ES2254192T3

ES2254192T3 - Composiciones t-bet y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2254192T3
Application number: ES00939546T
Authority: ES
Inventors: Laurie H. Glimcher; Susanne J. Szabo
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2020-06-01
Also published as: WO2000073453A9; ATE308615T1; JP2003510016A; EP1183355A1; DK1183355T3; CA2375050A1; JP2010011856A; DE60023691D1; AU784111B2; DE60023691T2; EP1183355B1; WO2000073453A1; AU5462000A; JP4427218B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína T-bet, que es un factor de transcripción específico de Th1 que es capaz de transactivar el gen del interferón gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-gamma y y de reprimir la producción de IL -2, en la que la secuencia de nucleótidos comprende el SEQ ID NO: 1 ó 3, o en la que la secuencia de nucleótidos se hibrida con la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 en SSC 6X, a 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0, 2X, SDS al 0, 1%, a 50ºC-65ºC, o en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 70% con al menos 700 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, o en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidosde al menos el 70% con al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

Description

Composiciones T-bet y métodos de uso.

Antecedentes de la invención

Las células del sistema inmunológico alteran patrones de expresión génica en respuesta a señales intracelulares y extracelulares. Un grupo de polipéptidos, denominados citoquinas o linfoquinas, que influyen sobre una variedad de actividades biológicas en algunos tipos celulares, se encuentran entre las más importantes de estas señales. Aunque muchos tipos de células del sistema inmunológico secretan citoquinas, el linfocito T coadyuvante (Th) (del inglés, " T helper") es la fuente principal de estos polipéptidos. Hace más de una década se descubrió que las células Th se diferencian en dos subgrupos distintos: Th1 y Th2, después de su encuentro con receptores de células T, ambos subgrupos definidos por sus distintas capacidades funcionales y por sus perfiles de citoquinas exclusivos (Paul y Seder, 1994, Cell 76, 241-251; Mosmann y Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Mossmann y col., 1986, J. Immunol. 136, 2348-2357; Snapper y Paul, 1987, Science 236, 944-947). Las células Th1 median en respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado y en la activación de macrófagos mientras que las células Th2 prestan ayuda a las células B y son críticas en la respuesta alérgica (Mosmann y Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Paul y Seder, 1994, Cell, 76, 241-251; Arthur y Mason, 1986, J. Exp. Med., 163, 774-786; Paliard y col., 1988, J. Immunol., 141, 849-855; Finkelman y col., 1988, J. Immunol., 141, 2335-2341). La evidencia de que las células Th1 dirigían la inmunidad mediada por células mientras que las células Th2 contribuían a respuestas humorales encaja perfectamente con las observaciones de que un organismo tiene tendencia a organizar o bien una respuesta mediada por células o bien una respuesta humoral, pero no ambas, en respuesta a los patógenos. Estas diferencias funcionales entre los subgrupos de células Th se puede explicar más fácilmente por las actividades de las propias citoquinas. El IFN-\gamma es la citoquina "distintiva" de las células Th1, aunque las células Th1 también producen IL-2, TNF y LT. La citoquina "distintiva" correspondiente de las células Th2 es IL-4. Las células Th2 también secretan IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13.

Después de encontrarse con un antígeno, la célula precursora indiferenciada de células T coadyuvantes (Thp) (del inglés, " T helper precursor") CD4+ ejecuta un programa genético que finalmente produce un linaje Th1 o Th2. Aunque está claro que la polarización se puede conseguir manipulando la señal del antígeno y la señal coestimuladora, es decir, la "fuerza de la señal" recibida por la Thp (Constant y Bottomly, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15, 297-322), los inductores más potentes de las células Th efectoras son sin duda las propias citoquinas. La IL-4 promueve la diferenciación de Th2 y simultáneamente bloquea la formación de Th1, efecto que está mediado a través de la ruta de señalización de Stat6. Debido a ello, los ratones que carecen de IL-4 o Stat6, son incapaces de formar células Th2 (Kopf y col., 1993, Nature 362, 245-248; Kuhn y col., 1991, Science 254, 707-710; Kaplan y col., 1996. Immunity 4,313-319; Shimoda y col., 1996, Nature 380, 630-633; Takeda y col., 1996, Nature 380, 627-630). Por el contrario, IL-12, IL-18 e IFN-\gamma son las citoquinas críticas para la formación de las células Th1 (Hsieh y col., 1993, Science 260, 547-549; Okamura y col., 1995, Nature 378, 88-91; Gu y col., Science 275, 206-209; Meraz y col., 1996, Cell 84, 431-442; Magram y col., 1996. Immunity 4, 471-481). El IFN-\gamma, que actúa a través de la ruta de Stat1 (Meraz y col., 1996, Cell 84, 431-442), y la IL-2, que actúa a través de la ruta de señalización de Stat-4 (Jacobson y col., 1995, J. Exp. Med. 181, 1755-1762), promueven juntos la diferenciación de las células Th1 y bloquean el destino hacia el linaje de Th2 (Szabo y col., 1995, Immunity 2, 665-675; Szabo y col., 1997. J. Exp. Med. 185:817-824). Los ratones deficientes en IL-2 o en Stat4 no tienen células Th1 (Magram y col., 1996, Immunity 4, 471-481; Takeda y col., 1996, Nature 380, 627-630; Shimoda y col., 1996, Nature 380, 630-633). Otra importante citoquina inductora de Th1 es IL-18, cuyo receptor está relacionado con la familia de receptores de IL-1 (Cerretti y col., 1992, Science 256, 97-100). Los ratones que carecen de IL-18 presentan respuestas Th1 defectuosas in vivo (Takeda y col., 1998, Immunity 8, 383-390) y tanto IL-12 como IL-18 regulan la expresión del IFN-\gamma (Barbulescu y col., 1998, Eur. J. Immunol. 27, 1098-1107; Robinson y col., 1997, Immunity 7, 571-581; Ahn y col., 1997, J. Immunol. 159, 2125-2131). Las propias citoquinas, por lo tanto, constituyen un sistema de realimentación positivo y negativo que dirige la polarización de las células Th (Powrie y Coffman, 1993, Immunol. Today 14, 270-274; Scott, 1991, J. Immunol. 147, 3149; Maggi y col., 1992, J. Immunol. 148, 2142; Parronchi y col., 1992, J. Immunol. 149, 2977; Fargeas y col., 1992, Eur. J. Immunol. 149, 2977; Manetti y col., 1993, J. Exp. Med. 177, 1199; Trinchieri, 1993, Immunol. Today 14, 335-338; Macafonia y col., 1993, Immunol. 5, 1119; Seder y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10188-10192; Wu y col., 1993, J. Immunol. 151, 1938; Hsieh y col., 1993, Science 260, 547-549) (revisada en Seder y Paul, 1994, en Annual Review of Immunology, Vol. 12, 635-673; Paul y Seder, 1994, Cell 76, 241-251; O'Garra, 1998, Immunity 8, 275-283).

Durante los últimos años, se ha realizado un avance significativo en la identificación de los factores de transcripción que controlan la transición de un Thp en una célula Th2 según se evidencia por la capacidad de estos factores para dirigir la producción de IL-4, revisada en (Glimcher y Singh, 1999, Cell 96, 13-23; Szabo y col., 1997, Current Opinions in Immunology 9, 776-781). La provisión de tres proteínas distintas, el proto-oncogén c-Maf, el factor de transcripción Factor Nuclear de células T Activadas (NFAT), y un antígeno nuclear nuevo, la Proteína Interaccionante con NFAT, de 45 kDa (NIP45), se ha mostrado que confiere a una célula no T la capacidad para producir IL-4 endógena (Hodge y col., 1996, Science 274, 1903-1905; Ho y col., 1998, J. Exp. Med. 188:1859-1866). Estos factores y otros tales como GATA-3 (Zheng y Flavell, 1997, Cell 89, 587-596) y Stat6 son claramente capaces de dirigir la producción de IL-4, y por lo tanto la formación de células Th2, tanto in vitro como in vivo.

Por el contrario, se sabe poco sobre la base molecular de la diferenciación de Th1. Por ejemplo, los únicos factores de transcripción conocidos cuya ausencia produce un fracaso para generar células Th1 son Stat4 (Thierfelder y col., 1996, Nature 382, 171-174; Kaplan y col., Nature 382, 174-177) e IRF-1 (Lohoff y col., 1997, Immunity 681-689; Taki y col., 1997, Immunity 6:673-679), ninguno de los cuales es específico de Th1. El miembro ERM de la familia de Ets que es inducido por IL-12, de una manera dependiente de Stat4, se ha publicado recientemente que es específico de Th1, pero que no afecta a la producción de citoquinas asociadas a Th1 (Ouyang y col., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3888). La ausencia de células Th1 en ratones deficientes en Stat4 es secundaria a la incapacidad de la IL-12 para dirigir el programa de Th1, mientras que la falta de Th1 en ratones deficientes en IRF-1 probablemente es debida a su efecto directo en el control de la transcripción del gen de IL-12 (Lohoff y col., 1997, Immunity 6:681-689; Taki y col., 1997, Immunity 6:673-679). No obstante, algunas de las rutas de señalización aguas arriba de estos factores de regulación específicos de Th1, están empezando a ser elucidadas. La quinasa p38 es una de esas moléculas de señalización según se demuestra por la capacidad de la MAP-quinasa-quinasa 6 (MKK6) (del inglés, " MAP Kinase Kinase 6 ") para reforzar la producción de IFN-\gamma. Por el contrario, la sobreexpresión de una MAP-quinasa p38 dominante negativa o la alteración dirigida de Jnk2 o Jnk1 disminuye las respuestas Th1 (Rincón y col., 1998, EMBO J. 17, 2817-2829; Yang y col., 1998, Immunity 9, 575-585; Dong y col., 1998, Science 282, 2092-2095). La ruta de señalización de JNK podría influir en la formación de Th mediante un efecto directo sobre la transcripción del gen de IFN-\gamma, pero esto no se ha observado. Por ejemplo, los factores de transcripción ATF-2 y AP-1 son sustratos de las quinasas JNK y estos factores, así como las proteínas NF\kappaB y Stat4, se sabe que se unen a sitios del promotor de IFN-\gamma (Zhang y col., 1998, Immunol. 161, 6105-6112; Ye y col., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:4744; Barbulescu y col., 1997, Eur. J. Immunol. 27,1098-1107; Sica y col., 1997, J. Biol. Chem. 272, 30412-30420). La producción de IFN-\gamma es, sin embargo, normal en ratones que carecen de ATF-2. Debido a que las citoquinas son críticas en producción de células Th1 y Th2 y, por ello, en la determinación de si una inmunorrespuesta es mayormente celular o humoral, las composiciones y los métodos encargados de modular la producción de citoquinas asociadas a Th1 y/o a Th2 constituiría un enorme beneficio para la modulación de la inmunorrespuesta.

Sumario de la invención

Esta invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de composiciones nuevas que actúan para promover el fenotipo Th1 en células indiferenciadas precursoras de células T coadyuvantes (Thp), tanto mediante la iniciación de programas genéticos de las células Th1 como mediante la represión de los programas contrarios en células Th2. En particular, esta invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína T-bet y una proteína T-bet aislada. T-bet (del inglés, "T box expressed in T cells") (caja T expresada en células T) es un miembro nuevo de la familia T box de factores de transcripción cuyo miembro fundador es el gen brachyury. T-bet se expresa constitutivamente y de manera selectiva en timocitos y en células Th1. T-bet es el primer factor de transcripción específico de Th1 que es capaz de transactivar el gen del interferón-gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y de redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1. La invención también proporciona métodos para usar estas composiciones nuevas de T-bet.

Uno de los aspectos de la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína T-bet, que es un factor de transcripción específico de Th1, que es capaz de transactivar el gen del interferón-gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-gamma y de reprimir la producción de IL-2, en la que la secuencia de nucleótidos comprende el SEQ ID NO: 1 ó 3, o en la que la secuencia de nucleótidos se hibrida con la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 en SSC 6X, a 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1%, a 50ºC-65ºC, o en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 70% con al menos 700 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, o en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 70% con al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención, que codifican T-bet, se pueden incorporar en un vector, tal como un vector de expresión, y este vector se puede introducir en una célula hospedadora. La invención también proporciona un método para producir una proteína T-bet cultivando una célula hospedadora de la invención (que porta un vector de expresión de T-bet) en un medio adecuado hasta que se produce una proteína T-bet. El método puede incluir además aislar la proteína T-bet del medio o de la célula hospedadora.

Otro aspecto de la invención concierne a una proteína T-bet aislada, según la invención, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 ó 3. Preferiblemente la proteína T-bet comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. En otras realizaciones, la proteína presenta una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, más preferiblemente una identidad de aminoácidos del 80%, y aún más preferiblemente una identidad de aminoácidos del 90%, con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ó 3.

La invención también abarca proteínas de fusión, que comprenden una proteína T-bet operativamente ligada a un polipéptido distinto de T-bet, así como anticuerpos que se unen específicamente a una proteína T-bet. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. En una de las realizaciones, los anticuerpos están acoplados a una sustancia detectable.

Otro aspecto de la invención concierne a un animal transgénico no humano que contiene células que portan un transgén que codifica una proteína T-bet codificada por una moléculas de ácido nucleico aislada según la invención.

Otro aspecto más de la invención concierne a un método para detectar la presencia de un mRNA de T-bet o de una proteína T-bet en una muestra biológica, mRNA que está codificando, o proteína T-bet que es, un factor de transcripción específico de Th1 según la invención, que comprende poner en contacto la muestra biológica con una sonda marcada de tipo ácido nucleico, o con un anticuerpo marcado, de manera que la presencia de T-bet se detecta en la muestra biológica, y con un agente que modula la actividad de T-bet de manera que la actividad de T-bet en la célula se modula.

Todavía otro aspecto más de la invención concierne a métodos para identificar un compuesto que estimula o inhibe la expresión o la actividad de una proteína T-bet, según la invención, que comprende:

proporcionar una composición indicadora que comprende dicha proteína T-bet;

poner en contacto in vitro la composición indicadora con un compuesto en estudio; y

determinar el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de la proteína T-bet en la composición indicadora para identificar de este modo a un compuesto que estimula o inhibe la expresión o la actividad de dicha proteína T-bet. En una realización preferida, la composición indicadora comprende una proteína T-bet y una molécula de DNA a la que la proteína T-bet se une, y el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de la proteína T-bet se determina evaluando la unión de la proteína T-bet a la molécula de DNA en presencia y ausencia del compuesto en estudio. En otra realización preferida, la composición indicadora es una célula que comprende una proteína T-bet y un gen de reporte que es sensible a la proteína T-bet, y el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de la proteína T-bet se determina evaluando la expresión del gen de reporte en presencia y ausencia del compuesto en estudio. En otra realización más, el método implica además la etapa de determinar el efecto del compuesto en estudio sobre una inmunorrespuesta para identificar con ello un compuesto que modula una inmunorrespuesta.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra el alineamiento de una secuencia de nucleótidos de las T-bet humana y murina. El alineamiento se preparó usando el programa ALIGN. La Figura 1B muestra el alineamiento de una secuencia de aminoácidos de las T-bet humana y murina preparada usando el programa de Lipman Pearson de alineamiento de proteínas. La secuencia de la caja T se muestra en negrilla. Los sitios de fosforilación de tirosina están subrayados. El sitio de localización nuclear está marcado con flechas.

Las Figuras 2A y 2B muestran que T-bet se une a, y transactiva, sitios consenso de caja T, con dominios funcionalmente importantes que se sitúan en el mapa tanto en regiones 3' como 5'.

La Figura 3A muestra que T-bet se expresa preferentemente en timocitos doble negativos. El recuadro B muestra que en un estudio de clones de Th, la expresión de T-bet está restringida a células Th1. El recuadro C muestra un análisis de transferencia Western de T-bet. El recuadro D muestra un análisis de FACS de la expresión de T-bet.

La Figura 4A y 4B muestra que la expresión de T-bet se correlaciona con la inducción de IFN-\gamma en células NK y en células B.

La Figura 5 muestra que T-bet transactiva el gen de IFN-\gamma en células Th.

La Figura 6 muestra que la transducción de T-bet en genes retrovíricos aumenta la producción de IFN-\gamma y reprime la producción de IL-2.

La Figura 7 muestra que T-bet activa la producción de IFN-\gamma y reprime la producción de IL-2 en células T primarias.

La Figura 8 muestra que T-bet induce la producción de IFN-\gamma e inhibe la producción de IL-4 en células Th2 en proceso de formación.

La Figura 9 muestra que T-bet redirige células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1. El viraje de las células Th se llevó a cabo según se ha expuesto anteriormente y las infecciones retrovíricas se realizaron en el día 9 de cultivo.

La Figura 10 muestra que T-bet redirige células polarizadas Tc2 hacia la ruta Tc1. Se purificaron células T CD8+ mediante MoFlo y se cultivaron en las condiciones de viraje de Th2 anteriormente mencionadas, y las transducciones retrovíricas se realizaron en el día 8 de cultivo.

La Figura 11 muestra que T-bet está fosforilada en tirosina.

La Figura 12 muestra la actividad de un mutante de T-bet dominante negativo.

La Figura 13 muestra que mutaciones del elemento con caja T del promotor de IL-2 disminuyen la actividad del promotor de IL-2.

Descripción detallada de la invención

Esta invención concierne a composiciones de T-bet, tales como moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican T-bet y a proteínas T-bet aisladas, así como a métodos para su uso.

Con el fin de que la invención se comprenda con mayor facilidad, se definen primero algunos términos y expresiones.

Según aquí se utiliza, la expresión "moléculas de T-bet" incluye moléculas de ácido nucleico de T-bet que comparten características estructurales y funcionales con las moléculas de ácido nucleico mostradas en los SEQ ID Nos: 1 y 3, y proteínas T-bet que comparten las características estructurales y funcionales distintivas de las proteínas T-bet mostradas en los SEQ ID Nos. 2 y 4. Las proteínas T-bet son miembros de la familia T-box de proteínas y comparten cierta homología de la secuencia de aminoácidos con Brachyury, Tbx1-6, T-brain-1 (Tbr-1). Las proteínas T-box comprenden un dominio con caja T que se une al DNA en un sitio de unión a caja T. Otras características estructurales y funcionales de las proteínas T-bet se proporcionan más adelante.

Según aquí se utiliza, la expresión "molécula de ácido nucleico" quiere incluir moléculas de DNA (p. ej., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (p. ej., mRNA). La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA bicatenario.

Según aquí se utiliza, una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está libre de secuencias génicas que flanquean en la naturaleza al ácido nucleico en el DNA genómico del organismo del que el ácido nucleico deriva (es decir, secuencias genéticas que están localizadas adyacentes al gen correspondiente a la molécula de ácido nucleico aislada en el DNA genómico del organismo del que el ácido nucleico deriva). Por ejemplo, en diferentes realizaciones, una molécula de ácido nucleico de T-bet aislada contiene típicamente menos de aproximadamente 10 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean en la naturaleza a la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que el ácido nucleico deriva, y más preferiblemente contiene menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que la flanquean en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico de T-bet "aislada" puede, sin embargo, estar unida a otras secuencias de nucleótidos que normalmente no flanquean las secuencias de T-bet en el DNA genómico (p. ej., las secuencias de T-bet pueden estar unidas a secuencias de un vector). En algunas realizaciones preferidas, una molécula de ácido nucleico "aislada" tal como una molécula de cDNA, también puede encontrarse libre de otro material celular. Sin embargo, no es necesario que la molécula de ácido nucleico de T-bet se encuentre libre de otro material celular para que se considere "aislada" (p. ej., una molécula de DNA de T-bet separada de otros DNA de mamífero e insertada en una célula bacteriana se seguiría considerando que está "aislada").

Según aquí se utiliza, la expresión "hibrida en condiciones de rigurosidad alta" quiere describir condiciones de hibridación y de lavado en las que secuencias de nucleótidos que tienen una homología sustancial entre sí (p. ej., típicamente, una homología mayor que el 70%) permanecen hibridadas de manera estable una con otra. Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de rigurosidad alta lo constituye una hibridación en un tampón de hibridación que contiene cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a una temperatura de aproximadamente 45ºC, durante desde varias horas hasta toda la noche, seguida de uno o más lavados en un tampón de lavado que contiene SSC 0,2X, SDS al 0,1%, a una temperatura de aproximadamente 50ºC-65ºC.

La expresión "tanto por ciento (%) de identidad", usada en el contexto de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos (p. ej., cuando una secuencia de aminoácidos se dice que es X% idéntica con respecto a otra secuencia de aminoácidos) se refiere al tanto por ciento de residuos idénticos compartidos entre las dos secuencias, cuando están alineadas de manera óptima. Para determinar el tanto por ciento de identidad de dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, las secuencias se alinean con el fin de su óptima comparación (p. ej., se pueden introducir huecos en una de las secuencia para su alineamiento óptimo con la otra secuencia). Los residuos de las posiciones que se corresponden se comparan entonces y cuando una posición en una de las secuencias está ocupada por el mismo residuo que el de la posición correspondiente de la otra secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El tanto por ciento de identidad entre dos secuencias, por lo tanto, es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las dos secuencias (es decir, % de identidad = n.º de posiciones idénticas/n.º total de posiciones x 100).

Se pueden usar algoritmos computacionales conocidos en la técnica para alinear óptimamente y comparar dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos para definir el tanto por ciento de identidad entre las dos secuencias. Un ejemplo preferido, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Este algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Para obtener alineamientos efectuados con huecos con el fin de su comparación, se puede utilizar el programa Gapped BLAST según se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., X-BLAST y N-BLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención se sometieron al programa BLAST usando la matriz por defecto Blastn 1-3 con penalizaciones por huecos establecidas en: por existencia 5 y por extensión 2. Las secuencias de aminoácidos de la invención se sometieron al programa BLAST usando los ajustes por defecto: la matriz Blosum62 con penalizaciones por hueco establecidas en: por existencia 11 y por extensión 1.

Otro ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Este algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programas de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización por hueco de 4. Si para comparar secuencias se usan múltiples programas, el programa que proporciona el alineamiento óptimo (es decir, el tanto por ciento de identidad más alto entre las dos secuencias) se usa con fines de comparación.

Según aquí se utiliza, una molécula de ácido nucleico "presente en la naturaleza" se refiere a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la naturaleza (p. ej., que codifica una proteína natural).

Según aquí se utiliza, un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "con sentido" que codifica una proteína, p. ej., que es complementaria a la cadena codificadora de una molécula de cDNA bicatenaria, que es complementaria a una secuencia de mRNA, o que es complementaria a la cadena codificadora de un gen. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con un ácido nucleico con sentido.

Según aquí se utiliza, la expresión "región codificadora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende codones que son traducidos en residuos de aminoácidos, mientras que la expresión "región no codificadora" se refiere a regiones de una secuencia de nucleótidos que no son traducidos en aminoácidos (p. ej., las regiones en 5' y 3' que no se traducen).

Según aquí se utiliza, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Uno de los tipos de vectores es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular dentro del cual se pueden ligar segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico en el que segmentos de DNA adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedadora en la que son introducidos (p. ej., vectores bacterianos que contienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episómicos de mamíferos) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de su introducción en la célula hospedadora, y por ello se replican junto con el genoma hospedador. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Esos vectores se denominan aquí "vectores de expresión recombinante" o simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión recombinante, de utilidad en técnicas de DNA recombinante, suelen estar en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención quiere incluir esas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (p. ej., retrovirus defectivos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que realizan funciones equivalentes.

