Expressionsvektoren enthalten eine oder mehrere Regulierungssequenzen, die ausgehend von den zur Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden und mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist (sind). In einem rekombinanten Expressionsvektor soll „operabel verknüpft" bedeuten, dass die interessierende Nukleotidsequenz mit der (den) Regulierungssequenzen) in einer Weise verknüpft ist, die eine Expression der Nukleotidsequenz (z. B. in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle gestattet, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff „Regulierungssequenz" umfasst Promoter, Enhancer und andere Expressionssteuerelemente (z. B. Polyadenylierungssignale). Solche Regulierungssequenzen sind beispielsweise in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben. Zu den Regulierungssequenzen gehören diejenigen, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, und diejenigen, welche die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z. B. gewebespezifische Regulierungssequenzen). Für den Fachmann ist ersichtlich, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsgrad des gewünschten Proteins usw., abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, herzustellen, die von Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden (z. B. T-bet-Proteine, mutierte Formen der T-bet-Proteine, T-bet-Fusionsproteine und dergleichen).
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren gemäß der Erfindung können zur Expression von T-bet-Protein in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ausgelegt sein. Beispielsweise kann T-bet in Bakterienzellen, wie E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen sind in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), weiter erörtert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. unter Verwendung von T7-Promoter-Regulierungssequenzen und T7-Polymerase.
  • Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt in E. coli meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promoter enthalten, welche die Expression von Fusions- oder von Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe von Aminosäuren zu einem Protein hinzu, das darin codiert wird, üblicherweise am Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren können einem oder mehreren Zwecken dienen: 1) Erhöhung der Expression von rekombinantem Protein; 2) Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; 3) Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Aktivität als Ligand bei einer Affinitätsreinigung; 4) Bereitstellung einer Epitop-Markierung zur Unterstützung der Detektion und/oder Reinigung des Proteins; und/oder 5) Bereitstellung eines Markers zur Unterstützung der Detektion des Proteins (z. B. eines Farbmarkers unter Verwendung von β-Galaktosidasefunktionen). Häufig wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltungsstelle am Übergang zwischen der Fusionseinheit und dem rekombinanten Protein eingeführt, um die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit im Anschluß an die Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre Kognaten-Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith. D. B. und Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly. MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase (GST), das Maltose E-Bindungsprotein oder das Protein A an das rekombinante Ziel-Protein fusionieren. Rekombinante Proteine können auch in eukaryotischen Zellen als Fusionsproteine für die gleichen Zwecke, wie oben diskutiert, exprimiert werden.
  • Beispiele für geeignete, induzierbare nicht-fusionierende E. coli-Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Ziel-Genexpression aus dem pTrc-Vektor stützt sich auf die Wirts-RNA-Polymerasetranskription aus einem hybriden trp-lac-FusionsPromoter. Die Ziel-Genexpression aus dem pET 11d-Vektor stützt sich auf eine Transkription aus einem T7 gn 10-lac-Fusionspromoter, die durch eine co-exprimierte virale RNA-Ppolymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) eines residenten λ-Prophagen, in dem ein T7 gn1-Gen aufgenommen ist, unter der Transkriptionssteuerung des lacUV 5-Promoters bereitgestellt.
  • Eine Strategie zur Maximierung der rekombinanten Proteinexpression in E. coli besteht darin, das Protein in einem Wirtsbakterium mit beeinträchtigter Fähigkeit zum proteolytischen Abspalten des rekombinanten Proteins zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128). Eine andere Strategie ist, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor einzusetzenden Nukleinsäure so zu verändern, dass die Einzelcodons für jede Aminosäure die sind, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118). Eine solche Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann mit üblichen DNA-Syntheseverfahren durchgeführt werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist der T-bet-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerivisae umfassen pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Alternativ kann T-bet in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Zu Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von in Insektenzellen (z. B. Sf 9-Zellen) kultivierten Proteinen verfügbar sind, zählen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow, V. A., und Summers, M. D., (1989) Virology 170:31-39).
  • Bei einer weiteren Ausführungsform wiederum wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektors in Säugetierzellen exprimiert. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pMex-Neol, pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Bei Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale Regulierungselemente bereitgestellt. Beispielsweise werden üblicherweise verwendete Promoter aus Polyom, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian-Virus 40 hergeleitet.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (z. B. werden gewebespezifische Regulierungselemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische Regulierungselemente sind dem Fachmann bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promoter umfassen Lymphoid-spezifische Promoter (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promoter von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobuline (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33:741-748), den Albumin-Promoter (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), neuronenspezifische Promoter (z. B. den Neurofilament-Promoter; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), Pankreas-spezifische Promoter (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) und Brustdrüsen-spezifische Promoter (z. B. Milchserum-Promoter; US-Patent Nr. 4,873,316 und europäische Patentveröffentlichung Nr. 264 166). Entwicklungsregulierte Promoter sind ebenfalls mit eingeschlossen, z. B. die Maus-Hox-Promoter (Kessel und Gruss (1990) Science 249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promoter (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
  • Zudem sind dem Fachmann induzierbare Regulierungssysteme zur Verwendung in Säugetierzellen bekannt, wie beispielsweise Systeme, in denen die Genexpression durch Schwermetallionen (siehe z. B. Mayo et al. (1982) Cell 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), Hitzeschock (siehe z. B. Nouer et al. (1991) in Heat Shock Response, Hrsg. Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, S. 167-220), Hormone (siehe z. B. Lee et al. (1981) Nature 294:228-232; Hynes et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel & Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604; und PCT-Veröffentlichungsnr. WO 93/23431), FK506-verwandte Moleküle (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungsnr. WO 94/18317) oder Tetrazykline reguliert wird (Gossen, M., und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; PCT-Veröffentlichungsnr. WO 94/29442; und PCT-Veröffentlichungsnr. WO 96/01313). Entsprechend stellt eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, in dem T-bet-DNA mit einem induzierbaren eukaryotischen Promoter operabel verknüpft ist, wodurch eine induzierbare Expression von T-bet-Protein in eukaryotischen Zellen ermöglicht wird.
  • Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, das in den Expressionsvektor in gegenläufiger Ausrichtung kloniert ist. Dabei ist das DNA-Molekül mit einer Regulierungssequenz in einer Weise operabel verknüpft, welche die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls gestattet, das gegenläufig zur T-bet-mRNA ist. Es können Regulierungssequenzen, die mit einer Nukleinsäure operabel verknüpft sind, welche in gegenläufiger Ausrichtung kloniert ist, gewählt werden, welche die kontinuierliche Expression des gegenläufigen RNA-Moleküls in verschiedenen Zelltypen steuern, z. B. virale Promoter und/oder Enhancer, oder es können Regulierungssequenzen gewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression gegenläufiger RNA steuern. Der gegenläufige Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines abgeschwächten Virus vorliegen, in dem gegenläufige Nukleinsäuren unter der Steuerung einer hochwirksamen Regulierungsregion, deren Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt wird, produziert werden. Eine Diskussion der Regulierung der Genexpression mittels gegenläufiger Gene findet sich in Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Nr.1 (1) 1986.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf rekombinante Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer Vektor, vorzugsweise ein rekombinanter Expressionsvektor, eingeführt wurde. Eine Wirtszelle kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann das T-bet-Protein in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie z. B. Chinesische Hamster Eizellen (CHO) oder COS Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt. Vektor-DNA kann mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionsverfahren in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingeführt werden. So wie sie hier verwendet werden, sollen sich die Begriffe „Transformation" und "Transfektion" auf verschiedene, im Stand der Technik anerkannte Verfahren zur Einführung einer fremden Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, wie Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation beziehen. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen finden sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) und anderen Laborhandbüchern.
  • Zur stabilen Transfektion von Säugetierzellen ist es bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und Transfektionsverfahren nur eine kleine Zellfraktion die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuwählen, wird allgemein ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen diejenigen, die Resistenz gegen Wirkstoffe verleihen, wie z. B. G418, Hygromycin und Methotrexat. Eine Nukleinsäure, die einen wählbaren Marker codiert, kann auf demselben Vektor wie die T-bet codierende Nukleinsäure, oder auf einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die stabil mit der eingeführten Nukleinsäure transfiziert sind, können durch Wirkstoffselektion identifiziert werden (z. B. überleben Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, während die anderen Zellen sterben).
  • Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie z. B. eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann dazu verwendet werden, ein T-bet-Protein zu produzieren (d.h. zu exprimieren). Daher stellt die Erfindung ferner Verfahren zur Herstellung von T-bet-Protein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der T-bet codiert, eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, bis T-bet produziert wird. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren von T-bet aus dem Medium oder der Wirtszelle. In seiner nativen Form ist das T-bet-Protein ein intrazelluläres Protein, und daher kann ein rekombinantes T-bet-Protein intrazellulär in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert und dann aus der Wirtszelle, z. B. durch Lyse der Wirtszelle und Gewinnung des rekombinanten T-bet-Proteins aus dem Lysat, isoliert werden. Alternativ kann ein rekombinantes T-bet-Protein als extrazelluläres Protein hergestellt werden, indem eine heterologe Signalsequenz operabel mit dem Aminoterminus des Proteins verknüpft wird, so dass das Protein aus den Wirtszellen sezerniert wird. In diesem Fall kann ein rekombinantes T-bet-Protein aus dem Kulturmedium gewonnen werden, in dem die Zellen kultiviert werden.
  • Bestimmte erfindungsgemäße Wirtszellen können auch zur Herstellung nicht-menschlicher, transgener Lebewesen verwendet werden. Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße Wirtszelle eine befruchtete Eizelle oder eine Embryonenstammzelle, in die T-bet-codierende Sequenzen eingeführt wurden. Diese Wirtszellen können dann dazu verwendet werden, nicht-menschliche, transgene Lebewesen, in deren Genom exogene T-bet-Sequenzen eingeführt wurden, oder homologe, rekombinante Lebewesen zu schaffen, in denen endogene T-bet-Sequenzen verändert wurden. Solche Lebewesen sind zum Studium der Funktion und/oder Aktivität von T-bet und zum Identifizieren und/oder Bewerten von Modulatoren der T-bet-Aktivität brauchbar. Daher bezieht sich ein anderer Aspekt der Erfindung auf nicht- menschliche, transgene Lebewesen, die Zellen enthalten, die ein Transgen tragen, welches ein T-bet-Protein oder einen Teil eines T-bet-Proteins codiert. Gemäß einer untergeordneten Ausführungsform der erfindungsgemäßen transgenen Lebewesen verändert das Transgen ein endogenes Gen, das ein endogenes T-bet-Protein codiert (z. B. homologe, rekombinante Lebewesen, in denen das endogene T-bet-Gen funktionell gestört oder „ausgeschaltet" oder die Nukleotidsequenz des endogenen T-bet-Gens mutiert ist oder die Transkriptionsregulierungsregion des endogenen T-bet-Gens verändert wurde).
  • Ein erfindungsgemäßes transgenes Lebewesen kann geschaffen werden, indem eine T-bet-codierende Nukleinsäure in die männlichen Pronuklei einer befruchteten Eizelle eingeführt wird, z. B. durch Mikroinjektion, und man die Eizelle sich in einem scheinschwangeren weiblichen Pflegelebewesen entwickeln läßt. Die T-bet-Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 kann als Transgen in das Genom eines nicht-menschlichen Lebewesens eingeführt werden. Intronsequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenfalls in dem Transgen enthalten sein, um die Wirksamkeit der Expression des Transgens zu erhöhen. (Eine) gewebespezifische Regulierungssequenzen) kann (können) mit dem T-bet-Transgen operabel verknüpft werden, um die Expression des T-bet-Proteins auf bestimmte Zellen zu richten. Verfahren zum Schaffen transgener Lebewesen mittels Embryonen-Manipulation und Mikroinjektion, insbesondere solcher Tiere wie Mäuse, sind im Stand der Technik üblich geworden und z. B. in den US-Patenten Nr. 4,736,866 und 4,870,009, beide von Leder et al., im US-Patent Nr. 4,873,191 von Wagner et al. und in Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986) beschrieben. Ähnliche Verfahren werden zur Herstellung anderer transgener Lebewesen verwendet. Ein transgenes Gründer-Lebewesen kann aufgrund des Vorliegens des T-bet-Transgens in dessen Genom und/oder der Expression von T-betm-RNA in Geweben oder Zellen der Lebewesen identifiziert werden. Ein transgenes Gründer-Lebewesen kann dann dazu verwendet werden, zusätzliche Lebewesen zu züchten, die das Transgen tragen. Darüber hinaus können transgene Lebewesen, die ein T-bet codierendes Transgen tragen, ferner mit anderen transgenen Lebewesen gekreuzt werden, die andere Transgene tragen.
  • Zur Schaffung eines homologen, rekombinanten Lebewesens wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines T-bet-Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht wurde, um dadurch das endogene T-bet-Gen zu verändern, z. B. funktionell zu stören. Bei einer Ausführungsform ist ein homologer Rekombinationsvektor so gestaltet, dass bei einer homologen Rekombination das endogene T-bet-Gen funktionell gestört wird (d. h. kein funktionelles Protein mehr codiert; auch als „Knockout"-Vektor bezeichnet).
  • Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass bei homologer Rekombination das endogene T-bet-Gen durch das T-bet-Gen ersetzt wird. Im homologen Rekombinationsvektor ist der veränderte Abschnitt des T-bet-Gens an seinen 5'- und 3'-Enden von einer zusätzlichen Nukleinsäure des T-bet-Gens flankiert, damit eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen T-bet-Gen, das vom Vektor getragen wird, und einem endogenen T-bet-Gen in einer Embryonenstammzelle erfolgen kann. Die zusätzliche flankierende T-bet-Nukleinsäure ist ausreichend lang für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen.
  • Typischerweise sind mehrere Kilobasen flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) im Vektor enthalten (siehe z. B. Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 als Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine Embryonenstammzell-Linie (z. B. durch Elektroporation) eingebracht, und es werden Zellen selektiert, in denen das eingeführte T-bet-Gen homolog mit dem endogenen T-bet-Gen rekombiniert wurde (siehe z. B. Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Lebewesens (z. B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z. B. Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, Hrsg. (IRL. Oxford, 1987) S.113-152). Dann kann ein chimärer Embryo in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Pflegelebewesen implantiert und der Embryo ausgetragen werden. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen beherbergen, können zur Züchtung von Lebewesen, bei denen alle Zellen des Lebewesens die homolog rekombinierte DNA enthalten, durch Keimlinienübertragung des Transgens verwendet werden. Verfahren zur Entwicklung homologer Rekombinationsvektoren und homologer, rekombinanter Lebewesen sind in Bradley. A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 und in den Internationalen PCT-Offenlegungsschriften Nr. WO 90/11354 von Le Mouellec et al., WO 91/01140 von Smithies et al., WO 92/0968 von Zijlstra et al und WO 93/04169 von Berns et al. näher beschrieben.
  • Zusätzlich zu den obigen Ausführungen ist für den Fachmann ersichtlich, dass andere im Stand der Technik zur homologen Rekombination bekannte Vorgehensweisen bei der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können. Enzym-gestützte, gerichtete Integrationssysteme sind dem Fachmann bekannt und können angewandt werden, um ein DNA-Molekül an einer vorbestimmten Stelle in ein zweites Ziel-DNA-Molekül zu integrieren. Beispiele für solche Enzym-gestützten Integrationssysteme umfassen das Cre-Rekombinase-Iox-Zielsystem (wie z. B. in Baubonis. W. und Sauer, B. (1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029, und Fukushige, S. und Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909, beschrieben) und das FLP-Rekombinase-FRT-Zielsystem (wie z. B. in Dang. D. T. und Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375, and Fiering, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473, beschrieben). Es können auch Tetracyclin-regulierte, induzierbare homologe Rekombinationssysteme verwendet werden, wie sie z. B. in der PCT-Offenlegungsschrift Nr. WO 94/29442 und in der PCT-Offenlegungsschrift WO 96/01313 beschrieben sind.
  • Bei einer anderen Ausführungsform können transgene Lebewesen, bei denen T-bet in allen T-Zellen exprimiert wird, z. B. unter Verwendung des CD4-Enhancers, hergestellt werden (Zheng, W-P. & Flavell, R. A. 1997. Cell 89, 587). Jüngste Arbeiten legen nahe, dass auch der CD2-Enhancer verwendet werden kann. Er ist sogar noch wirksamer beim Erzielen eines hohen Expressionsniveaus in T-Zellen; die Expression wird nicht verändert und die Transgen-Expression ist kopienzahlabhängig (Zhumabekov, T., et al. 1995. J. Immunol. Meth. 185, 133, Sharp, L. L., et al. 1997. Immunity 7, 609). Mäuse mit einem hohen T-bet-RNA-Expressionsniveau (unter Verwendung des Introns des menschlichen Wachstumshormons als Sonde zur Unterscheidung zwischen einem Transgen, das durch die T-bet-RNA gesteuert wird, und endogenem T-bet) können durch Screening entsprechender Mengen von Gründern identifiziert werden.
  • Bei einem anderen Ansatz kann ein dominantes Repressor-Transgen erzeugt werden. Beispielsweise kann ein dominantes Repressor-T-bet unter Verwendung des proximalen Ick-Enhancers (Alberola-IIa, J. et al. 1996 J Exp. Med. 184, 9), der eine Fusion von T-bet steuert, und von engrailed hergestellt werden (Taylor. D.. 1996. Genes Dev.10.2732; Li, J., Thurm. H., et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10885). Dieses Konstrukt unterdrückt insbesondere die T-bet-Transaktivierung eines multimerisierten T-bet-Reporters und beeinflusst die NFAT-abhängige Reporter-Transaktivierung nicht.
  • Alternativ können Null-Mutationen durch gezielte Mutagenese in ES-Zellen erzeugt werden (Ranger, A. et al. 1998. Nature 392, 186; Hodge. M. R., et al. 1996. Immunity 4:1., 144; Grusby. M. J.. et al. 1991. Science 253,1417; Reimold, A. M., et al. 1996. Nature 379: 262: Kaplan. M. H., 1996. Immunity: 313; Kaplan, M. H., et al. 1996. Nature 382, 174: Smiley, S. T., et al. 1997. Science 275, 77). Beispielsweise kann unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren ein genomischer T-bet-Klon aus einer Genom-Bank isoliert, die Intron-Exon-Organisation beschrieben und ein Targeting-Konstrukt im cre-Iox-Vektor (siehe nachfolgende Diskussion) erzeugt werden, welches das erste Exon und 450 bp stromaufwärtiger Promotersequenz deletieren sollte. Dieses Konstrukt kann in eine ES-Zelllinie elektroporiert werden, und doppelt wirkstoffresistente (z. B. Neomycin, Gancyclovir) Klone können mittels Southern Blot-Analyse identifiziert werden. Klone, die homologe, rekombinante Ereignisse im T-bet-Lokus tragen, können dann identifiziert und in Blastocysten injiziert werden, die aus schwangeren (Tag 3,5) BALB/c-Mäusen erhalten wurden. Dann können chimäre Mäuse produziert und mit Wildtyp-BALB/c- Mäusen gepaart werden, um eine Keimlinien-Übertragung des gestörten T-bet-Gens zu erzeugen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann eine Implantation in RAG2-defiziente Blastocysten (Chen, J., et al. 1993. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 4528) oder der Ansatz der cre-Iox-induzierbaren Deletion eingesetzt werden, um Mäuse zu entwickeln, denen T-bet nur im Immunsystem fehlt. Beispielsweise kann das Targeting-Konstrukt im cre-Iox-Vektor hergestellt werden. Das Blastocysten-Komplementierungssystem wurde verwendet, um NFATc, einen embryonalen, lethalen Phänotyp, zu untersuchen (Ranger, A. M., et al. 1998. Immunity 8:125). Dieser Ansatz erfordert eine Störung des T-bet-Gens auf beiden Chromosomen in ES-Zellen, was z. B. durch Verwendung eines mutanten Neomycin-Gens und Erhöhung der Konzentration von G418 in den ES-Kulturen, wie beschrieben (Chen, J. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 4528) oder durch Flankieren des Neo-Gens mit cre-Iox-Stellen erreicht werden kann. Um das zweite Allel zu stören, kann das Neomycin-Gen durch Transfektion des ES-Klons mit cre-Rekombinase deletiert werden, und dann kann der ES-Klon mit dem gleichen Targeting-Konstrukt transfiziert werden, um Klone mit T-bet-Deletionen auf beiden Allelen zu selektieren. Eine dritte Transfektion mit cre-Rekombinase ergibt die gewünschten doppelt defizienten ES-Zellen. Diese double-targeted ES-Zellen werden dann in RAG2-Blastocysten implantiert, und die Lymphorgane der so erzeugten chimären Mäuse werden vollständig von den übertragenen ES-Zellen kolonisiert. Dies gestattet eine Einschätzung des Effektes des Fehlens von T-bet auf Zellen des Lymphsystems, ohne andere Organsysteme zu beeinflussen, bei denen das Fehlen von T-bet lethal sein könnte.
