JP4427218B2

JP4427218B2 - Ｔ−ｂｅｔ組成物およびその使用の方法

Info

Publication number: JP4427218B2
Application number: JP2001500765A
Authority: JP
Inventors: グリムシヤー，ローリー・エイチ; スザボ，スーザン・ジエイ
Original assignee: プレジデント・アンド・フエローズ・オブ・ハーバード・カレツジ
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2020-06-01
Also published as: DE60023691D1; DE60023691T2; CA2375050A1; AU5462000A; WO2000073453A9; EP1183355A1; ES2254192T3; ATE308615T1; WO2000073453A1; DK1183355T3; JP2010011856A; EP1183355B1; AU784111B2; JP2003510016A

Description

【０００１】
政府の補助金
ここに記載する本研究は、少なくともその一部分がアメリカ国立衛生研究所により供与された補助金ＡＩ／ＡＧ３７８３３，ＡＩ３９６４６、ＡＩ３６５３５、ＡＲ６−２２２７、ＴＧＡＩ０７２９０により支援された。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する可能性がある。
発明の背景
免疫系の細胞は、細胞外および細胞内シグナルに反応して遺伝子発現のパターンを変化させる。種々の細胞タイプにおいて一連の生物学的活性に影響するサイトカインまたはリンホカインと名付けられたポリペプチドの群は、これらのシグナルの中で最も重要なものに属する。免疫系内の多数の細胞タイプがサイトカインを分泌するけれども、Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球はこれらのポリペプチドの主要な供給源である。１０年以上前に、Ｔｈ細胞は、Ｔ細胞受容体連結（engagement）の際に２種の異なるサブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２に分化し、これらの異なる機能性能力および独自のサイトカインプロフィールにより両者に定義されることが発見された(Paul and Seder, 1994, Cell 76, 241-251; Mosmann and Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Mosmann et al., 1986, J. Immunol. 136, 2348-2357; Snapper and Paul, 1987, Science 236, 944-947) 。Ｔｈ１細胞は遅延タイプ過敏性反応およびマクロファージ活性化を媒介し、一方Ｔｈ２細胞はＢ細胞を支援しそしてアレルギー反応に重要である(Mosmann and Coffman, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173; Paul and Seder, 1994, Cell 76, 241-251; Arthur and Mason, 1986, J. Exp. Med. 163, 774-786; Paliard et al., 1988, J. Immunol. 141, 849-855; Finkelman et al., 1988, J. Immunol. 141, 2335-2341)。Ｔｈ１細胞が細胞−媒介免疫を指令し、一方Ｔｈ２細胞が体液反応に関与するという証拠は、生物体が、病原に反応して細胞媒介または体液反応のいずれかを有する傾向があり、しかし両方ではないという観察に良く適合する。Ｔｈサブセット間のこれらの機能的な相違は、サイトカイン自体の活性により最も容易に説明できる。Ｔｈ１細胞はＩＬ−２、ＴＮＦおよびＬＴも産生するけれども、ＩＦＮ−γがＴｈ１細胞の「特徴(signatute) 」サイトカインである。Ｔｈ２の相当する「特徴」サイトカインはＩＬ−４である。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３も分泌する。
【０００２】
抗原に遭遇すると、ナイーブＣＤ４−Ｔヘルパー前駆体（Ｔｈｐ）細胞は発生プログラムを開始し、最終的にはこれをＴｈ１またはＴｈ２系統に送る。極性化は抗原および同時刺激シグナル、すなわちＴｈｐが受ける「シグナル強さ」を操作して達成できるが(Constant and Bottomly, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15,297-322)、エフェクターＴｈ細胞の最も強力な誘導物質は、疑いなくサイトカイン自体である。ＩＬ−４はＴｈ２分化を促進しそして同時にＴｈ１発生を遮断し、これはＳｔａｔ６信号伝達経路により媒介される作用である。従って、ＩＬ−４またはＳｔａｔ６を欠失するマウスは、Ｔｈ２細胞を発生しない(Kopf et al., 1993, Nature 362,245-248; Kuhn et al. 1991, Science, 254, 707-710, Kaplan et al.1996, Immunity 4, 313-319; Shimoda et al., 1996, Nature 380, 630-633; Takada et al., 1996, Nature 380, 627-630) 。反対に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞発生に重要なサイトカインである(Hsieh et al., 1993, Science 260, 547-549; Okamura et al., 1995, Nature 378, 88-91; Gu et al., 1997, Science 275, 206-209; Meraz et al., 1996, Cell 84, 431-442; Magram et al., 1996, Immunity 4, 471-481)。Ｓｔａｔ１経路を介して作用するＩＦＮ−γ(Meraz et al., 1996, Cell 84, 431-442)、およびＳｔａｔ４信号伝達経路を介して作用するＩＬ−１２(Jacobson et al., 1995,J. Exp. Ned. 181, 1755-61762) は、一緒になってＴｈ１細胞の分化を促進しそしてＴｈ２系統へのコミットメントを遮断する(Szabo et al., 1995, Immunity2, 665-675; Szabo et al., 1997, J. Exp. Med. 185: 817-825)。ＩＬ−１２またはＳｔａｔ４を欠失するマウスは、Ｔｈ１細胞を持っていない(Magram et al., 1996, Immunity 4, 471-481; Takada et al., 1996, Nature 380, 627-630; Shimoda et al., 1996, Nature 380, 630-633) 。別の重要なＴｈ１誘導サイトカインはＩＬ−１８であり、その受容体はＩＬ−１受容体ファミリーに関連する(Cerretti et al., 1992, Science 256, 97-100)。ＩＬ−１８を欠失するマウスは、生体内Ｔｈ１反応を欠き(Takeda et al., 1998, Immunity 8, 383-390)そしてＩＬ−１２およびＩＬ−１８の両者はＩＦＮ−γ発現を調節する(Barbulescu et al., 1998, Eur. J. Immunol., 27, 1098-1107; Robinson et al., 1997, Immunity 7, 571-581; Ahn et al., 1997, J. Immunol. 159, 2125-2131)。従って、これらのサイトカイン自体はＴｈ極性化を駆動する正および負のフィードバック系を形成する(Powrie and Coffman, 1993, Immunol. Today 14,270-274; Scott, 1991,J. Immunol. 147, 3149; Maggie et al., 1992, J. Immunol. 148, 2142; Paronchi et al., 1992, J. Immunol. 149, 2977; Fargeas et al., 1992, Eur. J. Immunol. 149, 2977; Menetti et al., 1993, J. Exp. Med. 177, 1199; Trinchieri, 1993, Immunol Today, 14, 335-338; Macatonia et al., 1993, Immunol. 5, 1119; Seder et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,,10188-10192; Wu et al., 1993, J. Immunol. 151, 1938; Hsieh et al., 1993, Science 260. 547-549)( 総説は、Seder and Paul, 1994, In Annual Review of Immunology, Vol. 12, 635-673; Paul and Seder, 1994, Cell 76, 241-251; O'Garra, 1998, Immunity 8, 275-283)。
【０００３】
最近数年間に、Ｔｈ２細胞へのＴｈ中の転移を制御する転写因子の同定に著しい進歩がなされ、これはＩＬ−４産生を駆動するこのような因子の能力により証明され、下記に概説されている(Glimcher and Singh, 1999 Cell 96, 13-23; Szabo et al., 1997, Current Opinions in Immunology 9, 776-781)。３種の異なるタンパク質、すなわちｃ−Ｍａｆプロト腫瘍遺伝子、転写因子である活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、および新規の核抗原であるＮＦＡＴ−相互作用タンパク質４５ｋＤ（ＮＩＰ４５）の産生が、非−Ｔ細胞に内因性ＩＬ−４産生能力を与えることが証明された(Hodge et al., 1996, Science 274, 1903-1905; Hoet al., 1998, J. Exp. Med. 188:1859-1866) 。これらの因子およびその他、例えばＧＡＴＡ−３(Zheng and Flavell, 1997, Cell 89, 587-596) およびＳｔａｔ６は、明らかにＩＬ−４の産生、従ってＴｈ２細胞の発生を、生体外および生体内の両方で駆動できる。
【０００４】
反対に、Ｔｈ１分化の分子的基礎はほとんど知られていない。例えば、その不在がＴｈ１細胞生成を不能とする既知のわずかな因子は、Ｓｔａｔ４(Thierfelder et al., 1996, Nature 382, 171-174; Kaplan et al., 1996, Nature 382, 174-177) およびＩＲＦ−１(Lohoff et al., 1997, Immunity: 681-689; Taki et al., 1997, Immunity 6: 673-679)であり、これらはいずれもＴｈ１特異性ではない。Ｓｔａｔ４依存の様式でＩＬ−１２中に導入されるＥｔｓファミリーメンバーＥＲＭは、最近Ｔｈ１特異性であると報告されたが、しかしこれはＴｈ１サイトカインの産生に影響しない(Ouyang et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3888) 。Ｓｔａｔ４欠失マウス中のＴｈ１細胞の不在は、Ｔｈ１プログラムを駆動するＩＬ−１２の欠損の結果であり、一方、ＩＲＦ−１欠失マウス中のＴｈ１細胞の欠失は、ＩＬ−１２遺伝子の転写制御における直接の作用によるものであるらしい(Lohoff et al., 1997,, Immunity 6, 681-689; Taki et al., 1997, Immunity 6: 673-679) 。しかし、このような推定Ｔｈ１−特異性調節因子の上流にある信号伝達経路の一部は、解明され始めている。ｐ３８キナーゼは、このような信号伝達分子の一つであり、これはＩＦＮ−γ産生をブーストする構成的活性化ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ６（ＭＫＫ−６）の能力により証明される。反対に、優性陰性(dominant negative) ｐ３８ＭＡＰキナーゼの過剰発現またはＪｎｋ２またはＪｎｋ１の標的破壊は、Ｔｈ１反応を低下する(Rincon et al.,1998, EMBO J. 17, 2817-2829; Yang et al., 1998, Imunity 9, 575-585; Dong et al., 1998, Scicence 282, 2092-2095) 。ＪＮＫ信号伝達経路は、ＩＮＦ−γ遺伝子の転写への直接作用によりＴｈ発生に影響するであろうが、しかしこれは証明されていない。例えば、ＡＴＦ−２およびＡＰ−１転写因子は、両者共にＪＮＫキナーゼの基質でありそしてこれらの因子ならびにＮＦκＢおよびＳｔａｔ４タンパク質はＩＦＮ−γプロモーター内の部位に結合することが知られている(Zhang et al., 1998, Immunol. 161, 6105-6112; Ye et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:4744; Barbulescu et al.,1997, Eur.J.Immunol. 27, 1098-1107; Sica et al.,1997,J.Biol.Chem. 272, 30412-30420)。しかし、ＩＦＮ−γの産生は、ＡＴＦ−２を欠失するマウスでは正常である。サイトカインはＴｈ１およびＴｈ２細胞の発生に重要であり、そして、これにより、免疫反応が主として細胞または体液的であるかの決定において重要なので、Ｔｈ１および／またはＴｈ２サイトカインの産生を調節するための組成物および方法は、免疫反応の調節において、甚大な利益であろう。
【０００５】
【発明の概要】
本発明は、少なくともその一部分は、ナイーブＴヘルパー前駆細胞（Ｔｈｐ）内でＴｈ１表現型を促進するように、Ｔｈ１細胞産生プログラムの開始およびＴｈ２細胞内の対立プログラムの抑制の両方によって作用する新規の組成物の発見に基づく。具体的には、本発明は、Ｔ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子および単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質を提供する。Ｔ−ｂｅｔ（ＴｂｏｘｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＴｃｅｌｌ）は、創始メンバーがｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子である転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーの新しいメンバーである。Ｔ−ｂｅｔは、胸腺細胞およびＴｈ１細胞内で選択的に構成性発現される。Ｔ−ｂｅｔは、インターフェロン−γ遺伝子をトランス活性化し、レトロウイルス的に形質導入された一次Ｔ細胞内でインターフェロン−γ産生を誘導しそして極性化したＴｈ２細胞をＴＨ１経路内に転向することができる、最初のＴｈ１特異性転写因子である。本発明は、これらの新規のＴ−ｂｅｔ組成物の使用方法も提供する。
【０００６】
本発明の一つの態様は、Ｔ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。好ましい態様では、核酸分子は、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含んでなる。他の態様では、核酸分子は、配列番号１の少なくとも約７００の連続したヌクレオチドまたは配列番号３の少なくとも５００の連続したヌクレオチドを含んでなる。好ましい態様では、核酸分子は、配列番号１の少なくとも約７００の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％のヌクレオチド一致または配列番号３の少なくとも５００の連続したヌクレオチドと少なくとも７０％のヌクレオチド一致を有する。
【０００７】
Ｔ−ｂｅｔをコードする本発明の単離された核酸分子は、ベクター、例えば発現ベクター内に組み込むことができ、そしてこのベクターは宿主細胞内に導入できる。本発明は、適当な培地内で本発明の宿主細胞（Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターを有する）をＴ−ｂｅｔタンパク質が産生されるまで培養することによるＴ−ｂｅｔタンパク質を産生する方法も提供する。この方法は、さらに培地または宿主細胞からＴ−ｂｅｔタンパク質の単離を含むことができる。
【０００８】
本発明の別の態様は、単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は配列番号２または４のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様では、タンパク質は少なくとも６０％のアミノ酸一致、少なくとも７０％のアミノ酸一致、さらに好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸一致、その上さらに好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸一致を配列番号１または３記載のアミノ酸配列と有する。
【０００９】
Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチドと操作可能に連結したＴ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる融合タンパク質も本発明に包含され、さらにＴ−ｂｅｔタンパク質を特異的に結合する抗体も包含される。例えば、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。一つの態様では、抗体は検出可能な物質にカプリングしている。
【００１０】
本発明の別の態様は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする導入遺伝子を有する細胞を含む非−ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、生物学的試料内のＴ−ｂｅｔの存在を検出するための方法に関する。この方法は、Ｔ−ｂｅｔの存在が生物学的試料中で検出されるＴ−ｂｅｔ活性の指標を検出する能力がある薬剤と生物学的試料とを接触させることを含む。本発明は、細胞内のＴ−ｂｅｔ活性が調節されるようにＴ−ｂｅｔ活性を調節する薬剤と生物学的試料とを接触させることを含んでなる細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を調節するための方法も提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する化合物を同定するための方法にも関する。このような方法は、一般に
Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を調製し、
指標組成物を供試化合物と接触させ、そして
指標組成物内のＴ−ｂｅｔタンパク質の活性に対する供試化合物の作用を決定し、これによりＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する化合物を同定する
ことを含む。好ましい態様では、指標組成物は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質が結合しそしてＴ−ｂｅｔタンパク質の活性に対する供試化合物の作用が供試化合物の存在または不在におけるＤＮＡ分子へのＴ−ｂｅｔタンパク質の結合を評価して決定されるＴ−ｂｅｔタンパク質およびＤＮＡ分子を含んでなる。さらに他の態様では、指標組成物がＴ−ｂｅｔタンパク質およびＴ−ｂｅｔタンパク質に反応するレポーター遺伝子を含んでなる細胞であり、そしてＴ−ｂｅｔタンパク質の活性に対する供試化合物の作用を、供試化合物の存在および不在におけるレポーター遺伝子の発現を評価することにより決定する。さらに別の態様では、本方法は、免疫反応に対する供試化合物の作用を決定し、これにより免疫反応を調節する化合物を同定する段階をさらに含む。
【００１３】
【発明の詳細な記述】
本発明は、Ｔ−ｂｅｔ組成物、例えばＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子および単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質、ならびにこれらの使用方法に関する。
【００１４】
本発明をさらに容易に理解できるために、一部の用語を最初に定義する。
【００１５】
本明細書中に使用される場合に、用語「Ｔ−ｂｅｔ分子」は、配列番号１および３に記載の核酸分子と構造的特徴を共有するＴ−ｂｅｔ核酸分子および配列番号２および４に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質の特徴的な構造および機能的特徴を共有するＴ−ｂｅｔタンパク質を含む。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、タンパク質のＴ−ｂｏｘファミリーのメンバーでありそしてＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘｌ−６．Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）といくらかのアミノ酸配列相同を共有する。Ｔ−ｂｏｘタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘ結合部位においてＤＮＡに結合するＴ−ｂｏｘドメインを含んでなる。さらにＴ−ｂｅｔタンパク質の構造および機能的特徴は以下に記載する。
【００１６】
本明細書中に使用される場合に、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を含むと考える。核酸分子は、一本鎖状または二本鎖状でもよいが、しかし好ましくは二本鎖状ＤＮＡである。
【００１７】
本明細書中に使用される場合に、「単離された核酸分子」は、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の核酸に本来的に近接する遺伝子配列（すなわち、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の単離された核分子に対する遺伝子に近接して位置する遺伝子配列）を含まない核酸分子を呼ぶ。例えば、種々の態様において、単離されたＴ−ｂｅｔ核酸分子は、代表的には、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に本来的に近接するヌクレオチド配列の約１０ｋｂ以下を含み、そしてさらに好ましくは、本来的に近接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ以下を含む。しかし、「単離された」Ｔ−ｂｅｔ核酸分子は、ゲノムＤＮＡ内のＴ−ｂｅｔ配列に正常では近接しない他のヌクレオチド配列に連結してもよい（例えば、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列はベクター配列に連結してもよい）。ある好ましい態様では、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞物質を含まなくてもよい。しかし、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子が「単離された」と考えられるために他の細胞物質を含まないという必要はない（例えば、他の哺乳類から分離されそして細菌細胞内に挿入されたＴ−ｂｅｔＤＮＡ分子は、まだ「単離された」と考えられる）。