Según aquí se utiliza, la expresión "célula hospedadora" quiere hacer referencia a una célula dentro de la cual se ha introducido un ácido nucleico de la invención, tal como un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan aquí indistintamente. Se debe entender que esas expresiones se refieren no sólo a la célula particular del individuo sino a la progenie o a la potencial progenie de esa célula. Debido a que pueden tener lugar algunas modificaciones en las generaciones sucesivas a causa de mutaciones o influencias medioambientales, esa progenie puede no ser idéntica, en realidad, a la célula parental, pero sigue estando incluida en el alcance de la expresión según aquí se utiliza.

Según aquí se utiliza, un "animal transgénico" se refiere a un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un "transgén". El término "transgén" se refiere a un DNA exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, por ejemplo dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico.

Según aquí se utiliza, un "animal recombinante homólogo" se refiere a un tipo de animal transgénico no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que un gen endógeno ha sido alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de un DNA exógeno introducida en una célula del animal, p. ej., una célula embrionaria del animal, antes de desarrollo del animal.

Según aquí se utiliza, una "proteína aislada" se refiere a una proteína que está sustancialmente libre de otras proteínas, de material celular y de medio de cultivo cuando se aísla a partir de células o cuando se produce mediante técnicas de DNA recombinante, o a partir de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se obtiene por síntesis química.

Según aquí se utiliza, el término "anticuerpo" quiere incluir moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno, que se une de manera específica a (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como los fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Las expresiones "anticuerpos monoclonales" y "composiciones de anticuerpos monoclonales", según aquí se utilizan, se refieren a una población de moléculas de anticuerpos que contienen únicamente una especie de sitio de unión a antígeno, capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular de un antígeno, mientras que la expresión "anticuerpos policlonales" y "composiciones de anticuerpos policlonales" se refieren a una población de moléculas de anticuerpos que contienen múltiples especies de sitios de unión a antígeno, capaces de interaccionar con un antígeno particular. Las composiciones de anticuerpos monoclonales por lo tanto presentan típicamente una única afinidad de unión con respecto a un antígeno particular con el que inmunorreacciona.

Existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoácidos de una proteína particular y las secuencias de nucleótidos que pueden codificar esa proteína, según se define en el código genético (mostrado a continuación). Asimismo, existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico particular y la secuencia de aminoácidos codificada por esa secuencia de ácido nucleico, según se define en el código genético.

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Una característica importante y muy conocida del código genético es su redundancia, debido a la cual, para la mayoría de los aminoácidos usados para fabricar proteínas, se puede emplear más de un único triplete de nucleótidos codificador (arriba ilustrado). Por lo tanto, varias secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar una secuencia de aminoácidos determinada. Esas secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes ya que dan como resultado la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos (aunque algunos organismos pueden traducir algunas secuencia de manera más eficiente que otros). Además, de manera ocasional, una variante metilada de una purina o de una pirimidina se puede encontrar en una secuencia de nucleótidos concreta. Esas metilaciones no afectan a la relación de codificación establecida entre el codón de trinucleótidos y el aminoácido correspondiente.

A la vista de lo anteriormente expuesto, la secuencia de nucleótidos de una molécula de DNA o RNA que codifica una proteína T-bet de la invención (o cualquiera de sus porciones) se puede usar para deducir la secuencia de aminoácidos de T-bet, usando el código genético para traducir la molécula de DNA o RNA en una secuencia de aminoácidos. De la misma amanera, en el caso de la secuencia de aminoácidos de cualquier T-bet, las secuencias de nucleótidos correspondientes que pueden codificar esa proteína T-bet se pueden deducir a partir del código genético (el cual, debido a su redundancia, producirá múltiples secuencias de ácido nucleico para una secuencia de aminoácidos determinada). Por lo tanto, la presente descripción y/o divulgación de una secuencia de nucleótidos de T-bet se debe de considerar que también incluye la descripción y/o divulgación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos. De manera similar, la presente descripción y/o divulgación de una secuencia de aminoácidos de T-bet se debe considerar que incluye también la descripción y/o divulgación de todas las posibles secuencias de nucleótidos que pueden codificar esa secuencia de aminoácidos.

Brachyury o T es el miembro fundador de una familia de factores de transcripción que comparten un dominio de unión a DNA de 200 aminoácidos denominado caja T (del inglés, "T-box") (revisado en (Smith, 1997; Papaioannou, 1997; Meisler, 1997)). La mutación Brachyury (del griego, "rabo corto") fue descrita por primera vez en 1.927 en animales mutantes heterozigotos que presentaban un rabo corto y ligeramente retorcido (Herrmann y col., 1990). La mitad amino terminal (aminoácidos 1-229) de la proteína T-box de Brachyury contiene un dominio conservado conocido como caja T que se ha demostrado que exhibe una actividad de unión a DNA específica de secuencia (Kispert, A. y Herrman, B.G. 1993, EMBO J. 12:3211; Papapetrou, C. y col., 1997, FEBS Lett. 409:201; Kispert, A. y col., 1995, EMBO J. 14:4763). La mitad C-terminal contiene dos pares de dominios de transactivación y de represión. La similitud de secuencia entre regiones con caja T de especies ortólogas puede ser de hasta el 99% y es de aproximadamente del 40%-70% entre genes no ortólogos. El dominio con caja T recientemente ha sido co-cristalizado con DNA y presenta una nueva arquitectura de reconocimiento de DNA específica de secuencia en la que la proteína contacta con el DNA tanto en el surco mayor como en el surco menor (Müller, C.W. y Herrmann, B.G. 1997, Nature 389, 884).

Se usó una estrategia basada en el sistema de un único híbrido en levaduras para identificar factores de transcripción específicos de Th1. Se prepararon células de lavadura para que expresasen una construcción formada por promotor de IL-2-gen de reporte y se transformaron con una biblioteca de cDNA preparada a partir de un clon de células Th1 activadas con anticuerpo anti-CD3. Un examen del promotor de IL-2 revela un excelente sitio de unión a caja T en las posiciones de la -240 a -220 justo en 5' del sitio de NF\kappaB. Según se describe en los ejemplos adjuntos, T-bet se aisló en un ensayo de escrutinio con el sistema de un único híbrido en levaduras, basado en su capacidad para unirse al promotor de IL-2.

La secuencia de nucleótidos que codifica la T-bet murina se muestra en SEQ ID NO: 3. La T-bet murina es una proteína de 530 aminoácidos que tiene un dominio con caja T de 190 aminoácidos localizado en los residuos 136-326. La secuencia de aminoácidos de la T-bet murina se muestra en SEQ ID NO: 4. Después de que la secuencia de la T-bet murina se hubo clonado según aquí se describe, fue posible componer la secuencia del ortólogo humano de T-bet a partir de fragmentos de ácido nucleico que hasta entonces se desconocía que codificasen alguna proteína conocida. La secuencia de nucleótidos de la T-bet humana se muestra en SEQ ID NO: 1. La T-bet humana es una proteína de 535 aminoácidos con un dominio con caja T de 190 aminoácidos localizado en los residuos 138-327. El gen de la T-bet humana mapea en el cromosoma 17. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de dos miembros (seres humanos y ratón) de la familia de proteínas T-bet se muestran en la Figura 1 y en las SEQ ID Nos: 1-4.

Las proteínas T-bet de la invención presentan homología con las proteínas T-box. En la actualidad existen ocho genes con caja T en ratón no incluyendo Brachyury. Estos genes incluyen Tbx1-6, T-brain-1 (Tbr-1) y ahora T-bet, cada uno de ellos con un patrón de expresión distinto y generalmente complejo. La expresión de T-brain-1, por ejemplo, está en su mayor parte restringida a dominios diferentes dentro de la corteza cerebral (Bulfone, A. y col., 1995, Neuron 15, 63). T-bet tiene una secuencia muy similar a la de Tbr-1. Aparte de la caja T, las proteínas T-bet de la invención no comparten similitudes con otras proteínas T-box.

T-bet es una proteína T-box expresada únicamente en células T y tiene una secuencia muy similar a la de Tbr-1. Otras especies también expresan genes similares a Brachyury. Esas especies de vertebrados incluyen Xenopus, pez cebra, pollo y seres humanos (Rao, 1994; Horb y Thomsen, 1997; Conlon y col., 1996: Ryan y col., 1996; Schulte-Merker y col., 1994; Edwards y col., 1996; Morrison y col., 1996; Law y col., 1995; Cambell y col., 1998) así como también especies más alejadas tales como amphioxus, ascidiáceos, equinodermos, Caenorhabditis elegans, Drosophila y otros insectos (Holland y col., 1995). Estos genes están conservados tanto en secuencia como en el patrón de expresión.

T-bet es única en cuanto es la única proteína T-box que está fosforilada en tirosina. Existen dos sitios consenso de fosforilación en tirosina situados en los aminoácidos 328-336 y 526-534 de la T-bet humana y en los aminoácidos 327-335 y 521-529 de la T-bet murina. Una secuencia de localización nuclear está también presente en los aminoácidos del 498-501 de la T-bet humana y en los aminoácidos 493-496 de la T-bet murina. Los experimentos de mapeo localizan dos dominios de transactivación, uno en 5' y otro en 3' del dominio con caja T. Los datos que aquí se exponen muestran que la T-bet se une a un sitio consenso con caja T (definido por selección in vitro del sitio diana como el sitio 5'-GGGAATTTCACACCTAGGTGTGAAATTCCC-3') y a un sitio con caja T en el promotor de IL-2. T-bet se expresa únicamente en el timo y en el sistema linfático periférico. En el sistema periférico, T-bet se expresa únicamente en células Th1 en las que es inducida tanto en respuesta a una estimulación de TcR como en respuesta a IL-12. En el timo, los niveles de T-bet alcanzan los valores más altos en timocitos DN y en timocitos-Rag2.

Estos datos demuestran que la expresión selectiva de T-bet, un nuevo miembro de la familia T-box, es responsable de la expresión de IFN-\gamma específica de tejido. T-bet se expresa únicamente en células Th1 y no en células Th2 y es inducida en las primeras de ellas después de una transmisión de señales a través del receptor de células T. La expresión de T-bet se correlaciona con la expresión de IFN-\gamma en células Th1, células NK y células B, y T-bet es un potente transactivador del gen del IFN-\gamma. Y lo que es más elocuente, la transducción con T-bet mediada por retrovirus, de células Thp, Th1, y de células polarizadas Th2 y Tc2, produce una inducción impresionante de la expresión de IFN-\gamma. Esta inducción va acompañada de la represión de la producción tanto de IL-2 como de IL-4. Por lo tanto, la función de T-bet se extiende más allá del simple control de la transcripción del gen de IFN-\gamma. T-bet convierte tanto las células efectoras polarizadas Th2 como las células polarizadas Tc2 en los subgrupos contrarios Th1 y Tc1, respectivamente. Considerados en sus conjunto, estos datos demuestran que T-bet es responsable del programa genético que inicia el desarrollo del linaje Th1 a partir de células Thp indiferenciadas y actúa tanto iniciando los programas genéticos de Th1 como reprimiendo los programas contrarios en las células Th2.

Diferentes aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones:

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Uno de los aspectos de la invención concierne a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican T-bet. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende al menos aproximadamente 700 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o al menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 1.200, al menos aproximadamente 1.400 o al menos aproximadamente 1.600 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico de la invención comprende al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 1.200 o al menos aproximadamente 1.400 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 70%, más preferiblemente una identidad del 80%, y aún más preferiblemente una identidad del 90% con una molécula de ácido nucleico que comprende: al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 1.200, al menos aproximadamente 1.400 o al menos aproximadamente 1.600 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 70%, más preferiblemente una identidad del 80%, y aún más preferiblemente una identidad del 90% con una molécula de ácido nucleico que comprende: al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 1.000, al menos aproximadamente 1.200 o al menos aproximadamente 1.400 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

Las moléculas de ácido nucleico que difieren de SEQ ID NO: 1 ó 3 debido a la degeneración del código genético, y aún así codifican la misma proteína T-bet que la codificada por SEQ ID NO: 1 y 3, están abarcadas por la invención. Por lo tanto, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

Además, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas T-bet se pueden aislar procedentes de otras fuentes usando técnicas estándar de biología molecular y la información de las secuencias que aquí se proporciona. Por ejemplo, un DNA de T-bet se puede aislar de una biblioteca de DNA genómico humano usando la totalidad o una porción de SEQ ID NO: 1 ó 3 como sonda de hibridación y técnicas estándar de hibridación (p. ej., según se describe en Sambrook, J. y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de un gen de T-bet se puede aislar mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores oligonucleotídicos diseñados teniendo como base la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3. Por ejemplo, se puede aislar mRNA a partir de células (p. ej., mediante el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidina de Chirgwin y col., (1979) Biochemistry 18:5294-5299) y se puede preparar el cDNA usando una transcriptasa inversa (p. ej., la transcriptasa inversa del MLV de Moloney, disponible procedente de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o la transcriptasa inversa del AMV, disponible procedente de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos sintéticos para la amplificación por PCR teniendo como base la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 ó 3. Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando un cDNA o, como alternativa, un DNA genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados según técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado, se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar mediante análisis de la secuencia de DNA. Además, se pueden preparar oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de T-bet mediante técnicas estándar de síntesis, p. ej., usando un sintetizador de DNA automático.

Además de la secuencia de nucleótidos de T-bet mostrada en SEQ ID NO: 1 y 3, los expertos en la técnica percibirán que dentro de una población pueden existir polimorfismos de secuencia de DNA que conducen a cambios pequeños en las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de T-bet. Esos polimorfismos genéticos en el gen de T-bet pueden existir entre individuos de dentro de una población debido a la variación alélica natural. Estas variaciones alélicas naturales pueden producir típicamente una variación del 1%-2% en la secuencia de nucleótidos de un gen. Cualquiera de estas variaciones de nucleótidos, y todas ellas, y los polimorfismos de aminoácidos resultantes en T-bet que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de T-bet, se quiere que estén incluidas en el alcance de la invención.

Se pueden aislar moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales de los DNA de T-bet de la invención tomando como base sus homologías con las moléculas de ácido nucleico de T-bet aquí descritas, usando el DNA humano, o una de sus porciones, como sonda de hibridación, conforme a técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Por consiguiente, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con una segunda molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID. NO: 1 ó 3. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención, que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3. En una de las realizaciones, esa molécula de ácido nucleico tiene una longitud de al menos aproximadamente 700, 800, 900, 1.000, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500 ó 1.600 nucleótidos. En otra de las realizaciones, esa molécula de ácido nucleico comprende al menos aproximadamente 700, 800, 900, 1.000, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500 ó 1.600 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o al menos aproximadamente 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.200, 1.300, 1.400 ó 1.500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO. 3. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada corresponde a una variante alélica presente en la naturaleza de una molécula de ácido nucleico de T-bet.

Además de las variantes alélicas de la secuencia de T-bet, presentes en la naturaleza, que puede existir en la población, el experto en la técnica percibirá además que se pueden introducir cambios menores mediante mutación en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3, produciendo con ello cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, sin alterar la actividad funcional de la proteína T-bet. Por ejemplo, sustituciones de nucleótidos que producen sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden hacerse en la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado en la secuencia de tipo salvaje de T-bet (p. ej., la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3) sin alterar la actividad funcional de T-bet, tal como su capacidad para interaccionar con DNA o su capacidad para estimular la transcripción desde un promotor de IFN-gamma, mientras que un "residuo de aminoácido esencial" se requiere para la actividad funcional.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención concierne a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas T-bet que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de T-bet. Esas proteínas T-bet difieren en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 ó 4 y aún así conservan la actividad de T-bet. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante no natural de una proteína T-bet se puede crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3 de manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en SEQ ID NO: 1 ó 3 mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida a sitio específico y la mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales. Una sustitución de aminoácidos "conservativa" es una sustitución en la que el residuo de aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial en T-bet se sustituye preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Como alternativa, en otra realización, se pueden introducir mutaciones de manera aleatoria a lo largo de la totalidad o de una parte de la secuencia codificadora de T-bet, como por ejemplo mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden someter a escrutinio con respecto a su capacidad para unirse a DNA y/o para activar la transcripción, con el fin de identificar los mutantes que conservan la actividad funcional. Después de la mutagénesis, la proteína mutante codificada se puede expresar de manera recombinante en una célula hospedadora, y la actividad funcional de la proteína mutante se puede determinar utilizando ensayos disponibles en la técnica para determinar la actividad de T-bet (p. ej., midiendo la capacidad de la proteína para unirse a un elemento de unión con caja T presente en un DNA o midiendo la capacidad de la proteína para modular el fenotipo Th1 o el fenotipo Th2 en células T.

Otro aspecto de la invención concierne a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido con respecto a la cadena codificadora de un mRNA o a un gen de T-bet. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede ser complementario a una cadena codificadora de T-bet completa, o solamente a una de sus porciones. En una de las realizaciones, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una región codificadora de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica T-bet que es única con respecto a la familia de proteínas T-bet o que es única con respecto a una secuencia de T-bet de una especie particular. En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una región no codificadora de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótidos que codifica T-bet que es única con respecto a la familia de proteínas T-bet o que es única con respecto a una secuencia de T-bet de una especie particular. En las realizaciones preferidas, una molécula antisentido de la invención comprende al menos aproximadamente 700 nucleótidos contiguos de la cadena no codificadora de SEQ ID NO: 1 o más preferiblemente al menos 800, 1.000, 1.200, 1.400 ó 1.600 nucleótidos contiguos de la cadena no codificadora de SEQ ID NO: 1 o al menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos de la cadena no codificadora de SEQ ID NO: 3, más preferiblemente al menos 600, 800, 1.000, 1.200 ó 1.400 nucleótidos contiguos de la cadena no codificadora de SEQ ID NO. 3.

Dadas las secuencias de las cadenas codificadoras que codifican T-bet, aquí descritas, (p, ej., SEQ ID NOS: 1 y 3, se pueden diseñar ácidos nucleicos antisentido de la invención conforme a las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificadora completa del mRNA de T-bet, o como alternativa puede ser un oligonucleótido que es antisentido con respecto a solamente una porción de la región codificadora o de la región no codificadora del mRNA de T-bet. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden ser complementarios a la región que rodea el sitio de iniciación de la traducción del mRNA de T-bet. Un oligonucleótido antisentido puede tener una longitud, por ejemplo, de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de la invención se puede construir usando reacciones de síntesis química y de ligación enzimática usando conocimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (p. ej. un oligonucleótido antisentido se puede sintetizar por métodos químicos usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos modificados de diversa manera y diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos, p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos de acridina sustituidos. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión dentro del cual un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado estará en una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito más ampliamente en la subsección siguiente).

En otra realización, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, con respecto al cual ellas presentan una región complementaria. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica T-bet se puede diseñar basándose en la secuencia de nucleótidos de un gen de T-bet aquí descrito, por ejemplo se puede construir un derivado del RNA de Tetrahymena L-19 IVS en el que la secuencia de bases del centro activo es complementaria a la secuencia de bases que ha de ser escindida en un mRNA que codifica T-bet. Véase por ejemplo, Cech y col., Patente de EE.UU. Núm. 4.987. 071; Cech y col., Patente de EE.UU. Núm. 5.116.742. Como alternativa, se puede usar mRNA de T-bet para seleccionar un RNA catalítico que tiene una actividad ribonuclesa específica, en un material reunido de moléculas de RNA. Véase por ejemplo Bartel D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Otro aspecto más de la invención concierne a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas de fusión con T-bet. Esas moléculas de ácido nucleico, que comprenden al menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína T-bet, un polipéptido T-bet o un péptido T-bet, operativamente ligada a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido distintos de T-bet, se pueden preparar mediante técnicas estándar de DNA recombinante. Las proteínas de fusión con T-bet se encuentran descritas con más detalle más adelante en la subsección III.

II. Vectores de expresión recombinante y células hospedadoras

Otro aspecto de la invención concierne a vectores, preferiblemente a vectores de expresión recombinante, que contienen un ácido nucleico que codifica T-bet (o una de sus porciones). Los vectores de expresión de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo cual significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en relación con las células hospedadoras que van a ser utilizadas para la expresión, secuencia que está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico que ha de ser expresada. En relación con un vector de expresión recombinante, por "operativamente ligado" se quiere indicar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la secuencia(s) reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector es introducido en la célula hospedadora). La expresión "secuencia reguladora" incluye promotores, secuencias estimuladoras de la transcripción y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Esas secuencias reguladoras se encuentran descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press. San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las secuencias que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en determinadas células hospedadoras (p. ej., las secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica percibirán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la mejor célula hospedadora que ha de ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedadoras para producir de esta manera proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos según aquí se describe (p. ej., proteínas T-bet, formas mutantes de proteínas T-bet, proteínas de fusión con proteínas T-bet, y proteínas similares.

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de una proteína T-bet en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, T-bet se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, en células de insectos (usando los vectores de expresión en baculovirus), en células de levadura, o en células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se tratan más ampliamente en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press. San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y la polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas, se lleva a cabo muy frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada por ellos mismos, normalmente en el extremo amino terminal de la proteína recombinante. Esos vectores de fusión pueden servir para uno o varios fines: 1) para aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; 3) para facilitar la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad; 4) para proporcionar un epítopo de identificación que facilite la detección y/o la purificación de la proteína; y/o 5) para proporcionar un marcador que facilite la detección de la proteína (p. ej., un marcador con color usando fusiones con \beta-galactosidasa). Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en el punto de unión del resto de fusión y de la proteína recombinante, para permitir la separación de la proteína recombinante y del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Esas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores típicos de expresión de fusiones incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-49), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fusionan glutation-S-transferasa (GST), la proteína E de unión a maltosa, o la proteína A respectivamente, a la proteína recombinante diana. Las proteínas recombinantes también se pueden expresar en células eucariotas en forma de proteínas de fusión para los mismos fines anteriormente comentados.

Ejemplos de vectores adecuados de expresión en E. coli, inducibles y de no fusión, incluyen pTrc (Amann y col., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier y col., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185. Academic Press. San Diego, California (1990) 60-89). La expresión de genes diana procedentes del vector pTrc se basa en la transcripción con la RNA-polimerasa del hospedador desde un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión de genes diana procedentes del vector pET 11d se basa en la transcripción desde un promotor de fusión gn10-lac de T7 mediada por una RNA-polimerasa vírica coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa vírica es suministrada por las cepas hospedadoras BL21 (DE3) o HMS174(DE3) procedente de un profago landa residente que alberga un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV5.

Una de las estrategias seguidas para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedadora que tiene una capacidad deteriorada para escindir la proteína recombinante mediante proteolisis (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press. San Diego. California (1990) 119-128). Otra de las estrategias consiste en alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que va a ser insertado en el vector de expresión de manera que los codones individuales de cada uno de los aminoácidos sean los usados preferencialmente en E. coli (Wada y col., (1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118). Esa alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización, el vector de expresión de T-bet es un vector de expresión en levaduras. Ejemplos de vectores de expresión en la levadura S. cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari y col., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y col., (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Como alternativa, T-bet se puede expresar en células de insecto usando vectores de expresión en baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto en cultivo (p. ej., células Sf9) incluyen la serie de pAc (Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2154-2165) y la serie de pVL (Lucklow, V.A. y Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39).

En otra realización más, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión en mamíferos. Los ejemplos de vectores de expresión en mamíferos incluyen Mex-NeoI, pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y col., (1987), EMBO J. 6 187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión suelen estar proporcionadas por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados son los derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y el Virus Simio 40.