  • Ebenso kann der konditionelle Ablationsansatz angewandt werden, bei dem das cre-Iox-System eingesetzt wird. Kurz gesagt: es wird ein Targeting-Konstrukt erzeugt, in dem Iox-Rekombinationssequenzen in Intronregionen platziert werden, welche die zu deletierenden Exons flankieren. Dieses Konstrukt wird dann in ES-Zellen transfiziert, und mutierte Mäuse werden wie zuvor erzeugt. Die resultierenden mutierte Mäuse werden dann mit Mäusen gepaart, die für die cre-Rekombinase, von einem induzierbaren Promoter gesteuert, transgen sind. Wenn cre exprimiert wird, induziert es eine Rekombination zwischen den eingeführten Iox-Stellen im T-bet-Gen, wodurch die Genfunktion wirksam gestört wird. Das Schlüsselmerkmal dieses Ansatzes besteht darin, dass eine Genstörung im erwachsenen Lebewesen durch Aktivierung der cre-Rekombinase beliebig induziert werden kann.
  • Ein gewebespezifischer Promoter kann verwendet werden, um Anormalitäten in Organen außerhalb des Immunsystems zu vermeiden. Das cre-exprimierende Transgen kann durch einen induzierbaren Promoter gesteuert werden. Derzeit werden mehrere induzierbare Systeme für cre-Iox-Rekombinationsstrategien verwendet, wobei die gebräuchlichsten das Tetracyclin- und das Ecdyson-System sind. Ein gewebespezifischer, induzierbarer Promoter kann verwendet werden, wenn bei der T-bet-Null-Maus eine embyronale Lethalität vorliegt.
  • Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine transgene Maus zu erzeugen, die ein reguliertes T-bet-Gen beherbergt (beispielsweise unter Verwendung des Tetracyclin-Off-Promoters; z. B. St-Onge, et al. 1996. Nuc. Acid Res. 24. 3875-3877), und dieses transgene Lebewesen dann mit der T-bet-defizienten Maus zu kreuzen. Dieser Ansatz erlaubt die Erzeugung von Mäusen mit normaler T-bet-Funktion; Tetracyclin kann erwachsenen Lebewesen verabreicht werden, um eine Störung der T-bet-Funktion in peripheren T-Zellen zu induzieren, und dann kann der Effekt der T-bet-Defizienz im Lauf der Zeit untersucht werden. Wiederholte Zyklen aus Bereitstellen und anschließendem Entfernen eines Wirkstoffs (Tetracyclin) gestatten das beliebige Ein- und Ausschalten des T-bet-Gens.
  • III. Isolierte T-bet-Proteine und Anti-T-bet-Antikörper
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte T-bet-Proteine. Das T-bet-Protein umfasst vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NO: 1 oder 3 codiert wird. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Protein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4. Bei anderen Ausführungsformen weist das Protein mindestens 70% Aminosäure- Übereinstimmung, bevorzugter 80% und noch bevorzugter 90% oder 95% Aminosäure-Übereinstimmung mit der in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigten Aminosäuresequenz auf.
  • Die erfindungsgemäßen T-bet-Proteine werden vorzugsweise mit rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt. Beispielsweise wird ein das Protein codierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor kloniert (wie zuvor beschrieben), der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingeführt (wie zuvor beschrieben) und das T-bet-Protein in der Wirtszelle exprimiert. Das T-bet-Protein kann dann nach einem geeigneten Reinigungsschema mittels üblicher Protein-Reinigungsverfahren aus den Zellen isoliert werden. Als Alternative zur rekombinanten Expression kann ein T-bet-Polypeptid mittels üblicher Peptidsyntheseverfahren chemisch synthesiert werden. Darüber hinaus kann natives T-bet-Protein aus Zellen (z. B. aus T-Zellen) beispielsweise mittels Immunpräzipitation unter Verwendung eines Anti-T-bet-Antikörpers isoliert werden.
  • Die Erfindung stellt auch T-bet-Fusionsproteine bereit. So wie es hier verwendet wird, umfasst ein T-bet-„Fusionsprotein" ein T-bet-Polypeptid, das mit einem anderen Polypeptid als T-bet operabel verknüpft ist. Ein „T-bet-Polypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem T-bet-Protein entspricht, während ein „anderes Polypeptid als T-bet" sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, die einem anderen Protein entspricht. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff „operabel verknüpft" angeben, dass das T-bet-Polypeptid und das andere Polypeptid in-frame miteinander fusioniert sind. Das andere Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des T-bet-Polypeptids fusioniert sein. Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GST-T-bet-Fusionsprotein, bei dem die T-bet-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein T-bet-HA-Fusionsprotein, bei dem die T-bet-Nukleotidsequenz in einen Vektor, wie den aspCEP4-HA-Vektor (Herrscher, R. F. et al. (1995) Genes Dev. 9:3067-3082), so insertiert ist, dass die T-bet-Sequenzen in einem Rahmen mit einem Grippe-Hämagglutinin-Epitopmarker fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinantem T-bet erleichtern.
  • Ein erfindungsgemäßes T-bet-Fusionsprotein wird vorzugsweise mit üblichen rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt. Beispielsweise werden DNA-Fragmente, die für die unterschiedlichen Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlichen Techniken miteinander in einem Rahmen verknüpft, z. B. durch Einsatz von Termini mit glatten oder mit versetzten Enden zur Ligation, durch Restriktionsenzymverdau zum Bereitstellen geeigneter Termini, durch Einfügen von kohäsiven Enden nach Bedarf, durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um unerwünschte Verbindungen zu vermeiden, und durch enzymatische Ligation. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mit herkömmlichen Techniken, die automatisierte DNA-Synthesizer beinhalten, synthetisiert werden. Alternativ dazu kann eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Verankerungsprimern durchgeführt werden, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten führen, die später annealt und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Zudem sind zahlreiche Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits eine Fusionseinheit codieren (z. B. ein GST-Polypeptid oder ein HA-Epitopmarker). Eine T-bet-codierende Nukleinsäure kann so in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, dass die Fusionseinheit mit dem T-bet-Protein in-frame verknüpft wird.
  • Ein isoliertes T-bet Protein oder ein Fragment davon kann als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch an T-bet binden, wobei übliche Techniken zur Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper angewandt werden. Das T-bet-Protein kann zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Beispielsweise können polyklonale Antiseren in Kaninchen unter Verwendung von rekombinantem, bakteriell hergestelltem T-bet voller Länge als Immunogen hergestellt werden. Ebendieses Immunogen kann dazu verwendet werden, mAb mittels Immunisierung von Mäusen und Entnahme von Milzzellen aus den immunisierten Mäusen herzustellen.
  • Milzzellen aus Mäusen, die eine Immunantwort auf T-bet erzeugen, können mit Myelom- Zellen, z. B. SP2/O-Agl4-Myleomen, fusioniert werden. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben, wurden diese Verfahren zur Herstellung an T-bet bindender polyklonaler und monoklonaler Antikörper verwendet.
  • Alternativ dazu kann ein antigenes Peptidfragment von T-bet als Immunogen verwendet werden. Ein antigenes Peptidfragment von T-bet weist typischerweise mindestens 8 Aminosäurereste der in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigten Aminosäuresequenz auf und umfasst ein Epitop von T-bet derart, dass ein gegen das Peptid gezüchteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit T-bet bildet. Das antigene Peptid weist vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens 15 Aminosäurereste, noch bevorzugter mindestens 20 Aminosäurereste und am bevorzugtesten mindestens 30 Aminosäurereste auf. Bevorzugte Epitope, die von dem antigenen Peptid umfasst sind, sind Regionen von T-bet, die auf der Oberfläche des Proteins liegen, z. B. hydrophile Regionen, und die einzigartig für T-bet sind. Bei einer Ausführungsform können solche Epitope spezifisch für T-bet-Proteine einer Spezies, wie Maus oder Mensch sein (d. h., ein antigenes Peptid, das eine Region von T-bet umspannt, die nicht speziesübergreifend konserviert ist, wird als Immunogen verwendet; diese nicht-konservierten Reste können mittels Alignment der hier bereitgestellten Art bestimmt werden). Zur Identifikation hydrophiler Regionen kann eine übliche Hydrophobizitätsanalyse des T-bet-Proteins durchgeführt werden.
  • Ein T-bet-Immunogen wird typischerweise zur Herstellung von Antikörpern durch Immunisierung eines geeigneten Subjektes (z. B. Kaninchen, Ziege, Maus oder ein anderes Säugetier) mit dem Immunogen verwendet. Ein geeignetes Immunogen-Präparat kann beispielsweise ein rekombinant exprimiertes T-bet-Protein oder ein chemisch synthetisiertes T-bet-Peptid enthalten. Ferner kann das Präparat ein Adjuvans, wie z. B. vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans, oder ein ähnliches immunstimulierendes Agens enthalten. Die Immunisierung eines geeigneten Subjektes mit einem immunogenen T-bet-Präparat induziert eine polyklonale Anti-T-bet-Antikörperreaktion.
  • Daher bezieht sich ein anderer Aspekt der Erfindung auf Anti-T-bet-Antikörper. Polyklonale Anti-T-bet-Antikörper können wie oben beschrieben durch Immunisierung eines geeigneten Subjektes mit einem T-bet-Immunogen hergestellt werden. Der Anti-T-bet-Antikörper-Titer in dem immunisierten Subjekt im Lauf der Zeit kann mit herkömmlichen Techniken überwacht werden, wie z. B. mit einem enzymverbundenen Immunadsorptions-Assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem T-bet. Falls erwünscht, können die gegen T-bet gerichteten Antikörpermoleküle aus dem Säugetier (z. B. aus dem Blut) isoliert und mittels hinlänglich bekannter Techniken, wie z. B. Protein A-Chromatographie, gereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Immunisierung, z. B. wenn die Anti-T-bet-Antikörper-Titer am höchsten sind, können Antikörper produzierende Zellen aus dem Subjekt erhalten und zur Herstellung monoklonaler Antikörper mittels üblicher Techniken, wie der Hybridom-Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) beschrieben wurde (siehe auch Brown et al. (1981) J Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31 und Yeh et al. (1982) Int. J Cancer 29:269-75), der neueren Human B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), der EBV-Hybridom-Technik (Cole et al. (1985). Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96) oder Triom-Techniken, verwendet werden. Die Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper-Hybridome ist hinlänglich bekannt (siehe allgemein R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). Kurzum, eine immortale Zelllinie (typischerweise ein Myelom) wird mit Lymphocyten (typischerweise Splenocyten) eines Säugetiers, das mit einem T-bet-Immunogen wie oben beschrieben immunisiert ist, fusioniert, und die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomzellen werden gescreent, um ein Hybridom zu identifizieren, das einen spezifisch an T-bet bindenden monoklonalen Antikörper produziert.
  • Eines der zahlreichen, hinlänglich bekannten Protokolle, die zur Fusion von Lymphocyten und immortalisierten Zelllinien verwendet werden, kann zum Zwecke der Erzeugung eines monoklonalen Anti-T-bet-Antikörpers angewandt werden (siehe. z. B. G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., wie oben zitiert; Lerner, Yale J. Biol. Med., wie oben zitiert; Kenneth, Monoclonal Antibodies, wie oben zitiert). Zudem ist für den Durchschnittsfachmann ersichtlich, dass es zahlreiche Variationen dieser Verfahren gibt, die ebenfalls nützlich wären. Typischerweise wird die immortale Zelllinie (z. B. eine Myelom-Zelllinie) von derselben Säugetierspezies hergeleitet, wie die Lymphocyten. Beispielsweise können Mäuse-Hybridome durch Fusion von Lymphocyten einer Maus, die mit einem immunogenen Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung immunisiert ist, mit einer immortalisierten Maus-Zelllinie hergestellt werden. Bevorzugte immortale Zelllinien sind Maus-Myelom-Zelllinien, die auf ein Kulturmedium ansprechen, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält („HAT-Medium"). Eine von mehreren Myelom-Zellinien kann bei herkömmlichen Verfahren als Fusionspartner verwendet werden, wie z. B. die Myelom-Zelllinien P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14. Diese Myelomlinien sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md, erhältlich. Typischerweise werden HAT-sensitive Maus-Myelomzellen mit Maus-Splenocyten unter Verwendung von Polyethylenglykol („PEG") fusioniert. Aus der Fusion resultierende Hybridomzellen werden dann mit HAT-Medium selektiert, das unfusionierte und unproduktiv fusionierte Myelom-Zellen abtötet (unfusionierte Splenocyten sterben nach mehreren Tagen, da sie nicht transformiert werden). Hybridomzellen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden durch Screening der Hybridom-Kulturüberstände hinsichtlich Antikörpern, die T-bet binden, z. B. mit einem üblichen ELISA-Assay, detektiert.
  • Alternativ zur Herstellung monoklonale Antikörper sezernierender Hybridome kann ein monoklonaler Anti-T-bet-Antikörper durch Screening einer rekombinanten, kombinatorischen Immunglobulinbank (z. B. einer Antikörper-Phagenbank) mit T-bet identifiziert und isoliert werden, um dadurch T-bet bindende Mitglieder der Immunglobulinbank zu isolieren.
  • Kits zur Erzeugung und zum Screening von Phagenbanken sind kommerziell erhältlich (z. B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog-Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Katalog-Nr. 240612). Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die besonders zur Verwendung beim Erzeugen und Screening einer Antikörper-Bank geeignet sind, finden sich zudem beispielsweise bei Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409 Kang et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/18619; Dower et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 91/17271; Winter et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/20791; Markland et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/15679; Breitling et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/01288; McCafferty et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/01047; Garrard et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/09690; Ladner et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, und McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.
  • Zudem fallen rekombinante Anti-T-bet-Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht-menschliche Abschnitte umfassen und mit herkömmlichen rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden können, unter den Umfang der Erfindung. Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch dem Fachmann bekannte rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, beispielsweise unter Anwendung der Verfahren, die beschrieben sind in: Robinson et al., Internationale Patentveröffentlichung PCT/US86/02269; Akira, et al. europäische Patentanmeldung 184 187; Taniguchi, M., europäische Patentanmeldung 171 496; Morrison et al., europäische Patentanmeldung 173 494; Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 86 01533; Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567; Cabilly et al., europäische Patentanmeldung 125 023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449, und Shaw et al. (1988) J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison. S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter, US-Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534, und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
  • Ein Anti-T-bet-Antikörper (z. B. ein monoklonaler Antikörper) kann dazu verwendet werden, T-bet mittels herkömmlicher Techniken, wie z. B. Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation, zu isolieren. Ein Anti-T-bet-Antikörper kann die Reinigung des natürlichen T-bet aus Zellen und von rekombinant produziertem T-bet, das in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern. Darüber hinaus kann ein Anti-T-bet-Antikörper verwendet werden, um ein T-bet-Protein (z. B. in einem Zell-Lysat oder Zellüberstand) zu detektieren. Die Detektion kann durch Kopplung (d. h. physikalische Verknüpfung) des Antikörpers mit einer detektierbaren Substanz erleichtert werden. Gemäß einer Ausführungsform wird daher ein erfindungsgemäßer Anti-T-bet-Antikörper mit einer detektierbaren Substanz markiert. Zu Beispielen für detektierbare Substanzen zählen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, Fluoreszenz-Materialien, Lumineszenz-Materialen und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; zu Beispielen für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe zählen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete Fluoreszenzmaterialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein Lumineszenzmaterial ist Luminol, und zu Beispielen für ein geeignetes radioaktives Material zählen 125I, 131I, 35S oder 3H.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Anti-T-bet-Antikörper, die durch ein Verfahren erhältlich sind, umfassend:
    • (a) das Immunisieren eines Lebewesens mit einem immunogenen T-bet-Protein oder einem immunogenen Abschnitt davon, der für das T-bet-Protein einzigartig ist, und
    • (b) das Isolieren von Antikörpern, die spezifisch an ein T-bet-Protein binden, aus dem Lebewesen.
  • Verfahren zur Immunisierung und Gewinnung der spezifischen Anti-T-bet-Antikörper sind weiter oben beschrieben.
  • IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • T-bet-Modulatoren (z. B. T-bet-inhibierende oder -stimulierende Agenzien, einschließlich T-bet- Nukleinsäuremolekülen, Proteinen, Antikörpern oder Verbindungen, die als Modulatoren der T-bet-Aktivität identifiziert wurden) können in pharmazeutische Zusammensetzungen aufgenommen werden, die zur Verabreichung geeignet sind. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das modulatorische Agens und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen Agenzien und Fungiziden, isotonischen und absorptionsverzögernden Agenzien und dergleichen umfassen, die zur pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. Sofern ein herkömmliches Medium oder Agens nicht inkompatibel mit der aktiven Verbindung ist, wird dessen Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Es können auch zusätzliche aktive Verbindungen in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, dass sie mit ihrem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispielsweise können Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Anwendung verwendet werden, die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zu Injektionszwecken, Kochsalzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Cheliermittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Agenzien zur Tonizitätseinstellung, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosis-Vials aus Glas oder Kunststoff aufgenommen sein.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für Injektionszwecke geeignet sind, umfassen sterile wässerige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur spontanen Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Zur intravenösen Verabreichung geeignete Träger umfassen physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte so fluid sein, dass eine einfache Injizierbarkeit vorliegt. Sie muss unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, konserviert sein. Bei dem Träger kann es sich um ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium handeln, das z. B. Wasser, Ethanol, ein Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyetheylenglykol und dergleichen) und geeignete Gemische davon enthält. Die geeignete Fluidität kann z. B. durch Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden. Die Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle Mittel und Fungizide, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, verhindert werden. In einigen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Agenzien, wie z. B. Zucker, Polyalkohole, wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid, in die Zusammensetzung aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Aufnahme eines Agens, das die Absorption verzögert, wie z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine, in die Zusammensetzung erreicht werden.
  • Sterile injizierbare Lösungen können durch Aufnahme der aktiven Verbindung in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem der oben aufgezählten Bestandteile oder einer Kombination derselben, je nach Bedarf, gefolgt von einer filtrierten Sterilisation, hergestellt werden. Im allgemeinen werden Dispersionen durch Aufnahme der aktiven Verbindung in einen sterilen Träger, der ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen der oben aufgezählten Bestandteile enthält, hergestellt. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler, injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren die Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknung, die ein Pulver des aktiven Bestandteils zusammen mit jedem zusätzlichen, gewünschten Bestandteil aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
  • Orale Zusammensetzungen umfassen allgemein ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln aufgenommen oder zu Tabletten verpresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Exzipienten aufgenommen und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch unter Verwendung eines Fluidträgers zur Verwendung als Mundspülung hergestellt werden, wobei die Verbindung im Fluidträger oral angewandt und gegurgelt und ausgespuckt oder geschluckt wird. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Adjuvans-Materialien können als Teil der Zusammensetzung enthalten sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können einen der folgenden Bestandteile oder ähnlich geartete Verbindungen enthalten: ein Bindemittel, wie z. B. mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie Stärke oder Lactose, ein Aufschlussmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliciumdioxid; einen Süßstoff, wie Saccharose oder Saccharin, oder einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangengeschmack.
  • Bei einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung vor rascher Eliminierung aus dem Körper schützen, wie z. B. eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, die Implantate und Mikrokapsel-Abgabesysteme enthält. Es können biologisch abbaubare, biologisch kompatible Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure, verwendet werden. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind für den Fachmann ersichtlich. Die Materialien sind zudem kommerziell erhältlich bei den Firmen Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomsuspensionen (die Liposome enthalten, welche auf infizierte Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene gerichtet sind) können ebenfalls als pharmazeutisch akzeptable Träger verwendet werden. Diese können nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie z. B. im US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben sind.
  • V. Erfindungsgemäße Verfahren
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Verwendung der verschiedenen erfindungsgemäßen T-bet-Zusammensetzungen. Beispielsweise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion des Vorliegens einer T-bet-Aktivität in einer biologischen Probe bereit. Bei dem Verfahren wird die biologische Probe mit einem Agens in Kontakt gebracht, das in der Lage ist, eine T-bet-Aktivität zu detektieren, wie z. B. mit einem T-bet-Protein oder einer T-bet-mRNA, so dass das Vorliegen einer T-bet-Aktivität in der biologischen Probe detektiert wird.
  • Ein bevorzugtes Agens zum Detektieren von T-bet-mRNA ist eine markierte Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch an T-bet-mRNA zu hybridisieren. Die Nukleinsäuresonde kann z. B. die T-bet-DNA der SEQ ID NO: 1 oder 3 sein, wie ein Oligonukleotid mit einer Länge von mindestens etwa 500, 600, 800, 900, 1000, 1200, 1400 oder 1600 Nukleotiden, das unter stringenten Bedingungen spezifisch an T-bet-mRNA hybridisiert.
  • Ein bevorzugtes Agens zur Detektion eines T-bet-Proteins ist ein markierter Antikörper, der in der Lage ist, an ein T-bet-Protein zu binden. Antikörper können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein. Es kann ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (z. B. Fab oder F(ab')2) verwendet werden. Der Begriff „markiert" soll im Zusammenhang mit der Sonde oder dem Antikörper eine direkte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Koppeln (d. h. physikalisches Verknüpfen) einer detektierbaren Substanz mit der Probe oder dem Antikörper ebenso umfassen, wie eine indirekte Markierung der Sonde oder des Antikörpers durch Reaktivität mit einem anderen Reagens, das direkt markiert ist. Beispiele für die indirekte Markierung umfassen die Detektion eines primären Antikörpers unter Verwendung eines fluoreszierend markierten zweiten Antikörpers und Endmarkierung einer DNA-Sonde mit Biotin derart, dass eine Detektion mit fluoreszierend markiertem Streptavidin erfolgen kann. Der Begriff „biologische Probe" soll Gewebe, Zellen und biologische Fluide umfassen. Beispielsweise zählen zu Techniken zur Detektion von T-bet-mRNA Northern-Hybridisierungen und in situ-Hybridisierungen. Techniken zur Detektion eines T-bet-Proteins umfassen enzymverbundene Immunadsorptions-Assays (ELISAs), Western Blots, Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenz.