【００１８】
本明細書中に使用される場合に、用語「高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、たがいに本質的な相同性（例えば代表的には７０％相同以上）を有するヌクレオチド配列がたがいに安定してハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図する。高いストリンジェンシー条件の好ましいが制限的ではない例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＳＣ）中、温度約４５℃で数時間から一晩ハイブリダイゼーションし、次いで０．２Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液中、温度約５０〜６５℃での１回またはそれ以上の洗浄である。
【００１９】
用語「パーセント（％）一致」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の範囲内で使用された場合（例えば、一つのアミノ酸配列が他のアミノ酸配列にＸ％一致である場合）に、最適に配列される場合に２個の配列の間で共有する一致した残基の百分率を呼ぶ。２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致百分率を決定するために、配列を最適比較の目的で整列する（例えば一つの配列を他の配列と最適に整列するために間隙を挿入してもよい）。次いで、相当する位置にある残基を比較しそして一方の配列内の位置が他の配列の相当する位置に相当して同じ残基で占められている場合に、分子はその位置で一致する。従って、２個の配列の間の一致百分率は、２個の配列が共有する一致した位置の数の関数である（すなわち、％一致＝（一致した位置の数／位置の全数）ｘ１００）。
【００２０】
当該技術分野で公知のコンピューターアルゴリズムは、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を最適に整列しそして比較して、２個の配列間の一致百分率を決定するために使用できる。２個の配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの好ましいが制限的ではない例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、変更はKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。比較のためにギャップ入りの整列を得るためには、ギャップ入りＢＬＡＳＴがAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびギャップ入りＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合に、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov 参照。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティーをexistance 5 およびextension 2 に設定したデフォールトBlastin マトリックス１−３を使用してＢＬＡＳＴ処理した。本発明のアミノ酸配列は、下記のデフォールト設定を用いてＢＬＡＳＴ処理した：ギャップペナルティーをexistance 11およびextension 1 に設定したBlosum62マトリックス。
【００２１】
配列の比較のために使用した数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合には、ＰＡＭ１２ weight residue table 、gap length penalty１２およびgap penalty ４が使用できる。配列比較のために複数のプログラムを使用する場合には、最適の整列（例えば２個の配列間の最高の一致パーセント）を与えるプログラムが比較の目的で使用される。
【００２２】
本明細書中に使用される場合に、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を呼ぶ（例えば天然タンパク質をコードする）。
【００２３】
本明細書中に使用される場合に、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的または遺伝子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。
【００２４】
本明細書中に使用される場合に、用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を呼び、一方用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を呼ぶ（例えば５’および３’非翻訳領域）。
【００２５】
本明細書中に使用される場合に、用語「ベクター」は、これが連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を呼ぶ。ベクターの一つのタイプは、「プラスミド」であり、これはその中に別のＤＮＡセグメントが連結してもよい環状二本鎖ＤＮＡループを呼ぶ。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは別のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム内に連結されてもよい。ある種のベクターは、これが導入された宿主細胞内で自律複製ができる（例えば複製の細菌起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非−エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてこれにより宿主ゲノムと同時に複製される。さらに、一部のベクターは、これらが操作可能に連結している遺伝子の発現を指令できる。このようなベクターは、本明細書中では「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用されるが、それはプラスミドがベクターの最も普通に使用される形であるからである。しかし、本発明は、同等の機能に役立つ発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠失レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）のような他の形も含むと考える。
【００２６】
本明細書中に使用される場合に、用語「宿主細胞」は、本発明の核酸、例えば本発明の組換え発現ベクターが導入された細胞を呼ぶと考える。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では交換可能に使用される。このような用語は、特定の細胞タイプを呼ぶだけでなく、このような細胞の後代または可能な後代も呼ぶと考える。ある種の変化は、突然変異または環境の影響により後続世代に起きるであろうから、このような後代は実際には親細胞と同等ではないが、しかし本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれる。
【００２７】
本明細書中に使用される場合に、「トランスジェニック動物」は、動物の１個またはそれ以上の細胞が「導入遺伝子」を含む非−ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを呼ぶ。用語「導入遺伝子」は、これからトランスジェニック動物が発生しそして成熟動物のゲノム内に残る細胞のゲノム内に組み込まれる外因性ＤＮＡを呼び、例えばトランスジェニック動物の１個またはそれ以上の細胞タイプまたは組織内にコードされた遺伝子産物の発現を指令する。
【００２８】
本明細書中に使用される場合に、「相同組換え動物」は、動物の発生に先立って、外因性遺伝子が、その中で外因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同性組換えにより改変されているトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスのタイプを呼ぶ。
【００２９】
本明細書中に使用される場合に、「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるかまたは組換えＤＮＡ技術により産生された場合に他のタンパク質、細胞物質および培地、または化学的に合成された場合に化学的前駆体または他の化学物質を本質的に含まないタンパク質を呼ぶ。
【００３０】
本明細書中に使用される場合に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子を含むと考え、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ 断片である。本明細書中に使用される場合に、用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集団を呼び、一方「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用可能な抗原結合部位の複数の種類を含む抗体分子の集団を呼ぶ。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を示す。
【００３１】
特定のタンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質をコードできるヌクレオチド配列との間には既知で一定の相関があり、これは遺伝暗号により定義される（以下に記載する）。同様に、特定の核酸分子のヌクレオチド配列と、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列との間にも遺伝暗号により規定される既知で一定の相関がある。
遺伝暗号
アラニン（Ａｌａ，Ａ）ＣＧＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）ＡＧＡ，ＡＣＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，
ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）ＡＡＣ，ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）ＧＡＣ，ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）ＴＧＣ，ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）ＧＡＡ，ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）ＣＡＡ．ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）ＣＡＣ，ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）ＡＴＡ，ＡＴＣ，ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）ＣＴＡ．ＣＴＣ，ＣＴＧ，ＣＴＴ，ＴＴＡ．
ＴＴＧ
リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）ＡＡＡ，ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）ＴＴＣ，ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）ＡＧＣ，ＡＧＴ，ＴＣＡ，ＴＣＣ，ＴＣＧ，
ＴＣＴ
トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｖ）ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）ＴＡＣ，ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ，Ｖ）ＧＴＡ，ＧＴＣ，ＧＴＧ，ＧＴＴ
終止シグナル（末端）ＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡ
遺伝暗号の重要で周知の特徴は、その重複性であり、これによりタンパク質を構成する大部分のアミノ酸に対して、１個を越えるコーディングヌクレオチドトリプレットを使用してもよい（以上に記載）。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が一つの与えられたアミノ酸配列に対してコードできる。このようなヌクレオチド配列は、機能的に等価と考えられ、それはこれらがすべての生物体内で同じアミノ酸配列の産生をもたらすからである（しかし、一部の生物体は、ある種の配列が他のものに対するより一層迅速に翻訳できる）。さらに、場合により、プリンまたはピリミジンのメチル化変種が、与えられたヌクレオチド配列内に見いだされてもよい。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと相当するアミノ酸との間のコーディング関係に影響しない。
【００３２】
以上を考慮して、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質（またはそのいかなる部分でも）に対してコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列に翻訳する遺伝暗号を用いてＴ−ｂｅｔアミノ酸配列を誘導するために使用できる。同様に、あらゆるＴ−ｂｅｔアミノ酸配列に対して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードできる相当するヌクレオチド配列が遺伝暗号から誘導できる（しかしその重複性により、これは与えられたアミノ酸配列に対して複数の核酸配列を生成する）。従って、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列に関する本明細書中での記述および／または開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記述および／または開示とも考えられるべきである。同様に、本明細書中のＴ−ｂｅｔアミノ酸配列の記述および／または開示は、アミノ酸配列をコードできるすべての可能なヌクレオチド配列の記述および／または開示とも考えるべきである。
【００３３】
ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＴは、Ｔ−ｂｏｘと呼ばれる２００アミノ酸ＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子のファミリーの創始メンバーである（総説は、(Smith, 1997; Papaioannou, 1997; Meisler, 1997中) 。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短尾」のギリシャ語）突然変異は、短くて少しねじれた尾を持った異型接合変異動物内で、１９２７年に最初に記載された(Herrmann et al., 1990) 。ＢｒａｃｈｙｕｒｙＴ−ｂｏｘタンパク質のアミノ−末端の半分（アミノ酸１〜２２９）は、配列特異性ＤＮＡ結合活性を示すことが知られているＴ−ｂｏｘとして知られる保存ドメインを含む(Kispert, A. & Herrmann, B.G. 1993, EMBO J. 12:3211; Papapetrou, C., et al. 1997, FEBS Lett. 409:201; Kispert. A., etal., 1995, EMBO J. 14:4763) 。Ｃ−末端の半分は、トランス活性化および抑制ドメインの２対を含む。オルソログ種内のＴ−ｂｏｘ領域の間の配列の類似性は、９９％と高くそして非オルソログ遺伝子間では４０〜７０％である。Ｔ−ｂｏｘ領域は最近ＤＮＡと同時結晶化され、そしてタンパク質がＤＮＡと大溝(major groove)および小溝(minor groove)内の両方で接触する新規の配列特異性ＤＮＡ認識構造を証明する(Mueller, C.W. & Herrmann, B.G., 1997, Nature 389, 884) 。
【００３４】
酵母ワンハイブリッド(yeast one hybrid)法を、Ｔｈ−１特異性転写因子を同定するために使用した。酵母細胞は、ＩＬ−２プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するように作製されそして抗−ＣＤ３活性化Ｔｈ１細胞クローンから作製されたｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換された。ＩＬ−２プロモーターの検査は、ＮＦκＢ部位の５’−２４０−２２０丁度の優れたＴ−ｂｏｘ結合部位を明らかにした。後記の実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターを結合する能力に基づいて酵母ワンハイブリッドスクリーニングアッセイで単離された。
【００３５】
ネズミ(murine)Ｔ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列を配列番号３に示す。ネズミＴ−ｂｅｔは５３０アミノ酸タンパク質であり、その１９０アミノ酸のＴ−ｂｏｘドメインは残基１３６−３２６に位置する。ネズミＴ−ｂｅｔのアミノ酸配列を配列番号４に示す。ネズミＴ−ｂｅｔ配列を本明細書中の記載のようにクローンした後、いままでどの既知のタンパク質をコードするか知られていなかった核酸断片からＴ−ｂｅｔのヒトオルソログの配列を編集できた。ヒトＴ−ｂｅｔのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ヒトＴ−ｂｅｔは、５３５アミノ酸タンパク質で、その１９０アミノ酸Ｔ−ｂｏｘドメインは残基１３８−３２７に位置する。ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子は、染色体１７に位置決定されている。タンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーの２メンバー（ヒトおよびマウス）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１および配列番号１〜４に示す。
【００３６】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘタンパク質と相同性を有する。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含まないマウス中に８種のＴ−ｂｏｘ遺伝子が存在する。これらは、Ｔｂｘ１〜６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）およびいまやＴ−ｂｅｔを含み、それぞれ明確で通常は複雑な発現パターンを有する。例えば、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１発現は、大部分が大脳皮質内の明確なドメインに限定される(Bulfone, A. et al., 1995, Neuron 15, 63) 。Ｔ−ｂｅｔはＴｂｒ−１の配列に最も類似している。Ｔ−ｂｏｘの外で、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は他のＴ−ｂｏｘタンパク質と一致性を有していない。
【００３７】
Ｔ−ｂｅｔは、Ｔ細胞内のみで発現されるＴ−ｂｏｘタンパク質であり、そしてＴｂｒ−１に配列が最も類似している。他の種もＢｒａｃｈｙｕｒｙ様の遺伝子を発現する。このような脊椎動物種は、ゼノプス(Xenopus) 、ミノカサゴ(Zebrafish)、ヒヨコおよびヒトであり(Rao, 1994; Horb and Thomsen, 1997; Conlon et al., 1996; Ryan et al., 1996; Schulte-Merker et al., 1994; Edwards et al., 1996; Morrison et al., 1996; Law et al., 1995; Cambell et al., 1998) ならびにさらに遠位の種、例えばナメクジウオ(amphioxus) 、ホヤ(ascidians）、キョク皮動物(echinoderm)、Ｃ．エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ショウジョウバエ(drosophila)などの昆虫である(Holland et al., 1995)。これらの遺伝子は配列でも発現パターンでも保存されている。
【００３８】
Ｔ−ｂｅｔはチロシンリン酸化で唯一のＴ−ｂｏｘタンパク質として特異である。２個の共通チロシンリン酸化部位がヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸３２８−３３６および５２６−５３４およびネズミＴ−ｂｅｔの３２７−３３５および５２１−５２９に存在する。核局在化配列は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８−５０１およびネズミＴ−ｂｅｔの４９３−４９６にも存在する。地図作製実験は、２個のトランス活性化部位、すなわちＴ−ｂｏｘドメインの一方は５’、他方は３’に位置決定した。ここに記載したデータは、Ｔ−ｂｅｔが共通Ｔ−ｂｏｘ部位に（生体外標的部位選択により、５’−ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣ−３’と決定）およびＩＬ−２プロモーター内のＴ−ｂｏｘ部位に結合することを証明する。Ｔ−ｂｅｔは胸腺内および末梢リンパ系内にのみ発現する。末梢系においてＴ−ｂｅｔはＴｈ１細胞内のみに発現され、ここでこれはＴｃＲ刺激およびＩＬ−１２の両方に反応して誘導される。胸腺内においてＴ−ｂｅｔのレベルは、ＤＮおよびｒａｇ２−／−胸腺細胞内で最高である。
【００３９】