En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamíferos es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (p. ej., se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Ejemplos no limitativos de promotores adecuados específicos de tejido incluyen promotores linfoide-específicos (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) y de inmunoglobulinas (Banerji y col., (1983) Cell 33:729-740); Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), el promotor de la albúmina (específico de hígado; Pinkert y col., (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de neuronas (p. ej., el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund y col. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (p. ej., promotor de suero de la leche; Patente de EE.UU. Núm. 4.873.316 y Publicación de Patente europea Núm. 264, 166). Los promotores de regulación medioambiental también están abarcados, por ejemplo, los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Además, en la técnica se conocen sistemas de regulación inducibles para usar en células de mamífero, por ejemplo, sistemas en los que la expresión génica está regulada por iones de metales pesados (véase: p. ej., Mayo y col., (1982) Cell 29:99-108; Brinster y col., (1982) Nature 296:39-42; Searle y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489), por choque térmico (véase p. ej., Nouer y col., (1991) en Heat Shock Response, redactor: Nouer, L., CRC, Boca Raton, FL, págs. 167-220), por hormonas (véase p. ej., Lee y col. (1981) Nature 294:228-232; Hynes y col. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock y col. (1987) Nature 329:734-736; Hynes y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock y col., (1987) Nature 329:734-736; Israel y Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604; y la Publicación de PCT Núm. WO 93/23431), por moléculas relacionadas con FK506 (véase p. ej., la Publicación de PCT Núm. WO 94/18317) o por tetraciclinas (Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. y col., (1995) Science 268:1766-1769; Publicación de PCT Núm. WO 94/29442; y publicación de PCT Núm. WO 96/01313). Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un vector de expresión recombinante en el que el DNA de T-bet está operativamente ligado a un promotor eucariota inducible, permitiendo de esta manera la expresión inducible de proteína T-bet en células eucariotas.

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está operativamente ligada a una secuencia reguladora de manera que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido con respecto al RNA de T-bet. Se pueden elegir secuencias reguladoras operativamente ligadas a un ácido nucleico en la orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en diversos tipos de células, por ejemplo, promotores víricos y/o secuencias estimuladoras víricas, o secuencias reguladoras que dirigen una expresión específica del RNA antisentido de tejido o una expresión específica de un tipo celular. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, un fagómido o un virus atenuado, en los que los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad puede estar determinada por el tipo de célula en la que el vector se introduce. Para un análisis de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, véase Weintraub, H. y col., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

Otro aspecto de la invención concierne a células hospedadoras recombinantes en la que se ha introducido un vector, preferiblemente un vector de expresión recombinante, de la invención. Una célula hospedadora puede ser una célula procariota o eucariota. Por ejemplo, la proteína T-bet se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, en células de insectos, en levaduras o en células de mamíferos (tales como las células de ovario de hámster chino (CHO)o las células COS). Otras células hospedadoras adecuadas son muy conocidas por los expertos en la técnica. El DNA vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección. Según aquí se utiliza, los términos "transformación" y "transfección" quieren hacer referencia a diversos métodos reconocidos en la técnica para introducir un ácido nucleico extraño (p. ej., DNA) en una célula hospedadora, que incluyen la coprecipitación con fosfato cálcico o con cloruro cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y en otros manuales de laboratorio.

Con respecto a una transfección estable en células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usados, solamente una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estas células integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej. un gen de resistencia a antibióticos) generalmente se introduce en la célula hospedadora junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los marcadores que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede ser introducido en una célula hospedadora en el mismo vector que codifica T-bet, o puede ser introducido en un vector diferente. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido, se pueden identificar mediante selección con fármacos (p. ej., las células que han incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que el resto de las células morirá).

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota, se puede usar para producir (es decir, para expresar) una proteína T-bet. Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir una proteína T-bet usando las células hospedadoras de la invención. En una de las realizaciones, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (dentro de la que se ha introducido el vector de expresión recombinante que codifica T-bet) en un medio adecuado hasta que se produce T-bet. En otra realización, el método comprende además aislar T-bet a partir del medio o de la célula hospedadora. En su forma natural, la proteína T-bet es una proteína intracelular y, por lo tanto, la proteína T-bet recombinante se puede expresar intracelularmente en una célula hospedadora recombinante y después aislar a partir de la célula hospedadora, p. ej., lisando la célula hospedadora y recuperando la proteína T-bet recombinante del lisado. Como alternativa, la proteína T-bet recombinante se puede preparar en forma de una proteína extracelular ligando operativamente una secuencia señal heteróloga a la terminación amino de la proteína de manera que la proteína es secretada en las células hospedadoras. En este caso, la proteína T-bet recombinante se puede recuperar a partir del medio de cultivo en el que las células se cultivan.

Algunas células hospedadoras de la invención también se pueden usar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una de las realizaciones, una célula hospedadora de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embrionaria totipotente en las que se han introducido secuencias que codifican T-bet. Esas células hospedadoras se pueden usar para crear animales transgénicos no humanos en los que secuencias de T-bet exógenas se han introducido en sus genomas, o animales homólogos recombinantes en los que secuencias de T-bet endógenas han sido alteradas. Esos animales son útiles para estudiar la función y/o la actividad de T-bet, y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad de T-bet. Por lo tanto, otro aspecto de la invención concierne a animales transgénicos no humanos que contienen células que portan un transgén que codifica una proteína T-bet o una porción de una proteína T-bet. En una subrrealización, de los animales transgénicos de la invención, el transgén altera un gen endógeno que codifica una proteína T-bet endógena (p. ej., animales homólogos recombinantes en los que el gen endógeno de T-bet ha sido funcionalmente alterado o inactivado (del inglés, "knocked out"), o la secuencia de nucleótidos del gen endógeno de T-bet ha sido mutada o la región reguladora transcripcional del gen endógeno de T-bet ha sido alterada).

Un animal transgénico de la invención se puede crear introduciendo un ácido nucleico que codifica T-bet en el pronúcleo masculino de un oocito fertilizado, p. ej., mediante microinyección, o permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal hembra adoptiva pseudopreñada. La secuencia de nucleótidos de T-bet de SEQ ID NO: 1 ó 3 se puede introducir en forma de un transgén en el genoma de un animal no humano. También se pueden incluir en el transgén secuencias intrónicas y señales de poliadenilación para aumentar la eficiencia de la expresión del transgén. Una secuencia(s) reguladora específica de tejido se puede ligar operativamente al transgén que porta T-bet para dirigir la expresión de una proteína T-bet en células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos a través de manipulación de embriones y microinyección, en particular animales tales como ratones, se han convertido en métodos convencionales en la técnica y se encuentran descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Núms. 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder y col., en la Patente de EE.UU. Núm. 4.873.191 de Wagner y col., y en Hogan, B., Manipulating de Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986). Métodos similares se usan para la producción de otros animales transgénicos. Un animal transgénico fundador se puede identificar basándose en la presencia del transgén que porta T-bet en su genoma y/o en la expresión del mRNA de T-bet en tejidos o células del animal. Un animal transgénico fundador se puede entonces utilizar para realizar cruces con animales adicionales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica T-bet se pueden cruzar también con otros animales transgénicos que portan otros transgenes.

Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de T-bet en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para de este modo alterar, p. ej., desactivar funcionalmente, el gen de T-bet endógeno. En una de las realizaciones, se diseña un vector de recombinación homóloga de manera que, después de la recombinación homóloga, el gen de T-bet endógeno está funcionalmente desactivado (es decir, deja de codificar una proteína funcional; también denominado vector "knock out"). Como alternativa, el vector se puede diseñar de manera que, después de la recombinación homóloga, el gen de T-bet endógeno es reemplazado por ese gen de T-bet. En el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen de T-bet está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen de T-bet que permite que tenga lugar una recombinación homóloga entre el gen de T-bet exógeno portado por el vector y un gen de T-bet endógeno presente en una célula madre embrionaria totipotente. El ácido nucleico adicional que flanquea el ácido nucleico de T-bet tiene la longitud suficiente para conseguir realizar una recombinación homóloga con el gen endógeno. Típicamente, en el vector se incluyen varias kilobases de DNA flanqueante (en ambos extremos 5' y 3') (véase p. ej., Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 en relación con una descripción de vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias totipotentes (p. ej., mediante electroporación) y se seleccionan las células en la que el gen de T-bet introducido ha experimentado una recombinación homóloga con el gen de T-bet endógeno (véase p. ej., Li, E. y col. (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas se inyectan luego en un blastocisto de un animal (p. ej., un ratón) para formar quimeras por agregación (véase p. ej., Bradley, A., en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A practical Approach, E.J. Robertson, redactor (IRL. Oxford, 1987) págs. 113-152). Un embrión quimérico se puede después implantar en un animal hembra adoptiva pseudopreñada adecuada, y el embrión se lleva a término. La progenie que alberga el DNA recombinado de manera homóloga en sus células germinales se puede usar para cruzarla con animales en los que todas las células del animal contienen el DNA recombinado de manera homóloga mediante transmisión del transgén a la línea germinal. Métodos para construir vectores de recombinación homóloga y animales recombinantes homólogos se encuentran descritos más ampliamente en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en la Publicación internacional de PCT Núms. WO 90/11354 de Le Mouellec y col.; WO/9101140 de Smithies y col.; WO 92/0968 de Zijlstra y col.; y WO 93/04169 de Bearns y col.

Además de lo anteriormente expuesto, el experto en la técnica percibirá que otras estrategias de recombinación homóloga conocidas en la técnica se pueden aplicar al presente invento. En la técnica se conocen sistemas de integración específica de sitio y asistida por enzimas y se pueden aplicar para integrar una molécula de DNA en una localización predeterminada de una segunda molécula de DNA diana. Ejemplos de esos sistemas de integración asistida por enzimas incluyen el sistema de la recombinasa Cre - sitio lox diana (p. ej., según se describe en Baubonis, W. y Sauer, B. (1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029; y en Fukushige, S. y Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909) y el sistema de la recombinasa FLP - sitio FRT diana (p. ej., según se describe en Dang, D.T. y Perrimon, N. (1992) Dev. Genet. 13:367-375; y Fiering, S. y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473). También se pueden utilizar sistemas inducibles de recombinación homóloga, regulados por tetraciclina, tales como los descritos en la publicación de PCT Núm. WO 94/29442 y en la publicación de PCT Núm. WO 96/01313.

En otra realización, se pueden preparar animales transgénicos en los que T-bet se expresa en todas las células T, p. ej., usando el factor estimulador CD4 (Zheng, W-P. y Flavell, R.A. 1997. Cell 89, 587). Un trabajo reciente sugiere que también se puede usar el factor estimulador CD2. De hecho, éste último en más potente en cuanto a alcanzar un alto nivel de expresión en células T, la expresión no es variegada y la expresión del transgén es dependiente del número de copias (Zhumabekov, T., y col. 1995. J. Immunol. Meth. 185, 133; Sharp, L.L. y col., 1997. Immunity 7, 609). Los ratones con un alto nivel de expresión de RNA de T-bet (usando como sonda el intrón de la hormona de crecimiento humana para distinguir el RNA de T-bet dirigido por el transgén de la T-bet endógena) se pueden identificar realizando el escrutinio de un número adecuado de animales fundadores.

En otra estrategia, se puede crear un transgénico represor dominante. Por ejemplo, se puede preparar una T-bet represora dominante usando el elemento proximal estimulador de la transcripción de lck (Alberola-Ila, J., y col. 1996, J. Exp. Med. 184, 9) que dirige una fusión de T-bet y del gen engrailed (Taylor, D., 1996, Genes Dev. 10, 2732; Li, J., Thurm, H., y col. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10885). Esta construcción reprime de manera específica la transactivación por T-bet de un gen de reporte dependiente de T-bet multimerizado y no afecta a la transactivación del gen de reporte dependiente de NFAT.

Como alternativa, se pueden generar mutaciones nulas mediante mutagénesis dirigida en células ES (Ranger, A.M., y col. 1998, Nature 392, 186; Hodge, M.R., y col. 1996, Immunity 4:1, 144; Grusby, M.J., y col. 1991. Science 253, 1417; Reimold, A.M., y col. 1996, Nature 379:262; Kaplan, M.H., 1996, Immunity :313; Kaplan, M.H., y col. 1996, Nature 382, 174; Smiley, S.T., y col., 1997, Science 275, 997). Por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica, se puede aislar un clon genómico de T-bet procedente de una biblioteca genómica, se puede delinear la organización de intrones-exones, y se puede crear una construcción de direccionamiento en el vector que porta cre-lox (véase el comentario más adelante) que debe delecionar el primer exón y 450 pb de la secuencia del promotor aguas arriba. Esta construcción se puede introducir por electroporación en una línea de células ES, y los clones que presentan una doble resistencia a fármacos (p. ej., a neomicina, a ganciclovir) se pueden identificar mediante análisis de transferencia Southern. Los clones que portan eventos recombinantes homólogos en el locus de T-bet se pueden después identificar e inyectar en blastocistos obtenidos de ratones hembras BALB/c preñadas de 3,5 días. Entonces se pueden producir ratones quiméricos y se pueden emparejar con ratones BALB/c de tipo salvaje para generar la transmisión del gen de T-bet desactivado a la línea germinal.

En otra realización, la implantación en blastocistos deficientes en RAG2 (Chen, J., y col. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4528) o la estrategia basada en producción de deleciones inducibles con el sistema cre-lox se puede usar para producir ratones que carecen de T-bet solamente en el sistema inmunológico. Por ejemplo, la construcción de direccionamiento se puede preparar en el vector que porta cre-lox. El sistema de complementación de blastocistos se ha usado para estudiar NFATc, un fenotipo embrionario letal (Ranger, A.M., y col. 1998. Immunity 8:125). Esta estrategia requiere desactivar el gen de T-bet en los dos cromosomas en células ES, lo cual se puede realizar, p. ej., usando un gen de neomicina mutante y subiendo la concentración de G418 en los cultivos de ES, según se ha descrito (Chen. J. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4528) o flanqueando el gen neo con sitios cre-lox. Para desactivar el segundo alelo, el gen de neomicina se puede delecionar transfectando el clon de ES con la recombinasea cre, y a continuación el clon de ES se puede transfectar con la misma construcción de direccionamiento para seleccionar clones con deleciones de T-bet en los dos alelos. Una tercera transfección con la recombinasa cre da lugar a las células ES doblemente deficientes deseadas. Esas células ES doblemente direccionadas se implantan a continuación en blastocistos RAG2 y los órganos linfáticos de los ratones quiméricos así generados serán totalmente colonizados por las células ES transferidas. Esto permite valorar el efecto de la ausencia de T-bet sobre las células del sistema linfático sin afectar a otros sistemas orgánicos en los que la ausencia de T-bet pudiera causar letalidad.

También se puede utilizar la estrategia de la eliminación condicional utilizando el sistema cre-lox. Brevemente expuesto, se genera una construcción de direccionamiento en la que las secuencias de recombinación lox se sitúan en regiones intrónicas que flanquean los exones que han de ser delecionados. Esta construcción se utiliza para transfectar luego células ES y se generan ratones mutantes como se ha descrito anteriormente. Los ratones mutantes resultantes se emparejan luego con ratones transgénicos con respecto a la recombinasa cre dirigida por un promotor inducible. Cuando cre se expresa, induce la recombinación entre los sitios lox introducidos y el gen de T-bet, inactivando así de manera efectiva la función del gen. La característica clave de esta estrategia es que la inactivación del gen puede ser inducida en el animal adulto a voluntad, mediante activación de la recombinasa cre.

Se puede usar un promotor específico de tejido para evitar anormalidades en órganos distintos del sistema inmunológico. El transgén que expresa cre puede estar dirigido por un promotor inducible. Varios sistemas inducibles están siendo actualmente utilizados en las estrategias de recombinacióm cre-lox, siendo los más comunes los sistemas que utilizan tetraciclina y ecdinosona. Se puede usar un promotor inducible, específico de tejidos si existe letalidad embrionaria en el ratón nulo de T-bet.

Una estrategia alternativa consiste en generar un ratón transgénico que alberga un gen de T-bet regulado (por ejemplo utilizando el promotor de apagado de tetraciclina; p. ej., St-Onge, y col., Nuc. Acid. Res. 24, 3875-3877) y cruzar después este ratón transgénico con el ratón deficiente en T-bet. Esta estrategia permite la creación de ratones con la función de T-bet normal; la tetraciclina se puede administrar a los animales adultos para inducir la inactivación de la función de T-bet en células T periféricas, y entonces se puede estudiar el efecto de la deficiencia en T-bet a lo largo del tiempo. Ciclos repetidos de aporte seguido de retirada del fármaco (tetraciclina) permiten el encendido y el apagado del gen de T-bet a voluntad.

III. Proteínas T-bet aisladas y anticuerpos anti-T-bet

Otro aspecto de la invención concierne a proteínas T-bet aisladas. Preferiblemente, la proteína T-bet comprende la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 ó 3. En otra realización preferida, la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. En otras realizaciones, la proteína tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, más preferiblemente del 80% y aún más preferiblemente una identidad de aminoácidos del 90% o del 95% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 ó 4.

Las proteínas T-bet de la invención se producen preferiblemente mediante técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión (según se ha descrito anteriormente), el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora (según se ha descrito anteriormente) y la proteína T-bet se expresa en la célula hospedadora. La proteína T-bet se puede luego aislar procedente de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas estándar de purificación de proteínas. Como alternativa a la expresión recombinante, un polipéptido T-bet se puede sintetizar por métodos químicos usando técnicas estándar de síntesis peptídica. Además, la proteína T-bet natural se puede aislar a partir de células (p. ej., de células T) por ejemplo mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-T-bet.

La invención también proporciona proteínas de fusión con T-bet. Según aquí se utiliza, una "proteína de fusión" con T-bet comprende un polipéptido T-bet operativamente ligado a un polipéptido diferente de T-bet. Un "polipéptido T-bet" se refiere a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína T-bet mientras que un "polipéptido diferente de T-bet" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a otra proteína. Dentro de la proteína de fusión, la expresión "operativamente ligado" quiere indicar que el polipéptido de T-bet y el otro polipéptido están fusionados uno al otro en el marco de lectura. El otro polipéptido puede estar fusionado en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido T-bet. Por ejemplo, en una de las realizaciones, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-T-bet en la que las secuencias de T-bet están fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias de GST. En otra realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión T-bet-HA en la que la secuencia de nucleótidos de T-bet está insertada en un vector tal como el vector pCEP4-HA (Herrscher, R.F. y col., (1995) Genes Dev. 9:3067-3082) de manera que las secuencias de T-bet están fusionadas en el marco de lectura con un epítopo identificador de la hemaglutinina de la gripe. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de la T-bet recombinante.

Preferiblemente, una proteína de fusión con T-bet de la invención se produce mediante técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de DNA que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se ligan entre sí en el marco de lectura de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando para la ligación terminaciones de extremos romos o terminaciones finalizadas en extremos escalonados, digestión con enzimas de restricción para proporcionar las terminaciones apropiadas, rellenado de extremos cohesivos según convenga, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones no deseadas y ligación enzimática. En otra realización, la proteína de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen los sintetizadores automáticos de DNA. Como alternativa, se puede llevar a cabo una amplificación de fragmentos génicos por PCR usando cebadores de anclaje que dan lugar a extremos protuberantes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente se pueden reasociar y reamplificar para generar una secuencia de gen quimérico (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausbel y col., redactores. John Wiley & Sons: 1992). Además, se encuentran comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (p. ej., un polipéptido GST o un epítopo identificador de HA). Un ácido nucleico que codifica T-bet se puede clonar en un vector de expresión de este tipo de manera que el resto de fusión está unido en el marco de lectura a la proteína T-bet.

Una proteína T-bet aislada, o uno de sus fragmentos, se puede usar como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen de manera específica a T-bet, usando técnicas estándar para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. La proteína T-bet se puede usar para generar anticuerpos. Por ejemplo, se pueden producir antisueros policlonales en conejos usando como inmunógeno una T-bet recombinante de longitud completa, producida en bacterias. Este mismo inmunógeno se puede usar para producir el mAb inmunizando ratones y extrayendo células del bazo de los ratones inmunizados. Las células de bazo procedentes de ratones que elevan una inmunorrespuesta contra T-bet se pueden fusionar a células de mieloma, p. ej., del mieloma SP2/O-Ag14. Según se describe en los ejemplos adjuntos, estos métodos se usaron para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a T-bet.

Como alternativa, como inmunógeno se puede usar un fragmento peptídico antigénico de T-bet. Un fragmento peptídico antigénico de T-bet típicamente comprende al menos 8 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 ó 4 y abarca un epítopo de T-bet de manera que un anticuerpo inducido contra el péptido forma un inmunocomplejo específico con T-bet. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos de aminoácido, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácido, aún más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácido, y muy preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácido. Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de T-bet que están situadas sobre la superficie de la proteína, p. ej., regiones hidrófilas, y que son exclusivas de T-bet. En una de las realizaciones, esos epítopos pueden ser específicos de proteínas T-bet de una única especie, tal como ratón o seres humanos (es decir, como inmunógeno se usa un péptido antigénico que se extiende a lo largo de una región de T-bet que no está conservada entre especies); esos residuos no conservados se pueden determinar usando un alineamiento como el que aquí se proporciona). Se puede realizar un análisis estándar de hidrofobicidad de la proteína T-bet para identificar las regiones hidrófilas.

Un inmunógeno de T-bet se usa típicamente para preparar anticuerpos inmunizando un individuo adecuado, (p. ej., conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína T-bet expresada de manera recombinante o un péptido T-bet sintetizado por métodos químicos. La preparación puede incluir además un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund o el adyuvante incompleto de Freund, o una agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un individuo adecuado con una preparación inmunogénica de T-bet induce una respuesta de anticuerpos anti-T-bet policlonales.

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Por consiguiente, otro aspecto de la invención concierne a anticuerpos anti-T-bet. Los anticuerpos anti-T-bet policlonales se pueden preparar según se ha descrito anteriormente, inmunizando un individuo adecuado con un inmunógeno de T-bet. El título de anticuerpos anti-T-bet en el individuo inmunizado se puede seguir a lo largo del tiempo mediante técnicas estándar, tales como un inmunoensayo enzimático por adsorción (ELISA) (del inglés, " Enzyme Linked Immunosorbent Assay") usando T-bet inmovilizada. Si se desea, las moléculas de anticuerpos dirigidas contra T-bet pueden ser aisladas del mamífero (p. ej., de la sangre) y posteriormente purificadas mediante técnicas muy conocidas, tales como la cromatografía con proteína A para obtener la fracción de IgG. A un tiempo apropiado después de la inmunización, p. ej., cuando los títulos de anticuerpos anti-T-bet son más altos, se pueden obtener del individuo células productoras de anticuerpos y se pueden usar para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tales como la técnica con hibridomas originariamente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (véase también, Brown y col., (1981) J. Immunol. 127:539-546; Brown y col., (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-4983; Yeh y col. (1976) PNAS 76 :2927-2931; y Yeh y col. (1982) Int. J. Cancer 29:269-275), la técnica más reciente con hibridomas de células B humanas (Kozbor y col. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica con hibridomas-EBV (Cole y col. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) o las técnicas con triomas. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es muy conocida (véase de manera general R.H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York. Nueva York (1980); E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol Med., 54:387-402; M.L. Gefter y col. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-236). Brevemente expuesto, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) se fusiona a linfocitos (típicamente a esplenocitos) procedentes de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de T-bet según se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes de los cultivos de las células de hibridoma resultantes se someten a escrutinio para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a T-bet.

Cualquiera de los muchos y muy conocidos protocolos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas se puede aplicar con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-T-bet (véase, p. ej., G. Galfre y col. (1977) Nature 266:55052; Gefter y col. Somatic Cell Genet., citada supra; Lerner, Yale J. Biol Med., citada supra, Kenneth, Monoclonal Antibodies, citada supra). Además, un trabajador con una experiencia ordinaria en la técnica percibirá que existen muchas variaciones de esos métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea de células inmortales (p. ej., una línea de células de mieloma) deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden preparar hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de células inmortalizadas de ratón. Las líneas de células inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Cualquiera de las numerosas líneas celulares de mieloma se puede usar como pareja de la fusión conforme a técnicas estándar, p. ej., las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.633 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma se encuentran disponibles procedentes de la American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, Md. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después usando un medio HAT, que mata a las células de mieloma no fusionadas o fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren al cabo de varios días porque no han sido transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan realizando un escrutinio de los sobrenadantes de los cultivos de los hibridomas con respecto a anticuerpos que se unen a T-bet, p. ej., usando un ensayo estándar de ELISA.