  • Solche Assays sind nützlich zur Detektion von Syndromen, die durch Entwicklungsdefekte gekennzeichnet sind. Beispielsweise sind Mutationen der menschlichen T-Box-Gene TBX5 und TBX3 (Orthologe von Maus-Tbx5 und -Tbx3) für die autosomalen, dominanten genetischen Erkrankungen Holt-Oram-Syndrom bzw. das Ulnar-Mammary-Syndrom verantwortlich (Bamshad, M., et al. 1997. Nature Genetics 16:311; Basson, C. T., et al. 1997. Nature Genetics 15:30; Li. Q. Y., et al. 1997. Nature Genetics 15:21; Spranger, S., et al. 1997. J. Med. Genet. 3:978). Diese Syndrome sind durch Entwicklungsdefekte gekennzeichnet und hätten anhand der Expressionsmuster von Tbx5 bzw. Tbx3 vorhergesagt werden können. Das Holt-Oram-Syndrom wirkt sich auf das Herz und die oberen Extremitäten aus, während das Ulnar-Mammary-Syndrom die Entwicklung der Extremitäten, der apokrinen Drüse, der Zähne und der Genitalien betrifft. Beide Syndrome sind durch Entwicklungsdefekte gekennzeichnet und hätten anhand der Expressionsmuster von Tbx5 bzw. Tbx3 vorhergesagt werden können. Die Mutationen bei diesen Patienten betreffen nur ein Allel des T-Box-Gens; daher wurde postuliert, dass eine Haploinsuffizienz von Tbx3 und Tbx 5 diese beiden Erkrankungen verursacht. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Tbx4 und Tbx5 an sich entwickelnde Hühnerembryonen die Übereinstimmung der Extremitätenknospen steuert (Rodriguez-Esteban et al., 1999; Takeuchi et al. 1999). Diese Erkenntnisse unterstreichen die kritische Bedeutung dieser Familie für die Entwicklung der Wirbeltiere.
  • Zudem liefert die Existenz von T-Gen-Homologa in zahlreichen Spezien starke Anhaltspunkte für dessen Funktion als Transkriptionsfaktor, der eine Gruppe noch unbekannter Zielgene reguliert, die an der Mesoderm-Entwicklung beteiligt sind. Das jüngste Hervortreten der T-Box-Familie rührt von ihrer klaren Bedeutung für diverse Entwicklungsprozesse her, deren dramatischstes Beispiel die T-Box-Mutationen bei menschlichen Erkrankungen sind. Die Erzeugung reifer T-Zellen aus Thymocyten-Stammzellen und von differentierten Th-Zellen aus nativen Präkursoren können auch als eng regulierte Entwicklungsprozesse betrachtet werden. Diese Entdeckung, dass T-bet für die Entwicklung der Th1-Linie verantwortlich ist, zeigt eine wichtige Rolle dieses neuesten T-Box-Familienmitgliedes im Lymphsystem.
  • Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Identifikation von Verbindungen bereit, welche die Aktivität eines T-bet-Proteins modulieren. Beispielsweise stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung bereit, welche die Aktivität eines T-bet-Proteins moduliert, umfassend:
    die Bereitstellung einer Indikatorzusammensetzung, die ein T-bet-Protein aufweist,
    das Kontaktieren der Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung, und das Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins in der Indikatorzusammensetzung, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, welche die Aktivität eines T-bet-Proteins moduliert.
  • Spezifische Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Screening-Verfahren nutzen die Fähigkeit der T-bet-Proteine, an DNA zu binden (z. B. die Fähigkeit zur Bindung an IL-2 oder IFN-gamma- Promoter) und/oder die Genexpression zu regulieren (z. B. die Expression eines Thf1-assoziierten Cytokingens, beispielsweise durch Unterdrückung des IL-2-Gens, zum Transaktivieren des IFN-γ-Gens zu regulieren) und/oder polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umzulenken.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Screening-Assays umfasst die Indikatorzusammensetzung eine Indikatorzelle, wobei die Indikatorzelle umfasst: (i) ein T-bet-Protein und (ii) ein Reporter-Gen, das auf das T-bet-Protein anspricht. Vorzugsweise enthält die Indikatorzelle:
    • i) einen rekombinanten Expressionsvektor, der T-bet codiert, und
    • ii) einen Vektor, der Regulierungssequenzen eines Th1-assoziierten Cytokingens aufweist, das mit einem Reporter-Gen operabel verknüpft ist, und wobei das Verfahren umfasst:
    • a) das Kontaktieren der Indikatorzelle mit einer Testverbindung,
    • b) das Bestimmen des Expressionsniveaus des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Gegenwart der Testverbindung, und
    • c) den Vergleich des Expressionsniveaus des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Gegenwart der Testverbindung mit dem Expressionsniveau des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Abwesenheit der Testverbindung, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, welche die Aktivität von T-bet moduliert.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorzusammensetzung die Herstellung: (i) eines T-bet-Proteins und (ii) eines DNA-Moleküls, an welches das T-bet bindet, und das Verfahren umfasst:
    • a) das Kontaktieren der Indikatorzelle mit einer Testverbindung,
    • b) das Bestimmen des Interaktionsgrades zwischen dem T-bet-Protein und dem DNA-Molekül in Gegenwart der Testverbindung, und
    • c) den Vergleich des Interaktionsgrades zwischen T-bet und dem DNA-Molekül in Gegenwart der Testverbindung mit dem Interaktionsgrad zwischen dem T-bet-Protein und dem DNA-Molekül in Abwesenheit der Testverbindung, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, welche die Aktivität von T-bet moduliert.
  • Das DNA-Molekül, an das T-bet bindet, umfasst vorzugsweise eine T-Box-Bindungssequenz.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden mit dem Verfahren Proteine identifiziert, die mit T-bet interagieren. Bei dieser Ausführungsform: ist die Indikatorzusammensetzung eine Indikatorzelle, wobei die Indikatorzelle umfasst:
    • i) ein Reporter-Gen, das mit einer Transkriptionsregulierungssequenz operabel verknüpft ist, und
    • ii) ein erstes chimäres Gen, das ein erstes Fusionsprotein codiert, wobei das erste Fusionsprotein T-bet enthält,
    umfasst die Testverbindung eine Bank eines zweiten chimären Gens, wobei die Bank zweite Fusionsproteine codiert,
    wobei die Expression des Reporter-Gens auf Interaktionen zwischen dem ersten Fusionsprotein, dem zweiten Fusionsprotein und der Transkriptisregulierungssequenz anspricht, und
    wobei die Wirkung der Testverbindung auf T-bet in der Indikatorzusammensetzung mittels Bestimmung des Expressionsniveaus des Reporter-Gens in der Indikatorzelle bestimmt wird, um dadurch eine Testverbindung zu identifizieren, die in mit T-bet interagierendes Protein umfasst.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bank eines zweiten chimären Gens aus der cDNA-Bank von Th2-Zellen hergestellt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Screening-Assays wird, sobald eine Testverbindung als die Aktivität von T-bet modulierend identifiziert ist, die Wirkung der Testverbindung auf eine Immunantwort getestet. Somit können die erfindungsgemäßen Screening-Verfahren ferner die Bestimmung der Wirkung der Verbindung auf eine Immunantwort umfassen, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die eine Immunantwort moduliert.
  • Bei einer Ausführungsform wird die Wirkung der Verbindung auf eine Immunantwort durch Bestimmung der Wirkung der Verbindung auf die Expression eines Th1-assoziierten Cytokingens, wie z. B. eines Interferon-gamma-Gens, bestimmt. So wie er hier verwendet wird, soll sich der Begriff „Th1-assoziiertes Cytokin" auf ein Cytokin beziehen, das vorzugsweise oder ausschließlich von Th1-Zellen, und nicht von Th2-Zellen, produziert wird. Beispiele für Th1-assoziierte Cytokine umfassen IFN-gamma, IL-2, TNF und Lymphtoxin (LT). Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Wirkung der interessierenden Verbindung auf eine Immunantwort durch Bestimmung der Wirkung der Verbindung auf die Entwicklung von T-Helfer-Typ 1 (Th1)- oder T-Helfer-Typ 2 (Th2)- Zellen bestimmt.
  • Rekombinante Expressionsvektoren, die zur Expression von T-bet in der Indikatorzelle verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt (siehe obige Erörterungen). Bei einer Ausführungsform sind die T-bet-Codierungssequenzen innerhalb des Expressionsvektors operabel mit den Regulierungssequenzen verknüpft, die eine konstitutive Expression von T-bet in der Indikatorzelle gestatten (z. B. können virale Regulierungssequenzen, wie ein Cytomegalovirus-Promoter/-Enhancer, verwendet werden). Die Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, der eine konstitutive Expression von T-bet in der Indikatorzelle gestattet, ist zur Identifikation von Verbindungen, welche die Aktivität von T-bet verstärken oder inhibieren, bevorzugt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform sind die T-bet-Codierungssequenzen innerhalb des Expressionsvektors operabel mit Regulierungssequenzen des endogenen T-bet-Gens verknüpft (d. h. mit der Promoter-Regulierungsregion, die aus dem endogenen T-bet-Gen stammt).
  • Die Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, bei dem die T-bet-Expression von endogenen Regulierungssequenzen gesteuert wird, ist zur Identifikation von Verbindungen bevorzugt, welche die Transkriptionsexpression von T-bet verstärken oder inhibieren.
  • Bei Verfahren, bei denen ein Th1-assoziiertes Cytokingen verwendet wird (z. B. als Reporter-Gen), ist das Th1-assoziierte Cytokin vorzugsweise Interferon- gamma oder IL-2. Beispielsweise zeigt der IL-2-Promoter eine T-Box-Bindungsstelle bei –240 bis –220, nur 5' von der NFκB-Stelle. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben, wurde T-bet in einem Hefe-Ein-Hybrid-Screening-Assay, ausgehend von seiner Fähigkeit, an den IL-2-Promoter zu binden, isoliert. Folglich wird bei einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß einer Ausführungsform ein Reporter-Gen-Konstrukt verwendet, das diese Region des proximalen IL-2-Promoter, am bevorzugtesten die Nukleotide –240 bis –220 des IL-2-Promoters, enthält.
  • Verschiedene Reporter-Gene sind dem Fachmann bekannt und zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Screening-Assays geeignet. Zu Beispielen für geeignete Reporter-Gene zählen diejenigen, die Chloramphenicolacetyltransferase, beta-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Luciferase codieren. Übliche Verfahren zur Bestimmung der Aktivität dieser Genprodukte sind dem Fachmann bekannt.
  • Verschiedene Zelltypen eignen sich zur Verwendung als Indikatorzelle im Screening-Assay. Vorzugsweise wird eine Zelllinie verwendet, die T-bet normalerweise nicht exprimiert, wie z. B. ein B-Zell- oder ein Th2-Zell-Klon. Als Indikatorzellen können auch nicht-lymphoide Zelllinien, wie die HepG2-Hepatom-Zellinie, verwendet werden. Auch Hefezellen können als Indikatorzellen verwendet werden.
  • Bei einer Ausführungsform ist das Expressionsniveau des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Gegenwart der Testverbindung höher als das Expressionsniveau des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Abwesenheit der Testverbindung, und die Testverbindung wird als Verbindung identifiziert, welche die Expression oder Aktivität von T-bet stimuliert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Expressionsniveau des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Gegenwart der Testverbindung niedriger als das Expressionsniveau des Reporter-Gens in der Indikatorzelle in Abwesenheit der Testverbindung, und die Testverbindung wird als eine Verbindung identifiziert, welche die Expression oder Aktivität von T-bet inhibiert.
  • Alternativ zur Verwendung eines Reporter-Gen-Konstruktes können Verbindungen, welche die Expression oder Aktivität von T-bet modulieren, unter Verwendung anderer „Messwerte" identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Indikatorzelle mit einem T-bet-Expressionsvektor transfiziert werden, der in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testverbindung inkubiert wird, und die Produktion von Th1-assoziiertem Cytokin kann durch Detektion von Cytokin-mRNA (z. B. Interferon-gamma-mRNA) in der Indikatorzelle oder der Sezernierung von Cytokin (d. h. Interferon-gamma) in den Kulturüberstand bestimmt werden. Standardmethoden zur Detektion von Cytokin-mRNA, wie z. B. die Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann ebenfalls bekannt sind Standardmethoden zur Detektion von Cytokin-Protein in Kulturüberständen, wie z. B. enzymverbundene Immunadsorptions-Assays (ELISA).
  • Wie oben beschrieben, stellt die Erfindung einen Screening-Assay zur Identifikation von Proteinen (z. B. Proteinen in Th1-Zellen) bereit, die mit T-bet interagieren.
  • Bei einer Ausführungsform können diese Assays ausgehend vom Zwei-Hybrid-Assay-System (auch als Interaktions-Trap-Assay bezeichnet), das dem Fachmann bekannt ist (siehe z. B. Field, US-Patent Nr. 5,283,173; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924, und Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696), gestaltet sein. Der Zwei-Hybrid-Assay wird allgemein zur Identifikation von Proteinen verwendet, die mit einem bestimmten Zielprotein interagieren. Bei dem Assay werden Genfusionen zur Identifikation von Proteinen eingesetzt, die zur Wechselwirkung in der Lage sind, um einen funktionellen Transkriptionsaktivator rekonstituieren. Der Transkriptionsaktivator besteht aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer Transkriptionsaktivierungsdomäne, wobei beide Domänen erforderlich sind, um die Transkription von Genen stromabwärts einer Zielsequenz (wie einer stromaufwärtigen Aktivatorsequenz (UAS) für GAL4) zu aktivieren. DNA-Sequenzen, die ein Ziel-„Köder"-Protein codieren, werden mit einer dieser Domänen fusioniert, und eine Bank von DNA-Sequenzen wird mit der anderen Domäne fusioniert. „Fisch"-Fusionsproteine (die aus der Fusionsbank erzeugt werden), die in der Lage sind, an das Ziel-Fusionsprotein (z. B. einen Ziel-GAL4-Fusions-„Köder") zu binden, bringen die beiden Domänen (die DNA-Bindungsdomäne und die Transkriptionsaktivierungsdomäne) allgemein in ausreichende Nähe zueinander, um die Transkription eines stromabwärts der Zielsequenz insertierten Reporter-Gens zu aktivieren. Damit können die „Fisch"-Proteine aufgrund ihrer Fähigkeit zur Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsaktivators (z. B. eines funktionellen GAL4-Transaktivators) identifiziert werden.
  • Dieses allgemeine Zwei-Hybrid-System kann zur Identifikation von Proteinen in Zellen (z. B. Th1- Zellen), die mit T-bet interagieren, durch Konstruktion eines Ziel-T-bet-Fusionsproteins (z. B. einer T-bet/GAL4-Bindungsdomänenfusion als „Köder") und einer cDNA-Bank von „Fisch"- Fusionsproteinen (z. B. einer cDNA/GAL4-Aktivierungsdomänenbank), wobei die cDNA-Bank aus mRNA eines interessierenden Zelltyps (z. B. Th1-Zellen) hergestellt wird, und Einführung dieser Konstrukte in eine Wirtszelle, die ebenfalls ein Reporter-Gen-Konstrukt enthält, das mit einer auf T-bet ansprechenden Regulierungssequenz verknüpft ist (z. B. einer IL-2-Promotersequenz, wie oben erörtert), angewandt werden. Die (sowohl an das 5'- als auch an das 3'-Ende kartierte(n)) Transaktivierungsdomäne(n) von T-bet wird (werden) in dem „Köder"-Konstrukt deletiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Köder-Konstrukt die T-Box-Domäne. Gemäß einer Ausführungsform ist auch mindestens eine Stelle zur Tyrosinphosphorylierung enthalten. Dominant negative T-bet-Proteine können ebenfalls zum Screening bezüglich Interaktoren verwendet werden, um weiterhin Stellen von T-bet zu lokalisieren, die zur Interaktion erforderlich sind. cDNAs, die mit T-bet interagierende Proteine codieren, können anhand der Transaktivierung des Reporter-Gen-Konstruktes identifiziert werden.
  • Alternativ dazu kann ein „Ein-Hybrid"-Assay, wie er in Sieweke, M. H. et al. (1996) Cell 85:49-60, beschrieben ist, dazu verwendet werden, mit T-bet interagierende Proteine zu identifizieren. Dieser Assay ist eine Abwandlung des oben dargelegten Zwei-Hybrid-Systems. Bei diesem System ist der „Köder" ein Transkriptionsfaktor, aus dem die Transaktivierungsdomäne entfernt wurde (z. B. T-bet, aus dem eine Transaktivierungsdomäne entfernt wurde), und der „Fisch" eine Nicht-Fusions-cDNA-Bank (z. B. eine aus Th1-Zellen hergestellte cDNA-Bank). Diese Konstrukte werden in Wirtszellen (z. B. Hefezellen) eingeführt, die auch ein Reporter-Gen-Konstrukt enthalten, das mit einer auf T-bet ansprechenden Regulierungssequenz verknüpft ist (das z. B. eine T-Box-Bindungsregion umfasst, wie eine Region des auf T-bet ansprechenden IL-2-Promoters). cDNAs, die mit T-bet interagierende Proteine codieren, können anhand der Transaktivierung des Reporter-Gen-Konstruktes identifiziert werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform die Repräsentationsunterschiedsanalyse (RDA) und die Mikrochip-DNA-Array-Analyse können zur Isolierung von T-bet-Zielgenen verwended werden. Beispielsweise können Differenzanzeige- oder Subtraktionsverfahren, gekoppelt mit PCR (RDA; siehe z. B. Hubank, M. & Schatz, D. G. 1994. Nuc. Acid Res. 22, 5640-5648; Chang, Y., et al. 1994. Science 266, 1865; von Stein, O. D. et al. 1997. Nuc. Acid Res. 25, 2598; Lisitsyn, N. & Wigler, M. 1993. Science 259, 946), bei denen subtrahierte oder unsubtrahierte Sonden eingesetzt werden, oder am aktuellsten eine DNA-Mikrochip-Array-Hybridisierung (Welford et al. 1998. Nucl. Acids. Res. 15:3059) verwendet werden. Zur Durchführung solcher Assays können verschiedene Zellen verwendet werden, z. B. normale Zellen, zur Expression von T-bet manipulierte Zellen oder Zellen von Mäusen, denen T-bet fehlt, oder die T-bet überexprimieren (z. B. aus einem transgenen, nicht-menschlichen Lebewesen).
  • Wie zuvor beschrieben, stellt die Erfindung einen Screening-Assay zur Identifikation von Verbindungen bereit, welche die Interaktion von T-bet und einer T-Box-Bindungsregion (z. B. einer IL-2-Gen-Regulierungsregion) modulieren. Dem Fachman sind Assays bekannt, welche die Interaktion eines DNA-Bindungsproteins mit einer Ziel-DNA-Sequenz detektieren (z. B. elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assays, DNAse I-Footprinting-Assays und dergleichen). Bei Durchführung dieser Assays in Gegenwart und in Abwesenheit von Testverbindungen können diese Assays dazu verwendet werden, Verbindungen zu identifizieren, welche die Interaktion des DNA- Bindungsproteins mit seiner Ziel-DNA-Sequenz modulieren (z. B. inhibieren oder verstärken).
  • Bei einer Ausführungsform ist das Maß der Bindung von T-bet an das DNA-Fragment in Gegenwart der Testverbindung größer als das Maß der Bindung von T-bet an das DNA-Fragment in Abwesenheit der Testverbindung, wobei die Testverbindung in diesem Fall als Verbindung identifiziert wird, welche die Bindung von T-bet verstärkt. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Maß der Bindung von T-bet an das DNA-Fragment in Gegenwart der Testverbindung geringer als das Maß der Bindung von T-bet an das DNA-Fragment in Abwesenheit der Testverbindung, wobei die Testverbindung in diesem Fall als Verbindung identifiziert wird, welche die Bindung von T-bet inhibiert.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Modulation der T-bet-Aktivität in einer Zelle bereitgestellt. Bei diesen modulatorischen Verfahren wird die Zelle mit einem Agens kontaktiert, das die T-bet-Aktivität moduliert, so dass die T-bet-Aktivität in der Zelle moduliert ist. Das Agens kann durch Modulation der Aktivität des T-bet-Proteins in der Zelle oder durch Modulation der Transkription des T-bet-Gens oder Translation der T-bet-mRNA wirken. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „Modulation" die Inhibierung oder Verminderung der T-bet-Aktivität und die Stimulation oder Erhöhung der T-bet-Aktivität umfassen. Gemäß einer Ausführungsform inhibiert das Agens daher die T-bet-Aktivität. Gemäß einer anderen Ausführungsform stimuliert das Agens die T-bet-Aktivität.