これらのデータは、新規のＴ−ｂｏｘファミリーメンバーであるＴ−ｂｅｔの組織特異性ＩＦＮ−γ発現の原因となる選択的発現を証明する。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１内でのみ発現されＴｈ２細胞内では発現されず、そしてＴ細胞受容体を介するシグナルの伝達に応じて前者内で誘導される。Ｔ−ｂｅｔの発現は、Ｔｈ１細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞中のＩＦＮ−γ発現と相関し、そしてＴ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ遺伝子の有力なトランス活性化剤である。最ももっともらしいのは、Ｔ−ｂｅｔを用いるＴｈｐ、Ｔｈ１および極性化Ｔｈ２およびＴｃ２細胞のレトロウイルス媒介形質導入が、ＩＦＮ−γ発現の印象的な誘導をもたらすことである。これは、ＩＬ−２およびＩＬ−４産生の両方の抑制により達成される。従って、Ｔ−ｂｅｔの機能は、ＩＦＮ−γ遺伝子転写の単なる制御を越えて延びる。Ｔ−ｂｅｔは極性化エフェクターＴｈ２細胞および極性化Ｔｃ２細胞をそれぞれ対立する１およびＴｃ１サブセットへ変換する。総合して考えると、これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔがナイーブＴｈｐ細胞からのＴｈ１系統発生を開始する発生プログラムに関与し、そしてＴｈ１発生プログラムの開始によりそしてＴｈ２細胞内の対立プログラムを抑制することの両方により作用することを証明する。
【００４０】
本発明の種々の態様をさらに詳細に以下の章に記述する。
１．単離された核酸分子
本発明の一つの態様は、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸分子の単離に関する。好ましい態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１の連続したヌクレオチドを少なくとも約７００個または配列番号３の連続したヌクレオチドを少なくとも約５００個を含んでなる。好ましい態様では、本発明の核酸分子は、配列番号１の連続したヌクレオチド少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００または少なくとも約１６００個を含んでなる。別の好ましい態様では、本発明の核酸分子は、配列番号３の連続したヌクレオチド少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００または少なくとも約１４００個を含んでなる。
【００４１】
他の態様では、核酸分子は、配列番号１の連続したヌクレオチド少なくとも７００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００または少なくとも約１６００個を含んでなる核酸分子と、少なくとも７０％一致、さらに好ましくは８０％一致、そしてその上さらに好ましくは９０％ヌクレオチド一致を有する。別の態様では、核酸分子は、配列番号３の連続したヌクレオチド少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００または少なくとも約１４００個を含んでなる核酸分子と、少なくとも７０％一致、さらに好ましくは８０％一致、そしてその上さらに好ましくは９０％ヌクレオチド一致を有する。
【００４２】
遺伝暗号の縮重により配列番号１または３とは異り、従って配列番号１または３によりコードされると同じＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は、本発明に包含される。従って、別の態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００４３】
さらに、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は、標準の分子生物学技術および本明細書中に提供する配列情報を用いて、他の起原から単離できる。例えばＴ−ｂｅｔＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１または３の全体または一部分、および標準ハイブリダイゼーション技術（例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY, 1989) を用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離できる。さらに、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の全体または一部分を包含する核酸分子は、配列番号１または３の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により単離できる。例えばｍＲＮＡは細胞から単離でき（例えばChirgwin et al (1979) Biochemistry 18: 5294-5299のグアニジウム- チオシアナート抽出法により) 、そしてｃＤＮＡは、逆転写酵素（例えば、Gibco/BRL, Betheda, MDから入手できるMoloney MLV 逆転写酵素; またはSeikagaku America Inc., St. Petersburg, FLから入手できるAMV 逆転写酵素）を用いて調製できる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１または３記載のヌクレオチド配列に基づいて設計できる。本発明の核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型としておよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、標準ＰＣＲ増幅技術に従って増幅できる。このようにして増幅した核酸は、適当なベクター内にクローンできそしてＤＮＡ配列決定分析により特性試験ができる。さらに、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準の合成技術、例えば自動化ＤＮＡ合成装置により調製できる。
【００４４】
配列番号１および３記載のＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に加えて、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチドまたはアミノ酸配列に小さい変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団内に存在してもよいことは当該技術分野の熟練者により認められる。このようなＴ−ｂｅｔ遺伝子内の遺伝多型は、自然の対立遺伝子変動により集団内の個体間に存在してもよい。このような自然の対立遺伝子変動は遺伝子のヌクレオチド配列内に代表的には１〜２％の変動をもたらす。このようなヌクレオチド変動の結果でありそしてＴ−ｂｅｔの機能的活性を変更しないＴ−ｂｅｔ内のこのようなヌクレオチド変動およびその結果であるアミノ酸多型のいずれもまたすべてが、本発明の範囲内に入ると考える。
【００４５】
本発明のＴ−ｂｅｔＤＮＡの天然対立遺伝子変種に相当する核酸分子は、ヒトＤＮＡ、またはその一部分を、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下の標準ハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書中に開示するＴ−ｂｅｔ核酸分子へのこれらの相同性に基づいて単離できる。従って、別の態様では、本発明の単離された核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子にハイブリダイズする。好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１または３の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子である。一つの態様では、このような核酸分子は、長さが少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００または１６００ヌクレオチドである。他の態様では、このような核酸分子は、配列番号１の連続したヌクレオチド少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００または１６００個、または配列番号３の連続したヌクレオチド少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００個を含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子は、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子の天然に存在する対立遺伝子変種に相当する。
【００４６】
集団内に存在してもよいＴ−ｂｅｔ配列の天然に存在する対立遺伝子変種に加えて、熟練者は、配列番号１または３のヌクレオチド配列内へ突然変異により小さい変化が導入され、これによりＴ−ｂｅｔタンパク質の機能的活性を変化することなくコードするタンパク質のアミノ酸配列内に変化をもたらしてもよいことをさらに認めるであろう。例えば、「非−必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換は、配列番号１または３内で起きてもよい。「非−必須」アミノ酸残基は、Ｔ−ｂｅｔの機能的活性、例えばＤＮＡと相互作用するその能力またはＩＦＮ−γプロモーターからの転写を促進するその能力を変化することなく、Ｔ−ｂｅｔの野生型配列（例えば配列番号１または３の配列）から変化され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸は残基は、機能的活性のために必要である。
【００４７】
従って、本発明の他の態様は、Ｔ−ｂｅｔ活性に必須でないアミノ酸残基内に変化を含むＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＴ−ｂｅｔタンパク質は、配列番号２または４からのアミノ酸配列とは異なるがしかしＴ−ｂｅｔ活性は保持する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の非−天然変種をコードする単離された核酸分子は、配列番号１または３のヌクレオチド配列内への１個またはそれ以上のヌクレオチド置換の導入、付加または除去により創成され、例えば１個またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または除去はコードされたタンパク質内への導入される。突然変異は、標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−媒介変異誘発により配列番号１または３内に導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１個またはそれ以上の非−必須アミノ酸残基に行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基により置換されることである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野では規定されており、これには塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、Ｔ−ｂｅｔ内の非−必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリー内の他のアミノ酸残基により置換される。
【００４８】
あるいは、別の態様では、突然変異は、Ｔ−ｂｅｔコード領域の全体または一部分に沿ってランダムに、例えば飽和変異誘発により導入でき、そしてもたらされた変異体は、機能的活性を保持している変異体を同定するために、ＤＮＡおよび／または活性転写体へ結合するその能力に関してスクリーニングできる。変異誘発に続き、コードされたＴ−ｂｅｔ変異タンパク質は宿主細胞内に組換え的に発現でき、そして変異タンパク質の機能的活性は、Ｔ−ｂｅｔ活性をアッセイするための当該技術分野で利用できるアッセイを用いて決定できる（例えばＤＮＡ中に存在するＴ−ｂｏｘ結合要素へ結合するタンパク質の能力の測定により、またはＴ細胞内のＴｈ１またはＴｈ２表現型を調節するタンパク質の能力を測定することによる）。
【００４９】
本発明の別の態様は、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡまたは遺伝子のコーディング鎖に対してアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸は、全Ｔ−ｂｅｔコーディング鎖に対して、またはその一部分に対してのみ相補的であることができる。一つの態様では、アンチセンス核酸分子は、タンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかまたは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特である、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸配列のコーディング鎖のコード領域に対してアンチセンスである。別の態様では、アンチセンス核酸分子は、タンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかまたは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特である、Ｔ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コード領域に対してアンチセンスである。好ましい態様では、本発明のアンチセンス分子は、配列番号１の非コーディング鎖の連続したヌクレオチドを少なくとも約７００個、さらに好ましくは、配列番号１の非コーディング鎖の連続したヌクレオチドの少なくとも８００、１０００、１２００、１４００、または１６００個、または配列番号３の非コーディング鎖の連続したヌクレオチドを少なくとも約５００個、さらに好ましくは、配列番号３の非コーディング鎖の連続したヌクレオチドを少なくとも６００、８００、１０００、１２００、または１４００個を含んでなる。
【００５０】
本明細書中で開示するＴ−ｂｅｔをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１および３）を与えると、本発明のアンチセンス核酸は、WatsonおよびCrick の塩基対規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、Ｔ−ｂｅｔ
ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であってもよく、あるいはＴ−ｂｅｔｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることもできる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば長さ約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野では公知の方法を用いて化学合成および酵素連結反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを用いて化学的に合成でき、または分子の生物学的安定性を増加するためまたはアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加するために設計された種々の変性ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。あるいは、アンチセンス核酸は、その中に核酸がアンチセンス方向にサブクローンされている発現ベクターを用いて生物学的に産生できる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、関係する標的核酸にアンチセンス方向であり、これは以下にさらに記述する）。
【００５１】
他の態様では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸、例えばこれらが相補領域を有するｍＲＮＡを開裂できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。Ｔ−ｂｅｔ−コード化核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示するＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナ(Tetrahymena)Ｌ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体は、活性部位の塩基配列がＴ−ｂｅｔをコードするｍＲＮＡ内の開裂される塩基配列に相補的であるものの中で構築できる。例えば、Cech et al., 米国特許（ＵＳ）第４，９８７，０７１号およびCech et al.,米国特許（ＵＳ）第５，１１６，７４２号参照。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ
ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールからの特異性リボヌクレアーゼ活性を有する触媒生ＲＮＡを選択するために使用できる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J.W.,(1993) Scicence 261:1411-1418参照。
【００５２】
本発明のさらに別の態様は、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。非−Ｔ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列に操作可能に連結するＴ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする少なくとも１個の第一ヌクレオチド配列を含んでなるこのような核酸分子は、標準の組換えＤＮＡ技術により調製できる。Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質は、以下のサブセクションＩＩＩ中にさらに記述される。
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、Ｔ−ｂｅｔ（またはその一部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現に適する形にある本発明の核酸を含んでなり、これは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に操作可能に連結する１個またはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結」とは、関係するヌクレオチド配列が、調節配列に対してヌクレオチド配列の発現を許容する様式で連結していることを意味すると考える（例えば、生体外転写／翻訳系内またはベクターが宿主細胞内に導入された場合の宿主細胞内）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。このような調節配列は、例えばGoeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990) 中に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびある種の宿主細胞内のみでヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば組織特異性調節配列）を含む。当該技術分野の熟練者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存することを認めるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、これにより本明細書に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生する（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の変異形、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質など）。
【００５３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中のＴ−ｂｅｔタンパク質の発現のために設計できる。例えば、Ｔ−ｂｅｔは、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用い）、酵母細胞または哺乳類細胞内に発現できる。適当な宿主細胞は、Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990) 中にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて生体外で転写および翻訳してもよい。
【００５４】
原核生物内のタンパク質の発現は、大腸菌内で、融合または非−融合タンパク質のいずれかの発現を指令する構成的または誘導的プロモーターを含むベクターを用いて最もしばしば行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に多数のアミノ酸を、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。このような融合ベクターは、１種またはそれ以上の目的に役立つことができる。１）組換えタンパク質の発現を増加するため、２）組換えタンパク質の溶解度を上昇するため、３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を支援するため、４）タンパク質の検出および／または精製を支援するためのエピトープタグを提供するため、および／または５）タンパク質の検出を支援するためのマーカーを提供するため（例えばβ−ガラクトシダーゼ融合を用いるカラーマーカー）。しばしば、融合発現ベクター中で、タンパク質分解開裂部位が融合部分の結合部に導入されそして融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質に融合部分から組換えタンパク質の分裂を可能とさせる。このような酵素、およびこれらの同起原の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johonson, K.S.(1988) Gene 67:31-40) 、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)およびｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ) を含み、これらはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質にそれぞれ融合する。組換えタンパク質は、真核細胞内にも上記と同じ目的で融合タンパク質として発現できる。
【００５５】
適当な誘導可能な非−融合大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ(Amann et al.,(1988) Gene 69:301-315) およびｐＥＴ１１ｄ(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-85) を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下のＴ７ｇｎ１遺伝子を内包する常在性λプロファージからの宿主系列ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により提供される。