Como alternativa para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal anti-T-bet se puede identificar y aislar mediante escrutinio de una biblioteca combinatoria de inmunoglobulinas recombinantes (p. ej., una biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos) con T-bet, para de esta manera aislar los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen a T-bet. Kits para generar y escrutar bibliotecas de presentación en fagos se encuentran comercialmente disponibles (p. ej. el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, Núm. de catálogo: 27-9400-01; y el SurfZAP^{TM} Phage Display Kit de Stratagene, Núm. de catálogo: 240612). De manera adicional, ejemplos de métodos y reactivos particularmente fáciles de manejas para usar en la generación y escrutinio de bibliotecas de presentación de anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en Ladner y col., Patente de EE.UU. Núm. 5.223.409; Kang y col., Publicación internacional Núm. WO 92/18619; Dower y col., Publicación internacional Núm. WO 91/17271; Winter y col., Publicación internacional Núm. WO 92/20791; Markland y col., Publicación internacional Núm. WO 92/15679; Breitling y col., Publicación internacional Núm. WO 93/01288; McCafferty y col., Publicación internacional Núm. WO 92/01047; Garrad y col., Publicación internacional Núm. WO 92/09690; Ladner y col., Publicación internacional Núm. WO 90/02809; Fuchs y col. (1991) Biol. Thecnology 9:1370-1372; Hay y col. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 2:81-85; Huse y col., (1989) Science 241:1275-1281; Griffiths y col. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins y col., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson y col. (1991) Nature 352:624-628; Gram y col. (1992) PNAS 89 :3576-3580; Garrad y col. (1991) Biol. Thecnology 9:1373-1377; Hoogenboom y col. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas y col., (1991) PNAS 88:7978-7982; y McCafferty y col., Nature (1990) 348: 552-554.

De manera adicional, anticuerpos anti-T-bet recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y porciones no humanas, y que se pueden preparar usando técnicas estándar de DNA recombinante, están dentro del alcance de la invención. Estos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante métodos de DNA recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en Robinson y col., Publicación de Patentes internacionales PCT/US86/02269; Akira y col., solicitud de Patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de Patente europea 171.496; Morrison y col., solicitud de Patente europea 173.494; Neuberger y col., Solicitud de PCT, WO 86/01533; Cabilly y col., Patente de EE.UU. Núm. 4.816.567; Cabilly y col., solicitud de Patente europea 125.023; Better y col. (1988) Science 240:1041-1043; Liu y col. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y col., (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y col. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw y col. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S.L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi y col. (1986) BioThecniques 4:214; Winter, Patente de EE.UU. Núm. 5.225.539; Jones y col.(1986) Nature 321:552-525; ERRATA; Verhoeyan y col. (1988) Science 239:1534; y Beidler y col. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Un anticuerpo anti-T-bet (p. ej., un anticuerpo monoclonal) se puede usar para aislar T-bet mediante técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-T-bet puede facilitar la purificación de una T-bet natural procedente de células y de T-bet producida por métodos recombinantes y expresada en células hospedadoras. Además, un anticuerpo anti-T-bet se puede usar para detectar una proteína T-bet (p. ej., en un lisado celular o en un sobrenadante celular). La detección se puede facilitar acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Por consiguiente, en una de las realizaciones, un anticuerpo anti-T-bet de la invención está marcado con una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol, y ejemplos de un material radiactivo adecuado incluye ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Otro aspecto más de la invención concierne a anticuerpos anti-T-bet que son obtenibles mediante un procedimiento que comprende:

(a) inmunizar un animal con una proteína T-bet inmunogénica, o con una de sus porciones inmunogénicas exclusivas de la proteína T-bet; y

(b) aislar procedentes del animal los anticuerpos que se unen de manera específica a una proteína T-bet.

Métodos de inmunización y recuperación de los anticuerpos anti-T-bet específicos se encuentran descritos más ampliamente en lo que antecede.

IV. Composiciones farmacéuticas

Se pueden incorporar moduladores de T-bet (p. ej., agentes inhibidores o estimuladores de T-bet, que incluyen moléculas de ácido nucleico, proteínas, anticuerpos o compuestos de T-bet identificados como moduladores de la actividad de T-bet) en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Esas composiciones comprenden típicamente el agente modulador y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según aquí se utiliza, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" quiere incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y agentes similares, compatibles con una administración farmacéutica. El uso de esos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en el caso de que algún medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos suplementarios.

Una composición farmacéutica se formula para que sea compatible con la vía de administración a la que está destinada. Por ejemplo, las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea, pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple, hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y/o polvos estériles para la preparación extemporánea de las disoluciones estériles inyectables o de las dispersiones. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen la disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (del inglés, "Phosphate Buffer Saline"). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contiene agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, polietilenglicol y polietilenglicol líquido, y vehículos similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir con diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y agentes similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede efectuar incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado junto con uno de los componentes anteriormente enumerados o junto con una combinación de los mismos, según se requiera, seguido por una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el resto de los componentes requeridos de entre los anteriormente enumerados. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la liofilización la cual produce un polvo del componente activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una disolución del mismo previamente esterilizada y filtrada.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden ir encerradas en cápsulas de gelatina o apelmazadas en forma de comprimidos. Para los fines de una administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ir incorporado junto con excipientes y se puede usar en forma de comprimidos, tabletas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido de uso como enjuague bucal, en el que el compuesto contenido en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se utiliza como enjuague y se escupe o se traga. Como parte de la composición se pueden incluir agentes ligantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, pastillas, cápsulas, tabletas y formas de administración similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de naturaleza similar; un agente ligante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un agente lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente endulzante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como pipermín, salicilato de metilo o aroma de naranja.

En una de las realizaciones, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegen el compuesto frente a una eliminación rápida por el organismo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como polímeros de acetato de vinilo-etileno, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de estas formulaciones resultarán evidentes a los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente procedentes de Alza Corporation y Nova Pharmaceuthicals, Inc. Como vehículos farmacéuticamente aceptables también se pueden usar suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos). Estas suspensiones liposmales se pueden preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, según se describe en la Patente de EE.UU. Núm. 4.522.811.

V. Métodos de la invención

Otro aspecto de la invención concierne a métodos para el uso de las diferentes composiciones de T-bet de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método para detectar la presencia de la actividad de T-bet en una muestra biológica. El método implica poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar la actividad de T-bet, tal como una proteína T-bet o un mRNA de T-bet, de manera que la presencia de la actividad de T-bet de detecta en la muestra biológica.

Un agente preferido para detectar el mRNA de T-bet es una sonda de ácido nucleico marcada, capaz de hibridarse de manera específica con el mRNA de T-bet. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el DNA de T-bet de SEQ ID NO: 1 ó 3, tal como un oligonucleótido con una longitud de al menos 500, 600, 800, 900, 1.000, 1.200, 1.400 ó 1.600 nucleótidos y que se hibrida de manera específica y en condiciones rigurosas con el mRNA de T-bet.

Un agente preferido para detectar una proteína T-bet es un anticuerpo marcado capaz de unirse a la proteína T-bet. Los anticuerpos pueden ser policlonales o más preferiblemente monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o uno de sus fragmentos (p. ej., Fab o F(ab')_{2}). El término "marcado", en relación con la sonda o con el anticuerpo, quiere abarcar el marcaje directo de la sonda o del anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, así como también el marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo mediante reactividad haciéndolo reaccionar con otro reactivo que está directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje de los extremos de una sonda de DNA con biotina de manera que la sonda se puede detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. La expresión "muestra biológica" quiere incluir tejidos, células y fluidos biológicos. Por ejemplo, las técnicas para la detección de mRNA de T-bet incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas para la detección de una proteína T-bet incluyen inmunoensayos enzimáticos por adsorción (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia.

Estos ensayos son útiles para detectar síndromes caracterizados por defectos en el desarrollo embrionario. Por ejemplo, las mutaciones en los genes T-box humanos, TBX5 y TBX3 (ortólogos a los genes Tbx5 y Tbx3 de ratón) son responsables de las enfermedades genéticas autosómicas dominantes síndrome de Holt-Oram y síndrome ulnar-mamario respectivamente (Bamshad, M., y col. 1997, Nature Genetics 16:311; Basson, C.T., y col. 1997, Nature Genetics 15:30; Li, Q.Y., y col. 1997, Nature Genetics 15:21; Spranger, S., y col. 1997. J. Med. Genet. 3:978). Estos síndromes se caracterizan por defectos en el desarrollo embrionario y se podrían pronosticar con los patrones de expresión de Tbx5 y Tbx3 respectivamente. El síndrome de Holt-Oram afecta al corazón y a las extremidades superiores mientras que el síndrome ulnar-mamario afecta a las extremidades, glándulas aprocrinas, dientes y desarrollo de genitales. Ambos síndromes se caracterizan por defectos en el desarrollo embrionario y se podrían pronosticar con los patrones de expresión de Tbx5 y Tbx3 respectivamente. Las mutaciones en estos pacientes implican solamente a un alelo del gen que contiene caja T, por lo que se ha postulado que la haploinsuficiencia de Tbx3 y Tbx5 produce estas dos enfermedades. Recientemente se ha demostrado que la provisión de Tbx4 y Tbx5 a embriones de pollo en desarrollo controla la identidad de los esbozos de las extremidades (Rodriguez-Esteban y col., 1999; Takeuchi y col., 1999). Estos descubrimientos enfatizan la importancia crítica de esta familia en el desarrollo embrionario de los
vertebrados.

Además, la existencia de homólogos del gen T en muchas especies, proporciona una sólida evidencia de su función como factor de transcripción que regula un conjunto de genes diana hasta el momento desconocidos, implicados en la formación del mesodermo. La reciente importancia de la familia T-box proviene de la evidente importancia que tiene en diversos procesos del desarrollo embrionario, de los que son ejemplos muy notorios la mutaciones en la caja T en enfermedades humanas. La generación de células T maduras procedentes de células madre totipotentes de timocitos, y la generación de células Th diferenciadas procedentes de precursores indiferenciados también pueden ser contempladas como procesos del desarrollo embrionario estrechamente regulados. Este descubrimiento de que T-bet es responsable de la formación del linaje de Th1 demuestra un papel importante de este miembro, el más reciente de la familia T-box en el sistema linfático.

La invención proporciona además métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de una proteína T-bet. Por ejemplo, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína T-bet, que comprende:

proporcionar una composición indicadora que comprende una proteína T-bet;

poner en contacto la composición indicadora con un compuesto en estudio;

determinar el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de la proteína T-bet en la composición indicadora para de esta manera identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína T-bet.

Las realizaciones específicas de los métodos de escrutinio de la invención explotan la capacidad de proteína T-bet para unirse al DNA (p. ej., la capacidad para unirse a un promotor de IL-2 o de IFN-gamma) y/o para regular la expresión génica (p. ej., para regular la expresión de un gen de una citoquina asociada a Th1, p. ej., reprimiendo el gen de IL-2, se transactivar el gen de IFN-gamma) y/o para redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta de Th1.

En una realización preferida de los ensayos de escrutinio de la invención, la composición indicadora comprende una célula indicadora, en la que dicha célula indicadora comprende: (i) una proteína T-bet y (ii) un gen de reporte que es sensible a la proteína T-bet. Preferiblemente, la célula indicadora contiene:

i) un vector de expresión que codifica la T-bet; y

ii) un vector que comprende secuencias reguladoras de un gen de citoquina asociada a Th1, operativamente ligado a un gen de reporte;

y dicho método comprende:

a) poner en contacto la célula indicadora con un compuesto en estudio;

b) determinar el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora en presencia del compuesto en estudio; y

c) comparar el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora en presencia del compuesto en estudio con el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora en ausencia del compuesto en estudio para identificar de este modo un compuesto que modula la actividad de T-bet.

En otra realización preferida, la composición indicadora comprende una preparación de: (i) una proteína T-bet y (ii) una molécula de DNA a la que T-bet se une, y

dicho método comprende:

a) poner en contacto la composición indicadora con un compuesto en estudio;

b) determinar el grado de interacción de la proteína T-bet y la molécula de DNA en presencia del compuesto en estudio; y

\newpage

c) comparar el grado de interacción de la T-bet y de la molécula de DNA en presencia del compuesto en estudio con el grado de interacción de la proteína T-bet y de la molécula de DNA en ausencia del compuesto en estudio para de esta manera identificar un compuesto que modula la actividad de T-bet.

Preferiblemente, la molécula de DNA a la que T-bet se une comprende una secuencia de unión con caja T.

En otra realización preferida, el método identifica proteínas que interaccionan con T-bet. En esta realización, la composición indicadora es una célula indicadora, célula indicadora que comprende:

i) un gen de reporte operativamente ligado a una secuencia reguladora transcripcional; y

ii) un primer gen quimérico que codifica una primera fusión, dicha primera fusión que incluye T-bet;

el compuesto en estudio comprende una biblioteca de segundos genes quiméricos, biblioteca que codifica segundas proteínas de fusión;

la expresión del gen de reporte que es sensible a las interacciones entre la primera proteína de fusión, la segunda proteína de fusión y la secuencia reguladora transcripcional; y

en el que el efecto del compuesto en estudio presente en la composición indicadora se determina determinando el nivel de expresión del gen de reporte presente en la célula indicadora, para de esta manera identificar un compuesto en estudio que comprende una proteína que interacciona con T-bet.

En una realización preferida, la biblioteca de segundos genes quiméricos se prepara a partir de una biblioteca de cDNA de células Th2.

En una realización preferida de los ensayos de escrutinio de la invención, una vez que se ha identificado que un compuesto en estudio modula la actividad de T-bet, se determina el efecto del compuesto en estudio sobre una inmunorrespuesta. Por lo tanto, los métodos de escrutinio de la invención pueden comprender además determinar el efecto del compuesto sobre una inmunorrespuesta para identificar con ello un compuesto que modula una inmunorrespuesta. En una de las realizaciones, el efecto del compuesto sobre una inmunorrespuesta se determina determinando el efecto del compuesto sobre la expresión de un gen de citoquina asociada a Th1, tal como un gen de interferón-gamma. Según aquí se utiliza, la expresión "citoquina asociada a Th1" quiere hacer referencia a una citoquina que se produce preferentemente o exclusivamente en células Th1 más que en células Th2. Ejemplos de citoquinas asociadas a Th1 incluyen IFN-\gamma, IL-2, TNF y linfotoxina (LT). En otra de las realizaciones, el efecto del compuesto de interés sobre una inmunorrespuesta se determina determinando el efecto del compuesto sobre la formación de células T coadyuvantes de tipo 1 (Th1) o de células T coadyuvantes de tipo 2 (Th2).

Los vectores de expresión recombinante que se pueden usar para la expresión de T-bet en la célula indicadora son conocidos en la técnica (véanse los comentarios anteriores). En una de las realizaciones, dentro del vector de expresión las secuencias que codifican T-bet se encuentran operativamente ligadas a secuencias reguladoras que permiten la expresión constitutiva de T-bet en la célula indicadora (p. ej., se pueden usar secuencias reguladoras víricas, tales como una secuencia de promotor/secuencia estimuladora procedente de citomegalovirus). El uso de un vector de expresión recombinante que permite la expresión constitutiva de T-bet en la célula indicadora se prefiere para la identificación de compuestos que estimulan o inhiben la actividad de T-bet. En una realización alternativa, en el vector de expresión, las secuencias que codifican T-bet se encuentran operativamente ligadas a secuencias reguladoras del gen endógeno de T-bet (es decir, la región reguladora promotor derivada del gen endógeno de T-bet). El uso de un vector de expresión recombinante en el que la expresión de T-bet está controlada por las secuencias reguladoras endógenas se prefiere para la identificación de compuestos que estimulan o inhiben la expresión transcripcional de T-bet.

En los métodos en los que se utiliza un gen de citoquina asociada a Th1 (p. ej., como gen de reporte), preferiblemente, la citoquina asociada a Th1 es interferón-gamma o IL-2. Por ejemplo, el promotor de IL-2 revela un sitio de unión con caja T situado en las posiciones de -240 a -220 justo en 5' del sitio NF\kappaB. Según se describe en los ejemplos adjuntos, T-bet se aisló en un ensayo de escrutinio con un único híbrido en levaduras basándose en su capacidad para unirse al promotor de IL-2. Por lo tanto, en una de las realizaciones, un método de la invención utiliza una construcción con un gen de reporte que contiene esta región del promotor de IL-2 proximal, muy preferiblemente los nucleótidos del -240 al -220 del promotor de IL-2.

En la técnica se conocen diversos genes de reporte y son adecuados para usar en los ensayos de escrutinio de la invención. Los ejemplos de genes de reporte adecuados incluyen los genes que codifican cloranfenicol-acetil-transferasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina o luciferasa. En la técnica se conocen métodos estándar para medir la actividad de estos productos génicos.

Diversos tipos de células son adecuados para usar como célula indicadora en el ensayo de escrutinio. Preferiblemente se usa una línea celular que normalmente no expresa T-bet, tal como un clon de células B o de células Th2. Como células indicadoras también se pueden usar líneas de células no linfocíticas, tales como la línea de células de hepatoma HepG2. Como células indicadoras también se pueden usar células de levadura.

En una de las realizaciones, el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora y en presencia del compuesto en estudio, es más alto que el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora y en ausencia del compuesto en estudio, y el compuesto en estudio es identificado como un compuesto que estimula la expresión o la actividad de T-bet. En otra de las realizaciones, el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora, en presencia del compuesto en estudio, es más bajo que el nivel de expresión del gen de reporte en la célula indicadora en ausencia del compuesto en estudio, y el compuesto en estudio es identificado como un compuesto que inhibe la expresión o la actividad de T-bet.

Como alternativa al uso de una construcción que contiene un gen reporte, los compuestos que modulan la expresión o la actividad de T-bet se pueden identificar usando otras "lecturas de los resultados". Por ejemplo, una célula indicadora se puede transfectar con un vector de expresión de T-bet, se puede incubar en presencia y ausencia de un compuesto en estudio, y la producción de una citoquina asociada a Th1 se puede determinar detectando el mRNA de la citoquina (p. ej., el mRNA del interferón-gamma) en la célula indicadora o la secreción de la citoquina (es decir, de interferón-gamma) en el sobrenadante del cultivo. Métodos estándar para detectar mRNA de citoquinas, tal como la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (del inglés, "Reverse Transcription - Polimerasa Chain Reaction") se conocen en la técnica. Métodos estándar para detectar una proteína citoquina en el sobrenadante procedentes de cultivos, tal como ensayos inmunoensayos enzimáticos por adsorción (ELISA) también se conocen en la técnica.

Según de ha descrito anteriormente, la invención proporciona un ensayo de escrutinio para identificar proteínas (p. ej., proteínas de células Th1) que interaccionan con T-bet.

En una de las realizaciones, estos ensayos se pueden diseñar basados en el sistema del ensayo de dos híbridos (también denominado ensayo de trampa de interacciones) conocido en la técnica (véase p. ej., Field, Patente de EE.UU. Núm. 5.283.173; Zervos y col. (1993) Cell 72:223-232; Madura y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel y col., (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8:1693-1696). El ensayo de dos híbridos generalmente se usa para identificar proteínas que interaccionan con una proteína diana particular. El ensayo utiliza fusiones de genes para identificar proteínas capaces de interaccionar para reconstituir una activador transcripcional funcional. El activador transcripcional consiste en un dominio de unión a DNA y un dominio de activación transcripcional, en el que ambos dominios se requieren para activar la transcripción de genes situados aguas abajo de una secuencia diana (tal como una secuencia de activador aguas arriba (UAS) (del inglés, " Upstream Activator Sequence") de GAL-4). Secuencias de DNA que codifican una proteína "cebo" diana están fusionadas con uno de estos dominios y una biblioteca de secuencias de DNA se fusiona con el otro dominio. Proteínas de fusión "presa" (generadas en la biblioteca de fusión) capaces de unirse a la proteína de fusión-proteína diana (p. ej., proteína "cebo" de fusión-proteína diana GAL4) generalmente acercarán los dos dominios (el dominio de unión a DNA y el dominio de activación transcripcional) lo suficientemente próximos para activar la transcripción de un gen de reporte insertado en dirección aguas abajo de la secuencia diana. De este modo, las proteínas "presa" pueden ser identificadas por su capacidad para reconstituir un activador transcripcional funcional (p. ej., un transactivador funcional para GAL-4). Este sistema general de dos híbridos se puede aplicar a la identificación de proteínas presentes en células (p. ej., en células Th1) que interaccionan con T-bet, mediante la construcción de una proteína de fusión de T-bet con una proteína diana (p. ej., una fusión de T-bet/dominio de unión de GAL4 como proteína "cebo") y de una biblioteca de cDNA de proteínas de fusión "presa" (p. ej., biblioteca de cDNA/dominio de activación de GAL4), en la que la biblioteca de cDNA se prepara a partir de mRNA de un tipo de células de interés (p. ej., células Th1), e introduciendo estas construcciones en una célula hospedadora que también contiene una construcción con un gen de reporte, unida a una secuencia reguladora que es sensible a T-bet (p. ej., una secuencia del promotor de IL-2, por ejemplo, como se ha tratado anteriormente). Preferiblemente, el dominio(s) de transactivación de T-bet (que se ha mapeado en ambos extremos 5' y 3') se encontrará delecionado en la construcción "cebo". En una realización preferida, la construcción "cebo" incluirá el dominio con caja-T. En una de las realizaciones, también estará incluido al menos un sitio de fosforilación de tirosina. También se pueden usar proteínas T-bet dominantes negativas para escrutar proteínas interaccionantes con el fin de localizar mejor los sitios de T-bet que son requeridos para la interacción. Los cDNA que codifican proteínas que interaccionan con T-bet se pueden identificar teniendo como base la transactivación de la construcción que contiene el gen de reporte.

Como alternativa, un ensayo de "un único híbrido", tal como el descrito en Sieweke, M.H. y col. (1996) Cell 85:49-60, se puede usar para identificar proteínas que interaccionan con T-bet. Este ensayo es una modificación del sistema de dos híbridos anteriormente tratado. En este sistema, el "cebo" es un factor de transcripción en el que se ha retirado el dominio de transactivación (p. ej., una T-bet en la que se ha retirado el dominio de transactivación) y la "presa" es una biblioteca de cDNA de no fusión (p. ej., una biblioteca de cDNA preparada en células Th1). Estas construcciones se introducen en células hospedadoras (p. ej., células de levadura) que contienen también una construcción con un gen de reporte unida a una secuencia reguladora que es sensible a T-bet (p. ej., que comprende una región de unión con caja T, tal como una región de promotor de IL-2 que es sensible a T-bet). Los cDNA que codifican proteínas que interaccionan con T-bet se pueden identificar basándose en la transactivación de la construcción que contiene el gen de reporte.