  • Nach noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulation der Menge an T-Helfer-Typ 2- und/oder T-Helfer-Typ 1-Cytokin durch eine Zelle bereit. Bei dem Verfahren wird eine Zelle mit einem Agens kontaktiert, das die Aktivität von T-bet moduliert. Beispielsweise regulieren Agenzien, welche die T-bet-Aktivität stimulieren, das Th1-Cytokin IFN-gamma aufwärts, während dieselben Agenzien das Th2-Cytokin IL-4 abwärts regulieren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulation des Musters von Cytokin, das von einer Zelle produziert wird, bereit. Bei dem Verfahren wird eine Zelle mit einem Agens kontaktiert, das die Aktivität von T-bet moduliert. Beispielsweise können Agenzien, welche die T-bet-Aktivität stimulieren, die IFN-gamma-Produktion in einer Zelle induzieren, die IFN-gamma normalerweise nicht produziert, und die IL-4-Produktion unterdrücken; solche Agenzien können z. B. zur Umlenkung des Cytokinsezernierungsprofils einer Th2-Zelle auf das einer Th1-Zelle verwendet werden.
  • A. Inhibitorische Agenzien
  • Gemäß einem modulatorischen Verfahren wird die T-bet-Aktivität in einer Zelle dadurch inhibiert, dass die Zelle mit einem inhibitorischen Agens in Kontakt gebracht wird. Inhibitorische Agenzien können beispielsweise intrazelluläre Bindungsmoleküle sein, welche eine Inhibierung der Expression oder Aktivität von T-bet bewirken. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „intrazelluläres Bindungsmolekül" Moleküle umfassen, die intrazellulär wirken, um die Expression oder Aktivität eines Proteins durch Bindung des Proteins selbst an eine Nukleinsäure (z. B. ein mRNA-Molekül), welche das Protein codiert, oder an ein Ziel, mit dem das Protein normalerweise interagiert (z. B. an eine DNA-Zielsequenz, an die T-bet bindet), zu inhibieren. Beispiele für intrazelluläre Bindungsmoleküle, die nachfolgend noch näher beschrieben sind, umfassen gegenläufige T-bet-Nukleinsäuremoleküle (z. B. zur Inhibierung der Translation von T-bet-mRNA), intrazelluläre Anti-T-bet-Antikörper (z. B. zur Inhibierung der Aktivität eines T-bet-Proteins) und dominant-negative Mutanten desT-bet-Proteins.
  • Bei einer Ausführungsform ist ein inhibitorisches Agens ein gegenläufiges Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu einem T-bet codierenden Gen oder zu einem Abschnitt dieses Gens ist, oder ein rekombinanter Expressionsvektor, der das gegenläufige Nukleinsäuremolekül codiert. Die Verwendung von gegenläufigen Nukleinsäuren zur Abwärtsregulierung der Expression eines bestimmten Proteins in einer Zelle ist dem Fachmann hinlänglich bekannt (siehe z. B. Weintraub, H. et al. Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis. Reviews – Trends in Genetics, Nr. 1(1) 1986; Askari, F. K. und McDonnell, W. M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M. R. und Schwanz, S. M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. und Cohen, J. S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J. J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R. W. (1994) Nature 372:333-335). Ein gegenläufiges Nukleinsäuremolekül umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zum Codierungsstrang eines anderen Nukleinsäuremoleküls ist (z. B. eine mRNA-Sequenz) und somit zur Wasserstoffbindung an den Codierungsstrang des anderen Nukleinsäuremoleküls befähigt ist. Gegenläufige Sequenzen, die komplementär zu einer Sequenz einer mRNA sind, können komplementär zu einer Sequenz sein, die in der Codierungsregion der mRNA, der 5'- oder 3'-untranslatierten Region der mRNA oder einer die Codierungsregion und eine untranslatierte Region überbrückenden Region (z. B. am Übergang der 5'-untranslatierten Region und der Codierungsregion) zu finden ist. Ferner kann eine gegenläufige Nukleinsäure hinsichtlich ihrer Sequenz komplementär zu einer Regulierungsregion des die mRNA codierenden Gens sein, wie z. B. zu einer Transkriptionsinitiationssequenz oder einem Regulierungselement.
  • Eine gegenläufige Nukleinsäure ist vorzugsweise so gestaltet, dass sie komplementär zu einer Region ist, die dem Initiationscodon auf dem Codierungsstrang oder in der 3'-untranslatierten Region einer mRNA vorausgeht oder dieses umspannt. Eine gegenläufige Nukleinsäure zur Inhibierung der Expression eines T-bet-Proteins in einer Zelle kann ausgehend von der Nukleotidsequenz, die das T-bet-Protein codiert (z. B. SEQ ID NO: 1 oder 3), gestaltet und gemäß den Regeln der Basenpaarung nach Watson und Crick konstruiert sein.
  • Eine gegenläufige Nukleinsäure kann in einer Reihe verschiedener Formen vorliegen. Beispielsweise kann die gegenläufige Nukleinsäure ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Abschnitt eines T-bet-Gens komplementär ist. Gegenläufige Oligonukleotide können mittels dem Fachmann bekannter chemischer Syntheseverfahren hergestellt werden. Ein gegenläufiges Oligonukleotid kann unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedentlich modifizierter Nukleotide, welche die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität der zwischen gegenläufigen und gleichläufigen Nukleinsäuren gebildeten Duplex erhöhen sollen, chemisch synthetisiert werden, wobei z. B. Phosphorthioat- Derivate und acridinsubstitutierte Nukleotide verwendet werden können. Zur Inhibierung der T-bet-Expression in Kultur vorliegender Zellen können ein oder mehrere gegenläufige Oligonukleotide zu Zellen in Kulturmedium, typischerweise in einer Menge von etwa 200 μg Oligonukleotid/ml, zugegeben werden.
  • Alternativ kann eine gegenläufige Nukleinsäure biologisch hergestellt werden, wobei ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in gegenläufiger Ausrichtung subkloniert wurde (d. h. eine von der eingesetzten Nukleinsäure transkribierte Nukleinsäure wird gegenläufig zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure ausgerichtet sein). Regulierungssequenzen, die mit einer in gegenläufiger Ausrichtung klonierten Nukleinsäure operabel verknüpft sind, können ausgewählt werden, welche die Expression des gegenläufigen RNA-Molekül in einer interessierenden Zelle steuern, z. B. können Promoter und/oder Enhancer oder andere Regulierungssequenzen ausgewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder induzierbare Expression gegenläufiger RNA steuern. Zur induzierbaren Expression gegenläufiger RNA kann beispielsweise ein induzierbares, eukaryotisches Regulierungssystem, wie das Tet-System (wie z. B. beschrieben in Gossen, M. und Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; PCT-Veröffentlichungsnr. WO 94/29442 und PCT-Veröffentlichungsnr. WO 96/01313) verwendet werden. Der gegenläufige Expressionsvektor wird, wie oben für rekombinante Expressionsvektoren beschrieben, hergestellt, wobei jedoch die cDNA (oder ein Teil davon) in gegenläufiger Ausrichtung in den Vektor kloniert wird. Der gegenläufige Expressionsvektor kann z. B. in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen. Der gegenläufige Expressionsvektor wird mit einer herkömmlichen Transfektionstechnik in Zellen eingeführt, wie dies oben bei den rekombinanten Expressionsvektoren beschrieben ist.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist eine gegenläufige Nukleinsäure zur Verwendung als inhibitorisches Agens ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die in der Lage sind, eine einsträngige Nukleinsäure, wie z. B. eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, abzuspalten (Besprechungen zu Ribozymen: siehe z. B. Ohkawa, J. et al. (1995) J. Biochem. 118:251-258; Sigurdsson, S. T. und Eckstein, F. (1995) Trends Biotechnol. 13:286-289 : Rossi, J. J. (1995) Trends Biotechnol. 13:301-306; Kiehntopf, M. et al. (1995) J. Mol. Med. 73:65-71). Ein gegenüber T-bet-mRNA spezifisches Ribozym kann ausgehend von der Nukleotidsequenz der T-bet-cDNA gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, bei dem die Basensequenz der aktiven Stelle komplementär zur abzuspaltenden Basensequenz einer T-bet-mRNA ist, siehe z. B. US-Patente Nr. 4,987,071 und 5,116,742, beide von Cech et al. Alternativ kann T-bet-mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen, siehe z. B. Bartel, D. und Szostak. J. W. (1993) Science 261:1411-1418.
  • Ein anderer Typ eines inhibitorischen Agens, das zur Inhibierung der Expression und/oder der Aktivität von T-bet in einer Zelle verwendet werden kann, ist ein intrazellulärer Antikörper, der für das T-bet-Protein spezifisch ist. Die Verwendung intrazellulärer Antikörper zur Inhibierung der Proteinfunktion in einer Zelle ist dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Carlson. J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge. T. M. et al. (1990) FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca. S. et al. (1994) Bio/Technology 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:5932-5936; Beerli. R. R. et al. (1994) J Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; PCT-Veröffentlichungsnr. WO 94/02610 von Marasco et al., und PCT-Veröffentlichungsnr. WO 95/03832 von Duan et al.).
  • Zur Inhibierung der Proteinaktivität mit einem intrazellulären Antikörper wird ein rekombinanter Expressionsvektor hergestellt, der die Antikörperketten in einer solchen Form codiert, dass die Antikörperketten bei Einführung des Vektors in eine Zelle als funktioneller Antikörper in einem intrazellulären Bereich der Zelle exprimiert werden. Zur Inhibierung der T-bet-Aktivität mittels inhibitorischer Verfahren wird ein intrazellulärer Antikörper, der das T-bet-Protein spezifisch bindet, im Cytoplasma der Zelle exprimiert. Zur Herstellung eines intrazellulären Antikörper-Expressionsvektors werden leicht- und schwerkettige Antikörper-cDNAs, welche für das interessierende Ziel-Protein, z. B. T-bet, spezifische Antikörperketten codieren, typischerweise aus einem Hybridom isoliert, das einen für das T-bet-Protein spezifischen monoklonalen Antikörper sezerniert. Hybridome, die monoklonale Anti-T-bet-Antikörper oder rekombinante, monoklonale Anti-T-bet-Antikörper sezernieren, können wie oben beschrieben hergestellt werden. Sobald ein für das T-bet-Protein spezifischer monoklonaler Antikörper identifiziert ist (z. B. ein Hybridoma-derivatisierter, monoklonaler Antikörper oder ein rekombinanter Antikörper aus einer kombinatorischen Bank), werden DNAs, welche die leichten und die schweren Ketten des monoklonalen Antikörpers codieren, mittels üblicher molekularbiologischer Techniken isoliert. Für Hybridom-derivatisierte Antikörper können leicht- und schwerkettige cDNAs beispielsweise durch PCR-Amplifikation oder cDNA-Bank-Screening erhalten werden. Für rekombinante Antikörper, z. B. aus einer Phagenbank, kann cDNA, welche die leichten und schweren Ketten codiert, aus dem während des Bank-Screening-Prozesses isolierten Display Package (z. B. dem Phagen) gewonnen werden. Nukleotidsequenzen eines Gens mit leichten und schweren Antikörperketten, aus dem PCR-Primer oder cDNA-Bank-Sonden hergestellt werden können, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind einige dieser Sequenzen in Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fünfte Auflage, U. S. Department of Health and Human Services, NIH-Veröffentlichungsnr. 91-3242 und in der „Vbase"-Human-Keimzelllinien- Sequenzdatenbank beschrieben.
  • Einmal erhalten, werden die leicht- und schwerkettigen Antikörper-Sequenzen mittels üblicher Methoden in einen rekombinanten Expressionsvektor kloniert. Um eine Cytoplasma-Expression der leichten und schweren Ketten zu ermöglichen, werden die Nukleotidsequenzen, welche die hydrophoben Leader der leichten und schweren Ketten codieren, entfernt. Ein intrazellulärer Antikörper-Expressionsvektor kann einen intrazellulären Antikörper in einer von mehreren Formen codieren. Beispielsweise codiert der Vektor bei einer Ausführungsform leichte und schwere Antikörperketten voller Länge, so dass ein Antikörper voller Länge intrazellulär exprimiert wird. Bei einer anderen Ausführungsform codiert der Vektor eine leichte Kette voller Länge, aber nur die VH/CH1-Region der schweren Kette, so dass ein Fab-Fragment intrazellulär exprimiert wird. Bei der bevorzugtesten Ausführungsform codiert der Vektor einen einkettigen Antikörper (scFv), bei dem die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten über einen flexiblen Peptid-Linker (z. B. (Gly4Ser)3) verknüpft sind und als einkettiges Molekül exprimiert werden. Zur Inhibierung der T-bet-Aktivität in einer Zelle wird der Expressionsvektor, der den intrazellulären Anti-T-bet-Antikörper codiert, mittels üblicher Transfektionsmethoden, wie sie hier zuvor diskutiert wurden, in die Zelle eingeführt.
  • Noch eine weitere Form eines inhibitorischen Agens ist eine inhibitorische Form von T-bet, die hier auch als dominant-negativer Inhibitor bezeichnet wird, z. B. eine Form von T-bet, bei der die Tyrosin-Phosphorylierungsstellen mutiert sind, oder z. B. eine mutierte Form von T-bet, bei der die Transaktivierungsdomäne entfernt wurde. Solche dominant-negativen T-bet-Proteine können in Zellen mittels eines das T-bet-Protein codierenden, rekombinanten Expressionsvektors exprimiert werden, der mit üblichen Transfektionsmethoden in die Zelle eingeführt wird. Um eine mutierte Form von T-bet, bei der Tyrosinphosphorylierungsstellen oder eine Transaktivierungsdomäne fehlen, zu exprimieren, werden Nukleotidsequenzen, die eine Transaktivierungsdomäne von T-bet codieren, mutiert oder aus den T-bet-Codierungssequenzen mittels üblicher rekombinanter DNA-Techniken entfernt. Die trunkierte DNA wird in einen rekombinanten Expressionsvektor insertiert, der dann in eine Zelle eingeführt wird, um die Expression der veränderten Form von T-bet in der Zelle zu gestatten.
  • Andere stimulatorische Agenzien, die zur Stimulation der Aktivität eines T-bet-Proteins verwendet werden können, sind chemische Verbindungen, welche die T-bet-Aktivität in Zellen stimulieren, wie z. B. Verbindungen, die das T-bet-Protein direkt stimulieren, und Verbindungen, welche die Interaktion zwischen T-bet und Ziel-DNA oder anderen. Proteinen fördern. Solche Verbindungen können mit Screening-Assays identifiziert werden, die für solche Verbindungen selektiv sind, wie dies oben näher beschrieben ist.
  • B. Stimulatorische Agenzien
  • Gemäß einem modulatorischen Verfahren wird die T-bet-Aktivität in einer Zelle durch Kontaktieren der Zelle mit einem stimulatorischen Agens stimuliert. Zu Beispielen für solche stimulatorischen Agenzien zählen aktives T-bet-Protein und T-bet codierende Nukleinsäuremoleküle, die in die Zelle eingeführt werden, um die T-bet-Aktivität in der Zelle zu erhöhen. Ein bevorzugtes stimulatorisches Agens ist ein Nukleinsäuremolekül, das ein T-bet-Protein codiert, wobei das Nukleinsäuremolekül in die Zelle in einer zur Expression des aktiven T-bet-Proteins in der Zelle geeigneten Form eingeführt wird. Zur Expression eines T-bet-Proteins in einer Zelle wird typischerweise zuerst eine T-bet codierende DNA mittels üblicher molekularbiologischer Techniken, wie sie hier beschrieben sind, in einen rekombinanten Expressionsvektor eingeführt. Eine T-bet codierende DNA ist z. B. durch Amplifikation mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von auf der T-bet-Nukleotidsequenz basierenden Primern erhältlich. Nach der Isolation oder Amplifikation der T-bet codierenden DNA wird das DNA-Fragment in einen Expressionsvektor eingeführt und mittels üblicher Verfahren, wie sie hier beschrieben sind, in Zielzellen transfiziert.
  • Andere stimulatorische Agenzien, die zur Stimulation der Aktivität eines T-bet-Proteins verwendet werden können, sind chemische Verbindungen, welche die T-bet-Aktivität in Zellen stimulieren, wie z. B. Verbindungen, die das T-bet-Protein direkt stimulieren, und Verbindungen, welche die Interaktion zwischen T-bet und Ziel-DNA oder anderen Proteinen fördern. Solche Verbindungen können mit Screening-Assays identifiziert werden, die für solche Verbindungen selektiv sind, wie dies oben näher beschrieben ist.
  • Die modulatorischen Verfahren können in vitro (z. B. durch Kultivierung der Zelle mit dem Agens oder durch Einführung des Agens in Zellen, die in Kultur vorliegen) oder alternativ in vivo (z. B. durch Verabreichung des Agens an ein Subjekt oder durch Einführung des Agens in Zellen eines Subjektes, wie z. B. mittels Gentherapie) durchgeführt werden. Zur Durchführung des modulatorischen Verfahrens in vitro können Zellen mittels üblicher Verfahren von einem Subjekt erhalten und in vitro mit einem modulatorischen Agens inkubiert (d. h. kultiviert) werden, um die T-bet-Aktivität in den Zellen zu modulieren. Beispielsweise können mononukleäre Peripherblutzellen (PBMCs) von einem Subjekt erhalten und mittels Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert werden, z. B. mit Ficoll/Hypaque. Spezifische Zellpopulationen können mittels üblicher Verfahren verarmt oder angereichert werden. Beispielsweise können T-Zellen durch positive Selektion mit Antikörpern gegen T-Zellen-Oberflächenmarker angereichert werden, z. B. durch Inkubieren von Zellen mit einem spezifischen, primären monoklonalen Antikörper (mAb), gefolgt von einer Isolation der Zellen, die den mAb binden, unter Verwendung von Magnetperlen, die mit einem sekundären Antikörper beschichtet sind, der die primären mAb bindet. Spezifische Zellpopulationen können auch durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung nach üblichen Verfahren isoliert werden. Falls erwünscht, können mit einem modulatorischen Agens in vitro behandelte Zellen dem Subjekt wieder verabreicht werden. Zur Verabreichung an ein Subjekt kann es bevorzugt sein, zuerst restliche Agenzien in der Kultur von den Zellen zu entfernen, bevor sie dem Subjekt verabreicht werden. Dies kann z. B. mit einer Ficoll/Hypaque-Gradientenzentrifugation der Zellen erfolgen. Weitere Besprechungen der ex vivo-Genmodifikation von Zellen, gefolgt von einer erneuten Verabreichung an ein Subjekt, finden sich auch in US-Patent Nr. 5,399,346 von W. F. Anderson et al.
  • Zur Durchführung des modulatorischen Verfahrens in einem Subjekt in vivo kann das modulatorische Agens dem Subjekt so verabreicht werden, dass die T-bet-Aktivität in Zellen des Subjektes moduliert wird. Der Begriff „Subjekt" soll lebende Organismen umfassen, in denen eine Immunantwort hervorgerufen werden kann. Bevorzugte Subjekte sind Säugetiere. Zu Beispielen für Subjekte zählen Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Kühe, Pferde, Ziegen und Schafe.
  • Bei stimulatorischen oder inhibitorischen Agenzien, die Nukleinsäuren (einschließlich rekombinanter Expressionsvektoren, die das T-bet-Protein codieren, gegenläufiger RNA, intrazellulärer Antikörper oder dominant-negativer Inhibitoren) umfassen, können die Agenzien in Zellen des Subjektes mittels dem Fachmann bekannter Verfahren zur Einführung von Nukleinsäure (z. B. DNA) in Zellen in vivo eingeführt werden. Beispiele für solche Verfahren umfassen sowohl nicht-virale als auch virale Verfahren, wie:
    Direkt-Injektion: Blanke DNA kann in vivo in Zellen eingeführt werden, indem die DNA direkt in die Zellen injiziert wird (siehe z. B. Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Beispielsweise kann eine Zuführvorrichtung (z. B. eine „Genpistole") zur Injektion von DNA in Zellen in vivo verwendet werden. Eine solche Vorrichtung ist kommerziell erhältlich (z. B. von BioRad).
    Kationische Lipide: Blanke DNA kann in vivo in Zellen eingeführt werden, indem die DNA mit kationischen Lipiden komplexiert oder in kationische Lipide eingekapselt wird. Beispiele für geeignete kationische Lipidformulierungen umfassen N-[-1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]N,N,N-triethylammoniumchlorid (DOTMA) sowie 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid (DMRIE) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in einem Molverhältnis von 1:1 (siehe z. B. Logan, J. J. et al. (1995) GeneTherapy 2:38-49; San. H. et al. (1993) Human Gene Therapy 4:781-788).
    Rezeptor-vermittelte DNA Aufnahme: Blanke DNA kann in vivo auch dadurch in Zellen eingeführt werden, dass die DNA an ein Kation, wie Polylysin, komplexiet wird, das mit einem Liganden für einen Zelloberflächen-Rezeptor gekoppelt ist (siehe beispielsweise Wu, G. und Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621, Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967, und US-Patent Nr. 5,166,320). Die Bindung des DNA-Ligand-Komplexes an den Rezeptor erleichtert die Aufnahme der DNA durch Rezeptor-vermittelte Endocytose. Ein DNA-Ligand- Komplex, der mit Adenovirus-Capsiden verknüpft ist, welche natürlicherweise Endosome stören und dadurch Material in das Cytoplasma freisetzen, können verwendet werden, um einen Abbau des Komplexes durch intrazelluläre Lysosome zu vermeiden (siehe z. B. Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-226).