【００５６】
大腸菌内の組換えタンパク質発現を最大化するための一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に開裂することに損傷された能力を有する宿主細胞内のタンパク質を発現することである(Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990) 119-128) 。別の戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンが大腸菌内に優先的に使用されるものであるように、発現ベクター内に挿入される核酸の核酸配列を変更することである(Wada et al.,(1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118) 。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準のＤＮＡ合成技術により実行できる。
【００５７】
別の態様では、Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セリビシエ(S. Cerivisae)内の発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１(Baldari et al.,(1987) EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultz et al.,(1987) Gene 54:113-123) およびｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, CA) を含む。
【００５８】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔはバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内に発現できる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）内のタンパク質の発現のために利用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ(Smith et al.,(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow, V.A., and Summers, M.D.,(1989) Virology 170:31-39)を含む。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例は、ｐＭｅｘ−Ｎｅｏｌ．ｐＣＤＭ８(Seed, B.,(1987) Nature 329:840 およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman et al.,(1987) EMBO J. 6:187-195) を含む。哺乳類細胞内に使用された場合に、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス調節要素により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。
【００６０】
他の態様では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプ内に優先的に核酸の発現を指令する能力がある（例えば組織特異性調節要素が、核酸を発現するために使用される）。組織特異性調節要素は、当該技術分野で公知である。適当な組織特異性プロモーターの非制限的な例は、リンパ系特異性プロモーター(Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、特にはＴ細胞受容体(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) および免疫グロブリン(Banerji et al.,(1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)アルブミンプロモーター（肝臓特異性;Pinkert et al.(1987) Genes Dev. 1: 268-277)、ニューロン特異性プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異性プロモーター(Edlund et al.,(1985) Science 230: 912-916) 、および乳腺特異性プロモーター（例えば乳漿プロモーター、米国特許（ＩＳ）第4,873,316 号および欧州特許出願公開第264,166 号) を含む。発生的に調節されるプロモーター、例えばネズミｈｏｘプロモーター(Kessel and Guss (1990) Science 249:374-379)およびα- フェトタンパク質プロモーター(Campes and Tilghman (1989) Gene Dev. 3:537-546)も包含される。
【００６１】
さらに、哺乳類細胞に使用するための誘導性調節系が、当該技術分野に公知であり、例えば遺伝子発現が重金属イオンにより調節される系（例えばMayo et al(1989) Cell 29:99-108; Brinster et al (1982) Nature 296: 39-42; Searle et al (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1480-1489 参照）、熱ショック（例えばNour et al.,(1991) in Heat Shock Response, e.d. Nour, L., CRC. Boca Raton, FL. pp167-220参照）、ホルモン（例えばLee et al.,(1981) Nature 294, 228-232; Haynes et al.(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042; Klock et al.,(1987) Nature 329: 734-736; Israel & Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604; およびPCT 公開番号ＷO93/23431 号参照）、ＦＫ５０６−関連分子（例えばPCT 公開番号ＷO94/18317 号参照）またはテトラサイクリン(Gossen, M. and Bujard, H.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M.et al.,(1995) Science 268:1766-1769; PCT公開番号 WO 94/29442号および PCT公開番号ＷO96/01313 号）がある。従って、別の態様では、本発明はＴ−ｂｅｔＤＮＡが誘導可能な真核プロモーターに操作可能に連結し、これにより真核細胞内のＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を誘導可能に発現させる組換え発現ベクターを提供する。
【００６２】
本発明は、さらにアンチセンス方向に発現ベクター内にクローンされた本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能とする様式で調節配列に操作可能に連結している。アンチセンス方向にクローンされた核酸に操作可能に連結する調節配列は、種々の細胞タイプ内のアンチセンスＲＮＡ、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーの連続発現を指令するように選択でき、または調節配列は、構成的、組織特異的または細胞タイプ特異的なアンチセンスＲＮＡ発現を指令するように選択できる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファジェミド(phagemid)または弱毒化ウイルスの形であることができ、その中でアンチセンス核酸は高効率調節領域の制御下で産生され、その活性はベクターが導入される細胞タイプにより決定できる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の考察に関しては、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1)1986 参照。
【００６３】
本発明の別の態様は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入された組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核または真核細胞であることができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）内で発現されてもよい。その他の適当な宿主細胞は、当該技術分野の熟練者には公知である。ベクターＤＮＡは、原核または真核細胞内に、慣用の形質転換またはトランスフェクション技術を利用して導入できる。本明細書中に使用する場合に、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞内への外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野で認められた各種の技術を呼び、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする適当な方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 、およびその他の実験用マニュアル内に見いだすことができる。
【００６４】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小さい部分だけがそのゲノム内に外来ＤＮＡを組み込んでもよいことが知られている。これらの組込物を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗体への抵抗性）をコードする遺伝子を一般に宿主細胞内に、関係する遺伝子と同時に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートに抵抗性を与えるものを含む。選択可能マーカーをコードする核酸は、Ｔ−ｂｅｔをコードするものと同じベクターで宿主細胞内に導入してもよくまたは別のベクターで導入してもよい。導入された核酸を用いて安定にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択により同定できる（例えば選択可能なマーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する）。
【００６５】
培養物内の本発明の宿主細胞、例えば原核または真核宿主細胞は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を産生（即ち発現）するために使用できる。従って、本発明は、さらに本発明の宿主細胞を用いるＴ−ｂｅｔタンパク質発現のための方法も提供する。一つの態様では、この方法は、Ｔ−ｂｅｔが産生されるまで適当な培地内で本発明の宿主細胞（その中にＴ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養することを含んでなる。別の態様では、本発明方法は、さらに培地または宿主細胞からＴ−ｂｅｔを単離することを含んでなる。その本来の形で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は細胞内タンパク質であり、従って、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は組換え宿主細胞内で細胞内的に発現でき、次いで例えば宿主細胞を溶解、そして溶解物から組換えＴ−ｂｅｔタンパク質を回収して宿主細胞から単離される。あるいは、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は、非相同シグナル配列をタンパク質のアミノ末端に、タンパク質が宿主細胞から分泌されるように操作可能に連結して細胞外タンパク質として調製できる。この場合に、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は、細胞が培養された培地から回収できる。
【００６６】
本発明のある種の宿主細胞は、非−ヒトトランスジェニック動物を作製するためにも使用できる。例えば、一つの態様では、本発明の宿主細胞は、Ｔ−ｂｅｔコード配列が導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である。従って、このような宿主細胞は、外因性Ｔ−ｂｅｔ配列がそのゲノム内に導入された非−ヒトトランスジェニック動物または内因性Ｔ−ｂｅｔ配列が改変された相同組換え動物を創成するために使用できる。このような動物は、Ｔ−ｂｅｔの機能および／または活性の研究のためおよびＴ−ｂｅｔ活性のモジュレーターの同定または評価のために有用である。従って、本発明の別の態様は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質またはＴ−ｂｅｔタンパク質の一部分をコードする導入遺伝子を有する細胞を含む非−ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物に関する従属態様では、導入遺伝子は内因性Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする内因性遺伝子を改変する（例えば内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊または「ノックアウト」されたか、または内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列が突然変異したかまたは内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の転写調節領域が改変された相同組換え動物）。
【００６７】
本発明のトランスジェニック動物は、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸を受精した卵母細胞のオス前核内に、例えばマイクロ注入により導入し、そして卵母細胞を擬妊娠メス養育動物内に発生させて創成できる。配列番号１または３のＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列は、導入遺伝子として非−ヒト動物のゲノム内に導入できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子内に含めて導入遺伝子の発現の効率を高くするために含めることができる。組織特異性調節配列は、Ｔ−ｂｅｔ導入遺伝子に操作可能に連結して、特定の細胞にＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を指令することができる。胚操作およびマイクロ注入を介するトランスジェニック動物、特にはマウスなどの動物を作製するための方法は、当該技術分野では慣用となておりそして例えば、米国特許（ＵＳ）第4,736,866 号および第4,870,009 号（共にLeder et al.) 、米国特許（ＵＳ）第4,873,191 号 (Wagner et al.)およびHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製にも使用される。トランスジェニック創始(founder) 動物は、そのゲノム内のＴ−ｂｅｔ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中のＴ−ｂｅｔｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有する別の動物を育種するために使用できる。さらに、Ｔ−ｂｅｔをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物にも育種できる。
【００６８】
相同組換え動物を創成するために、欠失、付加または置換が導入され、これにより内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子を改変、例えば機能性に破壊するＴ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含むベクターを調製する。一つの態様では、相同組換えの際に、内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊される（すなわち機能性タンパク質をコードしなくなり、「ノクアウト」ベクターとも呼ばれる）ように相同組換えベクターを設計する。あるいは、ベクターは、相同組換えの際に、内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子がＴ−ｂｅｔ遺伝子により置換されるように設計できる。相同組換えベクター中で、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の改変部分は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の付加核酸によりその５’および３’末端に近接し、相同組換えをベクターによりもたらされた外因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞内の内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子との間に起こさせる。付加的な近接Ｔ−ｂｅｔ核酸は、内因性遺伝子との相同組換え成功のために十分な長さである。代表的には、数千塩基の近接ＤＮＡ（５’および３’末端の両方）がベクター内に含まれる（例えば相同組換えベクターの説明に関してはThomas, K.R. and Capecchi, M.R.(1987) Cell 51:503 参照）。ベクターは胚幹細胞系列内に導入され（例えばエレクトロポレーションにより）、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組み換えられている細胞を選択する（例えばLi et al.,(1992) Cell 69:915参照）。次いで選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞内に注入して集合キメラを形成する（例えばBradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson ed. (IRL, Oxford, 1987) pp113-152) 。次いで、キメラ胚は、適当な疑妊娠雌養育動物内に移植され、そして胚を生育させる。生殖細胞内に相同組換えＤＮＡを内包する後代は、動物のすべての細胞が導入遺伝子の生殖細胞系転移により相同組換えＤＮＡを含む動物を育種するために使用できる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、さらにBradley, A.(1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829およびPCT 国際公開番号 WO 90/11354号(Mouellec et al.); WO 91/01140号(Smithieset al.); WO 92/0968 号(Zijlstra et al;およびWO 93/04169 号(Berns et al.)に記載されている。
【００６９】
上記に加えて、熟練者は、相同組換えに対する当該技術分野で公知の別の方法が本発明に適用できることを認めるであろう。酵素支援部位特異性組込み系は、当該技術分野では公知でありそして第二の標的ＤＮＡ分子内の所定の位置にＤＮＡ分子を組み込むために適用できる。このような酵素支援組込み系の例は、Ｃｒｅ組換え−ｌｏｘ標的系（例えばBaubonis, W. and Sauer, B.(1993) Nucl. Acids Res. 21:2025-2029; およびFukushige. S. and Sauer, B.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909 に記載）およびＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えばDang, D.T. and Perrimon, N.(1992) Dev. Genet. 13:367-375:およびFiering S. et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473 に記載）を含む。テトラサイクリン調節誘導可能相同組換え系、例えばPCT公開番号WO94/29442号およびPCT公開番号WO 96/01313 号に記載のものも使用できる。
【００７０】
別の態様では、トランスジェニック動物は、例えば、ＣＤ４エンハンサーを用いてＴ−ｂｅｔをすべてのＴ細胞内に発現するように作製できる(Zheng, W-P. & Flavell, R.A. 1997, Cell 89, 587)。最近の研究は、ＣＤ２エンハンサーも使用できることを示唆している。実際に、これはＴ細胞内の高レベルでの発現に一層強力であり、発現は多様ではなくそして導入遺伝子発現はコピー数依存性である(Zhumabekov, T. et al. 1995, J. Immunol. Meth. 185, 133l;Sharp, L.L. et al., 1997, Immunity 7,609)。Ｔ−ｂｅｔＲＮＡの高レベル発現を有するマウス（導入遺伝子駆動Ｔ−ｂｅｔＲＮＡを内因性Ｔ−ｂｅｔと区別するためのプローブとしてヒト成長ホルモンイントロンを使用）は、創始体の適当な数をスクリーニングして同定できる。
【００７１】
別の方法では、ドミナントレプレッサートランスジェニックを創成できる。例えばドミナントレプレッサーＴ−ｂｅｔは、Ｔ−ｂｅｔの融合を駆動して近位ｌｃｋエンハンサーを用いて作製できる(Alberola-Ila, J. et al., 1996, J. Exp. Med. 184,9) 、そしてｅｎｇｒａｉｌｅｄが作製できる(Taylor, D. 1996, Genes Dev. 10.2732; Li, J., Thurm H. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:10885) 。この構築物は、多量体化Ｔ−ｂｅｔレポーターのＴ−ｂｅｔトランス活性化を特異的に抑制しそしてＮＦＡＴ依存性レポータートランス活性化に影響しない。
【００７２】