En otra realización, se pueden usar análisis de diferencia representacional (RDA) y análisis de ordenaciones de DNA en microchips para aislar genes diana de T-bet. Por ejemplo, se pueden usar métodos de presentación diferencial o métodos de sustracción acoplados con PCR (RDA; véanse p. ej., Hubank, M. y Schatz, D.G. 1994. Nuc. Acid. Res. 22, 5640-5648; Chang Y., y col. 1994). Science 266, 1965; von Stein, O.D., y col. 1997, Nuc. Acid Res. 25, 2598; Lisitsyn, N. y Wigler, M. 1993. Science 259, 946) que utilizan sondas sustractivas o sondas no sustractivas o, más recientemente, la hibridación a ordenaciones de DNA en microchips (Welford y col. 1988. Nucl. Acids Res. 15:3059). Para realizar estos ensayos, se pueden usar diversas células (p. ej., células normales, células manipuladas por ingeniería genética para que expresen T-bet, o células procedentes de ratones que carecen de T-bet o que sobreexpresan T-bet (p. ej., procedentes de un animal transgénico no humano).

Según se ha descrito anteriormente, la invención proporciona un ensayo de escrutinio para identificar compuestos que modulan la interacción de T-bet y de una región de unión a una caja T (p. ej., una región reguladora del gen de IL-2). En la técnica se conocen ensayos que detectan la interacción de una proteína de unión a DNA con la secuencia de un DNA diana (p. ej., ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética, ensayos de determinación de la huella genética con DNAsa I y ensayos similares). Realizando estos ensayos en presencia y ausencia de los compuestos en estudio, estos ensayos se pueden usar para identificar compuestos que modulan (p. ej., inhiben o estimulan) la interacción de la proteína de unión a DNA con su secuencia de DNA diana.

En una de las realizaciones, la cantidad de unión de T-bet al fragmento de DNA en presencia del compuesto en estudio es mayor que la cantidad de unión de T-bet al fragmento de DNA en ausencia del compuesto en estudio, en cuyo caso el compuesto en estudio se identifica como un compuesto que estimula la unión de T-bet. En otra de las realizaciones, la cantidad de unión de T-bet al fragmento de DNA en presencia del compuesto en estudio es menor que la cantidad de unión de T-bet al fragmento de DNA en ausencia del compuesto en estudio, en cuyo caso el compuesto en estudio se identifica como un compuesto que inhibe la unión de T-bet.

Otro aspecto más de la invención proporciona métodos para modular la actividad de T-bet en una célula. Estos métodos de modulación implican poner en contacto la célula con un agente que modula la actividad de T-bet de manera que la actividad de T-bet en la célula es modulada. El agente puede actuar modulando la actividad de la proteína T-bet presente en la célula o modulando la transcripción del gen de T-bet o la traducción del mRNA de T-bet. Según aquí se utiliza, el término "modular" quiere incluir inhibir o disminuir la actividad de T-bet y estimular o aumentar la actividad de T-bet. Por consiguiente, en una de las realizaciones, el agente inhibe la actividad de T-bet. En otra de las realizaciones, el agente estimula la actividad de T-bet.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para modular una cantidad de citoquinas de células T coadyuvantes de tipo 1 y/o de células T-coadyuvantes de tipo 2 por parte de una célula. El método implica poner en contacto la célula con un agente que modula la actividad de T-bet. Por ejemplo, agentes que estimulan la actividad de T-bet regulan por aumento la citoquina IFN-gamma de Th1, mientras que estos mismos agentes regulan por disminución la citoquina IL-4 de Th2.

En un aspecto más, la invención proporciona un método para modular el patrón de citoquinas que se produce en una célula. El método implica poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad de T-bet. Por ejemplo, agentes que estimulan la actividad de T-bet pueden inducir la producción de IFN-gammma en una célula que normalmente no produce IFN-gamma y pueden reprimir la producción de IL-4; esos agentes se pueden usar, p. ej., para redirigir el perfil de secreción de citoquinas de una células Th2 al de una célula Th1.

A. Agentes inhibidores

Conforme a un método de modulación, la actividad de T-bet se inhibe en una célula poniendo la célula en contacto con un agente inhibidor. Los agentes inhibidores pueden ser, por ejemplo, moléculas de unión intracelular que actúan para inhibir la expresión o la actividad de T-bet. Según aquí se utiliza, la expresión "molécula de unión intracelular" quiere incluir moléculas que actúan de manera intracelular para inhibir la expresión o la actividad de una proteína uniéndose a la propia proteína, a un ácido nucleico (p. ej., una molécula de mRNA) que codifica la proteína, o a una diana con la que la proteína normalmente interacciona (p. ej., a una secuencia de DNA diana a la que la proteína T-bet se une). Ejemplos de moléculas de unión intracelular, descritas con más detalle más adelante, incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de T-bet (p. ej., para inhibir la traducción del mRNA de T-bet), anticuerpos anti-T-bet intracelulares (p. ej., para inhibir la actividad de una proteína T-bet) y mutantes dominantes negativos de la proteína T-bet.

En una de las realizaciones, un agente inhibidor es una molécula de ácido nucleico antisentido que es complementaria a un gen que codifica T-bet o a una porción de dicho gen, o un vector de expresión recombinante que codifica dicha molécula de ácido nucleico antisentido. El uso de ácidos nucleicos antisentido para regular por disminución la expresión de una proteína particular en una célula se conoce muy bien en la técnica (véase p. ej., Weintraub, H. y col., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Rewiews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari F.K. y McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334;316-318; Bennett, M.R. y Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. y Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J.J. (1995) Br. Med Bull. 51:217-227; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335). Una molécula de ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la cadena codificadora de otra molécula de ácido nucleico ((p. ej., una secuencia de mRNA) y por consiguiente es capaz de formar puentes de hidrógeno con la cadena codificadora de la otra molécula de ácido nucleico. Las secuencias antisentido complementarias a una secuencia de un mRNA pueden ser complementarias a una secuencia encontrada en la región codificadora del mRNA, a la región en 5' o en 3' que no se traduce del mRNA, o a una región situada entre la región codificadora y una región que no se traduce (p. ej., en el punto de unión de la región en 5' que no se traduce y la región codificadora). Además, un ácido nucleico antisentido puede tener una secuencia complementaria a la de una región reguladora del gen que codifica el mRNA, por ejemplo, a una secuencia de iniciación de la transcripción o a un elemento regulador de la transcripción. Preferiblemente, un ácido nucleico antisentido se diseña de manera que sea complementario a una región que precede o que abarca el codón de iniciación sobre la cadena codificadora o en la región en 3'que no se traduce de un mRNA. Un ácido nucleico antisentido encargado de inhibir la expresión de una proteína T-bet en una célula se puede diseñar basándose en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína T-bet (p. ej., SEQ ID NO: 1 ó 3), y se puede construir conforme a las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick.

Un ácido nucleico antisentido puede existir en una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, el ácido nucleico antisentido puede ser un oligonucleótido que es complementario a solamente una porción de un gen de T-bet. Se pueden construir oligonucleótidos antisentido usando procedimientos de síntesis química conocidos en la técnica. Un oligonucleótido antisentido se puede sintetizar por métodos químicos usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos modificados de diferentes maneras, diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre el ácido nucleico antisentido y el ácido nucleico con sentido, p.ej., se pueden utilizar nucleótidos derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Para inhibir la expresión de T-bet en células en cultivo, uno o más oligonucleótidos antisentido se pueden añadir a las células en el medio de cultivo, típicamente a una concentración de aproximadamente 200 \mug de oligonucleótido/ml.

Como alternativa, un ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ácido nucleico transcrito por el ácido nucleico insertado estará en una orientación antisentido con respecto al ácido nucleico diana de interés). Se pueden elegir secuencias reguladoras operativamente ligadas a un ácido nucleico clonado en orientación antisentido, que dirigen la expresión de la molécula de RNA antisentido en una célula de interés, por ejemplo se pueden elegir promotores y/o secuencias estimuladoras de la transcripción u otras secuencias reguladoras que dirigen una expresión constitutiva, específica de tejido o inducible, de un RNA antisentido. Por ejemplo, para una expresión inducible de un RNA antisentido, se puede usar un sistema regulador inducible en eucariotas, tal como el sistema de Tet (p. ej., según se describe en Gossen, M. y Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. y col. (1995) Science 268:1765-1769; Publicación de PCT Núm. WO 94/29442; y Publicación de PCT Núm. 96/01313). El vector de expresión antisentido se prepara según se ha descrito anteriormente en el caso de los vectores de expresión recombinante, excepto en que el cDNA (o una de sus porciones) se clona en el vector en la orientación antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de, por ejemplo, un plásmido recombinante, un fagómido o un virus atenuado. El vector de expresión antisentido se introduce en las células usando una técnica de transfección estándar, según se ha descrito anteriormente en el caso de los vectores de expresión recombinante.

En otra realización, un ácido nucleico antisentido para usar como agente inhibidor es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de RNA catalíticas con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario tal como un mRNA, con respecto al que tienen una región complementaria (para revisiones sobre ribozimas véanse p. ej., Ohkawa J. y col. (1995) J. Biochem. 118:251-258; Sigurdsson, S.T. y Eckstein, F. (1995) Trends Biothecnol. 13:286-289; Rossi, J.J. (1995) Trends Biothecnol. 13:301-306; Kiehntopf, M. y col. (1995) J. Mol. Med. 73:65-71). Una ribozima con especificidad para el mRNA de T-bet se puede diseñar tomando como base la secuencia de nucleótidos del cDNA de T-bet. Por ejemplo, se puede construir un derivado de un RNA L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de bases del centro activo es complementaria a la secuencia de bases que ha de ser escindida en un mRNA de T-bet. Véanse por ejemplo las Patentes de EE.UU. Núms. 4.987.071 y 5.116.742, ambas de Cech y col. Como alternativa, se puede usar un mRNA de T-bet para seleccionar un RNA catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica procedente de un material reunido de moléculas de RNA. Véase por ejemplo Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Otro tipo de agente inhibidor que se puede usar para inhibir la expresión y/o la actividad de T-bet en una célula es un anticuerpo intracelular específico para la proteína T-bet. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de una proteína en una célula, es conocido en la técnica (véanse p. ej., Carlson, J.R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. y col. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T.M. (1990) FEBS Letters 274:193-198; Carlson, J.R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W.A. y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. y col. (1994) BiolThecnology 12:396-399; Chen, S-Y. y col. (1994) Human Gen Therapy 5:595-601; Duan, L. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R.R. y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R.R. y col. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A.M. y col. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J.H. y col., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Publicación de PCT Núm. WO 94/02610 de Marasco y col.; y Publicación de PCT Núm. WO 95/03832 de Duan y col.

Para inhibir la actividad de una proteína usando un anticuerpo intracelular, se prepara un vector de expresión recombinante que codifica las cadenas del anticuerpo en una forma tal que, después de la introducción del vector en una célula, las cadenas del anticuerpo se expresan en forma de un anticuerpo funcional en un compartimento intracelular de la célula. Para la inhibición de la actividad de T-bet conforme a los métodos de inhibición, un anticuerpo intracelular que se une específicamente a la proteína T-bet se expresa en el citoplasma de la célula. Para preparar un vector de expresión de un anticuerpo intracelular, los cDNA de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, que codifican las cadenas del anticuerpo que son específicas para la proteína diana de interés, p. ej., T-bet, se aíslan típicamente a partir de un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal específico para la proteína T-bet. Los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales anti-T-bet, o anticuerpos monoclonales anti-T-bet recombinantes, se pueden preparar según se ha descrito anteriormente. Una vez se ha identificado un anticuerpo monoclonal específico para la proteína T-bet, (p. ej., ya sea un anticuerpo monoclonal derivado de un hibridoma, o ya sea un anticuerpo recombinante procedente de una biblioteca combinatoria), los DNA que codifican las cadenas ligera y pesada de ese anticuerpo monoclonal se aíslan mediante técnicas estándar de biología molecular. En el caso de los anticuerpos derivados de hibridomas, los cDNA de las cadenas ligera y pesada se pueden obtener, por ejemplo, mediante amplificación por PCR o mediante escrutinio de una biblioteca de cDNA. En el caso de anticuerpos recombinantes, tales como los procedentes de una biblioteca de presentación en fagos, los cDNA que codifican las cadenas ligera y pesada se pueden recuperar del empaquetamiento de presentación (p. ej., de un fago) y se pueden aislar durante el procedimiento de escrutinio de la biblioteca. Las secuencias de nucleótidos de los genes de las cadenas ligara y pesada del anticuerpo a partir de las cuales se pueden preparar los cebadores de la PCR o las sondas para el escrutinio de las bibliotecas de cDNA son conocidas en la técnica. Por ejemplo, muchas de estas secuencias se encuentran descritas en Kabat, E.A. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición, US Department of Health and Human services, NIH Publication Núm. 91-3242 y en la base de datos "Vbase" de secuencias de la línea germinal humana.

Una vez obtenidas, las secuencias de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se clonan en un vector de expresión recombinante usando métodos estándar. Para permitir la expresión citoplásmica de las cadenas ligera y pesada, se quitan las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias conductoras hidrófobas de las cadenas ligera y pesada. Un vector de expresión del anticuerpo intracelular puede codificar un anticuerpo intracelular en una de varias formas diferente. Por ejemplo, en una de las realizaciones, el vector codifica las cadenas ligera y pesada de longitud completa del anticuerpo, de manera que un anticuerpo de longitud completa se expresa intracelularmente. En otra de las realizaciones, el vector codifica una cadena ligera de longitud completa pero solamente la región VH/CH1 de la cadena pesada de manera que un fragmento Fab se expresa intracelularmente. En la realización más preferida, el vector codifica un anticuerpo monocatenario (scFV) (del inglés, "single chain Fv") en el que las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se encuentran unidas mediante un fragmento enlazador peptídico flexible (p. ej., Gly_{4}Ser)_{3}) y se expresan en forma de una molécula monocatenaria. Para inhibir la actividad de T-bet en una célula, el vector de expresión que codifica el anticuerpo intracelular anti-T-bet se introduce en la célula mediante métodos de transfección estándar, según se ha tratado en lo que antecede.

Otra forma más de un agente inhibidor es una forma inhibidora de T-bet, a la que también se hace aquí referencia como inhibidor dominante negativo, p. ej., una forma de T-bet en la que los sitios de fosforilación de tirosina se han mutado o, por ejemplo, una forma mutada de T-bet en la que el dominio de transactivación se ha quitado. Esas proteínas T-bet dominantes negativas se pueden expresar en las células usando un vector de expresión recombinante que codifica la proteína T-bet, que se introduce en la célula mediante métodos de transfección estándar. Para expresar una forma mutante de T-bet que carece de sitios de fosforilación de tirosina, o que carece de un dominio de transactivación, secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de transactivación de T-bet se mutan o se retiran de las secuencias que codifica T-bet, mediante técnicas estándar de DNA recombinante. El DNA truncado se inserta en un vector de expresión recombinante, que se introduce después en una célula para permitir la expresión de la forma alterada de T-bet en esa célula.

Otros agentes inhibidores que se pueden usar para inhibir la actividad de una proteína T-bet son compuestos químicos que inhiben directamente la actividad de T-bet o inhiben la interacción entre T-bet y un DNA diana u otra proteína. Esos compuestos se pueden identificar usando ensayos de escrutinio que seleccionan esos compuestos, según se ha descrito con detalle en lo que antecede.

B. Agentes estimuladores

Conforme a un método de modulación, la actividad de T-bet se estimula en una célula poniendo en contacto la célula con un agente estimulador. Los ejemplos de esos agentes estimuladores incluyen una proteína T-bet activa y moléculas de ácido nucleico que codifican T-bet, que se introducen en la célula para aumentar la actividad de T-bet en esa célula. Un agente estimulador preferido es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína T-bet, molécula de ácido nucleico que se introduce en la célula en una forma adecuada para la expresión de la proteína T-bet activa en la célula. Para expresar una proteína T-bet en una célula, típicamente un DNA que codifica T-bet se introduce primero en un vector de expresión recombinante usando técnicas estándar de biología molecular, según aquí se describe. Un DNA que codifica T-bet se puede obtener, por ejemplo, mediante amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores basados en la secuencia de nucleótidos de T-bet. Después del aislamiento o de la amplificación de un DNA que codifica T-bet, ese fragmento de DNA se introduce en un vector de expresión y se utiliza para transfectar células diana mediante métodos estándar según aquí se describe.

Otros agentes estimuladores que se pueden usar para estimular la actividad de una proteína T-bet son compuestos químicos que estimulan la actividad de T-bet en las células, tales como compuestos que estimulan directamente la proteína T-bet y compuestos que promueven la interacción entre T-bet y un DNA diana u otras proteínas. Esos compuestos se pueden identificar usando ensayos de escrutinio que seleccionan esos compuestos según se describe con detalle en lo que antecede.

Los métodos de modulación se pueden llevar a cabo in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente o introduciendo el agente en el interior de las células en cultivo) o, como alternativa, se pueden llevar a cabo in vivo (p. ej., administrando el agente a un individuo o introduciendo el agente en las células de un individuo, tal como mediante terapia génica). Para practicar el método de modulación in vitro, las células se pueden obtener procedentes de un individuo mediante métodos estándar, y se pueden incubar (es decir, cultivar) in vitro con un agente modulador que modula la actividad de T-bet en las células. Por ejemplo, se pueden obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (del inglés "Pheripheral Blood Mononuclear Cells") procedentes de un individuo y se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente de densidad, p. ej., con Ficoll/Hipaque. Se puede efectuar un empobrecimiento o un enriquecimiento de poblaciones de células específicas usando métodos estándar. Por ejemplo, se puede hacer un enriquecimiento en células T por ejemplo, mediante selección positiva usando anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie de células T, por ejemplo incubando las células con un anticuerpo monoclonal (mAb) primario específico, seguido del aislamiento de las células que se unen al mAb usando bolitas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario que se une al mAb primario. Se pueden aislar poblaciones de células específicas mediante la técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia conforme a métodos estándar. Si se desea, las células tratadas in vitro con un agente modulador se pueden volver a administra al individuo. Para la administración a un individuo, puede ser preferible retirar primero agentes residuales presentes en el cultivo, procedentes de las células, antes de administrarlas al individuo. Esto se puede realizar por ejemplo mediante una centrifugación de las células en un gradiente de Ficoll/Hypaque. Para un tratamiento más amplio de una modificación genética ex vivo de las células seguida de su readministración a un individuo, véase también la Patente de EE.UU. Núm. 5.399.346 de W.F. Anderson y col.

Para practicar el método de modulación in vivo en un individuo, el agente modulador se puede administrar al individuo de manera que la actividad de T-bet en las células del individuo se modula. El término "individuo" quiere incluir organismos vivos en los que se puede provocar una inmunorrespuesta. Los individuos preferidos son los mamíferos. Los ejemplos de individuos incluyen seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas.

Con respecto a los agentes estimuladores o inhibidores que comprende ácidos nucleicos (que incluyen vectores de expresión recombinante que codifican una proteína T-bet, un RNA antisentido, anticuerpos intracelulares o inhibidores dominantes negativos), los agentes se pueden introducir de las células del individuo usando métodos conocidos en la técnica para introducir un ácido nucleico (p. ej., un DNA) en las células in vivo). Ejemplos de esos métodos abarcan métodos víricos y métodos no víricos, que incluyen:

Inyección directa: se puede introducir un DNA desnudo en células in vivo inyectando directamente el DNA en las células (véanse p. ej., Acsadi y col. (1991) Nature 332:815-818; Wolff y col., (1990) Science 247:1465-1468). Por ejemplo, se puede usar un aparato de administración (p. ej., una "pistola génica") para inyectar el DNA en las células in vivo. Este aparato se encuentra comercialmente disponible (p. ej., procedente de Biorad).

Lípidos catiónicos: un DNA desnudo se puede introducir en las células in vivo formando complejos de ese DNA con lípidos catiónicos o encapsulando ese DNA en liposomas catiónicos. Ejemplos de formulaciones de lípidos catiónicos incluyen cloruro de N-[-1-(2,3-dioleoiloxi)propil]N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y una relación 1:1 en moles de bromuro de 1,2-dimiristiloxi-propil-3-dimetilhidroxietil-amonio (DMRIE) y dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) (del inglés, " DiOleil-PhosphatidylEthanolamine") (véanse p. ej., Logan, J.J. y col. (1995) Gene Therapy 2:38-49; San, H. y col., (1993) Human Gene Therapy 4:781-788).

Incorporación de DNA mediada por receptores: un DNA desnudo también se puede introducir en células in vivo formando un complejo del DNA con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando de un receptor de superficie celular (véanse por ejemplo Wu, G., y Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; y la Patente de EE.UU. Núm. 5.166.320). La unión del complejo DNA-ligando al receptor facilita la incorporación del DNA mediante una endocitosis mediada por el receptor. Un complejo DNA-ligando unido a las cápsidas de adenovirus, las cuales rompen los endosomas de manera natural liberando con ello el material en el citoplasma, se puede usar para evitar la degradación del complejo por parte de los lisosomas intracelulares (véanse por ejemplo Curiel y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126).

Retrovirus: Los retrovirus defectivos se encuentran perfectamente caracterizados para usar en transferencia génica con fines de terapia génica (para una revisión, véase Miller, A.D. (1990) Blood 76:271). Se puede construir un retrovirus recombinante que contiene secuencias de nucleótidos de interés incorporadas en el genoma del retrovirus. De manera adicional, porciones del genoma del retrovirus se pueden retirar para convertir al retrovirus en defectivo en replicación. El retrovirus defectivo en replicación se empaqueta luego en forma de viriones que se pueden usar para infectar una célula diana a través del uso de un virus auxiliar mediante técnicas estándar. Se pueden encontrar protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con esos virus en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y col. (redactores), Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14 y en otros manuales estándar de laboratorio. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son muy conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuadas incluyen \psiCrip, \psiCre, \psi2 y \psiAm. Los retrovirus se han utilizado para introducir diversos genes en muchos tipos de células diferentes, que incluyen células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de médula ósea, in vitro y/o in vivo (véanse por ejemplo Eglitis, y col. (1985) Science 230:1395-1398; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury y col. (1991) Science 254:1802-1805; van Beuschmen y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay y col. (1992) Human Gene Therapy 3:640-647; Dai y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu y col (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; Patente de EE.UU. Núm. 4.868.116; Patente de EE.UU. Núm. 4.980.286, solicitud de PCT WO 89/07136; solicitud de PCT WO 89/02468, solicitud de PCT WO 89/05345; y solicitud de PCT WO 92/07573). Los vectores retrovíricos requieren la división de la célula diana con el fin de que el genoma retrovírico (y el ácido nucleico extraño en él insertado) se integre en el genoma del hospedador para introducir de manera estable el ácido nucleico en la célula. Por lo tanto, puede ser necesario estimular la replicación de la célula diana.

Adenovirus: El genoma de un adenovirus se puede manipular de manera que codifique y exprese un producto génico de interés pero que esté inactivado en lo que se refiere a su capacidad para replicarse en un ciclo de vida lítico normal del virus. Véanse por ejemplo Berkner y col. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y col. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld y col. (1992) Cell 68:143-165. Vectores adenovíricos adecuados, derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 o de otras cepas de adenovirus (p. ej., Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son muy conocidos por los expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes presentan ventajas debido a que no requieren células en división para ser vehículos efectivos para el suministro de genes y se pueden usar para infectar una amplia variedad de tipos de células que incluyen el epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld y col.(1992) citado supra), células endoteliales (Lemarchand y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486), hepatocitos (Herz y Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) y células musculares (Quantin y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584). De manera adicional, el DNA adenovírico introducido (y el DNA extraño contenido en él) no se integra en el genoma de una célula hospedadora sino que permanecen en forma de episoma, evitando de este modo problemas potenciales que pueden tener lugar como resultado de una mutagénesis por inserción en situaciones en las que el DNA introducido se integra en el genoma del hospedador (p. ej., el DNA retrovírico). Además, la capacidad del genoma adenovírico para portar un DNA extraño es grande (de hasta 8 kilobases) en relación con la de otros vectores de transferencia de genes (Berkner y col., citado supra; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57: 267). La mayoría de los vectores adenovíricos defectivos en la replicación, que se usan normalmente, se encuentran delecionados en la totalidad o en partes de los genes víricos E1 y E3 pero conservan una cantidad grande, del orden del 80%, del material genético adenovírico.