    Retroviren: Defiziente Retroviren sind zur Verwendung für einen Gentransfer zu Gentherapiezwecken gut charakterisiert (eine Besprechung findet sich bei Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). Es kann ein rekombinantes Retrovirus konstruiert werden, das eine interessierende Nukleotidsequenz aufweist, die in das retrovirale Genom eingebaut ist. Zusätzlich können Teile des retroviralen Genoms entfernt werden, um das Retrovirus replikationsdefizient zu machen. Das replikationsdefiziente Retrovirus wird dann in Virionen gepackt, die zum Infizieren einer Zielzelle durch Verwendung eines Helfer-Virus mittels üblicher Techniken verwendet werden können. Protokolle zur Herstellung rekombinanter Retroviren und zur Infektion von Zellen mit solchen Viren in vitro oder in vivo finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) Greene Publishing Associates, (1989), Abschnitte 9.10-9.14 und in anderen Standard-Laborhandbüchern. Beispiele für geeignete Retroviren umfassen pLJ, pZIP, pWE und pEM, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Zu Beispielen für geeignete Verpackungsviruslinien zählen ψCrip, ψCre, ψ2 und ψAm. Retroviren wurden bisher zur Einführung verschiedener Gene in zahlreiche unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Endothelzellen, Lymphocyten, Myoblasten, Hepatocyten und Knochenmarkszellen, in vitro und/oder in vivo verwendet (siehe beispielsweise Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos und Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hw u et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; US-Patent Nr. 4,868,116; US-Patent Nr. 4,980,286; PCT-Anmeldung WO 89/07136; PCT-Anmeldung WO 89/02468; PCT-Anmeldung WO 89/05345, und PCT-Anmeldung WO 92/07573). Retrovirale Vektoren erfordern eine Zielzellteilung, damit das retrovirale Genom (und eine in dieses insertierte, fremde Nukleinsäure) in das Wirtsgenom integriert wird, um eine Nukleinsäure stabil in die Zelle einzuführen. Dabei kann es notwendig sein, die Replikation der Zielzelle zu stimulieren.
    Adenoviren: Das Genom eines Adenovirus kannn so manipuliert werden, dass es ein interessierendes Genprodukt codiert und exprimiert, aber hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Replikation in einem normalen lytischen Virus-Lebenszyklus inaktiviert ist, siehe beispielsweise Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616: Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434 und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Geeignete adenovirale Vektoren, die vom Adenovirusstamm Ad type 5dI324 oder anderen Adenovirus-Stämmen (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 usw.) hergeleitet sind, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Rekombinante Adenoviren sind insofern vorteilhaft, als sie keine Zellteilung benötigen, um wirksame Genbereitstellungsträger zu sein, und können zum Infizieren einer großen Vielfalt von Zelltypen, wie dem Atemwegs-Epithel (Rosenfeld et al. (1992), wie oben zitiert), Endothelzellen (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486), Hepatocyten (Herz und Gerard (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:2812-2816) und Muskelzellen (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584) verwendet werden. Darüber hinaus wird eingeführte adenovirale DNA (und darin enthaltene Fremd-DNA) nicht in das Genom einer Wirtszelle integriert, sondern bleibt episomal, wodurch mögliche Probleme vermieden werden, die infolge einer Insertionsmutagenese in Situationen auftreten können, in denen eingeführte DNA in das Wirtsgenom integriert wird (z. B. retrovirale DNA). Zudem ist die Tragekapazität des adenoviralen Genoms für Fremd-DNA gegenüber anderen Gen-Abgabevektoren groß (bis zu 8 Kilobasen) (Berknern et al., wie oben zitiert; Haj Ahmand und Graham (1986) J. Virol. 57:267). Die meisten replikationsdefizienten adenoviralen Vektoren, die derzeit verwendet werden, sind hinsichtlich der E1- und E3-Virusgene ganz oder teilweise deletiert, behalten jedoch bis zu 80% des adenoviralen genetischen Materials.
    Adeno-assoziierte Viren: Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein natürlich vorkommendes, defizientes Virus, das ein anderes Virus, wie ein Adenovirus oder ein Herpesvirus, als Helfer-Virus für eine wirksame Replikation und einen produktiven Lebenszyklus benötigt. (Eine Besprechung findet sich bei Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. und Immunol. (1992) 158:97-129). Es ist auch eines der wenigen Viren, die ihre DNA in sich nicht teilende Zellen integrieren können, und zeigt eine große Häufigkeit stabiler Integration (siehe z. B. Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828, und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Vektoren, die bis zu minimal 300 AAV-Basenpaare aufweisen, können gepackt und integriert werden. Der Platz für exogene DNA ist auf etwa 4,5 kb beschränkt. Ein AAV-Vektor, wie er in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, beschrieben ist, kann zur Einführung von DNA in Zellen verwendet werden. Verschiedene Nukleinsäuren wurden unter Verwendung von AAV-Vektoren in unterschiedliche Zelltypen eingeführt (siehe beispielsweise Hermonat et al. (1984) Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619, und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790).
  • Die Wirksamkeit eines bestimmten Expressionsvektorsystems und eines Verfahrens zur Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle kann mit üblichen Ansätzen, wie sie der Fachmann routinemäßig einsetzt, eingeschätzt werden. Beispielsweise kann in eine Zelle eingeführte DNA durch eine Filter-Hybridisierungstechnik (z. B. Southern Blotting) detektiert werden, und mittels Transkription der eingeführten DNA produzierte RNA lässt sich beispielsweise mittels Northern Blotting, RNase-Schutz oder Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) detektieren. Das Genprodukt kann durch einen geeigneten Assay detektiert werden, z. B. durch immunologische Detektion eines produzierten Proteins, wie z. B. mit einem spezifischen Antikörper, oder durch einen funktionellen Assay zur Detektion einer funktionellen Aktivität des Genproduktes.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein T-bet codierender, retroviraler Expressionsvektor dazu verwendet, das T-bet-Protein in Zellen in vivo zu exprimieren, um dadurch die T-bet-Protein-Aktivität in vivo zu stimulieren. Solche retroviralen Vektoren können nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden (wie weiter oben erörtert).
  • Ein modulatorisches Agens, wie z. B. eine chemische Verbindung, kann einem Subjekt als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das modulatorische Agens und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" sämtliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen Mitteln und Fungiziden, isotonischen und absorptionsverzögernden Agenzien und dergleichen umfassen, die zur pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. Sofern ein herkömmliches Medium oder Agens nicht inkompatibel mit der aktiven Verbindung ist, wird dessen Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Es können auch zusätzliche aktive Verbindungen in die Zusammensetzungen aufgenommen werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können wie zuvor in Unterabschnitt IV beschrieben hergestellt werden.
  • Die Identifikation von T-bet als Hauptregulator der Entwicklung der hier beschriebenen Th1-Zellen und bei der Unterdrückung des Th2-Phänotyps ermöglicht eine selektive Manipulation von T-Zell-Subsets in verschiedenen klinischen Situationen unter Anwendung der erfindungsgemäßen modulatorischen Verfahren. Die stimulatorischen Verfahren (d. h. Verfahren, bei denen ein stimulatorisches Agens zu Erhöhung der T-bet-Aktivität verwendet wird) führen zur Herstellung von IFN-gamma bei gleichzeitiger Förderung einer Th1-Antwort und Abwärtsregulierung sowohl von IL-2 als auch IL4, wodurch die Th2-Antwort abwärtsmoduliert wird. Im Gegensatz dazu inhibieren die inhibitorischen Verfahren (d. h. Verfahren, bei denen ein inhibitorisches Agens zum Abwärtsmodulieren der T-bet-Aktivität verwendet wird) die Produktion von IFN-gamma bei gleichzeitiger Abwärtsregulierung einer Th1-Antwort und Förderung einer Th2-Antwort. Somit wird zur Behandlung eines Krankheitszustandes, bei dem die Th1-Antwort von Nutzen ist, ein stimulatorisches Verfahren gewählt, so dass Th1-Antworten gefördert und gleichzeitig Th2-Antworten abwärtsreguliert werden. Alternativ dazu wird zur Behandlung eines Krankheitszustandes, bei dem eine Th2-Antwort von Nutzen ist, ein inhibitorisches Verfahren gewählt, so dass Th1-Antworten abwärtsreguliert und gleichzeitige Th2-Antworten gefördert werden. Die Anwendung der Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen kann zur Heilung des Zustandes, zu einer langfristigen oder kurzfristigen Verringerung der Art oder Anzahl von mit dem Zustand verbundenen Symptomen (d. h. Verbesserung des Zustandes) oder einfach zu einem vorübergehenden Nutzeffekt für das Subjekt führen.
  • Zahlreiche Krankheitszustände, die mit einer prädominanten Th1- oder Th2-Antwort verbunden sind, wurden identifiziert und könnten von einer Modulation der Art der Antwort profitieren, die in dem Individuum erzeugt wird, das an dem Krankheitszustand leidet. Die Anwendung immunmodulatorischer Verfahren bei solchen Erkrankungen ist nachfolgend näher beschrieben.
  • A. Allergien
  • Allergien werden durch IgE-Antikörper vermittelt, deren Produktion durch die Aktivität von Th2-Zellen und das dadurch produzierte Cytokin reguliert wird. Bei allergischen Reaktionen wird von Th2-Zellen IL-4 produziert, das die Produktion der IgE-Antikörper und die Aktivierung von Zellen, die allergische Reaktionen vermitteln, d. h. Mastzellen und Basophile, weiter stimuliert. IL-4 spielt auch bei Eosinophil-vermittelten Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle. Daher können stimulatorische Verfahren angewandt werden, um die Produktion von Th2-assoziierten Cytokinen und insbesondere von IL-4 in Allergiepatienten als Mittel zur Abwärtsregulierung der Produktion pathogener IgE-Antikörper zu inhibieren. Ein stimulatorisches Agens kann dem Subjekt direkt verabreicht werden, oder Zellen (z. B. Thp-Zellen oder Th2-Zellen) können von dem Subjekt erhalten, mit einem stimulatorischen Agens ex vivo kontaktiert und dem Subjekt wieder verabreicht werden. Zudem kann es in gewissen Situtationen günstig sein, dem Subjekt das Allergen zusammen mit dem stimulatorischen Agens oder mit dem stimulatorischen Agens behandelte Zellen zu verabreichen, um die Allergen-spezifische Antwort zu inhibieren (z. B. zu desensibilisieren). Die Behandlung kann dadurch weiter verbessert werden, dass dem allergischen Subjekt andere T1-fördernde Agenzien, wie das Cytokin IL-12 oder Antikörper gegen Th2-assoziierte Cytokine (z. B. Anti-IL-4-Antikörper) in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um eine Antwort vom Th1-Typ weiter zu stimulieren.
  • B. Krebs
  • Wie berichtet wurde, ist die Expression Th2-fördernder Cytokine bei Krebspatienten erhöht (siehe z. B. Yamamura, M., et al. (1993) J Clin. Invest. 91:1005-1010; Pisa, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7708-7712), und eine maligne Erkrankung ist häufig mit einer Verlagerung der Th1-Antworten zu Th2-Antworten zusammen mit einer Verschlimmerung des Krankheitsverlaufs verbunden. Somit können die stimulatorischen Verfahren dazu eingesetzt werden, die Produktion Th2-assoziierter Cytokine in Krebspatienten als Möglichkeit, der Verlagerung von Th1 zu Th2 entgegenzuwirken, zu inhibieren und dadurch eine bereits stattfindende Th1-Antwort in den Patienten zu fördern, um den Krankheitsverlauf zu verbessern. Das stimulatorische Verfahren kann eine direkte Verabreichung eines stimulatorischen Agens an ein Subjekt mit Krebs oder eine ex vivo-Behandlung von Zellen, die von dem Subjekt erhalten wurden (z. B. Thp- oder Th2-Zellen), mit einem stimulatorischen Agens, gefolgt von einer erneuten Verabreichung der Zellen an das Subjekt, beinhalten. Die Behandlung kann weiter verbessert werden, indem andere Th1-fördernde Agenzien, wie das Cytokin IL-12 oder Antikörper gegen Th2-assoziierte Cytokine (z. B. Anti-IL-4-Antikörper), dem Rezipienten in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um eine Th1-Antwort weiter zu stimulieren.
  • C. Infektiöse Erkrankungen
  • Von der Expression der Th2-fördernden Cytokine wurde auch berichtet, dass sie während einer Reihe infektiöser Erkrankungen, wie der HIV-Infektion, Tuberkulose, Leishmaniase, Schistosomiase, Filarien-Infektion und intestinale Nematoden-Infektion (siehe z. B.: Shearer, G. M. und Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:243; Clerici, M und Shearer, G. M. (1993) Immunology Today 14:107-111; Fauci, A. S. (1988) Science 239:617-623; Locksley, R. M. und Scott, P. (1992) Immunoparasitology Today 1:A58-A61: Pearce, E. J., et al. (1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M., et al. (1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kullberg, M. C., et al. (1992) J Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A. J., et al. (1993) J. Immunol. 150:1395-1402; Pearlman, E., et al. (1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K. J., et al. (1994) J. Exp. Med. 179:347-351) ansteigt, und diese infektiösen Erkrankungen sind ebenfalls mit einer Verlagerung der Immunantwort von Th1 zu Th2 verbunden. Somit können die stimulatorischen Verfahren dazu verwendet werden, die Produktion von Th2-assoziierten Cytokinen in Subjekten mit infektiösen Erkrankungen als Möglichkeit, der Verlagerung von Th1 zu Th2 entgegenzuwirken, zu inhibieren und dadurch eine bestehende Th1-Antwort in den Patienten zu fördern, um den Verlauf der Infektion zu verbessern. Das stimulatorische Verfahren kann eine direkte Verabreichung eines inhibitorischen Agens an ein Subjekt mit einer infektiösen Erkrankung oder eine ex vivo-Behandlung von Zellen, die von dem Subjekt erhalten wurden (z. B. Thp- oder Th2-Zellen), mit einem stimulatorischen Agens, gefolgt von einer erneuten Verabreichung der Zellen an das Subjekt, beinhalten. Die Behandlung kann weiter verbessert werden, indem andere Th1-fördernde Agenzien, wie das Cytokin IL-12 oder Antikörper gegen Th2-assoziierte Cytokine (z. B. Anti-IL-4-Antikörper), dem Rezipienten in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um eine Th1-Antwort weiter zu stimulieren.
  • D. Autoimmunerkrankungen
  • Die inhibitorischen Verfahren können therapeutisch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, die mit einer Th2-Dysfunktion verbunden sind, eingesetzt werden. Einige Autoimmunstörungen sind das Ergebnis einer unangemessenen Aktivierung von T-Zellen, die gegen Eigengewebe reaktiv sind und die Produktion von Cytokinen und Autoantikörpern fördern, die an der Pathologie der Erkrankungen beteiligt sind. Eine Modulation von T-Helfer-Antworten kann sich auf den Verlauf der Autoimmunerkrankung auswirken. Beispielsweise vermindert die Stimulation einer Th2-Antwort bei einer experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) durch Verabreichung von IL-4 zum Zeitpunkt der Induktion der Erkrankung die Schwere der Autoimmunerkrankung (Paul, W. E., et al. (1994) Cell 76:241-251). Ferner zeigte sich, dass die Genesung der Lebewesen von der Erkrankung mit einem Anstieg einer Th2-Antwort zusammenhing, wie sich durch eine Zunahme an Th2-spezifischen Cytokinen zeigte (Koury, S. J., et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1355-1364). Zudem sezernieren T-Zellen, die EAE unterdrücken können, Th2-spezifische Cytokine (Chen, C., et al. (1994) Immunity 1:147-154). Da die Stimulation einer Th2-Antwort in EAE eine Schutzwirkung gegen die Erkrankung hat, ist es wahrscheinlich, dass die Stimulation einer Th2-Antwort in Subjekten mit Multipler Sklerose (für die EAE ein Modell ist) von therapeutischem Nutzen ist. Die inhibitorischen Verfahren können dazu verwendet werden, eine solche Verringerung zu bewirken.
  • Ebenso bietet die Stimulation einer Th2-Antwort bei Diabetes vom Typ I in Mäusen eine Schutzwirkung gegen die Erkrankung. Tatsächlich verhindert oder verzögert die Behandlung von NOD-Mäusen mit IL-4 (das eine Th2-Antwort fördert) das Einsetzen von Diabetes vom Typ I, der sich normalerweise in diesen Mäusen entwickelt (Rapoport, M. J., et al. (1993) J. Exp. Med. 178:87-99). Somit kann eine Stimulation einer Th2-Antwort in einem Subjekt, das an Diabetes leidet oder dazu neigt, die Auswirkungen der Erkrankung lindern oder deren Einsetzen inhibieren.
  • Noch eine weitere Autoimmunerkrankung, bei der die Stimulation einer Th2-Antwort von Nutzen sein kann, ist die rheumatoide Arthritis (RA). Studien haben gezeigt, dass Patienten mit rheumatoider Arthritis vorwiegend Th1-Zellen im Synovialgewebe aufweisen (Simon, A. K., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8562-8566). Durch Stimulation einer Th2-Antwort in einem Subjekt mit RA kann eine Th1-Antwort gleichzeitig abwärtsmoduliert werden, um dadurch die Auswirkungen der Erkrankung zu lindern.
  • Somit können die inhibitorischen Verfahren dazu eingesetzt werden, die Produktion Th2-assoziierter Cytokine in Subjekten zu stimulieren, die an einer Autoimmunerkrankung leiden, bei der eine Th2-Antwort für den Verlauf der Erkrankung vorteilhaft ist, oder die zu einer solchen Erkrankung neigen. Das inhibitorische Verfahren kann eine direkte Verabreichung eines inhibitorischen Agens an das Subjekt oder eine ex vivo-Behandlung von Zellen, die von dem Subjekt erhalten wurden (z. B. Thp-, Th1-Zellen, B-Zellen, nicht-lymphoide Zellen), mit einem stimulatorischen Agens, gefolgt von einer erneuten Verabreichung der Zellen an das Subjekt, beinhalten. Die Behandlung kann weiter verbessert werden, indem andere Th2-fördernde Agenzien, wie IL-4 selbst oder Antikörper gegen Th1-assoziierte Cytokine, dem Subjekt in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um eine Th2-Antwort weiter zu stimulieren.
  • Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Autoimmunerkrankungen, bei denen eine Th2-Antwort erwünscht ist, können andere Autoimmunerkrankungen durch eine Th1-Antwort gelindert werden. Solche Erkrankungen können mit einem stimulatorischen Agens (wie oben für Krebs und infektiöse Erkrankungen beschrieben) behandelt werden. Die Behandlung kann weiter verbessert werden, indem ein Th1-förderndes Cytokin (z. B. IFN-γ) dem Subjekt in Mengen verabreicht wird, die ausreichen, um eine Th1-Antwort weiter zu stimulieren.
  • Die Wirksamkeit von Agenzien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen kann in den oben beschriebenen Tiermodellen für menschliche Erkrankungen (z. B. EAE als Modell für Multiple Sklerose und die NOD-Mäuse als Modell für Diabetes) oder anderen gut charakterisierten Tiermodellen für menschliche Autoimmunerkrankungen getestet werden. Zu solchen Tiermodellen zählen die mrl/lpr/lpr Maus als Modell für Lupus erythematosus, Collagen-induzierte Arthritis bei Mäusen als Modell für rheumatoide Arthritis, und experimentelle Myasthenia gravis bei Mäusen (siehe Paul, Hrsg., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 840-856). Ein modulatorisches (d. h. stimulatorisches oder inhibitorisches) Agens wird verabreicht, um Lebewesen zu testen, wobei dann der Verlauf der Erkrankung in den Test-Lebewesen mittels üblicher Verfahren für das jeweils verwendete Modell überwacht wird. Die Wirksamkeit des modulatorischen Agens ist anhand der Verbesserung des Erkrankungszustandes in mit dem Agens behandelten Lebewesen im Vergleich zu unbehandelten Lebewesen (oder mit einem Kontroll-Agens behandelten Lebewesen) ersichtlich.
  • Nicht einschränkende Beispiele für Autoimmunerkrankungen und Störungen mit einer Autoimmun-Komponente, die behandelt werden können, umfassen Diabetes mellitus, Arthritis (einschließlich rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, psoriatischer Arthritis), Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, systemischen Lupus erythematosis, autoimmune Thyroiditis, Dermatitis (einschließlich atopischer Dermatitis und ekzematöser Dermatitis), Psoriasis, das Sjögren-Syndrom, einschließlich Keratokonjunktivitis sicca als Begleiterscheinung des Sjögren-Syndroms, Alopecia areata, allergische Reaktionen aufgrund von Arthropodenbissreaktionen, Morbus Crohn, Aphthen, Iritis, Konjunktivitis, Keratokonjunktivitis, Colitis ulcerosa, Asthma, allergisches Asthma, kutaner Lupus erythematosus, Skleroderma, Vaginitis, Proctitis, Arzneimitteleruptionen, Lepra-Rückfallreaktionen, Erythema nodosum leprosum, Autoimmunuveitis, allergische Encephalomyelitis, akute, nekrotisierende, hämorrhagische Encephalopathie, idiopathischer bilateraler, progressiver sensorineuraler Hörverlust, aplastische Anämie, reine rote Blutkörperchen-Anämie, idiopathische Thrombocytopenie, Polychondritis, Wegenersche Granulomatose, chronische aktive Hepatitis, das Stevens-Johnson-Syndrom, idiopathische Sprue, Lichen planus, Morbus Crohn, Graves-Ophthalmopathie, Sarkoidose, primäre biliäre Zirrhose, Uveitis posterior und interstitielle Lungenfibrose.