あるいは、ヌル変異がＥＳ細胞内の標的変異誘発により発生できる(Ranger, A.M., et al., 1998, Nature 392,186; Hodge, M.R., et al. 1996, Immunity 4:1,144; Grusby, M.J., et al., 1991, Science 253, 1417; Reimold, A.M., etal. Nature 379:262; Kaplan, M.H., 1996, Immunity: 313; Kaplan, M.H.,et al., 1996, Nature 382, 174; Smiley, S.T. et al.,1997,Science 275.977)。例えば当該技術分野には公知の技術を用いて、ゲノムＴ−ｂｅｔクローンをゲノムライブラリーから単離し、イントロン−エキソン機構を調整し、そして第一エキソンおよびプロモーター配列の上流４５０ｂｐを欠失するｃｒｅ−ｌｏｘベクター内の標的構築物を創成できる（下記参照）。この構築物は、ＥＳ細胞系統内にエレクトロポレートでき、そして二重薬剤抵抗性（例えばネオマイシン、ガンシクロビル）クローンがサザンブロット分析により同定できる。次いで、Ｔ−ｂｅｔ座内に相同組換えイベントを有するクローンを同定できそして３．５日のＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスから得た胚盤胞内に注入した。次いでキメラマウスを作製し、そして野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスにかけ合わせて破壊されたＴ−ｂｅｔ遺伝子の生殖細胞系伝達を発生させた。
【００７３】
他の態様では、ＲＡＧ２−欠失胚盤胞内への移植(Chen, J., et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4528) またはｃｒｅ−ｌｏｘ誘導可能な欠失方法が、免疫系内でＴ−ｂｅｔのみを欠失するマウス発生に使用できる。例えば、標的構築物は、ｃｒｅ−ｌｏｘベクター内に作製できる。胚盤胞補足系をＮＦＡＴｃ、胚致死表現型研究のために使用した(Ranger, A.M. et al., 1998, Immunity 8:125) 。この方法は、ＥＳ細胞内の両方の染色体上のＴ−ｂｅｔ遺伝子を破壊することを要求し、これは例えば、記載(Chen, J., et al. 1993, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:4528) のようにして、変異ネオマイシン遺伝子を用いそしてＥＳ培養物内のＧ４１８の濃度を上昇することにより、またはｃｒｅ−ｌｏｘ部位を有するｎｅｏ遺伝子に近接して行うことができる。第二対立遺伝子を破壊するために、ネオマイシン遺伝子は、レコンビナーゼを用いてＥＳクローンをトランスフェクションして欠失でき、次いでＥＳクローンを同じ標的構築物を用いてトランスフェクションして両方の対立遺伝子上のＴ−ｂｅｔ欠失を有するクローンを選択できる。ｃｒｅ−レコンビナーゼを用いる第三のトランスフェクションは、所望の二重標的ＥＳ細胞を生成する。次いで、この二重標的ＥＳ細胞をＲＡＧ２胚盤胞細胞内に移植しそしてのようにして生成したキメラマウスのリンパ器官は転移したＥＳ細胞により完全にコロニー化される。これは、Ｔ−ｂｅｔの不在が致死を招きかねない他の臓器形質転換への影響を及ぼすことなく、リンパ系の細胞へのＴ−ｂｅｔの不在の影響の評価を可能とする。
【００７４】
ｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いる条件的除去法も使用できる。要約すると、除去すべきエキソンに近接するイントロン領域内にｌｏｘ組換え配列を位置させた標的構築物を作製する。次いで、この構築物をＥＳ細胞中にトランスフェクションしそして変異マウスを上記のようにして作製する。次いで得られた変異マウスを、誘導可能なプロモーターにより駆動されるｃｒｅレコンビナーゼに対してトランスジェニックなマウスにかけ合わせる。ｃｒｅが発現されると、これは、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子内に導入されたｌｏｘ部位の間の組換えを誘導し、従って遺伝子機能を有効に破壊する。この方法の主要な特徴は、遺伝子破壊が、ｃｒｅレコンビナーゼを活性化することにより意のままに成熟動物内に導入できることである。
【００７５】
組織特異性プロモーターは、免疫系以外の臓器内の異状を避けるために使用できる。ｃｒｅ発現性導入遺伝子は、誘導可能プロモーターにより駆動されてもよい。数種の誘導可能系がｃｒｅ−ｌｏｘ組換え戦略にいまでは使用され、最も一般的にはテトラサイクリンおよびエクジソン系である。組織特異性誘導可能プロモーターは、Ｔ−ｂｅｔヌルマウス内に胚的致死性がある場合に使用できる。
【００７６】
別の方法は、調節されたＴ−ｂｅｔ遺伝子を内包するトランスジェニックマウスの作製である（例えばテトラサイクリン・オフプロモーターの使用、例えばSt-Onge, et al, 1996, Nuc. Acidres. 24, 3875-3877)次いでこのトランスジェニックをＴ−ｂｅｔ欠失マウスへ養育する。この方法は、正常なＴ−ｂｅｔ機能を有するマウスの創成を可能とする。テトラサイクリンは成熟マウスに投与でき、末梢Ｔ細胞内にＴ−ｂｅｔ機能の破壊を誘導し、次いでＴ−ｂｅｔ欠失の効果は時間経過により試験できる。投与の反復サイクル、次いで薬剤（テトラサイクリン）の除去は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のオンおよびオフを意のままに変更できるようにする。
ＩＩＩ．単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質および抗Ｔ−ｂｅｔ抗体
本発明の別の態様は、単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、配列番号１または３によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様では、タンパク質は配列番号２または４のアミノ酸配列を含んでなる。別の態様では、タンパク質は配列番号２または４記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％のアミノ酸一致、さらに好ましくは７０％のアミノ酸一致、さらに好ましくは８０％のアミノ酸一致、その上さらに好ましくは９０％または９５％のアミノ酸一致を有する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明は、さらにＴ−ｂｏｘドメインを含むＴ−ｂｅｔのアミノ末端部分を包含する。種々の態様において、このアミノ末端部分は、ヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３８−３２７またはマウスＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３７−３２６を包含する。本発明により提供される別の単離されたＴ−ｂｅｔの部分は、チロシンリン酸化部位を包含する部分である。この部分は、少なくともヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸３２４−３６６および／または５２３−５３４またはネズミＴ−ｂｅｔのアミノ酸３２３−３３５または５１８−５２９を包含する。本明細書で提供するさらに別のＴ−ｂｅｔの単離された部分は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８−５０１またはネズミＴ−ｂｅｔの４９３−３９６内に記載の核局在化配列を包含する部分である。
【００７８】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は、好ましくは組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター内にクローンし（以上に記載）、発現ベクターを宿主細胞内に導入し（以上に記載）そしてＴ−ｂｅｔタンパク質を宿主細胞内に発現させる。次いで、標準のタンパク質精製技術を用いる適当な精製手順によりＴ−ｂｅｔタンパク質を細胞から単離できる。組換え発現の別の方法では、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを標準のペプチド合成技術を用いて化学的に合成できる。さらに、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を用いる免疫沈降により、ナイーブＴ−ｂｅｔタンパク質を細胞から分離する（例えばＴ細胞から）。
【００７９】
本発明は、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質も提供する。本明細書に使用する場合に、Ｔ−ｂｅｔ「融合タンパク質」は、Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチドに操作可能に連結したＴ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる。「Ｔ−ｂｅｔポリペプチド」は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＴ−ｂｅｔタンパク質の独特のそのペプチド断片を呼び、ここで、「Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチド」は、他のタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを呼ぶ。融合タンパク質内で、用語「操作可能に連結」は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドおよび他のポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すと考える。他のポリペプチドは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合してもよい。例えば、一つの態様では、融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合しているＧＳＴ−Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質である。別の態様では、融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列がベクター、例えばｐＣＥＰ４−ＨＡベクター内に挿入されたＴ−ｂｅｔ−ＨＡ融合タンパク質であり(Herrscher, R.F. et al.,(1995) Genes Dev. 9: 3067-3082) 、Ｔ−ｂｅｔ配列はインフルエンザ・ヘマグルチニン・エピトープタグにインフレームで融合している。このような融合タンパク質は、組換えＴ−ｂｅｔの精製を容易にすることができる。
【００８０】
好ましくは、本発明のＴ−ｂｅｔ融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を慣用の方法に従い、例えば結合のための平滑終止または段違い(stagered)終止末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、希望しない結合を避けるための適当なアルカリ性ホスファターゼ処置としての付着末端の充填、および酵素結合を用いてインフレームで一緒に結合する。別の態様では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む慣用の技術により合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２この連続断片の間の相補的オーバーハングを発生させるアンカープライマーを用いて行うことができ、これはその後にアニールしそして再度増幅してキメラ遺伝子配列を作製できる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausbel et al., John Wiley & Sons, 1992 参照）。さらに、すでに融合部分をコードした多数の発現ベクターが市販により入手可能である（例えばＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）。Ｔ−ｂｅｔコード核酸は、融合部分をＴ−ｂｅｔタンパク質にインフレームで連結するようにこのような発現ベクター内にクローンができる。
【００８１】
単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質またはその断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル調製のための標準方法を用いて、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合する抗体を産生させるための免疫原として使用できる。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、抗体産生に使用できる。例えば、ポリクローナル抗血清は、ラビット内で免疫原として全長組換え細菌産生Ｔ−ｂｅｔを用いて産生できる。この同じ免疫原は、マウスを免疫化しそして免疫化されたマウスから脾臓細胞を取り出すことによるｍＡｂを産生するために使用できる。Ｔ−ｂｅｔに対する免疫反応を備えたマウスからの脾臓細胞は、ミエローマ細胞、例えばＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマに融合できる。後記の実施例に記載のように、この方法は、Ｔ−ｂｅｔに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するために使用された。
【００８２】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔの抗原ペプチド断片は免疫原として使用できる。Ｔ−ｂｅｔの抗原ペプチド断片は、代表的には配列番号２または４記載のアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含んでなり、そしてペプチドに対して発生した抗体がＴ−ｂｅｔと特異性免疫複合体を形成するようにＴ−ｂｅｔのエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは少なくともアミノ酸残基１０個を含んでなり、さらに好ましくは少なくともアミノ酸残基１５個を含んでなり、その上さらに好ましくは少なくともアミノ酸残基２０個を含んでなり、そして最も好ましくは少なくともアミノ酸残基３０個を含んでなる。抗原ペプチドに包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面、例えば親水性領域上に位置し、そしてＴ−ｂｅｔに独特であるＴ−ｂｅｔの領域である。一つの態様では、このようなエピトープは、一つの種、例えばマウスまたはヒトからのＴ−ｂｅｔタンパク質に対して特異的であることができる（すなわち、種間では保存されないＴ−ｂｅｔの領域を有する抗原性ペプチドが免疫原として使用される。このような保存されない残基は、本明細書中に記載のような整列を用いて決定できる）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の標準疎水性分析は、親水性領域を同定するために行うことができる。
【００８３】
Ｔ−ｂｅｔ免疫原は、代表的には、適当な対象体（例えばラビット、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類）を免疫原を用いて免疫化して抗体を調製するために使用される。適当な免疫原調製物は、例えば、組換え的に発現したＴ−ｂｅｔタンパク質または化学的に合成したＴ−ｂｅｔペプチドを含むことができる。調製物は、さらにアジュバント、例えばフロイントの完全または不完全アジュバント、または類似の免疫刺激性薬剤を含むことができる。免疫原性Ｔ−ｂｅｔ調製物を用いる適当な対象体の免疫化は、ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体反応を誘発する。
【００８４】
従って、本発明の別の態様は、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、上記のようにして、適当な対象体をＴ−ｂｅｔ免疫原を用いて免疫化して調製できる。免疫化された対象体中の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価は、標準技術、例えば免疫化Ｔ−ｂｅｔを用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により時間に対して測定できる。希望する場合には、Ｔ−ｂｅｔに対抗する抗体分子は、哺乳類から（例えば血液から）単離しそしてさらに周知の方法、例えばタンパク質Ａクロマトグラフィーにより精製してＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化から適当な時間において、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価が最高になった時点で、抗体産生細胞が対象体から得られそして標準の方法、例えばKohler and Milstein(1975, Nature 256:495-497) により最初に記述されたハイブリドーマ技術(Brown et al (1981) J. Immunol. 127:539-46; Browen et al.,(1980) J. Biol.Chem. 255:4980-83; Yeh et al.(1976) PNAS 76:2927-31;およびYeh et al.(1982) Int J. Cancer 29:269-75も参照) 、さらに最近ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.(1983) Immunol. Today 4:72) 、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al.(1985)), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, Inc. pp77-96)またはトリオーマ技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用される。モノクローナル抗体ハイブリドーマ産生のための技術は周知である（一般的には、R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp. New York, New York(1980); E.A. Lerner(1981) Yale J. Biol. Ned.,54:387-402; M.L. Gefter et al.(1977) Somatic Cell Genet.,3:231-36参照）。要約すると、不死細胞系統（代表的にはミエローマ）を、上記のようにしてＴ−ｂｅｔ免疫原を用いて免疫化した哺乳類からのリンパ細胞（代表的には脾細胞）に融合させ、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００８５】
リンパ細胞よび不死細胞系統の融合に対して使用した周知の多数のプロトコールのいずれも、抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を産生する目的で適用できる（例えばG. Galfre et al.,(1997) Nature 266:55052; Gefter et al., Somatic Cell Genet.以上に引用; Lerner, Yale J. Biol. Med.以上に引用、Kenneth, Monoclonal antibodies、以上に引用も参照）。さらに、通常の技術者は、有用な多数のこのような方法の変形が存在することを認めるであろう。代表的には、不死細胞系統（例えばニエローマ細胞系統）は、リンパ細胞と同じ哺乳類種から誘導される。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物を用いて免疫化したマウスからのリンパ細胞を、不死化マウス細胞系統と融合して作製できる。好ましい不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウスミエローマ細胞系統である。多数のミエローマ細胞系統のいずれも、標準方法に従う融合相手として使用してもよく、例えばＰ３−ＮＳ１／１- Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系統である。これらのミエローマ系統は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ, Rockvill, Md) から入手できる。代表的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合する。次いで、融合からもたらされたハイブリドーマ細胞を、非融合および非産生性に融合されたミエローマ細胞を殺すＨＡＴ培地を用いて選択する（非融合脾細胞は、これらが形質転換されていないので数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準ＥＬＩＳＡ法を用いて、Ｔ−ｂｅｔを結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングして検出される。
【００８６】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体が、組換えコンビナトリアル(combinatorial) 免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ表示(display) ライブラリー）をＴ−ｂｅｔを用いてスクリーニングして、これによりＴ−ｂｅｔを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより固定および単離できる。ファージ表示ライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットは、市場で入手できる（例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System 、カタログ番号27-9400-1;およびStratagene SurfZAP^TM Phage Display Kit、カタログ番号240612) 。さらに、抗体表示ライブラリーの作製およびスクリーニングに使用するための特に適する方法および試薬の例は、例えば下記から見いだすことができる。Ladner et al.:米国特許(US)第5,223,409 号; Kang et al. 国際出願番号WO 92/18619 号; Dower et al.国際出願番号WO 91/17271 号; Winter et al. 国際出願番号WO 92/20791 号; Markland et al. 国際出願番号WO 92/15679 号; Breitlinget al.国際出願番号WO 93/01288 号; McCafferty et al. 国際出願番号WO 92/01047 号; Garrard et al.国際出願番号WO 92/09690 号; Ladner et al. 国際出願番号WO 90/02809 号; Fuchs et al.(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al.(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al.,(1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al.(1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al.(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al.(1991) Nature 352:624-628; Gram et al.(1992) PNSA 89: 3576-3580; Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al.(1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbes et al.(1991) PNAS 88: 7978-7982;およびMcCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554 。