Virus adenoasociados: Un virus adenoasociado (AAV) es un virus defectivo presente en la naturaleza que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un herpes virus, como virus auxiliar para una replicación eficaz y para un ciclo de vida productivo. (Para una revisión véase Muzyczka y col. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su DNA en células que no están en división, y exhibe una alta frecuencia de integración estable (véanse por ejemplo Flotte y col. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski y col. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin y col. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Los vectores que contiene una cantidad pequeña de AAV, del orden de 300 pares de bases, se pueden empaquetar y se pueden integrar. El espacio para un DNA exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Un vector AAV tal como el descrito en Tratschin y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, se puede usar para introducir DNA en las células. Se han introducido diversos ácidos nucleicos en diferentes tipos de células usando vectores AAV (véanse por ejemplo Hermonat y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford y col. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin y col. (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

La eficacia de un sistema particular de vector de expresión y del método para introducir el ácido nucleico en una célula se puede valorar mediante estrategias estándar de rutina usadas en la técnica. Por ejemplo, el DNA introducido en una célula se puede detectar mediante una técnica de hibridación en filtro (p. ej., transferencia Southern) y el RNA producido mediante transcripción del DNA introducido se puede detectar, por ejemplo mediante transferencia Northern, protección frente a RNasa o retro-transcripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El producto génico se puede detectar mediante un ensayo apropiado, por ejemplo, mediante detección inmunológica de una proteína producida, tal como con un anticuerpo específico, o mediante un ensayo funcional que detecta una actividad funcional del producto del gen.

En una realización preferida, un vector de expresión retrovírico que codifica T-bet se usa para expresar una proteína T-bet en células in vivo, para de este modo estimular la actividad de la proteína T-bet in vivo. Los vectores retrovíricos se pueden preparar conforme a métodos estándar conocidos en la técnica (tratados más ampliamente en lo que antecede).

Un agente modulador, tal como un compuesto químico, se puede administrar a un individuo en forma de composición farmacéutica. Esas composiciones típicamente comprenden el agente modulador y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según aquí se utiliza, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" quiere incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y agentes similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto en el caso de que algún medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos suplementarios. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar según se ha descrito anteriormente en la subsección IV.

La identificación de T-bet como regulador clave de la formación de células Th1 aquí descrita, y en la represión del genotipo Th2, permite una manipulación selectiva de subgrupos de células T en diversas situaciones clínicas, usando los métodos de modulación de la invención. Los métodos de estimulación (es decir, métodos que usan un agente estimulador para aumentar la actividad de T-bet) dan como resultado la producción de IFN-gamma, con una promoción concomitante de una respuesta Th1 y una regulación por disminución tanto de IL-2 como de IL-4, modulando por lo tanto por disminución la respuesta Th2. Por contraste, los métodos de inhibición (es decir, los métodos que usan un agente inhibidor para modular por disminución la actividad de T-bet) inhiben la producción de IFN-gamma con una regulación concomitante por disminución de una respuesta Th1 y una promoción de una respuesta Th2. Por lo tanto, para tratar una enfermedad en la que es beneficiosa una respuesta Th1, se selecciona un método de estimulación de manera que se promueve esa respuesta Th1 a la par que se regulan por disminución las respuestas Th2. De manera alternativa, para tratar una enfermedad en la que es beneficiosa una respuesta Th2, se selecciona un método de inhibición tal que las respuestas Th1 se regulan por disminución a la vez que se promueven las respuestas Th2. La aplicación de estos métodos al tratamiento de enfermedades puede dar como resultado la curación de la enfermedad, una disminución en el tipo o número de síntomas asociados con la enfermedad, ya sea a largo plazo o a corto plazo (es decir, una mejoría de la enfermedad) o simplemente un efecto beneficioso transitorio en el
individuo.

Se han identificado numerosas enfermedades asociadas con una respuesta predominante de tipo Th1 o de Tipo Th2 y se podrían beneficiar de una modulación del tipo de respuesta que se eleva en el individuo que padece la enfermedad. La aplicación de los métodos de inmunomodulación a esas enfermedades, se describe a continuación con más detalle.

A. Alergias

Las alergias están mediadas por anticuerpos IgE cuya producción está regulada por la actividad de las células Th2 y de las citoquinas producidas por ellas. En las reacciones alérgicas, las células Th2 producen IL-4, que estimula aún más la producción de anticuerpos IgE y la activación de células que median en las reacciones alérgicas, es decir, los mastocitos y basófilos. La IL-4 también desempeña un papel importante en las reacciones inflamatorias mediadas por eosinófilos. Por consiguiente, los métodos de estimulación se pueden usar para inhibir la producción de citoquinas asociadas a Th2, y en particular, de IL-4, en pacientes alérgicos, como medio para regular por disminución la producción de anticuerpos IgE patogénicos. Un agente estimulador se puede administrar directamente al individuo o a células (p. ej., a células Thp o a células Th2) que se pueden obtener procedentes del individuo, ponerse en contacto con un agente estimulador ex vivo y volverse a administrar al individuo. Además, en determinadas situaciones puede ser beneficioso coadministar al individuo el alergeno junto con el agente estimulador o las células tratadas con el agente estimulador, para inhibir (p. ej., desensibilizar) la respuesta específica al alergeno. El tratamiento se puede potenciar aún más administrando al individuo alérgico, otros agentes promotores de respuestas Th1, tales como la citoquina IL-12 o anticuerpos contra citoquinas asociadas a Th2 (p. ej., anticuerpos anti-IL-4), en cantidades suficientes para estimular más una respuesta de tipo Th1.

B. Cáncer

Se ha publicado que la expresión de citoquinas que promueven Th2 está elevada en pacientes con cáncer (véanse p. ej., Yamamura, M. y col. (1993) J. Clin. Invest. 91:1005-1010; Pisa, P. y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7708-77012) y las enfermedades malignas están con frecuencia asociadas con un desplazamiento de respuestas de tipo Th1 a respuestas de tipo Th2 junto con un empeoramiento de la evolución de la enfermedad. Por consiguiente, los métodos de estimulación se pueden utilizar para inhibir la producción de citoquinas asociadas a Th2 en pacientes con cáncer, como medio para contrarrestar el desplazamiento de respuestas Th1 a respuestas Th2 y con ello promover una respuesta Th1 continua en los pacientes para mejorar la evolución de la enfermedad. El método de estimulación puede implicar o bien la administración directa de un agente estimulador a un individuo con cáncer o bien un tratamiento ex vivo de células obtenidas del individuo (p. ej., células Thp o células Th2) con un agente estimulador, seguido de la readministración de esas células al individuo. El tratamiento se puede mejorar más administrando al receptor otros agentes que promueven Th1, tales como la citoquina IL-12 o anticuerpos dirigidos contra citoquinas asociadas a Th2 (p. ej., anticuerpos anti-IL-4), en cantidades suficientes para estimular aún más una respuesta de tipo Th1.

C. Enfermedades infecciosas

Se ha publicado también que la expresión de citoquinas que promueven Th2 aumenta durante diversas enfermedades infecciosas, que incluyen la infección por HIV, tuberculosis, leishmaniasis, esquistosomiasis, infección por nemátodos filarias e infección por nemátodos intestinales (véanse p. ej., Shearer G.M. y Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M. y Shearer, G.M. (1993) Immunology Today 14:107-111; Fauci, A.S. (1988) Science 239:617-623; Locksley, R.M. y Scott, P. (1992) Immunoparasitology Today 1:A58-A61; Pearce, E.J. y col. (1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych, J-M. y col. (1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kulberg, M.C. y col. (1992) J. Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A.J. y col. (1993) J. Immunol. 150:1395-1402; Pearlman, E. y col. (1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K.J. y col. (1994) J. Exp. Med. 179:347-351) y estas enfermedades infecciosas también están también asociadas con un desplazamiento de las respuestas Th1 a respuestas Th2 en la inmunorrespuesta. Por consiguiente, los métodos de estimulación se pueden utilizar para inhibir la producción de citoquinas asociadas a Th2 en individuos con enfermedades infecciosas, como medio para contrarrestar el desplazamiento de las respuestas Th1 a respuestas Th2 y con ello promover una respuesta Th1 continua en los pacientes para mejorar la evolución de la infección. El método de estimulación puede implicar o bien la administración directa de un agente inhibidor a un individuo que padece una enfermedad infecciosa o bien un tratamiento ex vivo de células obtenidas del individuo (p. ej., células Thp o células Th2) con un agente estimulador, seguido de la readministración de esas células al individuo. El tratamiento se puede mejorar más administrando al receptor otros agentes que promueven Th1, tales como la citoquina IL-12 o anticuerpos dirigidos contra citoquinas asociadas a Th2 (p. ej., anticuerpos anti-IL-4), en cantidades suficientes para estimular aún más una respuesta de tipo Th1.

D. Enfermedades autoinmunitarias

Los métodos de inhibición se pueden usar con fines terapéuticos en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que están asociadas con una disfunción de tipo Th2. Muchos trastornos autoinmunitarios son el resultado de una activación inapropiada de células T que son reactivas contra tejidos propios y que promueven la producción de citoquinas y anticuerpos implicados en la patología de esas enfermedades. La modulación de respuestas de tipo T coadyuvante puede tener un efecto sobre la evolución de la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, en la encefalomielitis alérgica experimental (EAE), la estimulación de una respuesta de tipo Th2 mediante la administración de IL-4 en el momento de la inducción de la enfermedad, disminuye la intensidad de la enfermedad autoinmunitaria (Paul, W.E. y col. (1994) Cell 76:241-251). Además, la recuperación de esta enfermedad por parte de los animales se ha demostrado que está asociada con un aumento en una respuesta de tipo Th2, como se evidencia por un aumento de citoquinas específicas de Th2 (Kuory, S.J. y col. (1992) J. Exp. Med. 176:1355-1364). Además, las células T que son capaces de suprimir EAE secretan citoquinas específicas de Th2 (Chen, C. y col. ((1994) Immunity 1:147-154). Ya que la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en EAE tiene un efecto protector frente a la enfermedad, la estimulación de una respuesta Th2 en individuos con esclerosis múltiple (enfermedad de la que EAE es modelo) es probable que sea terapéuticamente beneficiosa. Los métodos de inhibición se pueden usar para efectuar esta disminución.

De manera similar, la estimulación de una respuesta de tipo Th2 en la diabetes de tipo I en ratones proporciona un efecto protector contra esa enfermedad. Efectivamente, el tratamiento de ratones NOD con IL-4 (que promueve una respuesta Th2) previene o retrasa la aparición de la diabetes de tipo I que normalmente se desarrolla en estos ratones (Rapoport, M.J. y col. (1993) J. Exp. Med. 178:87-99). Por lo tanto, la estimulación de una respuesta Th2 en un individuo que padece, o que es susceptible a padecer, una diabetes, puede mejorar los efectos de esta enfermedad o puede inhibir la aparición de esta enfermedad.

Otra enfermedad autoinmunitaria más en la que la estimulación de una respuesta Th2 puede ser beneficiosa es la artritis reumatoide (RA). Existen estudios que han demostrado que pacientes con artritis reumatoide presentan de manera predominante células Th1 en el tejido sinovial (Simon, A.K. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8562-8566). Mediante estimulación de una respuesta Th2 en un individuo con RA, la respuesta Th1 perjudicial se puede concomitantemente modular por disminución para de esta manera mejorar los efectos de la enfermedad.

Por consiguiente, los métodos de inhibición se pueden usar para estimular la producción de citoquinas asociadas a Th2 en individuos que padecen, o que son susceptibles a padecer, una enfermedad autoinmunitaria en la que una respuesta de tipo Th2 es beneficiosa para la evolución de la enfermedad. El método de inhibición puede implicar o bien la administración directa de una agente inhibidor al individuo, o bien un tratamiento ex vivo de células obtenidas del individuo (p. ej., células Thp, Th1, células B, células no linfocíticas) con un agente inhibidor, seguido de la readministración de las células al individuo. El tratamiento se puede mejorar más administrando al individuo otros agentes que promueven Th2, tal como la propia IL-4 o anticuerpos dirigidos contra citoquinas asociadas a Th1, en cantidades suficientes para estimular aun más una respuesta de tipo Th2.

Por contraste con las enfermedades autoinmunitarias anteriormente descritas en las que es deseable una respuesta Th2, otras enfermedades autoinmunitarias se pueden mejorar con una respuesta de tipo Th1. Esas enfermedades se pueden tratar usando un agente estimulador (como se ha descrito anteriormente en los casos del cáncer y de enfermedades infecciosas). El tratamiento se puede mejorar más administrando al individuo una citoquina que promueve una respuesta Th1 (p. ej., INF-\gamma), en cantidades suficientes para estimular aún más una respuesta de tipo Th1.

La eficacia de los agentes encargados del tratamiento de enfermedades autoinmunitarias se puede determinar en los modelos animales de enfermedades humanas anteriormente descritos(p. ej., EAE es una modelo de la esclerosis múltiple y los ratones NOD son un modelo de la diabetes) o en otros modelos animales de enfermedades autoinmunitarias humanas que están perfectamente caracterizados. Estos modelos animales incluyen el ratón mrll/prl/pr como modelo del lupus eritematoso, la artritis murina inducida con colágeno como modelo de la artritis reumatoide, y la miastenia gravis experimental murina (véase, Paul redactor, Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs. 840-856). Un agente modulador (es decir, un agente estimulador o un agente inhibidor) se administra a los animales experimentales y a continuación se realiza el seguimiento de la evolución de la enfermedad en los animales experimentales con los métodos estándar apropiados para el modelo particular que esta siendo utilizado. La efectividad del agente modulador se evidencia por la mejoría de la enfermedad en los animales tratados con el agente en comparación con los animales no tratados (o con animales tratados con un agente de control).

Ejemplos no limitativos de enfermedades y trastornos autoinmunitarios que poseen un componente autoinmunitario que puede ser tratado, incluyen diabetes mellitus, artritis (que incluye la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica), esclerosis múltiple, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (que incluye dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, síndrome de Sjögren, que incluye la queratoconjuntivitis seca secundaria al síndrome de Sjögren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones producidas por la picadura de artrópodos, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones producidas por fármacos, reacciones leprosas inversas, eritema nodoso leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición sensorial y neural bilateral, progresiva e idiopática, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, tromobocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis crónica activa, Síndrome de Stevens-Johnson, esprúe idiopático, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior y fibrosis pulmonar intersticial.

E. Trasplantes

Aunque el rechazo de injertos o la aceptación de injertos no es exclusivamente atribuible a la acción de un subgrupo particular de células T (es decir, a células Th1 o Th2) en el receptor del injerto (para un análisis del tema véase Dallman, M.J. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:632-638), numerosos estudios han implicado una respuesta Th2 predominante en la supervivencia prolongada de un injerto o una respuesta Th2 predominante en el rechazo de un injerto. Por ejemplo, la aceptación de un injerto se ha asociado con la producción de un patrón de citoquinas asociadas a Th2 y/o el rechazo de un injerto se ha asociado con la producción de un patrón de citoquinas asociadas a Th1 (véanse p. ej., Takeuchi, T. y col., (1992) Trasplantation 53:1281-1291; Tzakis, A.G. y col., (1994) J. Pedriat. Surg. 29:754-756; Thai, N.L. y col., (1995) Transplantation 59:274-281). Además, la transferencia adoptiva de células que poseen un fenotipo de citoquinas asociadas a Th2 prolonga la supervivencia del injerto de piel (Maeda, H. y col. (1994) Int. Immunol. 6:855-862) y reduce la enfermedad del injerto frente al hospedador (Fowler, D.H. y col. (1994) Blood 84:3540-3549; Fowler, D.H. y col. (1994) Prog. Clin. Biol. Res. 389:533-540). Aún más, la administración de IL-4, que promueve la diferenciación de Th2, prolonga la supervivencia de injertos cardíacos (Levy, A.E. y Alexander, J.W. (1995) Trasplantation 60:405-406), mientras que la administración de IL-12 en combinación con anticuerpos anti-IL-10, que promueve la diferenciación de Th1, aumenta el rechazo de aloinjertos de piel (Gorczynski, R.M. y col. (1995) Transplantation 60:1337-1341).

Por consiguiente, los métodos de inhibición se pueden usar para estimular la producción de citoquinas asociadas a Th2 en receptores de trasplantes para prolongar la supervivencia del injerto. Los métodos de inhibición se pueden utilizar tanto en trasplantes de órganos sólidos como en el trasplante de médula ósea (p. ej., para inhibir la enfermedad del injerto frente al hospedador). El método de inhibición puede implicar o bien la administración directa de un agente inhibidor al receptor del trasplante o bien un tratamiento ex vivo de células obtenidas del individuo (p. ej., células Thp, Th1, células B, células no linfocíticas) con un agente inhibidor, seguido de la readministración de esas células al individuo. El tratamiento se puede mejorar más administrando al receptor otros agentes que promueven respuestas Th2, tales como la propia IL-4 o anticuerpos dirigidos contra citoquinas asociadas a Th1, en cantidades suficientes para inhibir aún más una respuesta de tipo Th2.

Además de las patologías anteriormente mencionadas, los métodos de modulación son también útiles para otros fines. Por ejemplo, los métodos de estimulación (es decir, métodos que usan un agente estimulador) se pueden usar para estimular la producción de citoquinas que promueven Th1 (p. ej., el interferón-gamma) in vitro para la producción comercial de estas citoquinas (p. ej., las células se pueden poner en contacto con el agente estimulador in vitro para estimular la producción de interferón-gamma y el interferón-gamma se puede recuperar en el sobrenadante del cultivo, se puede purificar más en caso necesario y se puede envasar para su uso comercial).

Además, los métodos de modulación se pueden aplicar a vacunas para promover en un individuo una respuesta Th1 o una respuesta Th2 frente a un antígeno de interés. Es decir, los agentes se pueden utilizar como adyuvantes para dirigir una inmunorrespuesta frente a una vacuna ya sea una respuesta Th1 o una respuesta Th2. Por ejemplo, para promover una respuesta de anticuerpos frente a un antígeno de interés (es decir, con fines vacunales), el antígeno y un agente inhibidor se pueden coadministrar a un individuo para promover en el individuo una respuesta Th2 frente al antígeno, ya que las respuestas Th2 proporcionan la ayuda eficiente de células B y promueven la producción de IgG1. De manera alternativa, para promover una inmunorrespuesta celular frente a un antígeno de interés, el antígeno y un agente estimulador se pueden coadministrar a un individuo para promover en el individuo una respuesta Th1 frente al antígeno, ya que las respuestas Th1 favorecen el desarrollo de inmunorrespuestas mediadas por células (p. ej., respuestas de hipersensibilidad retardada). El antígeno de interés y el agente modulador se puede formular juntos en forma de una composición farmacéutica única, o en composiciones distintas. En una realización preferida, el antígeno de interés y el agente modulador se administran simultáneamente al individuo. Como alternativa, en determinadas situaciones, puede ser conveniente administrar primero el antígeno y después el agente modulador o viceversa (por ejemplo, en el caso de un antígeno que provoca de manera natural una respuesta Th1, puede ser beneficioso administrar primero el antígeno solo para estimular una respuesta Th1 y después administrar un agente inhibidor, solo o junto con una dosis de refuerzo del antígeno, para desplazar la inmunorrespuesta hacia una respuesta Th2).

Esta invención se ilustra más ampliamente por medio del siguiente ejemplo, que no debe ser interpretado como limitativo. Además, todas las secuencias de nucleótidos y aminoácidos depositadas en las bases de datos públicas aquí nombradas, se incorporan también por la presente como referencia.

Una molécula de ácido nucleico que comprende un cDNA de T-bet de ratón clonado en el sitio EcoRI del vector pJG4-5 se depositó en la American Type Culture Collection (Manassas, V.A.) el 9 de noviembre de 1.999 y se le asignó el número de depósito PTA-930. Una molécula de ácido nucleico que comprende un cDNA de la T-bet humana (preparado a partir del RNA del clon ROT-10 de células Th1 humanas) se clonó en el vector pCR 2.1-TOPO, se depositó en la American Type Culture Collection (Manassas, V.A.) el 28 de enero de 2.000 y se le asignó el número de depósito PTA-1339. Ambos depósitos de hicieron bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest.

Ejemplos

Los siguientes procedimientos experimentales se utilizaron en los ejemplos:

Ratones, líneas celulares, citoquinas, anticuerpos y plásmidos

Los ratones Balb/c se obtuvieron procedentes de Jackson Laboratories. Se han descrito ratones transgénicos que expresan TcR DO11.10 (Jacobson, N.G. y col., 1995, J. Exp. Med. 181, 1755-1762) y ratones transgénicos que expresan TcR MBP (Lafaille, J.J., 1994, Cell 78,399-408). Se usaron ratones con edades de 5-6 semanas. Las líneas celulares y las células primarias se mantuvieron en un medio completo que contenía RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone Laboratories), glutamina (2 mM), penicilina (50 unidades/ml), estreptomicina (50 \mug/ml), HEPES (10 mM) y \beta-ME (50 \muM). Jurkat es un linfoma Th1 humano, EL4 es un timoma Th0 de ratón, NK3.3 es una línea de células NK humanas (Ye, J., 1995. J. Leuko. Biol. 58, 225-233; Kornbluth, J., 1982, J. Immunol. 129, 2831-2837), YT es una línea de células NK humanas (Yodoi, J., 1985. J. of Immunol. 134, 1623-1630), AE7 es un clon Th1 de ratón, D10 es un clon Th2 de ratón y M12 es una línea de linfoma de células B. La IL-4 recombinante se obtuvo procedente de DNAX, la rIL-2 humana se obtuvo procedente de la Chiron Corp., la rIL-12 se obtuvo procedente de Hoffman LaRoche y la rIL-18 se adquirió procedente de Prepotech Inc. También se usaron los anticuerpos anti-IL-12 monoclonal, anti-IFN-\gamma monoclonal y anti-IL-4 monoclonal (11B11) (Ohara, J. y Paul, W.E. 1985, Nature 315, 333-336). Tanto el antisuero policlonal contra T-bet, producido en conejos, como el mAb, se indujeron frente a una T-bet recombinante de longitud completa producida en bacterias. El mAb se produjo mediante la fusión de esplenocitos procedentes de ratones con el mieloma SP2/O-Ag14 y es del subtipo IgG1. Los plásmidos de expresión incluyeron c-Maf (pMex-maf) (Ho, I-C. y col. 1996, Cell 85, 973-983), NFATp (Hodge, M.R. y col. 1996, Immunity 4, 1-20) y p65, éste último clonado dos veces en el vector pCDNA.