  • E. Transplantation
  • Während eine Transplantatabstoßung oder Transplantatannahme nicht ausschließlich der Wirkung eines bestimmten T-Zell-Subsets (d. h. Th1- oder Th2-Zellen) im Transplantat-Empfänger zuzuschreiben sein kann (Diskussion siehe Dallman, M. J. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:632-638), haben zahlreiche Studien eine prädominante Th2-Antwort bei verlängerter Transplantat-Überlebensdauer oder eine prädominante Th2-Antwort bei einer Transplantatabstoßung impliziert. Beispielsweise wurde die Transplantatannahme mit der Produktion eines Th2-Cytokinmusters in Verbindung gebracht, und/oder die Transplantatabstoßung wurde mit der Produktion eines Th1-Cytokinmusters in Verbindung gebracht (siehe z. B. Takeuchi, T. et al. (1992) Transplantation 53:1281-1291; Tzakis, A. G. et al. (1994) J. Pediatr. Surg. 29:754-756; Thai, N. L. et al. (1995) Transplantation 59:274-281). Zusätzlich verlängert ein adoptiver Transfer von Zellen, die einen Th2-Cytokin-Phänotyp aufweisen, die Überlebensdauer eines Hauttransplantates (Maeda, H. et al. (1994) Int. Immunol. 6:855-862) und verringert die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (Fowler, D. H. et al. (1994) Blood 84:3540-3549; Fowler, D. H. et al. (1994) Prog. Clin. Biol. Res. 389:533-540). Darüber hinaus verlängert die Verabreichung von IL-4, das die Th2-Differenzierung fördert, die Überlebensdauer eines allgonen Herz-Transplantates (Levy, A. E. und Alexander, J. W. (1995) Transplantation 60:405-406), während die Verabreichung von IL-12 in Kombination mit Anti-IL-10-Antikörpern, welche die Th1-Differenzierung fördern, die Abstoßung allogener Hauttransplantate verstärkt (Gorczynski, R. M. et al. (1995) Transplantation 60:1337-1341).
  • Daher können die inhibitorischen Verfahren dazu verwendet werden, die Produktion Th2-assoziierter Cytokine in Transplantat-Empfängern zu stimulieren, um die Überlebensdauer des Transplantates zu verlängern. Die inhibitorischen Verfahren können sowohl zur soliden Organtransplantation als auch zur Knochenmarkstransplantation verwendet werden (z. B. um die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit zu inhibieren). Das inhibitorische Verfahren kann eine direkte Verabreichung eines inhibitorischen Agens an den Transplantat-Empfänger oder eine ex vivo-Behandlung von Zellen, die von dem Subjekt erhalten wurden (z. B. Thp, Th-1Zellen, B-Zellen, nicht-lymphoide Zellen), mit einem inhibitorischen Agens, gefolgt von einer erneuten Verabreichung der Zellen an das Subjekt, beinhalten. Die Behandlung kann weiter verbessert werden, indem andere Th2-fördernde Agenzien, wie IL-4 selbst oder Antikörper gegen Th1-assoziierte Cytokine, dem Empfänger in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um eine Th2-Antwort weiter zu stimulieren.
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Erkrankungssituationen sind die modulatorischen Verfahren auch für andere Zwecke brauchbar. Beispielsweise können die stimulatorischen Verfahren (d.h. Verfahren, bei denen ein stimulatorisches Agens verwendet wird) zur Stimulation der Produktion Th1-fördernder Cytokine (z. B. Interferon-gamma) in vitro zur kommerziellen Produktion dieser Cytokine verwendet werden (z. B. können Zellen mit dem stimulatorischen Agens in vitro kontaktiert werden, um die Interferon-gamma-Produktion zu stimulieren, und das Interferon-gamma kann aus dem Kulturüberstand gewonnen, gegebenenfalls weiter gereinigt und zur kommerziellen Verwendung verpackt werden).
  • Ferner können die modulatorischen Verfahren bei Impfungen zur Anwendung kommen, um entweder eine Th1- oder eine Th2-Antwort auf ein interessierendes Antigen in einem Subjekt zu fördern. Dabei können die Agenzien als Adjuvanzien dienen, um eine Immunantwort auf ein Vakzin entweder gegen eine Th1-Antwort oder eine Th2-Antwort zu richten. Beispielsweise können das Antigen und ein inhibitorisches Agens zum Fördern einer Antikörperantwort auf ein interessierendes Antigen (d. h. zu Impfzwecken) einem Subjekt zusammen verabreicht werden, um in dem Subjekt eine Th2-Antwort auf das Antigen zu fördern, da Th2-Antworten wirksame B-Zellen-Hilfe bereitstellen und die IgG1-Produktion fördern. Alternativ dazu können das Antigen und ein stimulatorisches Agens zum Fördern einer zellulären Immunantwort auf ein interessierendes Antigen einem Subjekt zusammen verabreicht werden, um in dem Subjekt eine Th1-Antwort auf das Antigen zu fördern, da Th1-Antworten die Entwicklung von zellvermittelten Immunantworten (z. B. verzögerten Hypersensibilitätsantworten) begünstigen. Das interessierende Antigen und das modulatorische Agens können zusammen als eine einzige pharmazeutische Zusammensetzung oder als getrennte Zusammensetzungen formuliert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das interessierende Antigen und das modulatorische Agens dem Subjekt gleichzeitig verabreicht. Alternativ dazu kann es in gewissen Situationen erwünscht sein, zuerst das Antigen und dann das modulatorische Agens zu verabreichen, oder umgekehrt (z. B. kann es im Falle eines Antigens, das natürlicherweise eine Th1-Antwort hervorruft, vorteilhaft sein, zuerst das Antigen alleine zu verabreichen, um eine Th1-Antwort zu stimulieren, und dann ein inhibitorisches Agens, alleine oder zusammen mit einem Antigen-Boost, zu verabreichen, um die Immunantwort zu einer Th2-Antwort hin zu verändern).
  • Diese Erfindung wird weiter durch das nachfolgende Beispiel veranschaulicht, das nicht als einschränkend zu verstehen ist. Zusätzlich sind alle in öffentlichen Datenbanken hinterlegten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, auf die hier Bezug genommen wird, hier ebenfalls durch Bezugnahme aufgenomen.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, das Maus-T-bet-cDNA umfasst, die in die EcoRI-Stelle des pJG4-5-Vektors kloniert ist, wurde am 9. November 1999 bei der American Type Culture Collection (Manassas, VA) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer PTA-930. Ein Nukleinsäuremolekül, das menschliche T-bet-cDNA (hergestellt aus RNA des menschlichen Th1-Klons ROT-10) umfasst, die in den PCR 2.1-TOPO-Vektor kloniert ist, wurde am 28. Januar 2000 bei der American Type Culture Collection (Manassas, VA) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer PTA-1339. Beide Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens.
  • BEISPIELE
  • In den Beispielen wurden die folgenden Versuchsverfahren eingesetzt:
  • Mäuse, Zelllinien, Cytokine, Antikörper und Plasmide
  • BALB/c-Mäuse wurden von Jackson Laboratories erhalten; DO11.10 TcR-transgene Mäuse (Jacobson, N. G., et al. 1995. J. Exp. Med. 181, 1755-1762) und MBP TcR-transgene Mäuse (Lafaille, J. J., 1994. Cell 78, 399-408.) sind beschrieben. Die Mäuse wurden im Alter von 5 bis 6 Wochen verwendet. Zelllinien und primäre Zellen wurden in Komplettmedium aufbewahrt, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänztes RPMI 1640 (HyClone Laboratories), Glutamin (2 mM), Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml), Hepes (100 mM) und β-ME (50 μM) enthielt. Jurkat ist ein menschliches Th1-Lymphom, EL4 ein Maus-Th0-Thymom, NK3.3 eine menschliche NK-Zelllinie (Ye, J., 1995. J. Leuko. Biol. 58, 225233.; Kornbluth, J., 1982. J. immunol. 129, 2831-2837), YT eine menschliche NK-Zelllinie (Yodoi, J., 1985. J. of Immuno. 134, 1623-1630), AE7 ein Maus-Th1-Klon, D10 ein Maus-Th2-Klon und M12 eine B-Zellen-Lymphomlinie. Es wurden rekombinantes IL-4 von DNAX, menschliches rIL-2 von der Chiron Corp., rIL-12 von Hoffman LaRoche und rIL-18 von Peprotech, Inc. erhalten. Monoklonales Anti-IL12, monoklonales Anti-IFN-γ und monoklonales Anti-IL-4 (IIBII) wurden ebenfalls verwendet (Ohara, J. und Paul, W. E. 1985. Nature 315, 333-336). Sowohl die polyklonalen T-bet-Antiseren, die in Kaninchen produziert wurden, als auch die mAb wurden gegen rekombinantes, bakteriell produziertes T-bet voller Länge gezüchtet. Der mAb wurde durch Fusion von Milzzellen aus Mäusen mit dem SP2/O-Ag14-Myelom fusioniert und ist vom IgG1-Subtyp. Die Expressionplasmide umfassten c-Maf (pMex-maf) (Ho, I-C., et al. 1996. Cell 85, 973-983), NFATp (Hodge. M. R., et al. 1996. Immunity 4, 1-20) und p65, wobei die beiden letztgenannten in den pcDNA-Vektor kloniert waren.
  • CD4+-T-Zell-Reinigung und in vitro-Kulturen
  • CD4+-T-Zellen aus Lymphknoten (LN) wurden mittels Flußcytometrie unter Verwendung von PE-konjugiertem Anti-CD4 (RM4-4) (Pharmingen) gereinigt und mittels FACS (Mo Flo, Becton Dickenson) nach 98-99%iger Reinheit sortiert. Zur Aktivierung in vitro wurden 2 × 106/ml CD4+-Zellen in Komplettmedium resuspendiert und mit 1 μg/ml plattengebundenem Anti-CD3 (2C11) und 2 μg/ml Anti-CD28 (Pharmingen) 3 Tage in Gegenwart von 100 Einheiten/ml IL2 aktiviert. Dann wurden die Zellen 1:4 in Komplettmedium aufgeteilt und 4 Tage in Gegenwart von 100 Einheiten/ml IL2 kultiviert. Am 7. Tag nach der primären Stimulation wurden die Zellen geerntet, zweimal gewaschen und in einer Menge von 1 × 106 Zellen/ml mit 1 μg/ml plattengebundenem Anti-CD3 während 1,3 und 6 Stunden erneut stimuliert. Für Th1- und Th2-Differenzierungskulturen wurden nicht-transgene oder DO11.10 LN- und Milzzellen gepoolt, in 1 × 106 Zellen/ml Komplettmedium resuspendiert und unter Th1-Bedingungen (10 mg/ml Anti-IL4 [11B11], 10 ng/ml rIL12) oder Th2-Bedingungen (10 mg/ml Anti-IFNγ, 10 ng/ml IL4) mit 1 μg/ml plattengebundenem Anti-CD3 kultiviert. Die Zellen wurden am 3. Tag 1:4 mit Komplettmedium +100μ/ml IL2 aufgeteilt. Am 7. Tag wurden die Zellen mit 1 μg/ml Anti-CD3 für 4 Stunden erneut stimuliert und zur RNA-Herstellung geerntet (Jacobson, N. G., et al. 1995). J. Exp. Med. 181, 1755-1762). Nach 24 Stunden wurden Überstände zum Testen auf Cytokine genommen.
  • Northern und Western Blot-Analyse
  • Aus ruhenden und stimulierten Zellen wurde Gesamt-RNA mit TRIZOL-Reagens (Gibco/BRL) isoliert und 10 μg jeder Probe wurden auf 1,2% Agarose- 6% Formaldehyd-Gelen aufgetrennt, über Nacht auf eine Gen-Screen-Membran (NEN) in 20X SSC transferiert und mit einem UV-Stratalinker (Stratagene) kovalent gebunden. Eine Hybridisierung der Blots wurde wie beschrieben bei 42°C durchgeführt (Hodge, M. R., et al. 1996. Immunity 4, 1-20), wobei die folgenden, mit 32P markierten cDNA-Sonden verwendet wurden: T-bet, γ-Aktin. Kern- und Cytoplasma-Extrakte für eine Western Blot-Analyse wurden aus AE7.D10- und NK3.3-Zellen hergestellt. Die Kerne wurden wie beschrieben isoliert (Dolmetsch, R. E., et al. 1997. Nature 386, 855-858). Die extrahierten Proteine wurden mittels 8% PAGE, gefolgt von einem Elektrotransfer auf Nitrocellulose-Membranen, getrennt und mit einem für T-bet spezifischen mAb sondiert, gefolgt von einem Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG und verstärkter Chemilumineszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers (Amersham).
  • Assays mit vorübergehender Transfektion
  • EL4- und Jurkat-Zellen wurden mit einem Bio Rad Electroporator (280 V, 975 μF) unter Verwendung von 5 × 106 Zellen in 0,4 ml RPMI pro Transfektion mit 5 μg Reporter-Plasmid und 5 bis 10 μg Expressionsplasmid transfiziert. Nach 24 Stunden wurden Luciferase-Assays durchgeführt, wobei die Luciferase-Aktivität in 20% jeder Probe gemäß Anweisungen bestimmt wurde (Promega). Das IFN-γ-Reporter-Luciferase-Konstrukt wird aus dem Plasmid pB9 erhalten, welches das gesamte menschliche IFN-γ-Gen enthält (P. Gray und D. V. Goeddel. 1982. Nature. 298:859). Das pGL2-Luciferase-Gen wurde in das erste Exon von pB9 insertiert. IL-2-Promoter-Reporterkonstrukt. Das IL-4-Promoter-Reporterkonstrukt, IL-4Luc, enthält 807 bp stromaufwärts des Maus-IL-4-Gens.
  • Retrovirale Konstrukte und Transduktion
  • Der bicistronische GFP-RV-Vektor wurde ebenso beschrieben (Ouyang, W., et al. 1998. Immunity 9:745-755) wie die Phoenix-Eco-Packzelllinie (Kinoshita, S., et al. 1998. Cell 95, 595-604). Der GFP-RV-Vektor wurde mittels Insertieren der internen ribosomalen Eingangssequenz (IHRES) des Encephalomyocarditis-Virus und des GFP-Allels in den retroviralen MSCV2.2-Vektor (Ouyang, W., et al. 1998. Immunity 9:745-755) oder in den IL-2-MSCV-Vektor konstruiert. Beide Vektoren exprimieren zwei cDNAs, T-bet und die cDNA, die GFP codiert, wobei gleichzeitig eine IRES verwendet wird, um eine Translation jeder mRNA einzeln zu initiieren. Die Transfektion der Packzelllinie und retrovirale Transduktionen primärer T-Zellen wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Ouyang, W., et al. 1998. Immunity 9:745-755).
  • Intrazelluläre Cytokinfärbung und FACS-Analyse
  • Eine intrazelluläre Färbung für Cytokin wurde wie beschrieben durchgeführt (Ouyang, W., et al. 1998. Immunity 9:745-755). Primäre transgene oder nicht-transgene T-Zellen, die über verschiedene Zeiträume wie angegeben mit Retrovirus infiziert worden waren, wurden mit PMA (50 ng/ml und Ionomycin (1 uM) 2 Stunden restimuliert, und 10 μg/ml Brefeldin A wurde weitere 2 Stunden zugegeben.
  • Beispiel 1: Klonieren eines neuen Transkriptionsfaktors, T-bet
  • Da die Th1-spezifische Region des IL-2-Promoters gut lokalisiert worden war (Brombacher, F., et al. 1994. Int. Immunol. 6:189-197.; Rooney, J., et al. 1995. Mol. Cell. Biol. 15, 6299-6310; Lederer, J. A., et al. 1994. J. Immunol. 152, 77-86; Durand, D., et al. 1988. Mol. Cell. Biol. 8, 1715-1724; Hoyos, B., et al. 1989: Science 244, 457-450), wurde ein Hefe-Ein-Hybrid-Ansatz unter Verwendung eines IL-2 Promoter-Reporters und einer aus dem OF6 Th1-Klon hergestellten cDNA-Bank gewählt, um Th1-spezifische Transkriptionsfaktoren zu identifizieren. Zur Validierung dieses Ansatzes wurde die Th2-spezifische Region des IL-4-Promoters in Hefe exprimiert und gezeigt, dass diese durch Einführung von c-Maf, aber nicht durch verschiedene andere Transkriptionsfaktoren (z. B. NFAT) transaktiviert wird. Eine C-Maf-Transaktivierung erfolgte nicht, wenn das c-Maf-Antwortelement (MARE) mutiert war. Daher wurde der Hefe-Ein-Hybrid-Ansatz angewandt.
  • Der EGY48-Hefestamm wurde stabil in das IL-2 Promoter/Histidin-Konstrukt integriert und mit einer cDNA-Bank transformiert, die aus einem Anti-CD3-aktivierten Th1-Zellklon, OF6, hergestellt war. Von 5,6 × 106 gescreenten Klonen waren 488 beim primären Screening positiv. Von den 210 während des zweiten Screens getesteten Klonen erwiesen sich 72 als spezifisch für den IL2-Promoter. Um die Anzahl positiver Klone zu reduzieren, hybridisierten wir die Hefe-Klon-cDNA mit cDNAs, die in Th1- und Th2-Zelllinien differenziert exprimiert wurden. Diese Th1-Th2- und Th2-Th1-cDNAs wurden unter Verwendung des Clontech PCR-Select Kit hergestellt, radioaktiv markiert und zunächst in einem Pilotversuch zum Screenen der 16 positivsten Hefe-Klone verwendet. Von diesen 16 Klonen waren 8 positiv gegenüber der Th1 (PL17)-spezifischen DNA-Produktsonde, und nicht gegenüber der Th2 (D 10)-spezifischen cDNA-Produktsonde. Es wurde eine repräsentative Differenzanalyse (RDA; z. B. Lisitsyn. 1993. Science. 259:946; O'Neill und Sinclair. 1997. Nucleic Acids Res. 25:2681; Hubank und Schatz. 1994. Nucleic Acids Research. 22:5640; Welford et al. 1998. Nucleic Acids Research. 26:3059) mit einer Th1-Th2-Sonde bei 16 positiven Klonen mit einer Kontrollhybridisierung der Sonde zu IL-2, IFN-gamma und IL-4 durchgeführt. Die Spezifität der Th1- und Th2-subtrahierten cDNA-Sonden zeigt sich jeweils durch ihre Detektion von IL-2 und IFN-γ gegenüber IL-4.
  • Restriktionsenzymanalysen und Sequenzierungsdaten zeigten, dass alle 8 Klone verwandt waren. Sie fielen in drei Gruppierungen, basierend auf Unterschieden in den 5'- und 3'-untranslatierten Regionen, wobei jede dieser Kategorien ein unabhängiges cDNA-Molekül darstellt. Ein Vergleich der Sequenz dieser Klone mit der NCBI-GenBank-Sequenzdatenbank ergab eine Homologie mit der T-Box-Familie der Transkriptionsfaktoren. 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von T-bet.
  • Beispiel 2: T-bet teilt sich eine Homologieregion mit den T-Box-Familienmitgliedern T-brain und Eomesodermin
  • Brachyurie oder T ist das Gründungsmitglied einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine 200 Aminosäuren umfassende, als T-Box bezeichnete DNA-Bindungsdomäne gemeinsam ist (besprochen in Smith, J. 1997. Current Opinion in Genetics & Development 7, 474-480; Papaioannou und Silver. 1998. Bioessay. 20:9; Meisler, M. H. 1997. Mammalian Genome 8, 799-800). Die Brachyurie (Griechisch für „kurzer Schwanz")-Mutation wurde erstmals 1927 für heterozygote, mutierte Lebewesen beschrieben, die einen kurzen, leicht geknickten Schwanz hatten (Herrmann, B. G., 1990. Nature 343, 617-622). Es gibt nun acht T-Box-Gene in der Maus, Brachyurie nicht mitgezählt. Dazu gehören Tbx1-6, T-brain-1 (Tbr-1) und nun T-bet, jeweils mit einem eigenen und üblicherweise komplexen Expressionsmuster. Die T-Box-Familie der Transkriptionsfaktoren ist durch eine Homologie der Familienmitglieder hinsichtlich der DNA-Bindungsdomäne definiert. Die T-bet-DNA- Bindungsdomäne (Reste 138-327 von Maus-T-bet) ist den T-Box-Domänen von Maus-T-brain und Xenopus eomesodermin am ähnlichsten und ordnet T-bet somit in die Tbr1-Unterfamilie der T-Box-Genfamilie ein. Das menschliche Homolog des Maus-T-bet-Proteins ist etwa zu 88% mit Maus-T-bet identisch. 1A wurde unter Verwendung eines Lipman-Pearson-Protein-Alignment (wobei ein G-Penalty bei 4 und ein Gap-Längen-Penalty bei 12 gesetzt sind) hergeleitet. Der Ähnlichkeitsindex wurde als 86,6, der Gap-Penalty als 2, die Gap-Länge als 5, und die Konsenslänge als 535 berechnet). T-bet hat eine Homologieregion mit den T-Box-Familienmitgliedern T-brain und Eomesodermin gemeinsam. Die Maus-T-bet-DNA-Bindungsdomäne ist den T-Box-Domänen von Maus-T-brain und Xenopus eomesodermin am ähnlichsten. Zwischen den drei T-Box-Regionen liegt eine Aminosäureübereinstimmung von etwa 69% vor. T-bet weist keine Sequenzhomologie mit anderen T-Box-Familienmitgliedern außerhalb der T-Box-Domäne auf.