【００８７】
さらに、ヒトおよび非−ヒト部分を含んでなり、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製できる組換え抗Ｔ−ｂｅｔ抗体、例えばキメラ性および人体適応モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラ性および人体適応モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術により産生でき、例えば下記の方法を用いる。Robinson et al. 国際出願番号PCT/US86/02269号; Akira et al.欧州特許出願184,187 号;Taniguchi M. 欧州特許出願172,496 号; Morrison et al. 欧州特許出願173,494 号; Neuberger et al. PCT出願 WO 86/01533号; Cabilly et al.米国特許(US)4,816,567 号; Cabilly et al.欧州特許出願125,023 号; Butter et al.(1988) Science 240:1041-1043; Liu et al.(1987)PNAS 84: 3439-3443; Liu et al.(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al.(1987)PNAS 84: 214-218; Nishimura et al.(1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al.(1985) Nature 314:446-449;およびShaw et al.(1988) J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison S.L. Science 229:1202-1207; Oi et al.(1986) BioTechniques 4: 214; Winter米国特許(US)5,225,539 号; Jones et al.(1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al.(1988) Science 239: 1534:およびBeidler et al.,(1988) J. Immunol. 141: 4053-4060。
【００８８】
抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）は、標準技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法によりＴ−ｂｅｔを単離するために使用できる。抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、細胞からの本来のＴ−ｂｅｔおよび宿主細胞内で発現された組換え産生Ｔ−ｂｅｔの精製を容易にすることができる。さらに、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出するために使用できる（例えば細胞溶解物または細胞上清中）。検出は、抗体を検出可能な物質にカプリング（物理的連結）すると容易になるであろう。従って、一つの態様では、本発明の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能な物質の例は、種々の酵素、接合分子族、蛍光性物質、発光性物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む、適当な接合分子族複合体の例は、ストレプタビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。適当な蛍光性物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含む、発光性物質の例は、ルミノールを含み、そして適当な放射性物質の例は、 ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、³⁵Ｓまたは ³Ｈを含む。
【００８９】
本発明発明のさらに別の態様は、
（ａ）動物を免疫原性Ｔ−ｂｅｔタンパク質、またはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特なその免疫原部分を用いて免疫化し、そして
（ｂ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質に特異的に結合した動物抗体から単離する
ことを含んでなる方法により得られる抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。
【００９０】
特異性抗Ｔ−ｂｅｔ抗体の免疫化および回収の方法は、別途記載する。
ＩＶ．薬剤組成物
本発明のＴ−ｂｅｔモジュレーター（例えば、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子、タンパク質、抗体、またはＴ−ｂｅｔ活性のモジュレーターとして同定された化合物を含むＴ−ｂｅｔ阻害または刺激剤）は、投与に適する薬剤組成物内に組み込むことができる。このような組成物は、代表的には、調節剤および薬剤的に許容できるキャリヤーを含んでなる。本明細書中に使用する場合に、用語「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、薬剤投与に適合するあらゆる溶剤、分散媒体、被覆、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むと考える。薬剤的に活性の物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野では周知である。あらゆる慣用の媒体または薬剤が活性化合物と非適合である場合を除いて、組成物中でのこれらの使用を考える。補足的活性化合物を組成物内に混和してもよい。
【００９１】
本発明の薬剤組成物は、意図するその投与経路に適合するように調剤される。例えば、非経口、皮内、または皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は、下記の成分を含むことができる：滅菌した希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたはその他の合成溶剤、抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、サイトレートまたはホスフェートおよび毒性の調節のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば塩化水素酸または水酸化ナトリウムを用いて調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または反復使用の調剤バイアル内に収容してもよい。
【００９２】
注射使用に適する薬剤組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液または滅菌した注射用液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために適するキャリヤーは、生理食塩水、静菌水、クレモフォルＥＬ^TM（Cremophor EL., BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝塩水(PBS) を含む。すべての場合に、組成物は滅菌されそして容易な注射性となる範囲で液状でなければならない。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならずそして微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリヤーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、および適合するこれらの混合物を含む溶剤または分散媒体であることができる。適当な液体状態は、例えばコーティング例えばレシチンの使用により、分散液の場合に要求される粒径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用により達成できる。多くの場合に、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化などを組成物内に含むと好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物内に含めてもたらすことができる。
【００９３】
滅菌した注射用液剤は、適当な溶剤中の所要量の活性化合物を必要に応じて以上に列記した成分の１種または組み合わせを混和し、次いで濾過滅菌して調製できる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体を含む滅菌ビヒクルおよび以上に列挙したものから所要のその他成分中に活性化合物を混和して調製できる。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌粉末の場合に、好ましい調製方法は、有効成分の粉末およびあらかじめ滅菌濾過したこれらの溶液からの追加の所望の成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９４】
経口組成物は、一般に不活性希釈剤または食用に適するキャリヤーを含む。これらはゼラチンカプル内に封入または錠剤内に圧縮されることができる。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤と混和しそして錠剤、トローチ、またはカプセルの形で使用される。経口組成物は、口内洗浄剤として使用するために液体キャリヤーを使用して調製でき、その際、液体キャリヤー内の化合物は経口で適用されそしてガラガラとしそして吐き出すかまたは呑み込む。薬剤的に適する結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部分として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、下記の成分、または同様な性質の化合物のいずれも含むことができる：結合剤、例えばマイクロクリスタリンセルロース、トラガントガムまたはゼラチン、賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル(Primogel)、またはトウモロコシデンプン、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート(Sterote)、滑り剤例えばコロイド状二酸化ケイ素、甘味剤例えばスクロースまたはサッカリン、または調味剤例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味。
【００９５】
一つの態様では、活性化合物は、化合物の体内からの早期の排出を防止するキャリヤーを用いて、例えば移植およびミクロカプセル投与系も含む制御放出調剤として調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酪酸が使用できる。このような調剤の製造方法は、当該技術分野の熟練者には明らかである。材料はAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc からも入手できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬剤的に許容できるキャリヤーとして使用できる。これらは当該技術分野の熟練者には公知の方法、例えば米国特許（ＵＳ）第4,522,811 号に記載の方法に従って調製してもよい。
Ｖ．本発明の方法
本発明の別の態様は、本発明の種々のＴ−ｂｅｔ組成物を使用する方法に関する。例えば、本発明は、生物学的試料中のＴ−ｂｅｔ活性の存在を検出するための方法を提供する。この方法は、生物学的試料をＴ−ｂｅｔ活性検出可能な薬剤、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質またはＴ−ｂｅｔｍＲＮＡと、生物学的試料中のＴ−ｂｅｔ活性の存在を検出できるように接触させることを含む。
【００９６】
Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡを検出するための好ましい薬剤は、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズできる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば配列番号１または３のＴ−ｂｅｔＤＮＡ、例えば長さが少なくとも約５００、６００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、または１６００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドでありそしてストリンジェント条件下でＴ−ｂｅｔｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであることができる。
【００９７】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出するための好ましい薬剤は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を結合できる標識された抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであることができる。変化していない抗体、またはその断片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂ ）が使用できる。プローブまたは抗体に関連する用語「標識」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカプリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識された他の薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含すると考える。間接標識の例は、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出および蛍光標識したストレプタビジンを用いて検出できるようなビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識を含む。用語「生物学的試料」は、組織、細胞および生物学的液体を含むと考える。例えば、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡを検出するための技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situ ハイブリダイゼーションを含む。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための技術は、酵素連結免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。
【００９８】
このようなアッセイは、発育不全により特徴付けられる症候群の検出に有用である。例えば、ヒトＴ−ｂｏｘ遺伝子ＴＢＸ５およびＴＢＸ３内（マウスＴｂｘ５およびＴｂｘ３のオルソログ）の突然変異が、それぞれ常染色体優性遺伝性疾患ホールト−オーラム(Holt-Oram) 症候群および尺骨−乳腺症候群の原因である（Bamshad, M. et al. 1997, Nature Genetics 16:311; Basson, C.T., et al., 1997, Nature Genetics 15: 30; Li, Q.Y., et al., 1997, Nature Genetics 15: 21; Spranger, S., et al., 1997, J. Med. Genet. 3:978)。これらの症候群は、発育不全により特徴付けられ、そしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予想される。ホールト−オーラム症候群は、心臓および上肢に影響し、一方尺骨−乳腺症候群は手足、アポクリン腺、歯および生殖器発育に影響する。両方の症候群も発育不全が特徴であり、そしてそしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予想される。これらの患者内の突然変異は、Ｔ−ｂｏｘ遺伝子のただ１個の対立遺伝子のみが関係し、従って、Ｔｂｘ３およびＴｂｘ５のハプロタイプ不全(haploinsufficiency)は、がこれら２種の疾患を起こすと考えられる。最近、発生中のヒヨコ胚へのＴｂｘ４およびＴｂｘ５の供給が肢芽体を制御することが証明された(Rodriguez-Esteban et al., 1999; Takeuchi et al., 1999) 。これらの発見は、脊椎動物発生におけるこのファミリーの重要性を強調する。
【００９９】
さらに、多くの種内でのＴ遺伝子相同性の存在は、中胚葉発生に関係するまだ未知の標的遺伝子の組を調節する転写因子としてのその機能に対する強い証拠を提供する。Ｔ−ｂｏｘファミリーの最近の突出は、種々の発生過程におけるその明瞭な重要性から起きたものであり、ヒト疾患におけるＴ−ｂｏｘ突然変異により最も劇的に例示される。胸腺幹細胞からの成熟Ｔ細胞およびナイーブ前駆体から分化したＴｈ細胞の発生は、緊密に調節された発生過程として考えられている。Ｔ−ｂｅｔがＴｈ１系統の発生に関係するというこの発見は、リンパ系におけるこの最新のＴ−ｂｏｘファミリーメンバーの重要な役割を証明する。
【０１００】
本発明は、さらに、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。例えば、本発明は、
Ｔ−ｂｅｔタンパク質を含んでなる指標組成物を調製し、
指標組成物を供試化合物と接触させ、そして
指標組成物内のＴ−ｂｅｔタンパク質の活性に対する供試化合物の作用を決定し、これによりＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する化合物を同定することを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【０１０１】
本発明のスクリーニング法の特定の態様は、ＤＮＡに結合する（例えばＩＬ−２またはＩＦＮ−γプロモーターに結合する能力）、および／または遺伝子発現を調節する（例えばＴｈ１関連サイトカイン遺伝子の発現を、例えばＩＬ−２遺伝子を抑制、ＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化して調節）および／または極性化合物Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に転向するためのＴ−ｂｅｔタンパク質の能力を利用する。
【０１０２】
本発明スクリーニングアッセイの好ましい態様では、指標組成物は指標細胞を含んでなりここで該指標細胞は、（ｉ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質および（ｉｉ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質に反応するレポーター遺伝子を含んでなる。好ましくは、指標細胞は、
ｉ）Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクター、および
ｉｉ）レポーター遺伝子に操作可能に連結したＴｈ１−関連サイトカイン遺伝子の調節配列を含んでなるベクター
を含み、そして該方法は、
ａ）指標細胞を供試化合物と接触させ、
ｂ）供試化合物の存在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルを決定し、そして
ｃ）供試化合物の存在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルを供試化合物の不在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルと比較し、これによりＴ−ｂｅｔの活性を調節する化合物を同定する
ことを含んでなる。
【０１０３】
別の好ましい態様では、指標組成物は、（ｉ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質、および（ｉｉ）Ｔ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ分子の調製を含んでなり、そして該方法は、
ａ）指標組成物を供試化合物と接触させ、
ｂ）供試化合物の存在下でのＴ−ｂｅｔタンパク質とＤＮＡ分子との相互作用の程度を決定し、そして
ｃ）供試化合物の存在下でのＴ−ｂｅｔとＤＮＡ分子との相互作用の程度を供試化合物の不在下でのＴ−ｂｅｔとＤＮＡ分子との相互作用の程度と比較し、これによりＴ−ｂｅｔの活性を調節する化合物を同定する
ことを含んでなる。
【０１０４】
好ましくは、Ｔ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ分子は、Ｔ−ｂｏｘ結合配列を含んでなる。
【０１０５】
別の好ましい態様では、本方法はＴ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質を同定する。この態様では、
指標組成物は、指標細胞が
ｉ）転写調節配列に操作可能に連結したレポーター遺伝子、および
ｉｉ）第一融合タンパク質をコードする第一キメラ遺伝子を含んでなり、該第一融合タンパク質はＴ−ｂｅｔを含む
指標細胞であり、
供試化合物は第二キメラ遺伝子のライブラリーを含んでなり、該ライブラリーは第二融合タンパク質をコードし、
レポーター遺伝子の発現は、第一融合タンパク質、第二融合タンパク質および転写調節配列の間の相互作用に感受性であり、そして
ここで指標組成物内のＴ−ｂｅｔに対する供試化合物の作用が、指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルを決定することにより決定され、これによりＴ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質を含んでなる供試化合物を同定する。