Purificación de células T CD4+ y cultivos in vitro

Las células T CD4+ se purificaron procedentes de ganglios linfáticos (LN) (del inglés, " Lymp Nodes") mediante citometría de flujo usando un anticuerpo anti-CD4 (RM4-4)conjugado con PE (Pharmigen) y se sometieron a un ensayo de clasificación celular usando FACS (Mo Flo, Becton Dickenson) hasta una pureza del 98%-99%. Para la activación in vitro, una concentración de células CD4+ de 2 x 10^{6}/ml se suspendieron en un medio completo y se activaron con los anticuerpos anti-CD3 (2C 11), 1 \mug/ml, y anti-CD28 (Pharmigen), 2 \mug/ml, unidos a la placa, durante 3 días, en presencia de IL-2, 100 unidades/ml. Las células se dividieron luego en proporción 1:4 en medio completo y se cultivaron 4 días en presencia de IL-2, 100 unidades/ml. En el día 7 después de la estimulación primaria, las células se recogieron, se lavaron dos veces y se volvieron a estimular en concentraciones de 1 x 10^{6} células/ml con anticuerpo anti-CD3, 1 \mug/ml, unido a la placa, durante 1, 3 y 6 horas. Para los cultivos de diferenciación de Th1 y Th2, células no transgénicas o células LN DO11.10 y esplenocitos se juntaron, se resuspendieron en un medio completo en una concentración de 1 x 10^{6} células/ml medio completo y se cultivaron en condiciones para Th1 (anticuerpo anti-IL-4 [11B11], 10 mg/ml, rIL-12, 10 ng/ml) o en condiciones para Th2 (anticuerpo anti-IFN-\gamma, 10 mg/ml, IL-4 10 ng/ml) con anticuerpo anti-CD3, 1 \mug/ml unido a la placa. Las células se dividieron en proporción 1:4 en el día 3 con medio completo + IL-2, 100 unidades/ml. En el día 7,las células se volvieron a estimular con anticuerpo anti-CD3 1 \mug/ml durante 4 horas y se recogieron para la preparación del RNA (Jacobson, N.G. y col. (1995), J. Exp. Med. 181, 1755-1762). Los sobrenadantes se recogieron a las 24 horas para realizar los ensayos de las citoquinas.

Análisis de transferencias Northern y Western

Se aisló el RNA total procedente de células en reposo y de células estimuladas usando el reactivo TRIZOL (Gibco/BRL) y 10 \mug de cada una de las muestras se sometieron a separación en geles de agarosa al 1,2% con formaldehído al 6%, se transfirieron a una membrana Genescreen (NEN) en SSC 20X durante la noche y se unieron covalentemente a ella usando un Stratalinker UV (Stratagene). La hibridación de las transferencias se llevó a cabo a 42ºC según se encuentra descrito (Hodge, M.R. y col., 1996, Immunity 4, 1-20) usando las siguientes sondas de cDNA marcadas con ^{32}P: T-bet y \gamma-actina. Se prepararon extractos nucleares y extractos citoplásmicos para los análisis de tranferencia Western procedentes de células AE7.D10 y NK3.3. Los núcleos se aislaron según se encuentra descrito (Dolmetsch, R.E. y col., 1997, Nature, 386, 855-858). Las proteínas extraídas se separaron mediante una PAGE al 8% seguida de la electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa y se sometieron a una hibridación con sondas con un mAb específico de T-bet seguido de IgG anti-ratón procedente de cabra, conjugada con peroxidasa de rábano, y a quimioluminiscencia intensificada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

Ensayos de transfección transitoria

Células EL4 y células Jurkat se transfectaron usando un aparato de electroporación de Bio Rad (280 V, 975 \muF) usando 5 x 10^{6} células en 0,4 ml de RPMI en cada transfección con 5 \mug de un plásmido de reporte y con 5-10 \mug de un plásmido de expresión. Se realizaron ensayos de luciferasa 24 h después, midiéndose la actividad luciferasa en el 20% se cada una de las muestras según las instrucciones (Promega). La construcción de reporte IFN-\gamma-luciferasa deriva del plásmido pB9 que contiene el gen completo del IFN-gamma humano (P. Gray y D.V. Goeddel, 1982, Nature, 298:859). El gen de luciferasa de pGL2 se insertó en el primer exón de pB9. La construcción de reporte que contiene el promotor de IL-2.... La construcción de reporte que contiene el promotor de IL4, IL-4Luc, contiene 807 pb en dirección aguas arriba del gen de la IL-4 murina.

Construcciones retrovíricas y transducción

El vector bicistrónico GFP-RV se encuentra descrito (Ouyang, W. y col. 1998, Immunity 9:745-755) así como también la línea de células de empaquetamiento Phoenix-Eco (Kinoshita, S. y col. 1998, Cell 95, 595-604). El vector GFP-RV se construyó insertando la secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis y el alelo GFP en el vector retrovírico MSCV2.2 (Ouyang, W. y col. 1998, Immunity 9:745-755) o en el vector IL-2-MSCV. Ambos vectores expresan dos cDNA, el de T-bet y el cDNA que codifica GFP, simultáneamente, usando una IRES para iniciar la traducción de cada uno de los mRNA por separado. La transfección de la línea de células de empaquetamiento y las transducciones de células T primarias con retrovirus se realizaron esencialmente según se encuentra descrito (Ouyang, W. y col. 1998, Immunity 9:745-755).

Tinción intracelular para la determinación de citoquinas y análisis por FACS

La tinción intracelular para la determinación de citoquinas se realizó según se ha descrito (Ouyang, W. y col. 1998, Immunity 9:745-755). Células T primarias, transgénicas o no transgénicas, que habían sido infectadas con retrovirus durante períodos de tiempo diferentes según se indica, se re-estimularon con PMA (50 ng/ml) y con ionomicina (1 \muM) durante 2 horas, y se añadieron 10 \mug/ml de Brefeldin A durante un período adicional de 2 horas.

Ejemplo 1 Clonación de un nuevo factor de transcripción, T-bet

Ya que la región Th1-específica del promotor de IL-2 se encuentra perfectamente localizada (Brombacher, F. y col. 1994, Int. Immunol. 6:189-197; Rooney, J. y col. 1995, Mol. Cell. Biol. 156299-6310; Lederer, J.A. y col. 1994, J. Immunol. 152, 77-86; Durand, D. y col. 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1715-1724; Hoyos, B. y col. 1989, Science 244, 457), una estrategia del híbrido único en levaduras usando una construcción de reporte que contiene el promotor de IL-2 y una biblioteca de cDNA preparada a partir del clon OF6 de Th1 se eligió para identificar factores de transcripción Th1-específicos. Para validar esta estrategia, la región Th2-específica del promotor IL-4 se expresó en levaduras y mostró que era transactivada con la introducción de c-Maf, pero no con la de otros varios factores de transcripción (p. ej., NFAT). La transactivación con c-Maf no tenía lugar cuando el elemento de respuesta a c-Maf (MARE) estaba mutado. Por lo tanto, se utilizó la estrategia del híbrido único en levaduras.

La cepa de levadura EGY48 se integró de manera estable con la construcción que contiene promotor de IL-2/histidina y se transformó con una biblioteca de cDNA preparada a partir de un clon de células Th1 activadas con anticuerpo anti-CD3, OF6. De 5,6 x 10^{6} clones escrutados, 488 fueron positivos en el primer escrutinio. De los 210 clones ensayados durante el segundo escrutinio, 72 clones demostraron ser específicos para el promotor de IL-2. Para disminuir el número de clones positivos, se hizo la hibridación de un cDNA de un clon de levadura con unos cDNA que se habían expresado de manera diferencial en las líneas celulares Th1 y Th2. Estos cDNA Th1-Th2 y Th2-Th1 se prepararon usando el kit "PCR select kit" de Clontech, se marcaron radiactivamente y se usaron inicialmente en un experimento piloto para escrutar los 16 clones de levadura más fuertemente positivos. De esos 16 clones, 8 fueron positivos con la sonda del producto de un cDNA específico de Th1 (PL17) y no con la sonda del producto de un cDNA específico de Th2 (D10). Se realizó una análisis de diferencia representacional (RDA, p. ej, Lisitsyn, 1993, Science, 259:946; O'Neill y Sinclair, 1997, Nucleic Acids Research, 25:2681; Hubank y Schatz, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 5640; Welford y col. 1998, Nucleic Acids Research, 26:3059) con la sonda Th1-Th2 en los 16 clones positivos, con una hibridación de control de la sonda a IL-2, IFN-gamma e IL-4. La especificidad de las sondas de cDNA sustractivas para Th1 y para Th2 se demuestra mediante la detección que realizan de IL-2 e IFN-\gamma respectivamente, frente a la de IL-4.

Los análisis con enzimas de restricción y los datos de la secuenciación revelaron que los 8 clones estaban emparentados. Estos clones entraban dentro de tres agrupaciones basadas en diferencias en las regiones en 5' y en 3' que no se traducen, representando cada una de estas categorías una molécula de cDNA independiente. La comparación de la secuencia de estos clones con las bases de datos de secuencias NCBI y GenBank dio como resultado una homología con la familia T-box de factores de transcripción. La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de T-bet.

Ejemplo 2 T-bet comparte una región de homología con los miembros T-brain y eomesodermina de la familia T-box

Brachyury o T es el miembro fundador de una familia de factores de transcripción que comparten un dominio de unión a DNA de 200 aminoácidos denominado caja T (del inglés, "T-box") (revisado en Smith, J. 1997, Current Opinion in Genetics and Development, 7,474-480; Papaioannou y Silver, 1998, Bioessay, 20:9; Meisler, M.H. 1997, Mammalian Genome, 8, 799-800). La mutación Brachyury (del griego, rabo corto) fue descrita por primera vez en 1.927 en animales mutantes heterozigotos que presentaban un rabo corto y ligeramente retorcido (Herrmann, B.G., 1990, Nature, 343, 617-622). En la actualidad existen ocho genes T-box en ratón no incluyendo a Brachyury. Estos genes incluyen Tbx1-6, T-brain-1 (Tbr-1) y ahora T-bet, cada uno ellos con un patrón de expresión distinto y generalmente complejo. La familia T-box de factores de transcripción está definida por la homología de los miembros de la familia en el dominio de unión a DNA. El dominio de unión a DNA de T-bet (residuos 138-327 de la T-bet murina) es muy similar a los dominios con caja T de la T-brain murina y de la eomesodermina de Xenopus y por lo tanto sitúa a T-bet en la subfamilia Tbr1 de la familia de genes T-box. La proteína homóloga humana de la proteína T-bet murina es idéntica a la T-bet de ratón en aproximadamente el 88%. La Figura 1A se dedujo usando un alineamiento de proteínas de Lipman-Pearson (con una penalización por G establecida en 4 y una penalización por longitud de hueco establecida en 12. Se calculó que el índice de similitud era 86,6; número de huecos 2, longitud de hueco 5 y la longitud consenso 535). T-bet comparte una región de homología con los miembros T-brain y eomesodermina de la familia T-box. El dominio de unión a DNA de la T-bet murina es muy similar a los dominios con caja T de la T-brain murina y de la eomesodermina de Xenopus. Existe una identidad de aminoácidos de aproximadamente el 69% entre las tres regiones con caja T. T-bet no comparte ninguna otra homología de secuencia con otros miembros de la familia T-box aparte del dominio con caja T.

Ejemplo 3 T-bet se une a sitios consenso de caja T y los transactiva, y contiene dominios funcionalmente importantes que mapean en ambas regiones 5' y 3'

La proteína T-bet recombinante se une a sitios consenso de caja T y al sitio para T-bet presente en el promotor de IL-2, y un complejo presente en extractos nucleares procedentes de células Th1 AE7 estimuladas con anticuerpo anti-CD3, se une específicamente a una sonda oligonucleotídica consenso que contiene la caja T (GGGAATTTCACACCTAGGTGAAATTCC). Para determinar la actividad de T-bet en células T se realizaron los siguientes experimentos. Células Jurkat Th1 se cotransfectaron con T-bet y con una construcción de reporte que lleva luciferasa. La Figura 2A muestra el nivel basal (barras blancas) y la actividad del promotor inducido (barras negras) con PMA (50 ng/ml) más ionomicina (1 \muM), en células Jurkat, de una construcción de reporte que lleva luciferasa y que contiene un promotor mínimo de timidina-quinasa (TK) (del inglés, " Timidine Kinase") con o sin 4 copias del sitio consenso de caja T. Cada una de las construcciones de reporte se cotransfectó con un vector pcDNA vacío o con un vector pcDNA que contenía el cDNA de T-bet de longitud completa según se indica en la figura. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes. La Figura 2B muestra células Jurkat transfectadas de manera transitoria con la construcción de reporte que lleva luciferasa y que contiene el promotor mínimo de TK y sitios consenso de caja T multimerizados, y con el vector pCDNA que contiene las regiones indicadas del cDNA de T-bet representadas a la izquierda del diagrama de barras. La actividad luciferasa se midió 24 horas después de la transfección. El experimento se repitió tres veces con resultados similares. El nivel basal (barras blancas) y la actividad obtenida del promotor (barras negras) inducido con PMA (50 ng/ml) más ionomicina (1 \muM) demuestra que T-bet es activa en células T, y que su actividad puede incrementar aún más después de la estimulación.

Ejemplo 4 La expresión de T-bet en células T está restringida al subgrupo Th1 y está regulada por señales transmitidas a través del TcR

T-bet se aisló procedente de una biblioteca de cDNA de Th1 y un análisis de transferencia Northern de múltiples órganos reveló que T-bet se transcribe únicamente en pulmón, timo y en órganos linfáticos periféricos.

La Figura 3A muestra que T-bet se expresa preferentemente en timocitos doble negativos (DN), no en células doble positivas (DP) ni en células simple positivas (SP). Un análisis de transferencia Northern de RNA celular total, aislado de clones de células Th1 (AE7 y D1.1) o de clones de células Th2 (D10 y CDC35) que se habían tratado con medio o con anticuerpo anti-CD3 (2C11) unido a la placa durante 6 horas, reveló la presencia de transcritos de T-bet únicamente en los clones Th1. El RNA celular total se aisló de clones de células Th1 (AE7 y D1.1) o de clones de células Th2 (D10 y CDC35) que se habían tratado con medio o con anticuerpo anti-CD3 (2C11) unido a la placa durante 6 horas. El RNA total se aisló procedente de células M12 (un linfoma de células B) y de células EL4 (un timoma de células T) tratadas con medio o con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 \muM) durante 6 horas. Se realizaron análisis de transferencia Northern con 10 \mug de RNA total por pista, usando procedimientos estándar y se hibridaron con sondas usando el cDNA de T-bet de longitud completa. T-bet se expresa preferentemente en los clones Th1. Además, el nivel de expresión de T-bet aumentó con las señales transmitidas a través de TcR como se evidencia por medio de la inducción de los transcritos de T-bet con anticuerpo anti-CD3. Los transcritos de T-bet no se detectaron en células M12, un linfoma de células B, ni en las células de linfoma Jurkat Th1, ni en células EL4, un timoma de células Th0, cuando estas células fueron tratados o con medio o con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (1 \muM) durante 6 horas.

Para determinar los niveles de proteína de T-bet en células T primarias, esplenocitos transgénicos TcR DO11.10 se cultivaron en condiciones polarizantes hacia Th1 o hacia Th2. A las 72 horas, las células se expandieron 3 veces en medio nuevo que contenía IL-2, 200 U/ml. En el día 7 después de la primera estimulación, se prepararon extractos nucleares y extractos citosólicos procedentes de células DO11.10, Th1 y Th2 del cultivo heterogéneo, en reposo o activadas con PMA/ionomicina (1h). También se prepararon extractos nucleares de células M12, EL4, Jurkat, NK3.3 e YT en reposo. Como se muestra en la Figura 3C, de entre las líneas celulares, la proteína T-bet solamente estuvo presente en las células YT. La Figura 3C muestra que la proteína T-bet está restringida a las células Th1 y a las células NK. Se realizaron análisis de transferencia Western de los extractos nucleares y citosólicos preparados a partir de células DO11.10, Th1 y Th2 del cultivo heterogéneo, en reposo o activadas con PMA/ionomicina (1h), según se ha expuesto anteriormente. Brevemente expuesto, esplenocitos transgénicos DO11,10 se activaron con péptido OVA (323-339) en una concentración de 3 x 10^{6} células/ml, y en presencia de IL-12, 10 ng/ml, y de anticuerpo anti-IL-4 (11B11), 10 \mug/ml, para promover la formación del fenotipo Th1, o en presencia de IL-4, 10 ng/ml, y de anticuerpo anti-IFN-gamma, 10 \mug/ml, para promover la formación del fenotipo Th2. A las 72 horas, las células se expandieron 3 veces en medio nuevo que contenía con IL-2, 200 U/ml. En el día 7 después de la primera estimulación, se prepararon extractos nucleares y extractos citosólicos procedentes de células DO11.10, Th1 y Th2 del cultivo heterogéneo, en reposo o activadas con PMA/ionomicina (1h). Se prepararon también extractos nucleares a partir de células M12, EL4, Jurkat, NK3.3 e YT en reposo. Treinta microgramos de los extractos nucleares y citosólicos se separaron mediante SDS-PAGE (gel al 8%), se transfirieron a nitrocelulosa, y se sometieron a una hibridación con sonda utilizando un antiscra anti-T-bet como sonda. En células T-primarias, la proteína T-bet se expresa de manera selectiva en células T conducidas hacia la ruta Th1 pero no hacia la ruta Th2, lo que está conforme con el análisis de la transferencia Northern de clones de células T y de células T primarias, anteriormente mostrado.

Un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para T-bet, permitió la visualización directa de proteína T-bet mediante análisis por FACS. La Figura 3D muestra que T-bet se puede visualizar por FACS en células Th1 AE7. Las células D10 (Th2) o AE7 (Th1) se trataron con medio o con PMA (50 ng/ml) y con ionomicina (1 \muM) durante 2 horas, y con monensina 2 \muM durante un período adicional de 3 horas. Las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con saponina al 0,5%, y se tiñeron con medio (línea de rayas) o con un anticuerpo IgG1 de control isotípico (línea de puntos) o con un anticuerpo monoclonal anti-T-bet \alpha3D10 purificado por afinidad (línea continua) seguido de una tinción con PE-IgG1 anti-ratón procedente de cabra. Las células se analizaron mediante citometría de flujo en un FACSCalibur. Se indujeron anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra una T-bet producida en bacterias. La proteína T-bet no fue detectable en células D10, estaba presente en niveles bajos en células AE7 no estimuladas y estaba presente a niveles incrementados en células AE7 estimuladas. Considerados en conjunto, los experimentos aquí detallados demuestran que en células T, la T-bet se expresa selectivamente en células Th1 en las que su nivel de expresión está regulado por señales que provienen de TcR.

Ejemplo 5 La expresión de T-bet se correlaciona con la inducción del IFN-\gamma en células NK y células B

La expresión de T-bet limitada a Th1, y acoplada con su aislamiento en virtud de la unión de un sitio con caja T presente en el promotor de IL-2, sugirió que T-bet podría activar la transcripción del gen de IL-2. Sin embargo, fue desconcertante que dos líneas celulares productoras de IL-2, Jurkat y EL4, no expresasen T-bet, mientras que la línea YT de células NK, que produce IFN-\gamma pero no produce IL-2, sí expresase T-bet. Además, experimentos preliminares no habían demostrado la transactivación del gen IL-2 por acción de T-bet, a pesar de la presencia de un sitio con caja T excelente en el promotor de IL-2. Otras citoquinas específicas de Th1 incluyen IFN-\gamma, TNF \alpha y LT. La expresión de T-bet se correlacionó también con la expresión del IFN-\gamma. Además, se encontró que un sitio con caja T estaba presente en el tercer intrón del gen del IFN-\gamma humano. Esto fue especialmente digno de atención ya que un sitio con hipersensibilidad a DNasa I específica de Th1 había sido recientemente mapeado en esta región.

Para estudiar la posibilidad de que T-bet controlase la expresión del gen del IFN-\gamma, se midió la expresión de T-bet y la expresión de IFN-\gamma en células distintas de las células Th1. El IFN-\gamma se expresa en células citotóxicas naturales (NK) (del inglés, " Natural Killer cells") a niveles bajos y es inducido a niveles altos después de un tratamiento con IL-2 e IL-12 (Kornbluth, J., y col., 1982. J. Immunol. 129:2831, Ye y col., 1995. J. Leuko. Biol. 58:225). Por lo tanto, la línea celular NK3.3 se trató durante 24 horas con IL-2, IL-12 e IL-2 más IL-12, se prepararon los lisados y se realizó el análisis de transferencia Western con el mAb de T-bet según se ha expuesto anteriormente. La Figura 4b muestra una inducción coordinada de la proteína T-bet y de la secreción de IFN-\gamma en células NK3.3. La línea celular NK3.3 se trató durante 24 horas con reactivos, IL-2, IL-12 e IL-2 más IL-12, que se sabe que inducen IFN-\gamma en células NK, se prepararon los lisados y se realizó el análisis de transferencia Western con el mAb de T-bet según se ha expuesto anteriormente. Se realizó un ensayo ELISA en los sobrenadantes recogidos procedentes de las células.

Las células B, que no producen IFN-\gamma en condiciones basales, pueden ser dirigidas a que produzcan grandes cantidades de IFN-\gamma después de un tratamiento con anticuerpo anti-CD40 y con una combinación de IL-12 e IL-18 (Yoshimoto, T., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3948-3953). Las células B purificadas se trataron durante 72 horas con el mAb anti-CD40, rIL-12 y rIL-18, se aisló su RNA y se realizó una transferencia Northern usando el cDNA de T-bet según se ha expuesto anteriormente. La Figura 4A muestra la inducción del mRNA de T-bet en células B tratadas con esta combinación de reactivos, y se confirmó la inducción de transcritos de IFN-\gamma en estas células. En conclusión, aunque ninguno de los tipos celulares expresa T-bet de manera constitutiva, tanto las células NK3.3 como las células B pueden ser inducidas a hacerlo en condiciones que también dan como resultado la producción de IFN-\gamma. Por lo tanto, el patrón de expresión de T-bet se correlaciona bien con la transcripción del gen de IFN-\gamma.

Ejemplo 6 T-bet transactiva el gen de IFN-\gamma en células Th

En la actualidad de sabe muy poco de las regiones reguladoras del gen del IFN-\gamma. En concreto, las regiones del gen que dirigen su expresión específica de tejido no han sido identificadas ni in vitro ni in vivo. Se ha demostrado que construcciones de reporte que contienen 500 pb o 3 kb de la secuencia aguas arriba, se expresan en células Th1 y en células Th2 (Young, H.A., 1994, J. of Immunol. 153, 3603-3610). Se piensa que los sitios ATF-2, NF\kappaB, AP-1 y Stat4 del promotor de IFN-\gamma o los intrones son funcionalmente importantes, pero es evidente que no son responsables de la expresión específica de tejido (Young, H.A., 1994, J. of Immunol. 153, 3603-3610; Sica, A., 1997, J. Biol. Chem. 272, 30412-30420; Penix, L. 1993, J. Exp. Med. 178, 1483-1496; Penix, L.A., 1996, J. Biol. Chem. 271, 31964-31972). De igual manera, aunque se han detectado sitios con hipersensibilidad a DNAsa I, preferenciales de Th1, en los dos intrones primero y tercero, los elementos cis relevantes localizados en estos intrones no han sido identificados (Young, H.A., 1994, J. of Immunol. 153, 3603-3610; Agarwal, S. y Rao, A. 1998, Immunity 9, 765-775). Por lo tanto, una construcción de reporte que contiene el gen de IFN-\gamma completo se utilizó para realizar estos estudios. El gen de reporte de IFN-\gamma utilizado incluye 3 kb de la secuencia aguas arriba, la secuencia codificadora completa con los tres intrones, y 1,5 kb de la secuencia aguas abajo (Xu, X. y col. 1996, Science 273, 794-796).

Se determinó la actividad de una construcción de reporte que porta luciferasa y que contiene 9 kb del gen de IFN-gamma presente en el linfoma Jurkat de células Th1 humanas y en el timoma EL4 de células Th0 de ratón. Cada una de las construcciones de reporte (10 \mug) se cotransfectó con un vector pCDNA vacío o con un vector pCDNA que contiene el cDNA de T-bet de longitud completa, c-Maf, NFATp o p65 (10 \mug). Las construcciones también incluyen las posiciones de -400 a -40 de los promotores de IL-2 e IL-4 y el gen de luciferasa de reporte.