  • Beispiel 3: T-bet bindet an Konsens-T-Box-Stellen und transaktiviert diese und hat funktionell wichtige Domänen, die sowohl an 5'- als auch an 3'-Regionen kartieren
  • Rekombinantes T-bet-Protein bindet an Konsens-T-Box-Stellen und an die T-bet-Stelle im IL-2-Promoter, und ein in Kernextrakten von Anti-CD3-stimulierten AE7 Th1-Zellen vorhandener Komplex bindet spezifisch an eine Konsens (GGGAATTTCACACCTAGGTGAAATTCC)-T-Box-Oligonukleotidsonde. Zum Testen der Aktivität von T-bet in T-Zellen wurden die folgenden Versuche durchgeführt: Jurkat-Th1-Zellen wurden mit T-bet und einem Luciferase-Reporterkonstrukt cotransfiziert. 2A zeigt das Grundniveau (offene Balken) und die durch PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (1 uM) induzierte (geschlossene Balken) Promoter-Aktivität in Jurkat-Zellen eines Luciferase-Reporterkonstruktes, das einen minimalen Thymidinkinase (TK)-Promoter mit oder ohne 4 Kopien der Konsens-T-Box-Stelle enthielt. Jedes Reporterkonstrukt wurde mit einem leeren pCDNA-Vektor oder mit pCDNA, welche die T-bet-cDNA in voller Länge enthielt, wie in der Figur angegeben cotransfiziert. Die gezeigten Daten stehen für drei unabhängige Versuche. 2B zeigt Jurkat-Zellen, die vorläufig mit dem Luciferase-Reporterkonstrukt transfiziert wurden, das den minimalen TK-Promoter und multimerisierte Konsens-T-Box-Stellen sowie einen pCDNA-Vektor enthielt, der die angegebenen Regionen der T-bet-cDNA enthielt, die auf der linken Seite des Balkendiagramms dargestellt sind. Die Luciferaseaktivität wurde 24 Stunden nach der Transfektion gemessen. Der Versuch wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Das Grundniveau (offene Balken) und die erhaltene, durch PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (1 uM) induzierte (geschlossene Balken) Promoter-Aktivität zeigen, dass T-bet in T- Zellen aktiv ist und dass seine Aktivität durch Stimulation weiter erhöht werden kann.
  • Beispiel 4: Die T-bet-Expression in T-Zellen ist auf das Th1-Subset beschränkt und wird durch Signale reguliert, welche mittels TcR übertragen werden
  • T-bet wurde aus einer Th1-cDNA-Bank isoliert, und eine Northern Blot-Analyse mehrerer Organe zeigte T-bet-Transkripte nur in der Lunge, im Thymus und in peripheren Lymphorganen.
  • 3A zeigt, dass T-bet bevorzugt in doppelnegativen (DN) Thymocyten, nicht in doppelpositiven (DP) oder einfach positiven (SP) Zellen, exprimiert wird. Eine Northern Blot-Analyse der Gesamtzell-RNA, die aus Th1-Zellklonen (AE7 und D1.1) oder Th2-Klonen (D10 und CDC35) isoliert war, die 6 Stunden mit Medium oder mit plattengebundenem Anti-CD3 (2C11) behandelt worden waren, zeigte T-bet-Transkripte nur in den Th1-Klonen. Gesamtzell-RNA wurde aus Th1-Zellklonen (AE7 und D1.1) oder Th2-Klonen (D10 und CDC35) isoliert, die 6 Stunden mit Medium oder mit plattengebundenem Anti-CD3 (2C11) behandelt worden waren. Gesamt-RNA wurde auch aus M12 (B-Zell-Lymphom) und EL4 (T-Zell-Thymom) isoliert, die 6 Stunden mit Medium oder mit PMA (50 ng/ml) und Ionomycin (1 uM) behandelt worden waren. Eine Northern Blot-Analyse wurde mit 10 ug Gesamt-RNA pro Bahn mittels Standardverfahren durchgeführt und unter Verwendung von T-bet-cDNA voller Länge sondiert. T-bet wird bevorzugt in Th1-Klonen exprimiert. Ferner wurde das Niveau der T-bet-Expression durch Signale erhöht, die über die TcR übertragen wurden, wie anhand der Induktion der T-bet-Transkripte durch Anti-CD3 ersichtlich ist. T-bet-Transkripte wurden in M12, einem B-Zell-Lymphom, im Th1-Lymphom Jurkat oder in EL4, einem Th0-Zell-Thymom, nicht detektiert, wenn diese Zellen 6 Stunden entweder mit Medium oder mit PMA (50 ng/ml) und Ionomycin (1 uM) behandelt wurden.
  • Zur Bestimmung der Proteinmengen von T-bet in primären T-Zellen wurden transgene DO11.10 TcR-Splenocyten unter Th1- oder Th2-Polarisationsbedingungen kultiviert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen 3-fach in frischem Medium mit 200 U/ml IL-2 expandiert. Am 7. Tag nach der primären Stimulation wurden Kernextrakte und cytosolische Extrakte aus ruhenden oder mit PMA/Ionomycin (1 Stunde) aktivierten Bulk-Kultur-11.10-Th1- und Th2-Zellen hergestellt. Es wurden auch Kernextrakte aus ruhenden M12-, EL4-, Jurkat-, NK3.3- und YT-Zellen hergestellt. Wie in 3C gezeigt ist, war bei den Zelllinien das T-bet Protein nur in den YT-Zellen vorhanden.
  • 3C zeigt, dass das T-bet Protein auf die Th1-Zellen und NK-Zellen beschränkt ist. Eine Western Blot-Analyse wurde mit Kernextrakten und cytosolischen Extrakten durchgeführt, die aus ruhenden oder mit PMA/Ionomycin (1 Stunde) aktivierten Bulk-Kultur-DO11.10 Th1- und Th2-Zellen wie oben hergestellt waren. Kurzum, es wurden DO11.10 Tcr-transgene Splenocyten mit dem OVA-Peptid (323-339) bei 3 × 106 Zellen/ml in Gegenwart von 10 ng/ml IL-12 und 10 ug/ml Anti-IL-4 (11B11) aktiviert, um die Th1-Phänotyp-Entwicklung zu fördern, oder mit 10 ng/ml IL-4 und 10 ug/ml Anti-IFN-gamma, um die Th2-Phänotyp-Entwicklung zu fördern. Nach 72 Stunden wurden die Zellen 3-fach in frischem Medium mit 200 U/ml IL-2 expandiert. Am 7. Tag nach der primären Stimulation wurden Kernextrakte und cytosolische Extrakte aus ruhenden oder mit PMA/Ionomycin (1 Stunde) aktivierten Bulk-Kultur- DO11.10 Th1- und Th2-Zellen hergestellt. Es wurden auch Kernextrakte aus ruhenden M12-, EL4-, Jurkat-, NK3.3- und YT-Zellen hergestellt. 30 ug Kernextrakte und cytosolische Extrakte wurden mittels SDS-PAGE (8% Gel) getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einem Anti-T-bet-Antiserum sondiert. In primären T-Zellen wird das T-bet-Protein selektiv in T-Zellen exprimiert, die entlang einem Th1-Pfad, nicht aber einem Th2-Pfad, gesteuert werden, was mit der oben gezeigten Northern Blot-Analyse von T-Zellklonen und primären T-Zellen übereinstimmt.
  • Ein für T-bet spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) ermöglichte die direkte Visualisierung des T-bet-Proteins durch FACS-Analyse. 3D zeigt, dass T-bet durch FACS in aktivierten AE7 Th1-Zellen visualisiert werden kann. D10 (Th2)- oder AE7 (Th1)-Zellen wurden 2 Stunden mit Medium oder PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (1 uM) und weitere 3 Stunden mit 2 uM Monensin behandelt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5% Saponin permeabilisiert und mit Medium (gestrichelte Linie) oder einem IgG 1-Isotyp-Kontrollantikörper (gepunktete Linie) oder einem affinitätsgereinigten, monoklonalen Anti-T-bet-Antikörper α3D10 (durchgezogene Linie) gefärbt, gefolgt von einer Ziege-Anti-Maus-IgG1-PE-Färbung. Die Zellen wurden mittels Flußcytometrie mit einem FACSCalibur analysiert. Monoklonale Maus-Antikörper gegen bakteriell produziertes T-bet wurden gezüchtet. Das T-bet-Protein war in den D10-Zellen nicht detektierbar, in unstimulierten AE7-Zellen in geringen Mengen vorhanden und in stimulierten AE7 in erhöhten Mengen vorhanden. Zusammen genommen zeigen die hier dargelegten Versuche, dass T-bet in T-Zellen selektiv in Th1-Zellen exprimiert wird, in denen das Expressionsniveau durch Signale reguliert wird, die vom TcR stammen.
  • Beispiel 5: Die T-bet-Expression korreliert mit der IFN-γ-Induktion in NK- und B-Zellen
  • Die auf Th1 beschränkte Expression von T-bet, gekoppelt mit seiner Isolierung aufgrund der Bindung an eine T-Box-Stelle im IL-2-Promoter legte nahe, dass T-bet die Transkription des IL-2-Gens aktivieren könnte. Es war jedoch überraschend, dass zwei IL-2-produzierende Zelllinien, Jurkat und EL4, T-bet nicht exprimierten, während die NK-Zelllinie YT, die IFN-γ, aber nicht IL-2 produziert, T-bet exprimierte. Ferner zeigten Vorversuche trotz der Gegenwart einer ausgezeichneten T-Box-Stelle im IL-2-Promoter keine Transaktivierung des IL-2-Gens durch T-bet. Andere Th1-spezifische Cytokine umfassen IFN-γ, TNFα und LT. Die Expression von T-bet korrelierte gut mit der Expression von IFN-γ. Ferner wurde festgestellt, dass eine T-Box-Stelle im dritten Intron des menschlichen IFN-γ-Gens vorhanden ist. Dies war besonders bemerkenswert, da kurz zuvor eine Th1-spezifische DNasel-Hypersensitivitätsstelle in diese Region kartiert worden war.
  • Zur Untersuchung der Möglichkeit, dass T-bet die Expression des IFN-γ-Gens steuert, wurde die Expression von T-bet und die Expression von IFN-γ in anderen Zellen als Th1-Zellen bestimmt. IFN-γ wird in natürlichen Killer (NK)-Zellen in geringen Mengen exprimiert und bei Behandlung mit IL-2 und IL-12 in großen Mengen induziert (Kornbluth, J., et al. 1982. J. Immunol. 129:2831; Ye et al. 1995. J. Leuko. Biol. 58:225). Daher behandelte man die NK3.3-Zelllinie 24 Stunden mit IL-2, IL-12 und IL-2 plus IL-12, stellte Lysate her und führte eine Western Blot-Analyse mit T-bet mAb wie oben durch. 4b zeigt die Koordinaten-Induktion des T-bet-Proteins und die Sezernierung von IFN-γ in NK3.3-Zellen. Man behandelte die NK3.3-Zelllinie 24 Stunden mit den Reagenzien IL-2, IL-12 und IL-2 plus IL-12, die bekanntlich IFN-γ in NK-Zellen induzieren, stellte Lysate her und führte eine Western Blot-Analyse mit T-bet mAb wie oben durch. Ein ELISA wurde mit Überständen durchgeführt, die von den Zellen geerntet worden waren.
  • B-Zellen, die an der Basislinie kein IFN-γ produzieren, können dazu gebracht werden, bei Behandlung mit einem Anti-CD40-Antikörper und einer Kombination von IL-12 und IL-18 große Mengen an IFN-γ zu produzieren (Yoshimoto. T., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3948-3953). Man behandelte gereinigte B-Zellen 72 Stunden mit Anti-CD40-mAb, rIL-12 und rIL-18, isolierte die RNA und führte einen Northern Blot unter Verwendung der T-bet-cDNA wie oben durch. 4A zeigt die Induktion von T-bet-mRNA in B-Zellen, die mit dieser Kombination von Reagenzien behandelt wurden, und die Induktion von IFN-γ-Transkripten in diesen Zellen wurde bestätigt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass zwar keiner der Zelltypen T-bet konstitutiv exprimiert, aber sowohl NK3.3-Zellen als auch B-Zellen unter Bedingungen, die auch zur IFN-γ-Produktion führen, dazu induziert werden können. Somit korreliert das Expressionsmuster von T-bet gut mit der Transkription des IFN-γ-Gens.
  • Beispiel 6: T-bet transaktiviert das IFN-γ-Gen in Th-Zellen
  • Sehr wenig ist bisher über die Regulierungsregionen des IFN-γ-Gens bekannt. Insbesondere wurden die Regionen des Gens, die seine gewebespezifische Expresssion steuern, bisher weder in vitro noch in vivo identifiziert. Es wurde gezeigt, dass Reporterkonstrukte, die 500 bp oder 3 kb stromaufwärtiger Sequenz enthalten, sowohl in Th1- als auch in Th2-Zellen exprimiert werden (Young, H. A., 1994, J. of Immuno. 153, 3603-3610). Man geht davon aus, dass die Stellen ATF-2, NFκB, AP-1 und Stat4 im IFN-γ-Promoter oder dessen Introns funktionell wichtig, aber eindeutig nicht für die gewebespezifische Expression verantwortlich sind (Young, H. A., 1994, J. of Immuno. 153, 3603-3610; Sica, A., 1997. J. Biol. Chem. 272, 30412-30420; Penix, L., 1993. J. Exp. Med. 178, 1483-1496; Penix, L. A., 1996, J. Biol. Chem. 271, 31964-31972). Gleichermaßen wurden zwar Th1-bevorzugende DNasel-hypersensitive Stellen sowohl im ersten als auch im dritten Intron festgestellt, aber die relevanten cis-Elemente in diesen Introns wurden nicht identifiziert (Young, H. A., et al., 1994. J. of Immuno. 153, 3603-3610; Agarwal, S. und Rao. A., 1998. Immunity 9, 765-775). Daher wurde für diese Studien ein Reporterkonstrukt verwendet, welches das gesamte IFN-γ-Gen enthielt. Das verwendete IFN-γ-Reportergen enthält 3 kb stromaufwärtiger Sequenz, die gesamte Codierungssequenz mit allen drei Introns und 1,5 kb stromabwärtiger Sequenz (Xu, X., et al. 1996. Science 273, 794-796).
  • Die Aktivität eines Luciferase-Reporterkonstruktes, das 9 kb des IFN-gamma-Gens im menschlichen Jurkat-Th1-Lymphom und des Maus-EL4-Th0-Thymoms enthielt, wurde getestet. Jedes Reporterkonstrukt (10 ug) wurde mit einem leeren pCDNA-Vektor oder mit pCDNA, welche die T-bet cDNA in voller Länge enthielt, c-Maf, NFATp oder p65 (10 ug) cotransfiziert. Die Konstrukte enthalten auch die –400- bis –40 IL-2- und IL-4-Promoter-Luciferase-Reporter.
  • Das Th0-Maus-T-Zell-Thymom EL4, das IL-2 und IL-4, aber nicht IFN-γ produziert, wurde mit einem T-bet-cDNA-Expressionsplasmid und dem IFN-y-Luciferase-Reporter transfiziert (5). Die Einführung des T-bet-Expressionsplasmids führte zu einer (etwa 20- bis 30-fachen) Transaktivierung des IFN-γ-Gens im Vergleich zum leeren Vektor alleine. Dies stand im Gegensatz zur fehlenden Transaktivierung durch zwei andere Faktoren, nämlich des Th2-spezifischen Transkriptionsfaktors c-Maf und des nicht-selektiven Th-Transkriptionsfaktors NFAT. Interessanterweise transaktivierte das NFκB-Familienmitglied p65 den IFN-γ-Reporter nicht alleine, sondern eine Cotransfektion mit T-bet und p65 führte zu einer synergistischen Aktivierung.
  • Es wurde auch eine Untersuchung des IL-2-Promoters durchgeführt, wobei eine als Th1-spezifisch bekannte Region des Promoters verwendet wurde (Lederer, J. A., et al. 1994. J. Immunol. 152, 77-86). T-bet unterdrückte die Aktivität des IL-2-Promoters etwa 10-fach. Dies war nach Aktivierung des Promoters mit PMA und Ionomycin besonders deutlich. Wie zuvor, wurde eine deutliche Transaktivierung des IFN-γ-Gens festgestellt. Die T-bet-Aktivität war spezifisch für das IL-2- und das IFN-γ-Gen, da keine Wirkung auf die Transaktivierung eines IL-4-Promoters (5) oder eines TNF-α-Promoters vorlag. Diese Daten zeigen, dass T-bet spezifisch die Transkription des IFN-γ-Gens aktiviert und die Transkription des IL-2-Gens unterdrückt.
  • Zur Untersuchung der endogenen Genexpression wurden EL4-Zellen vorübergehend mit T-bet oder einem leeren Vektor transfiziert, und die IFN-γ-Produktion wurde mittels ELISA 48 Stunden nach der Stimulation mit PMA/Ionomycin bestimmt (5). In Übereinstimmung mit den oben angegebenen Transaktivierungsdaten führte die ectopische Expression von T-bet in EL4-Zellen zu einer messbaren IFN-γ-Produktion, während die Transfektion mit dem Kontrollvektor nicht zu detektierbarem IFN-γ führte.
  • Beispiel 7: Retroviraler, genvermittelter Transfer von T-bet in primäre Th-Zellen führt zu erhöhter IFN-γ-Produktion
  • Die oben beschriebenen Experimente sprechen deutlich für eine kritische Rolle von T-bet bei der Steuerung der Transkription des IFN-γ-Gens.
  • Ein Rinderkollagen-spezifischer Th0-Hybrid wurde mit retroviralen Konstrukten transduziert, die T-bet-GFP oder GFP nur unter der Kontrolle des TcR-induzierbaren IL-2-Promoters enthielten. Transduzierte Populationen wurden zweimal auf GFP FACS-sortiert, ruhen gelassen und dann mit Anti-CD3 und Überständen stimuliert, die nach 60 Stunden gesammelt wurden, um die Cytokin-Produktion mittels ELISA zu bestimmen (6). Zu retroviralen Kontrollvektoren, die keine Wirkung zeigten, gehörte gegenläufiges T-bet.
  • Um weiter zu testen, ob T-bet für die gewebespezifische Expression von IFN-γ verantwortlich ist, wurde ein retroviral genvermittelter Transfer von T-bet sowohl in nicht-transgene als auch in TcR-transgene, primäre T-Zellen durchgeführt. Zwei unterschiedliche bicistronische Retroviren, die sowohl T-bet als auch GFP exprimieren, wurden verwendet. Das erste exprimiert T-bet unter der Kontrolle eines IL-2-induzierbaren Promoters, und das zweite exprimiert T-bet unter der Kontrolle eines MSCV-LTR. Mit beiden Konstrukten wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
  • BALB/c-CD4 T-Zellen wurden 36 Stunden nach der primären Aktivierung mit Anti-CD3 plus Anti-CD28 infiziert, am 7. Tag geerntet, und eine intrazelluläre IFN-gamma- und IL-2-Färbung wurde 5 Stunden nach Stimulation mit PMA und Ionomycin wie bei den Versuchsprozeduren beschrieben durchgeführt. Die Daten sind als zweifarbige Plots dargestellt, welche die GFP-Expression (FL1) gegenüber intrazellulärem Cytokin (FL2) für Ereignisse zeigen, die von der CD4-Expression abhängig waren.
  • Primäre T-Zellen aus MBP TcR-transgenen Mäusen wurden mit MBP (Ac1-11) bei 6 uM stimuliert, und am 1. Tag wurde eine Infektion mit IL-2/GFP und IL-2/T-bet/GFP durchgeführt. Am 7. Tag wurden die Zellen nach GFP-Expression sortiert, 1 Tag ruhen gelassen, und dann wurde eine intrazelluläre Cytokin-Analyse nach 5-stündiger Stimulation mit PMA und Ionomycin durchgeführt.