【０１０６】
好ましい態様では、第二キメラ遺伝子のライブラリーは、Ｔｈ２細胞からのｃＤＮＡライブラリーから調製される。
【０１０７】
本発明のスクリーニングアッセイの好ましい態様では、供試化合物がＴ−ｂｅｔの活性を調節すると同定された場合に、免疫反応に対する供試化合物の作用を次いで試験する。従って、本発明のスクリーニング法は、免疫反応に対する化合物の作用を決定し、これにより免疫反応を調節する化合物を同定することをさらに含んでなるぉとができる。一つの態様では、免疫反応に対する化合物の作用は、Ｔｈ１−関連サイトカイン遺伝子、例えばインターフェロン−γ遺伝子の発現に対する化合物の作用を決定して決定される。本明細書中に使用する場合に、用語「Ｔｈ１−関連サイトカイン」は、Ｔｈ２細胞ではなくむしろＴｈ１細胞により優先的または独占的に産生されるサイトカインを呼ぶと考える。Ｔｈ１−関連サイトカインの例は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびリンホトキシン（ＬＴ）を含む。別の態様では、免疫反応に対する関係する化合物の作用は、Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）またはＴヘルパータイプ２（Ｔｈ２）細胞の発生に対する化合物の作用を決定して決定される。
【０１０８】
指標細胞内のＴ−ｂｅｔの発現のために使用できる組換え発現ベクターは、当該技術分野では公知である（上記の考察参照）。一つの態様では、発現ベクター内で、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列は、指標細胞内のＴ−ｂｅｔの構成的発現を許容する調節配列に操作可能に連結する（例えばウイルス調節配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーが使用できる）。指標細胞内のＴ−ｂｅｔの構成的発現を許容する組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの活性を促進または阻害する化合物の同定のために好ましい。別の態様では、発現ベクター内で、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列は、内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の調節配列に操作可能に連結する（すなわち内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子から誘導されたプロモーター調節領域）。Ｔ−ｂｅｔ発現が内因性調節配列により制御される組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの転写発現を促進または阻害する化合物の同定のために好ましい。
【０１０９】
Ｔｈ１−関連サイトカイン遺伝子が使用される方法（例えばレポーター遺伝子として）において、好ましくはＴｈ１一関連サイトカインはインターフェロン−γまたはＩＬ−２である。例えば、ＩＬ−２プロモーターは、ＭＦκＢ部位の５’の−２４０〜−２２０丁度にあるＴ−ｂｏｘ結合部位を明らかにする。下記の実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づいて酵母ワンハイブリッドスクリーニングアッセイで単離される。したがって、一つの態様では、本発明の方法は、近位ＩＬ−２プロモーターのこの領域、最も好ましくは、ＩＬ−２プロモーターのヌクレオチド−２４０〜−２２０を含むレポーター遺伝子構築物を利用する。
【０１１０】
種々のレポーター遺伝子が当該技術分野で公知でありそして本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適合する。適合するレポーター遺伝子の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼをコードするものを含む。これらの遺伝子産物の活性を測定するための標準方法は、当該技術分野では公知である。
【０１１１】
種々の細胞タイプがスクリーニングアッセイにおける指標細胞としての使用に適合する。好ましくは、通常はＴ−ｂｅｔを発現しない細胞系統、例えばＢ細胞またはＴｈ２細胞クローンが使用される。非リンパ細胞系統、例えばＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞系統も指標細胞として使用できる。酵母細胞も指標細胞として使用できる。
【０１１２】
一つの態様では、供試化合物の存在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルは、供試化合物の不在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルよりも高くそして供試化合物はＴ−ｂｅｔの発現または活性を刺激する化合物として同定される。別の態様では、供試化合物の存在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルは、供試化合物の不在下での指標細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルよりも低く、そして供試化合物はＴ−ｂｅｔの発現または活性を阻害する化合物として同定される。
【０１１３】
レポーター遺伝子構築物の使用の代わりに、Ｔ−ｂｅｔの発現または活性を調節する化合物が他の「読み取り(read-out)」を用いて同定できる。例えば、指標細胞はＴ−ｂｅｔ発現ベクターを用いてトランスフェクションでき、供試化合物の存在および不在でインキュベーションされ、そしてＴｈ１−関連サイトカイン産生は指標細胞内のサイトカインｍＲＮＡ（例えばインターフェロン−γｍＲＮＡ）または培地上清内へのサイトカイン分泌（例えばインターフェロン−γ）を検出して評価できる。サイトカインｍＲＮＡを検出するための標準方法、例えば逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は当該技術分野では公知である。培地上清内のサイトカインタンパク質を検出するための標準方法、例えば酵素連結免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）も当該技術分野では公知である。
【０１１４】
以上に記載のように、本発明は、Ｔ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質（例えばＴｈ１細胞内のタンパク質）を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。
【０１１５】
一つの態様では、このようなアッセイは、当該技術分野では公知のツーハイブリッドアッセイ（相互作用トラップアッセイとも呼ばれる）に基づいて設計できる（例えばField 米国特許（ＵＳ）第5,283,173 号; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; およびIwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696参照）。ツーハイブリッドアッセイは、一般に特定の標的タンパク質と相互作用するタンパク質を同定するために使用される。このアッセイは、機能性転写活性化物質を再構築する相互作用が可能なタンパク質を同定するために遺伝子融合を利用する。転写活性化物質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインから成り、ここで両方のドメインは標的配列から下流側の遺伝子を転写を活性化することを要求される（例えばＧＡＬ４に対する上流活性化物質配列（ＵＳＡ））。標的「餌(bait)」タンパク質をコードするＤＮＡ配列がこれらのドメインのいずれかにＤＮＡ融合されそして配列のライブラリーは他のドメインに融合される。標的−融合タンパク質（例えば標的ＧＡＬ４−融合「餌」）に結合できる「魚(fish)」融合タンパク質（融合ライブラリーから作製）は、一般に二つのドメイン（ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメイン）を標的配列から下流に挿入されたレポーター遺伝子の転写を活性化するために十分近位に持ってくる。従って「魚」タンパク質は、機能性転写活性化物質を再構築するその能力により同定できる（例えば機能性ＧＡＬ４トランス活性化物質）。
【０１１６】
この一般的なツー−ハイブリッド系は、標的Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質（例えば「餌」としてのＴ−ｂｅｔ／ＧＡＬ４結合ドメイン融合物）の構築によりＴ−ｂｅｔと相互作用する細胞（例えばＴｈ１細胞）内のタンパク質および「魚」融合タンパク質のｃＤＮＡライブラリー（例えばｃＤＮＡ／ＧＡＬ４）活性化ドメインライブラリー）の同定に適用でき、ここでｃＤＮＡライブラリーは関係する細胞タイプ（例えばＴｈ１細胞）のｍＲＮＡから調製でき、そしてこれらの構築物を、Ｔ−ｂｅｔに反応する調節配列（例えばＩＬ−２プロモーター配列、例えば以上に考察）に連結するレポーター遺伝子構築物も含む宿主細胞内に導入する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔのトランス活性化ドメイン（これは５’および３’の両方に位置する）は、「餌」構築物内に欠失するであろう。好ましい態様では、餌構築物は、Ｔ−ｂｏｘドメインを含む。一つの態様では、チロシンリン酸化の少なくとも一つの部位も含まれる。優性陰性Ｔ−ｂｅｔタンパク質も、相互作用に必要なＴ−ｂｅｔの部位をさらに定位するために相互作用物質のスクリーニングに使用できる。Ｔ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡは、レポーター遺伝子構築物のトランス活性化に基づいて同定できる。
【０１１７】
あるいは、「シングル−ハイブリッド」アッセイ、例えばSieweke, M.H. et al. (1996) Cell 85:49-60 記載のものは、Ｔ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質を同定するために使用できる。このアッセイは、上記のツーハイブリッド系の変形である。この系では、「餌」は、トランス活性化ドメインが除去された転写因子（例えばトランス活性化ドメインが除去されたＴ−ｂｅｔ）であり、そして「魚」は、非融合ｃＤＮＡライブラリーである（例えばＴｈ１細胞から調製したｃＤＮＡライブラリー）。これらの構築物は、Ｔ−ｂｅｔに反応する調節配列（例えばＴ−ｂｏｘ結合領域、例えばＴ−ｂｅｔに反応するＩＬ−２プロモーターの領域）に連結されたレポーター遺伝子構築物も含む宿主細胞（例えば酵母細胞）内に導入される。Ｔ−ｂｅｔと相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡは、レポーター遺伝子構築物のトランス活性化に基づいて同定できる。
【０１１８】
別の態様では、Ｔ−ｂｅｔ標的遺伝子を単離するための代表差異分析(representational differential analysis)（ＲＤＡ）およびマイクロチップ(microchip) ＤＮＡアレイ分析がある。例えば、ＰＣＲと組み合わせた差異ディスプレーまたは差し引き法（ＲＤＡ：例えばHubank, M. % Schatz, D.G., 1994, Nuc. Acid Res. 22, 5640-5648; Chang Y. et al., 1994, Science 266: 1865; von Stein O.D. et al., 1997, Nuc. Acid Res. 25.2598; Lisitsyn, N. & Wigler, M., 1993, Science 259, 946 参照) は差し引きまた非差し引きプローブを用い、または最近では、ＤＮＡマイクロチップアレイハイブリダイゼーション(Welford etal., 1998, Nucl. Acid. Res. 15:3059)が使用できる。このようなアッセイを行う場合に、種々の細胞、例えば正常細胞、Ｔ−ｂｅｔを発現するように操作された細胞、またはＴ−ｂｅｔ欠失またはＴ−ｂｅｔ過剰発現のマウス（例えばトランスジェニック非−ヒト動物）からの細胞も使用できる。
【０１１９】
上記のように、本発明は、Ｔ−ｂｅｔとＴ−ｂｏｘ結合領域（例えばＩＬ−２遺伝子調節領域）の相互作用を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。ＤＮＡ結合タンパク質と標的ＤＮＡ配列の相互作用を検出するアッセイは当該技術分野で公知である（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮＡアーゼＩフットプリントアッセイなど）。供試化合物の存在または不在におけるこのアッセイを行う場合に、これらのアッセイは、ＤＮＡ結合タンパク質とその標的ＤＮＡ配列との相互作用を調節（例えば阻害または促進）する化合物を同定するために使用できる。
【０１２０】
一つの態様では、供試化合物の存在下でのＤＮＡ断片へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、供試化合物の不在下でのＤＮＡ断片へのＴ−ｂｅｔの結合の量より大きく、その場合に供試化合物はＴ−ｂｅｔの結合を促進する化合物として同定される。別の態様では、供試化合物の存在下でのＤＮＡ断片へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、供試化合物の不在下でのＤＮＡ断片へのＴ−ｂｅｔの結合の量より小さく、その場合に供試化合物はＴ−ｂｅｔの結合を阻害する化合物として同定される。
【０１２１】
本発明のさらの別の態様は、細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を調節方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、細胞内のＴ−ｂｅｔ活性が調節されるようにＴ−ｂｅｔ活性を調節する薬剤と接触させることを含む。この薬剤は、細胞内のＴ−ｂｅｔタンパク質の活性の調節により、またはＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写またはＴ−ｂｅｔｍＲＮＡの翻訳の調節により作用してもよい。本明細書中に使用する場合に、用語「調節」は、Ｔ−ｂｅｔ活性を阻害または低下およびＴ−ｂｅｔ活性を刺激または増進することを含むと考える。従って、一つの態様では、薬剤はＴ−ｂｅｔ活性を阻害する。別の態様では、薬剤はＴ−ｂｅｔ活性を刺激する。
【０１２２】
さらに別の態様では、本発明は、細胞によるＴヘルパー−タイプ２およびＴヘルパー−タイプ１サイトカインの量の調節のための方法を提供する。この方法は、細胞を、Ｔ−ｂｅｔの活性を調節する薬剤と接触させることを含む。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性を刺激する薬剤は、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γを上昇制御し、一方、これらの同じ薬剤は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４を下降制御する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は細胞により産生されるサイトカインのパターンを調節するための方法を提供する。本方法は、細胞をＴ−ｂｅｔの活性を調節する薬剤と接触させることを含む。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性を刺激する薬剤は、通常はＩＦＮ−γを産生しない細胞内でＩＦＮ−γ産生を誘導でき、そしてＩＬ−４産生を抑制できる。このような薬剤は、例えばＴｈ２のサイトカイン分泌プロフィールをＴｈ１細胞のものに転向するために使用できる。
Ａ．阻害剤
本発明の調節方法に従って、Ｔ−ｂｅｔ活性は、細胞を阻害剤と接触させることにより細胞内で阻害される。本発明の阻害剤は、例えばＴ−ｂｅｔの発現または活性を阻害するように作用する細胞内結合分子であることができる。本明細書内に使用する場合に、用語「細胞内結合分子」は、タンパク質自体、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ分子に）またはタンパク質が通常相互作用する標的に（例えばＴ−ｂｅｔが結合するＤＮＡ標的配列に）結合することによりタンパク質の発現または活性を阻害するように細胞内で作用する分子を含むと考える。細胞内結合分子の例は、以下にさらに詳細に記述するが、アンチセンスＴ−ｂｅｔ核酸分子（例えばＴ−ｂｅｔｍＲＮＡの翻訳を阻害する）、細胞内抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を阻害）およびＴ−ｂｅｔタンパク質の優性陰性変異体を含む。
【０１２４】
一つの態様では、本発明の阻害剤は、Ｔ−ｂｅｔをコードする遺伝子または該遺伝子の一部分に相補的なアンチセンス核酸分子、または該アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。細胞内の特定のタンパク質の発現を下降制御するためのアンチセンス核酸の使用は、当該技術分野で周知である（例えばWeintraub,H. et al.,「遺伝子分析のための分子的道具としてのアンチセンスＲＮＡ」Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari, F.K. and McDonnel, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M.R. and Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J.S.(1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335) 。アンチセンス核酸分子は、他の核酸分子（例えばｍＲＮＡ配列）のコーディング鎖に相補的であり、従って他の核酸分子のコーディング鎖に水素結合が可能であるヌクレオチド配列を含んでなる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域内に見られる配列、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域またはコード領域と非翻訳領域とを架橋する領域（例えば５’非翻訳領域とコード領域との結合部分）に相補的であることができる。さらに、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域への配列、例えば転写開始配列または調節要素に相補的であることができる。好ましくは、アンチセンス核酸は、コーディング鎖上の開始コドンの前またはそれを含む領域またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域に相補的であるように設計される。細胞内でＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を阻害するためのアンチセンス核酸は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸配列（例えば配列番号１または３）に基づいて設計し、WatsonおよびCrick の塩基対法則に従って構築できる。
【０１２５】
アンチセンス核酸は、種々の異なる形で存在できる。例えば、アンチセンス核酸は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の一部分に対してのみ相補的であるオリゴヌクレオチドであることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野では公知の化学合成法を用いて構築できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を上昇するためまたはアンチセンスとセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理的安定性を上昇させるために設計された種々の変性ヌクレオチドを用いて化学的に合成でき、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。培地中の細胞内のＴ−ｂｅｔ発現を阻害するために、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、培地内の細胞に、代表的には約２００μｇ（オリゴヌクレオチド）／ｍｌで加えることができる。
【０１２６】
あるいはアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に産生できる（すなわち挿入された核酸から転写された核酸は、関係する標的核酸に対してアンチセンス方向となるであろう）。関係する細胞内のアンチセンスＲＮＡ分子の発現を指令し、アンチセンス方向にクローンされた核酸に操作可能に連結した調節配列が選択でき、例えば、アンチセンスＲＮＡの発現を構成的、組織特異的または誘導可能に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーまたはその他の調節配列が選択できる。例えば、アンチセンスＲＮＡの誘導可能な発現のために、誘導可能な真核調節系、例えばＴｅｔ系（例えばGossen, M. and Bujard, H.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769; PCT公開番号WO94/29442号およびPCT 公開番号WO96/01313号に記載）が使用できる。アンチセンス発現ベクターは、組換え発現ベクターに関して以上に記載したようにして調製できるが、しかし、ｃＤＮＡ（またはそのタンパク質）はアンチセンス方向にベクター中にクローンされる。アンチセンス発現ベクターは、例えば組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であることができる。アンチセンス発現ベクターは、標準のトランスフェクション技術、例えば組換え発現ベクターに関して以上に記載した方法を用いて細胞内に導入できる。
【０１２７】
別の態様では、阻害剤として使用するためのアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、これらが相補領域を有する一本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを開裂できるリボヌクレオチドを有する触媒性ＲＮＡ分子である（リボザイムに関する総説としては、例えばOhkawa, J.et al.(1995) J. Biochem. 118:251-258; Sigurdsson, S.T. and Eckstein, F. (1995) Trends Biotechnol. 13:286-289; Rossi, J,J, (1995) Trends Biotechnol. 13: 301-306: Kiehntoph, M. et al. (1995) J. Mol. Med. 73:65-71参照) 。Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡに特異性を有するリボザイムは、Ｔ−ｂｅｔｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体は、活性部位の塩基配列が、Ｔ−ｂｅｔｍＲＮＡ内で開裂される塩基配列に相補的であるように構築できる。例えば米国特許(US)第4,987,071 号および第5,116,742 号（両方共にChech et al.) 参照。あるいはＴ−ｂｅｔｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異性リボヌクレオチド活性を有する触媒生ＲＮＡを選択するために使用できる。例えばBartel. D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418参照。