El timoma EL4 de células T Th0 de ratón, que produce IL-2 e IL-4, pero no INF-\gamma, se transfectó con un plásmido de expresión de cDNA de T-bet y con la construcción de reporte que contiene IFN-\gamma y luciferasa (Figura 5). La introducción del plásmido de expresión de T-bet produjo una transactivación (de aproximadamente 20-30 veces) del gen de IFN-\gamma en comparación con la del vector vacío solo. Esto estaba en desacuerdo con la ausencia de transactivación por parte de los otros dos factores, el factor de transcripción c-Maf específico de Th2 y el factor de transcripción NFAT no selectivo de Th. Curiosamente, aunque el miembro p65 de la familia NF\kappaB no transactivó el gen IFN-\gamma de reporte él solo, la cotransfección de T-bet y p65 produjo una activación sinergística.

Se realizó también un estudio del promotor de IL-2 usando una región del promotor que se sabe que es específica de Th1 (Lederer, J.A. y col. 1994, J. Immunol. 152, 77-86). T-bet reprimió la actividad del promotor de IL-2 aproximadamente 10 veces. Esto fue especialmente apreciable después de la activación del promotor con PMA e ionomicina. Igual que en el caso anterior, se detectó una transactivación sustancial del gen de TNF-\gamma. La actividad de T-bet fue específica para los genes de IL-2 e IFN-\gamma ya que no presentó ningún efecto sobre la transactivación de un promotor de IL-4 (Figura 5) o de un promotor de TNF-\alpha. Estos resultados demuestran que T-bet activa de manera específica la transcripción del gen del IFN-\gamma y reprime la transcripción del gen de IL-2.

Para estudiar la expresión endógena del gen, células EL4 se transfectaron de manera transitoria con el vector que portaba T-bet o con el vector vacío, y se midió la producción de IFN-\gamma mediante la técnica ELISA 48 horas después de la estimulación con PMA/ionomicina (Figura 5). Coincidiendo con los datos de la transactivación anteriormente mostrados, la expresión ectópica de T-bet en células EL4 condujo a una producción medible de IFN-\gamma mientras que la transfección con el vector de control no produjo IFN-\gamma detectable.

Ejemplo 7 La transferencia de T-bet a células Th primarias, mediada por genes retrovíricos, da como resultado una producción incrementada de IFN-\gamma

Los experimentos anteriormente descritos defienden firmemente la existencia de un papel crítico de T-bet en el control de la transcripción del gen de IFN-\gamma.

Un híbrido Th0 específico de colágeno bovino se transdujo con construcciones retrovíricas que contenían T-bet y GFP o solamente GFP bajo el control del promotor de IL-2 inducible por TcR. Las poblaciones transducidas se clasificaron con la técnica FACS dos veces sobre GFP, se dejaron en reposo y después se estimularon con anticuerpo anti-CD3 y los sobrenadantes se recogieron a las 72 horas para medir la producción de citoquinas con la técnica ELISA (Figura 6). Los vectores retrovíricos de control que no ejercían efecto incluyeron una T-bet antisentido.

Para determinar mejor si T-bet es responsable de la expresión de IFN-\gamma específica de tejido, se realizó una transferencia de T-bet mediada por genes retrovíricos, a células T primarias, tanto TcR-transgénicas como no transgénicas. Se utilizaron dos retrovirus bicistrónicos diferentes, que expresan tanto T-bet como GFP. El primero de ellos expresa T-bet bajo el control de un promotor de IL-2 inducible, y el segundo expresa T-bet bajo el control de una LTR de MSCV. Se obtuvieron resultados similares con ambas construcciones.

Células T CD4 procedentes de ratones Balb/c se infectaron después de 36 horas de una activación primaria realizada con anticuerpo anti-CD3 más anticuerpo anti-CD28, se recogieron en el día 7 y una tinción intracelular para la determinación de IFN-gamma e IL-2 se realizó cinco horas después de la estimulación con PMA e ionomicina según se ha descrito en el apartado Procedimientos Experimentales. Los resultados se muestran en forma de representaciones a dos colores que muestran la expresión de GFP (FL1) frente a la de la citoquina intracelular (FL2), de eventos conectados por la expresión de CD4. Células T primarias procedentes de ratones transgénicos que portan MBP y TcR se estimularon usando MBP (Ac1-11) en una concentración 6 \muM y la infección se realizó en el día 1 con las construcciones IL-2/GFP e IL-2/T-bet/GFP. En el día 7, las células de clasificaron con respecto a la expresión de GFP, se dejaron en reposo durante 1 día y seguidamente se realizó el análisis de citoquinas intracelulares después de una estimulación de 5 horas con PMA e ionomicinina.

Células T CD4 indiferenciadas, procedentes de ratones Balb/c MBP-transgénicos o no transgénicos, se activaron con MBP 1-11 y con anticuerpo anti-CD3 en condiciones no polarizantes y se infectaron con retrovirus en el día 1 después de una primera activación según se encuentra descrito (Ouyang, W. y col. 1998, Immunity 9:745-755). Las células se cultivaron 7 días y seguidamente se midió la expresión de GFP para determinar el porcentaje de células infectadas. Las células GFP-positivas se sometieron a un ensayo de clasificación celular y la producción de citoquinas se midió mediante tinción intracelular después de una estimulación adicional de 4 horas con PMA más ionomicina. La transducción de ambos tipos de células T, MBP-TcR-transgénicas y no transgénicas, con T-bet produjo un aumento impresionante tanto en el número de células que producían IFN-\gamma como en la cantidad de IFN-\gamma producido por célula en comparación con las células transducidas con GFP solo (Figura 7).

Las células Thp indiferenciadas, poco después de la estimulación, producen grandes cantidades de IL-2, y después son gradualmente reemplazadas convirtiéndose en células polarizadas Th por acción de las citoquinas efectoras IFN-\gamma e IL-4. Las células polarizadas Th1 continúan produciendo IL-2 pero en cantidades considerablemente menores que las células Thp indiferenciadas. Las células polarizadas Th2 cortan la producción de IL-2. Las células Th transducidas con T-bet produjeron algo menos de IL-2 que células de control transducidas con GFP/RV, lo cual está en acuerdo con la represión de la transactivación del promotor de IL-2 por T-bet que se había observado en células EL4. La represión de IL-2 por T-bet concuerda con una función de T-bet de dirigir el destino del linaje desde una célula precursora indiferenciada hacia la formación de una célula efectora totalmente diferenciada.

Ejemplo 8 T-bet activa la producción de IFN-\gamma y reprime la producción de IL-4 en células Th2 en desarrollo

Los experimentos anteriores demuestran que T-bet es capaz de dirigir células Th no viradas hacia la ruta Th1. Se realizaron ensayos para determinar si la T-bet podría forzar a las células Th a dirigir sus programas genéticos a lo largo de una ruta Th1 incluso en presencia de estímulos que normalmente las conducirían hacia la ruta Th2. En los experimentos de la Figura 8, células T CD4+ procedentes de ratones Balb/c se activaron con anticuerpo anti-CD-3 y anticuerpo anti-CD28 en presencia de rIL-4 y de anticuerpos dirigidos contra IFN-\gamma e IL-12, a las 36 horas se realizó una infección retrovírica, las células se expandieron con IL-2, las células GFP-positivas se separaron por clasificación celular en el día 7 y la producción de citoquinas se midió mediante tinción intracelular después de una estimulación adicional de 4 horas con PMA más ionomicina. La transducción con GFP-RV solo dio como resultado una población que contenía el 13,4% de células productoras de IL-4 y el 0,9% de células productoras de IFN-\gamma (Figura 8). Como era de esperar, las células Thp no están todavía completamente polarizadas en este momento. La introducción de T-bet/GFP/RV produjo un desplazamiento sustancial de las Thp hacia la ruta Th1 como se evidencia por el gran número de células (50%) que producen IFN-\gamma y por el reducido número de células que producen IL-4 (3,5%), incluso en condiciones (rIL-4 y anticuerpo anti-IL-2) que inhiben la diferenciación hacia Th1. Por lo tanto, T-bet es capaz de vencer las señales que promueven la diferenciación hacia Th2, enviadas por citoquinas, para dirigir a las células Th en desarrollo hacia la ruta Th1.

Ejemplo 9 T-bet redirige las células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1

Se ha demostrado que la reversibilidad de las poblaciones Th1 y Th2 se pierde después de una estimulación prolongada en condiciones polarizantes. La reversibilidad se anula en gran medida pasada una semana y se pierde por completo pasadas 3 semanas (Murphy, E. y col. 1996, J. Exp. Med. 183, 901-913). Para determinar si T-bet puede redirigir el destino de una población pura de células Th2 ya polarizadas, se cultivaron células T CD4+ de la manera anteriormente descrita y se realizó una transducción de genes retrovíricos en el día 9 de cultivo. En las células Th cultivadas durante 9 días en condiciones que polarizan hacia Th2, las células de control transducidas con GFP/RV son virtualmente todas ellas productoras de IL-4 e IL-5 (23% y 11%) siendo escasamente detectables las células productoras de IFN-\gamma (6%) (Figura 9). Por lo tanto, como era de esperar, se había producido una polarización casi completa. Increíblemente, la introducción de T-bet en estas células Th2 totalmente polarizadas, las redirigió o las convirtió en células polarizadas Th1 según se evidencia tanto por la inducción de la expresión de IFN-\gamma como por la pérdida de expresión de IL-4 e IL-5. Esta conversión tuvo lugar en presencia de IL-4 exógena. Un total del 77% de las células Th2 transducidas con T-bet produjeron ahora IFN-\gamma, mientras que el porcentaje de células que produjeron IL-4 e IL-5 se redujo al 13% y al 1% respectivamente. Estas células transducidas con T-bet no son por lo tanto células Th0 que producen tanto IFN-\gamma como IL-4. Por consiguiente, T-bet no solamente ha inducido la expresión de IFN-\gamma en células Th2 sino que ha reprogramado realmente las células Th2 hacia el subgrupo opuesto Th1.

Ejemplo 10 T-bet también redirige las células polarizadas Tc2 hacia la ruta Th1

Aunque la mayor parte de la atención se ha centrado sobre los linfocitos T CD4+, es evidente que las células T citotóxicas CD8+ también se pueden dividir en un subgrupo que produce IFN-\gamma (Tc1) y en un subgrupo que produce IL-4 (Tc2). Se determinó la capacidad de T-bet para redirigir las células Tc2 completamente polarizadas hacia una ruta Tc1. Por lo tanto, células T CD8+ purificadas se diferenciaron en cultivo en condiciones que polarizan hacia Tc2, durante 9 días, hasta conseguir la diferenciación completa. La Figura 10 muestra que las células Tc2 transducidas con T-bet, al igual que sucede con las células Th2 CD4 transducidas con T-bet, han sido reprogramadas para producir IFN-\gamma (85% frente al 15%) y para reprimir la producción de IL-4 e IL-5 (3% frente al 34% y 1% frente al 45% respectivamente). Por lo tanto, T-bet es capaz de convertir las células Tc2 CD8+ completamente diferenciadas en células Tc1.

Ejemplo 11 T-bet está fosforilada en tirosina

Para determinar si T-bet es una proteína fosforilada en tirosina, se prepararon lisados de células completas procedentes de células Th1 AE7 después de una incubación de 0, 5, 10 y 30 minutos con pervanadato. Los lisados se inmunoprecipitaron con un antisuero anti-T-bet, se separaron en fracciones mediante SDS-PAGE (gel al 8%), se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a una hibridación con sonda utilizando como sonda un mAb 4G10 anti-fosfotirosina. Después de la exposición, las transferencias se extrajeron y se volvieron a someter a una hibridación con sonda con un antisuero anti-T-bet como sonda. Como se muestra en la Figura 11, T-bet es claramente una proteína fosforilada en tirosina presente en células T.

Ejemplo 12 Creación de una molécula T-bet dominante negativa

Se prepararon moléculas de cDNA quiméricas que contenían el dominio de unión a DNA de T-bet (residuos 138-327) y el dominio represor de la proteína engrailed de Drosophila. La proteína engrailed es un potente y activo represor de la transcripción (Taylor, D., 1966, Genes Dev. 10, 2732; Li, J. H., y col. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10885). La construcción T-bet-proteína engrailed se preparó in vitro usando una construcción de reporte formada por sitio consenso de caja T multimerizado/promotor mínimo de TK/luciferasa. Como se muestra en la Figura 12, la construcción T-bet/proteína engrailed reprime específica y significativamente la capacidad de la T-bet de tipo salvaje para transactivar una construcción de reporte que contiene una caja T, en una proporción 5:1, y no reprime la transactivación de un gen de reporte NFAT o NF\kappaB en construcciones de expresión NAFTp y p65 respectivamente.

Ejemplo 13 Mutaciones en la caja T del promotor de IL-2 disminuyen la actividad del promotor de IL-2

Recientemente, la estructura cristalina de la región con caja T del gen Brachyury unido a DNA se ha esclarecido y se han deducido los restos de aminoácidos esenciales para los contactos específicos con el DNA o para contactos menores. El estudio del promotor proximal de la IL-2 humana y de la IL-2 murina muestra que los nucleótidos críticos para la unión a un miembro de la familia T-box están presentes. En concreto la secuencia de -240 pb a -220 pb del promotor de la IL-2 murina presenta una fuerte similitud con el sitio consenso de la caja T. El sitio consenso de la caja T es: AATTTCA C ACCTAGGT G TGAAATT. El promotor de la IL-2 humana comprende: gAgcTatC A CCTAaG T G TGggcTa. El promotor de la IL-2 murina comprende: AAacTgcC ACCTAaG T G TGggcTa. El promotor de la mIL-2 que tiene la caja T mutada comprende: AAacTgctgtCTAaaca T GgecTa. (Los contactos con el DNA están en negrilla, los contactos menores están subrayados). Las sustituciones de nucleótidos por transversión, que por estudios de la estructura cristalina han demostrado ser esenciales para las interacciones DNA-proteína, se prepararon dentro de este sitio de caja T putativo en el contexto de la secuencia de -440 pb a -40 pb del promotor de la IL-2 murina. Se muestra la actividad del promotor a nivel basal (barras blancas) y la actividad del promotor inducida (barras negras) con PMA (50 ng/ml) más ionomicina (1 \muM) en células Jurkat (a la izquierda) o en el clon AE7 de Th1 (a la derecha), de las construcciones de reporte que contienen IL-2/luciferasa (Figura 13).

El papel de T-bet es dirigir la diferenciación de células Th, según se evidencia por su capacidad para inducir el gen de IFN-\gamma y reprimir el gen de IL-2 simultáneamente. La célula Thp que no ha experimentado todavía estimulación por antígeno produce únicamente IL-2. Después de la estimulación, la producción de IL-2 desciende y es sustituida por la producción de citoquinas efectoras de células Th maduras. En concreto, las células Th2 dejan de fabricar IL-2 a medida que adquieren la capacidad de fabricar IL-4, y la función de T-bet de inducir IFN-\gamma y reprimir IL-2 simultáneamente fue especialmente obvia en células Th2. La capacidad de T-bet para transactivar el promotor de IFN-\gamma y reprimir el promotor de IL-2 simultáneamente, es por lo tanto consistente con un papel de T-bet de impulsar la diferenciación de las células Thp indiferenciadas. Se ha demostrado que T-bet transactiva una construcción que contiene únicamente 3 kb de la secuencia del promotor aguas arriba, lo que está de acuerdo con la presencia de dos sitios con caja T en las posiciones de -2.300 a -2.291 y de -1.957 a -1.948. Sin embargo, debido a que esa región del promotor no es específica para células Th1, es probable que el sitio con caja T presente en el tercer intrón sea también importante y puede haber también sitios con caja T adicionales en otras partes del gen.

El dominio con caja T recientemente se ha cocristalizado con DNA y muestra una nueva arquitectura de reconocimiento de DNA específica de secuencia, en la que la proteína entra en contacto con el DNA en ambos surcos mayor y menor (Müller, C.W. y Herrmann, B.G. 1997, Nature 389, 884-888). El sitio consenso de unión de la caja T, definido mediante selección in vitro de un sitio diana, es un palíndrome 5'-GGGAATTTCACACCTAGGTGTGAAATTCCC-3'. La inspección del promotor de IL-2 revela un sitio excelente con caja T en la secuencia de -240 a -220 inmediatamente en 5' del sitio NF\kappaB al que la proteína T-bet recombinante se une. La unión de T-bet al promotor de IL-2 explica su aislamiento en el escrutinio basado en el sistema de un único híbrido en levaduras en el que la lectura de los resultados dependió simplemente de la unión de T-bet al sitio con caja T del promotor de IL-2 para dirigir un reporte artificial. A pesar de la evidente represión de la actividad del promotor de IL-2 producida por T-bet, se ha observado una disminución en la actividad del promotor de IL-2 después de una mutación en el sitio con caja T. Sin embargo, esa T-bet es todavía capaz de reprimir la transactivación de una construcción que contiene el promotor de IL-2 en la que ese sitio con caja T ha sido mutado. Esto sugiere o bien la presencia de otro sitio con caja T en el promotor de IL-2 o bien una interferencia con otro factor que actúa de manera positiva y que se une a un sitio próximo. Un buen candidato para ser este factor es una actividad descrita por Rothenberg y colaboradores, que se une a un sitio TGGGCC situado inmediatamente al lado del sitio con caja T (Chen, D. y Rothenberg, E.V. 1994. J. Exp Med. 179, 931-942).

Además, T-bet reprime el programa Th2 en células Thp y en células Th2. Esto no es probable que sea el resultado directo de un desequilibrio entre IFN-\gamma e IL-4 a favor del primero de ellos. El efecto de T-bet de reprimir el programa Th2 a la vez que activa simultáneamente el programa Th1, recuerda a GATA-3 y c-Maf, ambos de los cuales reprimen indirectamente la expresión de IFN-\gamma, el primero de ellos a través de influir sobre la expresión de la cadena \beta2 del receptor de IL-12 (Ho, I-C. y col. 1998, J. Exp. Med. 188:1859-1866; Ouyang, W. y col. 1998, Inhibition of Th1 developmental mediated by GATA-3 through an IL-4 independent mechanism. Immunity 9:745-755). Sin embargo, al contrario que GATA-3 y cMaf, T-bet es realmente capaz de dirigir las células Th efectoras totalmente polarizadas hacia la ruta contraria.

Realizaciones equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando simplemente una experimentación de rutina, muchas realizaciones equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita.

<110> Presidente y Miembros del Harvard College

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<120> COMPOSICIONES DE T-BET Y SUS MÉTODOS DE USO

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<130> HUI-040PC

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<140>

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<141>

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<150> USSN 60/137.085

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<151> 02-06-1.999

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1.608

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1.605)

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<400> 1

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2

3

4

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<210> 2

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<211> 535

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

5

6

7

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<210> 3

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<211> 1.593

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1.590)

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<400> 3

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8

9

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<210> 4

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<211> 530

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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12

13

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína T-bet, que es un factor de transcripción específico de Th1 que es capaz de transactivar el gen del interferón gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-gamma y de reprimir la producción de IL-2,

en la que la secuencia de nucleótidos comprende el SEQ ID NO: 1 ó 3, o

en la que la secuencia de nucleótidos se hibrida con la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 en SSC 6X, a 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1%, a 50ºC-65ºC, o

en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 70% con al menos 700 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, o

en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 70% con al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

2. La molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos presenta una identidad de nucleótidos de al menos el 90% con al menos 700 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, o con al menos 500 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido con respecto a la cadena codificadora completa de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, o con respecto a una porción de la cadena codificadora que consiste en 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la región codificadora completa de un mRNA que se transcribe desde un gen que codifica un polipéptido T-bet codificado por una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1.

5. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5, que es un vector de expresión.

7. Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 5 ó 6.

8. Una proteína T-bet aislada que es un factor de transcripción específico de Th1 que es capaz de transactivar el gen del interferón-gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-\gamma y de reprimir la producción de IL-2 y que tiene la capacidad de unirse a DNA,

comprendiendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ó 3, o

presentando dicha proteína una identidad de al menos el 70% con la proteína mostrada en SEQ ID NO: 2 ó 4.

9. La proteína T-bet aislada según la reivindicación 8, que presenta una identidad de al menos el 90% con el SEQ ID NO: 1 ó 3.

10. Una proteína de fusión que comprende una proteína T-bet según la reivindicación 8 ó 9, operativamente ligada a un polipéptido distinto de T-bet.

11. Anticuerpos policlonales o monoclonales que se unen específicamente a una proteína T-bet según cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.

12. Los anticuerpos de la reivindicación 11, que están acoplados a una sustancia detectable.

13. Un método para producir una proteína T-bet según cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 en un medio adecuado hasta que se produce una proteína T-bet.

14. El método de la reivindicación 13, que además comprende aislar la proteína T-bet a partir del medio o de la célula hospedadora.

15. Un método para detectar la presencia de un mRNA de T-bet o de una proteína T-bet en una muestra biológica, mRNA que está codificando, o proteína T-bet que es, un factor de transcripción específico de Th1 según la reivindicación 8, y que es capaz de transactivar el gen del interferón-gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células T primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-gamma y de reprimir la producción de IL-2, que comprende poner en contacto la muestra biológica con una sonda marcada de tipo ácido nucleico o con un anticuerpo marcado de manera que la presencia de T-bet se detecta en la muestra biológica.

16. Un método para identificar un compuesto que estimula o inhibe la expresión o la actividad de una proteína T-bet o de un polipéptido T-bet según cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10, que es capaz de transactivar el gen del interferón gamma, de inducir la producción de interferón-gamma en células primarias transducidas con retrovirus y redirigir células polarizadas Th2 hacia la ruta Th1, de aumentar la producción de interferón-gamma y de reprimir la producción de IL-2, que comprende:

proporcionar una composición indicadora que comprende dicha proteína T-bet o polipéptido T-bet, poner en contacto in vitro la composición indicadora con un compuesto en estudio; y

determinar el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de esa proteína T-bet o de ese polipéptido T-bet en la composición indicadora para identificar de este modo a un compuesto que estimula o inhibe la expresión o la actividad de dicha proteína T-bet o de dicho polipéptido T-bet.

17. El método de la reivindicación 16, en el que:

la composición indicadora comprende dicha proteína T-bet o dicho polipéptido T-bet y una molécula de DNA al que esa proteína T-bet o ese polipéptido T-bet se une; y

el efecto del compuesto en estudio sobre la actividad de esa proteína T-bet o ese polipéptido T-bet se determina evaluando la unión de la proteína T-bet o del polipéptido T-bet a la molécula de DNA en presencia y ausencia del compuesto en estudio.

18. El método de la reivindicación 16, en el que:

la composición indicadora es una célula que comprende dicha proteína T-bet o dicho polipéptido T-bet y un gen de reporte que es sensible a esa proteína T-bet o ese polipéptido T-bet; y

el efecto del compuesto en estudio sobre la expresión o la actividad de esa proteína T-bet o ese polipéptido T-bet se determina evaluando la expresión del gen de reporte en presencia y ausencia del compuesto en estudio.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 16 a 18, que además comprende determinar el efecto del compuesto en estudio sobre una inmunorrespuesta para identificar con ello un compuesto que estimula o inhibe una inmunorrespuesta.

20. El método de la reivindicación 18, en el que la célula es una célula B o una célula Th2.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 18 a 20, en el que la célula expresa un polipéptido T-bet.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 18 a 21, en el que la célula ha sido manipulada por ingeniería genética para que exprese el polipéptido T-bet, introduciendo en la célula un vector de expresión que codifica el polipéptido T-bet.

23. El método de la reivindicación 16 ó 18, en el que la composición indicadora comprende una célula indicadora, en el que la célula indicadora comprende dicho polipéptido T-bet y un gen de reporte que es sensible al polipéptido T-bet.

24. Un animal transgénico no humano que contiene células que portan un transgén que codifica la proteína T-bet codificada por una molécula de ácido nucleico aislada, según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4.