  • Native MBP-transgene oder nicht-transgene BALB/c CD4-T-Zellen wurden mit MBP1-11 und Anti-CD3 unter nicht-polarisierenden Bedingungen aktiviert und mit Retrovirus am 1. Tag nach der primären Aktivierung wie beschrieben infiziert (Ouyang, W., et al. 1998. Immunity 9:745-755). Die Zellen wurden 7 Tage kultiviert, und dann wurde die GFP-Expression gemessen, um den Prozentsatz infizierter Zellen zu bestimmen. GFP-positive Zellen wurden sortiert und die Cytokinproduktion durch intrazelluläres Färben nach einer weiteren 4-stündigen Stimulation mit PMA plus Ionomycin bestimmt.
  • Eine Transduktion sowohl von MBP-TcR-transgenen als auch -nicht-transgenen T-Zellen mit T-bet führte sowohl zu einem beeindruckenden Anstieg der Anzahl der Zellen, die IFN-γ produzieren, als auch der Menge an pro Zelle produziertem IFN-γ im Vergleich zu Zellen, die nur mit GFP transduziert wurden (7).
  • Bald nach der Stimulation produzieren native Thp-Zellen große Mengen an IL-2, das dann in polarisierten Th-Zellen allmählich von den Effektor-Cytokinen IFN-γ und IL-4 ersetzt wird. Polarisierte Th1-Zellen produzieren zwar weiterhin IL-2, aber in deutlich geringeren Mengen als das native Thp. Polarisierte Th2-Zellen beenden die Produktion von IL-2. T-bet-transduzierte Th-Zellen produzierten etwas weniger IL-2 als GFP/RV-Kontrolle-transduzierte Zellen, was mit der Unterdrückung der IL-2-Promoter-Transaktivierung durch T-bet übereinstimmt, die wir in EL4-Zellen beobachteten. Die Unterdrückung von IL-2 durch T-bet stimmt mit einer Funktion für T-bet bei der Steuerung der Abstammungsbindung von einer nativen Präkursorzelle zu einer voll differenzierten Effektorzelle überein.
  • Beispiel 8: T-bet aktiviert IFN-γ und unterdrückt die IL-4-Produktion bei der Entwicklung von Th2-Zellen
  • Die obigen Versuche zeigen, dass T-bet nicht-verschobene Th-Zellen auf den Th1-Pfad lenken kann. Es wurde getestet, ob T-bet Th-Zellen sogar in Anwesenheit von Stimuli, die sie normalerweise auf den Th2-Pfad lenken, dazu zwingen könnte, ihr genetisches Programm entlang einem Th1-Pfad zu richten. In den Versuchen wurden BALB/c CD4+ T-Zellen in 8 mit Anti-CD3 und Anti-CD28 in Gegenwart von rIL-4 und Antikörper gegen IFN-γ und IL-12 aktiviert, eine retrovirale Infektion über 36 Stunden durchgeführt, die Zellen mit IL-2 expandiert, GFP-positive Zellen am 7. Tag sortiert und die Cytokinproduktion durch intrazelluläres Färben nach einer weiteren, 4-stündigen Stimulation mit PMA plus Ionomycin bestimmt. Eine Transduktion mit GFP-RV alleine führte zu einer Population, die 13,4% IL-4-produzierende Zellen und 0,9% IFN-γ-Produzenten enthielt (8). Wie erwartet, sind die Thp-Zellen zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig polarisiert. Die Einführung von T-bet/GFP/RV erzeugte eine merkliche Verschiebung von Thp zum Th1-Pfad, wie aus der großen Anzahl von IFN-γ-produzierenden Zellen (50%) und der verringerten Anzahl von IL-4-produzierenden Zellen (3,5%) ersichtlich ist, auch unter Bedingungen (rIL-4 und Anti-IL-12), welche die Th1-Differenzierung inhibieren. Somit kann T-bet die von Cytokinen abgegebenen, Th2-fördernden Signale überwinden, um die Entwicklung von Th-Zellen zum Th1-Pfad hin zu steuern.
  • Beispiel 9: T-bet lenkt polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad um
  • Es wurde gezeigt, dass die Reversibilität von Th1- und Th2-Populationen nach einer langfristigen Stimulation unter polarisierenden Bedingungen verloren geht. Die Reversibilität ist nach einer Woche weitgehend außer Kraft gesetzt und fehlt nach 3 Wochen vollständig (Murphy, E., et al. 1996. J. Exp. Med. 183, 901-913). Um festzustellen, ob T-bet die Bindung einer reinen Population bereits polarisierter Th2-Zellen umlenken könnte, wurden CD4+ T-Zellen wie oben kultiviert und eine retrovirale Gentransduktion am 9. Tag der Kultivierung durchgeführt. In Th-Zellen, die 9 Tage unter Th2-Polarisationsbedingungen kultiviert werden, sind die GFP/RV-transduzierten Kontroll-Zellen nahezu alle IL-4- und IL-5-Produzenten (23% und 11%) mit kaum detektierbaren IFN-γ-produzierenden Zellen (6%) (9). Somit war, wie erwartet, eine nahezu vollständige Polarisation erfolgt. Bemerkenswerterweise führte die Einführung von T-bet in diese vollständig polarisierten Th2-Zellen zu deren Umlenkung oder Umwandlung in polarisierte Th1-Zellen, was sowohl an der Induktion der IFN-γ-Expression als auch am Verlust der IL-4- und IL-5-Expression ersichtlich ist. Diese Umwandlung erfolgte in Gegenwart von exogenem IL-4. Ganze 77% der T-bet-transduzierten Th2-Zellen produzierten nun IFN-γ, während der Prozentsatz der IL-4 und der IL-5 produzierenden Zellen auf 13% bzw. auf 1% sank. Diese T-bet-transduzierten Zellen sind daher keine Th0-Zellen, die sowohl IFN-γ als auch IL-4 produzieren. Daher induzierte T-bet nicht einfach die IFN-γ-Expression in Th2-Zellen, sondern programmierte Th2-Zellen tatsächlich zum gegenüberliegenden Th1-Subset um.
  • Beispiel 10: T-bet lenkt auch polarisierte Tc2-Zellen auf den Th1-Pfad um
  • Obwohl sich die größte Aufmerksamkeit auf den CD4+ T-Lymphocyten richtete, ist ersichtlich, dass auch cytotoxische CD8+ T-Zellen in IFN-γ-produzierende (TcI) und IL-4-produzierende (Tc2) Subsets unterteilt werden können. Die Fähigkeit von T-bet, vollständig polarisierte Tc2-Zellen auf einen Tc1-Pfad umzulenken, wurde getestet. Dazu wurden gereinigte CD8+ T-Zellen in Kultur unter Tc2-Polarisationsbedingungen 9 Tage differenziert, um eine vollständige Differenzierung zu erreichen. 10 zeigt, dass T-bet-transduzierte Tc2-Zellen, ähnlich wie T-bet-transduzierte CD4 Th2-Zellen, umprogrammiert wurden, um IFN-γ zu produzieren (85% gegenüber 15%) und die Produktion von IL-4 und IL-5 zu unterdrücken (3% gegenüber 34% bzw. 1% gegenüber 45%). Somit kann T-bet vollständig differenzierte CD8+Tc2-Zellen in Tc1-Zellen umwandeln.
  • Beispiel 11: T-bet ist Tyrosin-phosphoryliert
  • Um festzustellen, ob T-bet ein Tyrosin-phosphoryliertes Protein ist, wurden Ganzzell-Lysate von AE7 Th1-Zellen nach Inkubation während 0, 5, 10 und 30 Minuten mit Pervanadat hergestellt. Die Lysate wurden mit Anti-T-bet-Antiserum immunpräzipitiert, mittels SDS-PAGE (8% Gel) getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einem Antiphosphotyrosin-mAB 4G10 sondiert. Nach Belichtung wurden die Blots abgezogen und mit Anti-T-bet-Antiseren erneut sondiert. Wie in 11 gezeigt, ist T-bet in T-Zellen eindeutig ein Tyrosin-phosphoryliertes Protein.
  • Beispiel 12: Erzeugung eines dominant-negativen T-bet Moleküls
  • Chimäre cDNA-Moleküle wurden mit der T-bet DNA-Bindungsdomäne (Reste 138-327) und der Repressordomäne des engrailed Drosophila-Proteins hergestellt. Das engrailed Protein ist ein starker, aktiver Transkriptionsrepressor (Taylor, D., 1996. Genes Dev. 10, 2732; Li. J.. Thurm. H., et al. 1997. Proc. Natl. Acad Sci. USA 94, 10885). Das T-bet-engrailed Konstrukt in vitro unter Verwendung eines multimerisierte T-Box-Konsensstelle/TK Minimal-Promoter-Luciferase-Reporterkonstruktes. Wie in 12 gezeigt ist, unterdrückt T-bet/engrailed spezifisch und signifikant die Fähigkeit von wt T-bet, ein T-Box-Reporterkonstrukt in einem Verhältnis von 5:1 zu transaktivieren, unterdrückt aber nicht die Transaktivierung eines NFAT- oder NFκB-Reporters durch NFATp- bzw. p65-Expressionskonstrukte.
  • Beispiel 13: Mutationen der T-Box des IL-2-Promoters vermindern die IL-2-Promoter-Aktivität
  • Kürzlich wurde die Kristallstruktur der T-Box-Region des DNA-gebundenen Brachyurie-Gens aufgeklärt und auf die Aminosäureeinheiten, die für spezifische DNA-Kontakte oder für geringfügige Kontakte essentiell sind, rückgeschlossen. Eine Untersuchung des IL-2-proximalen Promoters bei Mensch und Maus zeigt, dass die kritischen Nukleotide zur Bindung eines T-Box-Familienmitgliedes vorliegen. Insbesondere weisen –240 bis –220 bp des Maus-IL-2-Promoters eine starke Ähnlichkeit mit der Konsens-T-Box-Stelle auf. Die Konsens-T-Box-Stelle ist AATTTCACACCTAGGTGTGAAATT. Der menschliche IL-2-Promoter umfasst: gAgcTatCACCTAaGTGTGggcTa. Der Maus-IL-2-Promoter umfasst: AAacTgcCACCTAaGTGTGggcTa. Der mutierte T-Box-mIL-2-Promoter umfasst: AAacTgctgtCTAaacaTGggcTa. (DNA-Kontakte sind fett, geringfügige Kontakte unterstrichen dargestellt). Transversale Nukleotidsubstitutionen, anhand deren Kristallstruktur gezeigt wurde, dass sie für DNA-Protein-Interaktionen wichtig sind, wurden innerhalb dieser putativen T-Box-Stelle im Zusammenhang mit dem –440 bis –40 bp-IL-2-Promoter der Maus hergestellt. Das Grundniveau (offene Balken) und die durch PMA (50 ng/ml) plus Ionomycin (1 uM) induzierte (geschlossene Balken) Promoter-Aktivität in Jurkat-Zellen (links) oder einem AE7 Th1-Klon (rechts) von IL-2-Luciferase-Reporterkonstrukten ist gezeigt (13).
  • Die Rolle von T-bet besteht darin, die Differenzierung von Th-Zellen zu steuern, wie anhand seiner Fähigkeit ersichtlich ist, gleichzeitig das IFN-γ-Gen zu induzieren und das IL-2-Gen zu unterdrücken. Die Antigen-unerfahrene Thp-Zelle produziert nur IL-2. Nach Stimulation sinkt die IL-2-Produktion und wird durch die Produktion der reifen Th-Effektor-Cytokine ersetzt. Insbesondere stellen die Th2-Zellen kein IL-2 mehr her, sobald sie die Fähigkeit erwerben, IL-4 herzustellen, und die Funktion von T-bet, gleichzeitig IFN-γ zu induzieren und IL-2 zu unterdrücken, war in Th2-Zellen besonders offensichtlich. Die Fähigkeit von T-bet, gleichzeitig den IFN-γ-Promoter zu transaktivieren und den IL-2-Promoter zu unterdrücken, steht daher im Einklang mit einer Rolle von T-bet beim Vorantreiben der Differenzierung des nativen Thp. Es wurde gezeigt, dass T-bet ein Konstrukt transaktiviert, das nur 3 kb stromaufwärtiger Promotersequenz enthält, was im Einklang mit dem Vorliegen von zwei T-Box-Stellen an den Positionen –2300 bis –2291 und –1957 bis –1948 steht. Da diese Region des Promoters jedoch nicht Th1-specifisch ist, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass die T-Box-Stelle im dritten Intron ebenfalls wichtig ist, und es können durchaus zusätzliche T-Box-Stellen an anderen Orten im Gen vorhanden sein.
  • Die T-Box-Domäne wurde kürzlich mit DNA cokristallisiert und zeigt eine neue sequenzspezifische DNA-Erkennungsarchitektur, bei der das Protein mit DNA sowohl in den Major Grooves als auch in den Minor Grooves in Kontakt kommt (Müller, C. W. und Herrmann, B. G. 1997. Nature 389, 884-888). Die durch die Zielstellen-Selektion in vitro definierte Konsens-T-Box-Bindungsstelle ist ein Palindrom 5'-GGGAATTTCACACCTAGGTGTGAAATTCC3'. Eine Untersuchung des IL-2-Promoters zeigt eine hervorragende T-Box-Stelle bei –240 bis –220, nur 5' von der NFκB-Stelle, an die rekombinantes T-bet-Protein bindet. Die Bindung von T-bet an den IL-2-Promoter erklärt seine Isolierung im Hefe-Ein-Hybrid-Screen, bei dem der Messwert einfach von der T-bet-Bindung an die T-Box-Stelle im IL-2-Promoter zur Steuerung eines artifiziellen Reporters abhing. Trotz der klaren Unterdrückung der IL-2-Promoter-Aktivität durch T-bet wurde eine Abnahme der IL-2-Promoter-Aktivität nach Mutation der T-Box-Stelle beobachtet. Dieses T-bet kann jedoch noch immer die Transaktivierung eines IL-2-Promoter-Konstruktes unterdrücken, in dem diese T-Box-Stelle mutiert ist. Dies legt entweder das Vorhandensein einer anderen T-Box-Stelle im IL-2-Promoter oder die Beeinflussung eines anderen positiv wirkenden Faktors nahe, der in der Nähe bindet. Ein guter Kandidat für diesen Faktor ist eine von Rothenberg und Kollegen beschriebene Aktivität, die an eine der T-Box-Stelle unmittelbar benachbarte Stelle TGGGCC bindet (Chen, D. und Rothenberg, E. V. 1994. J. Exp. Med. 179, 931-942).
  • Zusätzlich unterdrückt T-bet das Th2-Programm in Thp- und Th2-Zellen. Es ist unwahrscheinlich, dass dies unmittelbar auf ein Ungleichgewicht zwischen IFN-γ und IL-4 zugunsten des ersteren zurückzuführen ist. Die Wirkung von T-bet zur Unterdrückung des Th2-Programms bei gleichzeitiger Verstärkung des Th1-Programms erinnert an GATA-3 und c-Maf, die beide die IFN-γ-Expression indirekt unterdrücken, ersteres durch Einwirken auf die IL-12-Rezeptor-β2-Kette (Ho. I-C., et al. 1998. J. Exp. Med. 188. 1859-1866.; Ouyang, W., et al. 1998. Inhibition of Th1 developmental mediated by GATA-3 through an IL-4 independent mechanism. Immunity 9:745-755). Anders als GATA-3 und c-Maf kann T-bet jedoch vollständig polarisierte Effektor-Th-Zellen tatsächlich zum entgegengesetzten Pfad konvertieren.
  • Äquivalente
  • Der Fachmann wird zahlreiche Äquivalente der spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung erkennen oder mittels reiner Routineversuche feststellen können.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (24)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die ein T-bet-Protein codiert, bei dem es sich um einen Th1-spezifischen Transkriptionsfaktor handelt, der das Interferon-gamma-Gen transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten primären T-Zellen induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenken, die Interferon-gamma-Produktion erhöhen und die IL-2-Produktion unterdrücken kann, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder 3 umfasst oder wobei die Nukleotidsequenz mit dem Komplement der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 angegeben ist, in 6 x SSC bei 45 C hybridisiert, gefolgt von einer oder mehreren Wäschen in 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65 C, oder wobei die Nukleotidsequenz mindestens 70% Nukleotidübereinstimmung mit mindestens 700 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID NO: 1 aufweist, oder wobei die Nukleotidsequenz mindestens 70% Nukleotidübereinstimmung mit mindestens 500 benachbarten Nukleotiden der SEQ ID NO: 3 aufweist.
  2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz mindestens 90% Nukleotidübereinstimmung mit mindestens 700 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID NO: 1 oder mit mindestens 500 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID NO: 3 aufweist.
  3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das gegenläufig zum gesamten Codierungsstrang des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder zu einem Abschnitt des Codierungsstrangs ist, der aus 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 oder 3 besteht.
  4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die komplementär zum gesamten Codierungsbereich einer mRNA ist, die von einem Gen transkribiert wurde, das ein T-bet-Polypeptid codiert, welches von einem isolierten Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird.
  5. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Vektor nach Anspruch 5, bei dem es sich um einen Expressionsvektor handelt.
  7. Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 5 oder 6 enthält.
  8. Isoliertes T-bet-Protein, bei dem es sich um einen Th1-spezifischen Transkriptionsfaktor handelt, der das Interferon-gamma-Gen transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten, primären T-Zellen induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenken, die Interferon-gamma-Produktion erhöhen und die IL-2-Produktion unterdrücken kann, sowie die Fähigkeit hat, an DNA zu binden, wobei das Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die von der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 codiert wird, oder mindestens 70% Übereinstimmung mit dem Protein aufweist, das in SEQ ID NO: 2 oder 4 gezeigt ist.
  9. Isoliertes T-bet-Protein nach Anspruch 8, das mindestens 90% Übereinstimmung mit SEQ ID NO: 1 oder 3 aufweist.
  10. Fusionsprotein, umfassend ein T-bet-Protein nach Anspruch 8 oder 9, das mit einem anderen Polypeptid als T-bet operativ verknüpft ist.
  11. Polyklonale oder monoklonale Antikörper, die ein T-bet-Protein nach einem der Ansprüche 8 und 9 spezifisch binden.
  12. Antikörper nach Anspruch 11, die mit einer detektierbaren Substanz gekoppelt sind.
  13. Verfahren zum Herstellen eines T-bet-Proteins nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 7 in einem geeigneten Medium, bis ein T-bet-Protein hergestellt ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, das ferner das Isolieren des T-bet-Proteins aus dem Medium oder der Wirtszelle umfasst.
  15. Verfahren zum Detektieren des Vorliegens einer T-bet-mRNA oder eines T-bet-Proteins in einer biologischen Probe, die (das) Th1 codiert oder ein Th1-spezifischer Transkriptionsfaktor nach Anspruch 8 ist, der das Interferon-gamma-Gen transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten, primären T-Zellen induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umlenken, die Interferon-gamma-Produktion erhöhen und die IL-2-Produktion unterdrücken kann, umfassend das Kontaktieren der biologischen Probe mit einer (einem) markierten Nukleinsäuresonde oder Antikörper, so dass das Vorliegen von T-bet in der biologischen Probe detektiert wird.
  16. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Expression oder Aktivität eines T-bet-Proteins oder -Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 10 stimuliert oder inhibiert, in der Lage ist, das Interferon-gamma-Gen zu transaktivieren, die Interferon-gamma-Produktion in retroviral transduzierten, primären Zellen zu induzieren und polarisierte Th2-Zellen auf den Th1-Pfad umzulenken, die Interferon-gamma-Produktion zu erhöhen und die IL-2-Produktion zu unterdrücken, umfassend das Bereitstellen einer Indikatorzusammensetzung, die das T-bet-Protein oder -Polypeptid aufweist, Kontaktieren der Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung in vitro, und Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins oder -Polypeptids in der Indikatorzusammensetzung, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, welche die Expression oder Aktivität des T-bet-Proteins oder -Polypeptids stimuliert oder inhibiert.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Indikatorzusammensetzung das T-bet-Protein oder -Polypeptid und ein DNA-Molekül umfasst, an welches das T-bet-Protein oder -Polypeptid bindet, und die Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des T-bet-Proteins oder -Polypeptids durch Auswertung der Bindung des T-bet-Proteins oder -Polypeptids an das DNA-Molekül in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung bestimmt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Indikatorzusammensetzung eine Zelle ist, die das T-bet-Protein oder -Polypeptid und ein Reporter-Gen umfasst, das auf das T-bet-Protein oder -Polypeptid anspricht, und die Wirkung der Testverbindung auf die Expression oder Aktivität des T-bet-Proteins oder -Polypeptids durch Auswertung der Expression des Reporter-Gens in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung bestimmt wird.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, ferner umfassend das Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf eine Immunantwort, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die eine Immunantwort stimuliert oder inhibiert.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zelle eine B-Zelle oder eine Th2-Zelle ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Zelle ein T-bet-Polypeptid exprimiert.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Zelle so manipuliert ist, dass sie das T-bet-Polypeptid exprimiert, indem in die Zelle ein Expressionsvektor eingebracht wird, der das T-bet-Polypeptid codiert.
  23. Verfahren nach Anspruch 16 oder 18, wobei die Indikatorzusammensetzung eine Indikatorzelle umfasst, die das T-bet-Polypeptid und ein auf das T-bet-Polypeptid ansprechendes Reporter-Gen umfasst.
  24. Nicht-menschliches, transgenes Lebewesen, das Zellen enthält, die ein Transgen tragen, welches T-bet-Protein codiert, das von einem isolierten Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
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