【０１２８】
細胞内のＴ−ｂｅｔの発現および／または活性を阻害するために使用できる阻害剤の別の種類は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に特異的な細胞内抗体である。細胞内のタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用は当該技術分野では公知である（例えばCarlson J.R. (1988) Mol. Cell Biol. 8:2638-2646; Biocca S. et al. (1990) EMBO J. 9: 101-108; Werge T.M. (1990) et al., FEBS Letters274:193-198; Carlson J.R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco W.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca S. et al. (1994) Bio/Technology 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Human Gene Therapy 5:595-601; Duan, L. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5932-5936; Beerli, R.R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R.R. et al. (1994) Biochem. Biophys, Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A.M. et al. (1995) RMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J.H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; PCT公開番号WO94/02610(Marasco et al.); およびPCT 公開番号WO95/03832(Duan et al.) 参照）。
【０１２９】
細胞内抗体を用いてタンパク質活性を阻害するために、細胞内へのベクターの導入の際に、抗体鎖が細胞の細胞内コンパートメント内の機能性抗体として発現されるような形の抗体鎖をコードする組換え発現ベクターを調製する。本発明の阻害方法に従うＴ−ｂｅｔ活性の阻害のために、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を特異的に結合する細胞内抗体を細胞の細胞質内に発現する。細胞内抗体発現ベクターを調製するために、関係する標的タンパク質、例えばＴ−ｂｅｔに対して特異的な抗体鎖をコードする抗体軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを、代表的にはＴ−ｂｅｔタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体、または組換え抗−Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、上記のようにして産生できる。Ｔ−ｂｅｔタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体が同定されると（例えばハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体またはコンビナトリアルライブラリーからの組換え抗体）、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準の分子生物学技術により単離される。ハイブリドーマ誘導抗体に対して、軽鎖および重鎖ＤＮＡは、例えばＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより得ることができる。例えばファージ表示ライブラリーからの組換え抗体に対して、軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、ライブラリースクリーニング過程の間に単離された表示パッケージ（例えばファージ）から回収できる。それからＰＣＲプライマーまたはｃＤＮＡライブラリープローブが調製できる抗体軽鎖および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は、当該技術分野では公知である。例えば、多数のこのような配列は、Kabat, E.a. et al., (1990)「免疫学で関係するタンパク質の配列」(Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)および「Ｖｂａｓｅ」ヒト−生殖細胞系配列データベースに公開されている。
【０１３０】
一旦入手されると、抗体軽鎖および重鎖配列は、標準方法を用いて組換え発現ベクター内にクローンされる。軽鎖および重鎖の細胞質発現を可能とするために、軽鎖および重鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列を除去する。細胞内抗体発現ベクターは、種々の異なる形の中の一つとして細胞内抗体をコードできる。例えば、一つの態様では、ベクターは全長抗体が細胞内に発現されるように、全長抗体軽鎖および重鎖をコードする。別の態様では、ベクターは全長軽鎖はコードするがしかしＦａｂ断片が細胞内に発現されるように、重鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードする。最も好ましい態様では、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、ここで、軽鎖および重鎖鎖の変動領域がフレキシブルなペプチドリンカー（例えば（Ｇｌｙ₄ Ｓｅｒ）₃ ）により連結されそして一本鎖分子として発現される。細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を阻害するために、Ｔ−ｂｅｔ細胞内抗体をコードする発現ベクターを、以下に記載する標準トランスフェクション方法により細胞内に導入する。
【０１３１】
本発明の阻害剤のさらに別の形は、本明細書内で優性陰性阻害剤とも呼ばれるＴ−ｂｅｔの阻害形、例えばチロシンリン酸化部位が変異されているＴ−ｂｅｔの形、または例えばトランス活性化ドメインが除去されているＴ−ｂｅｔの変異形である。このような優性陰性Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする組換え発現ベクターを用いて細胞内に発現でき、これは標準トランスフェクション法により細胞内に導入される。Ｔ−ｂｅｔ欠失チロシンリン酸化部位またはトランス活性化ドメインの変異形を発現するために、Ｔ−ｂｅｔのトランス活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列を、標準組換えＤＮＡ技術を用いてＴ−ｂｅｔコード配列から変異または除去する。末端切除ＤＮＡを組換え発現ベクター内に挿入し、次いでこれを細胞内に導入し、細胞内でＴ−ｂｅｔの改変された形の発現を可能とする。
【０１３２】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を阻害するために使用できる他の阻害剤は、Ｔ−ｂｅｔ活性を直接阻害するかまたはＴ−ｂｅｔと標的ＤＮＡまたは他のタンパク質との間の相互作用を阻害する化学化合物である。このような化合物は、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定でき、以上に記載されている。
Ｂ．刺激剤
本発明の調節方法に従って、Ｔ−ｂｅｔ活性は刺激剤と細胞とを接触させて細胞内で刺激される。このような刺激剤の例は、活性Ｔ−ｂｅｔタンパク質および細胞内でのＴ−ｂｅｔ活性を上昇させるように細胞内に導入されるＴ−ｂｅｔをコードする核酸分子を含む。好ましい刺激剤は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子であり、ここで核酸分子は、細胞内の活性Ｔ−ｂｅｔタンパク質の発現のために適する形で細胞内に導入される。細胞内でＴ−ｂｅｔタンパク質を発現するために、代表的には、Ｔ−ｂｅｔをコードするＤＮＡを、本明細書中に記載するように標準分子生物学技術を用いて最初に組換え発現ベクター内に導入する。Ｔ−ｂｅｔコードＤＮＡは、例えばＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅により得ることができる。Ｔ−ｂｅｔコードＤＮＡの単離または増幅に続いて、ＤＮＡ断片を発現ベクター内に導入しそして本明細書中に記載する標準方法により標的細胞内にトランスフェクションする。
【０１３３】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の活性を刺激するために使用できる他の刺激剤は、細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を刺激する化学化合物、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質を直接刺激する化合物およびＴ−ｂｅｔと標的ＤＮＡまたは他のタンパク質との間の相互作用を促進する化合物である。このような化合物は、以上に詳細に記載したような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定できる。
【０１３４】
本発明の調節方法は、生体外（例えば細胞を薬剤と一緒に培養するかまたは培地中の細胞内へ薬剤を導入することにより）、あるいは、生体内（例えば対象体に薬剤を投与するかまたは対象体の細胞内に薬剤を、例えば遺伝子治療により導入することにより）で行うことができる。生体外で調節方法を実施するために、細胞を対象体から標準方法により入手しそして本発明の調節剤を用いて生体外でインキュベーション（すなわち培養）して細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を調節できる。例えば、末梢血液単球（ＰＢＭＣ）を対象体から入手しそして密度勾配遠心分離、例えばフィコル／ハイパック(Ficoll/Hypaque)により単離できる。特異性細胞集団は、標準法を用いて除去または濃縮できる。例えば、Ｔ細胞は、例えばＴ細胞表面マーカーに対する抗体を用いる正の選択、例えば細胞を特異性一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と一緒にインキュベーションし、次いで一次ｍＡｂを結合する二次抗体を用いて被覆した磁気ビーズを用いてｍＡｂを結合する細胞の単離により濃縮できる。特異性細胞集団は、標準方法による蛍光活性化細胞選別により単離できる。希望する場合には、本発明の調節剤を用いて生体外で処理された細胞は、対象体に再投与できる。対象体に投与するために、対象体に投与する前に細胞から培地内の残留薬剤を最初に除去することが好ましい。これは、例えば細胞のフィコル／ハイパック勾配遠心分離により行うことができる。細胞の生体外遺伝子モディフィケーションおよび引き続いての対象体への再投与のこれ以上の考察は、米国特許第5,399,346 号(W.F. Anderson et al) 参照。
【０１３５】
対象体内の生体内調節方法を実行するために、調節剤は、対象体の細胞内のＴ−ｂｅｔ活性が調節されるように対象体に投与できる。用語「対象体」は、免疫反応を誘発できる生体を含むと考える。好ましい対象体は哺乳類である。対象体の例は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジである。
【０１３６】
核酸（Ｔ−ｂｅｔタンパク質、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体または優性陰性阻害剤をコードする組換え発現ベクターを含む）を含んでなる刺激または阻害剤に対して、薬剤は、生体内の細胞内へ核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野では公知の方法を用いて対象体の細胞内へ導入できる。このような方法の例は、非ウイルスおよびウイルス法を含み、下記を含む。
【０１３７】
直接注入：裸のＤＮＡは、ＤＮＡを細胞内への直接注入して生体内細胞内に導入できる（例えばAcsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468参照) 。例えばＤＮＡを細胞内へ生体内で注入するための投与装置（例えば「ジーンガン(gene gun)」）が使用できる。このような装置は、市場で入手できる（例えばBioRadから）。
【０１３８】
カチオン性脂質：裸のＤＮＡは、ＤＮＡをカチオン性脂質と複合するかまたはＤＮＡをカチオン性リポソーム内にカプセル化して生体内細胞内に導入できる。適当なカチオン性脂質製剤の例は、Ｎ−〔−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル〕Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム・クロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ミリスチルオキシ−プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム・ブロミド（ＤＭＲＩＥ）とジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１モル比を含む（例えばLogan, J.J. et al. (1995) Gene Therapy 2: 38-49; San H. et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 781-788 参照）。
【０１３９】
受容体−媒介ＤＮＡ取り込み：裸のＤＮＡは、ＤＮＡをカチオン、例えば細胞表面受容体に対するリガンドとカプリングするポリリシンに複合して生体内で細胞に導入することもできる（例えばWu, G and Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967;および米国特許(US)第5,166,320 号参照）ＤＮＡ−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体−媒介エンドサイトーシスによりＤＮＡの取り込みを容易にする。本来的にエンドソームを破壊するアデノウイルスキャプシドに連結し、これにより細胞質内へ物質を放出するＤＮＡ−リガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために使用できる（例えばCuriel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850: Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126参照）。
【０１４０】
レトロウイルス：欠損ウイルスは、遺伝子治療目的の遺伝子転移に使用するために特性が良く知られている（総説はMiller, A.D. (1990) Blood 76:271参照）。組換えレトロウイルスは、レトロウイルスゲノム内に組み込まれた関係するヌクレオチド配列を持って構築できる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部分を除去してレトロウイルス複製欠損を与えることができる。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオン内にパッケージし、これは標準技術によりヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染するために使用できる。組換えレトロウイルス作製およびこのウイルスを用いる生体外および生体内での細胞感染のためのプロトコールは、「分子生物学の最近のプロトコール」(Current Protocols in Molecular Biology, Ausbel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989) 第９．１０−９．１４章およびその他の標準実験マニュアル中に見いだすことができる。適当なレトロウイルスの例は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭであって、これらは当該技術分野の熟練者には良く特性が知られている。適当なパッケージングウイルス系統の例は、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２およびψＡｍである。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多数の異なる細胞タイプ、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含めて、生体外または生体内で導入するために使用される（例えばEglitis, et al. (1985) Science 230: 1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115:米国特許(US)第4,868,116 号; 米国特許(US)第4,980,286 号; PCT 出願WO89/07136;PCT出願WO89/02468; PCT 出願WO89/05345; および PCT出願WO92/07573参照）。レトロウイルスゲノム（およびこれに挿入された外来核酸）を宿主ゲノム内に組み込んで安定に核酸を細胞内に導入するために、レトロウイルスベクターは、標的細胞分裂を必要とする。従って、標的細胞の複製を刺激する必要があるであろう。
【０１４１】
アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、これが関係する遺伝子産物をコードしそして発現するがしかし正常な溶解ウイルスライフサイクル中で複製する能力に関しては不活性化されるように操作できる。例えばBerkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; およびRosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155参照。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルスの株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）から誘導される適当なアデノウイルスベクターは、当該技術分野の熟練者には周知である。組換えアデノウイルスは、これらが有効な遺伝子伝達ビヒクルであるために細胞分裂を必要とせずそして気道外皮(Rosenfeld et al. (1992)、以上に引用) 、内皮細胞(Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486)、肝細胞(Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816)、および筋肉細胞(Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584) を含む広範囲の種々の細胞タイプに感染するために使用できるという長所を有する。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれないでエピソームとして残り、これにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム内に組み込まれる状況（例えばレトロウイルスＤＮＡ）における挿入突然変異誘発の結果として起きる可能性がある問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの保持能力は、他の遺伝子伝達ベクターと比較して大きい（８ｋｂまで）(Berkner et al, 以上に引用; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267)。現在使用されている大部分の複製−欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全体または一部分を欠損していが、しかしレトロウイルス遺伝物質の８０％は保持している。
【０１４２】
アデノ関連ウイルス：アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、有効な複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（概説としてMuzyszka et al. Curr, Topics in Micro. and Immunol.(1992) 158:97-129 参照）。これはまたそのＤＮＡを分裂しない細胞内に組込んでもよく、そして安定な組込みを高い頻度で発現する数少ないウイルスの一つである（例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828;およびMcLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973 参照）。ＡＡＶの３００塩基対しか含まないベクターをパッケ−ジングできそして組込みができる。外来性ＤＮＡに対するスペースは、約４．５ｋｂに限られる。Tratschin et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:3251-3260 により記載されたようなＡＡＶベクターは、ＤＮＡを細胞内に導入するために使用できる。種々の核酸がＡＡＶベクターを用いて種々の細胞タイプ内に導入された（例えばHermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984)J. Virol. 51:611-619; およびFlotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790 参照）。
【０１４３】
特定の発現ベクター系の効力および細胞内に核酸を導入する方法は、当該技術分野で日常的に使用されている標準の方法により評価できる。例えば、細胞内に導入されるＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えばサザンブロッティング）で検出でき、そして導入されたＤＮＡの転写により産生されたＲＮＡは、例えばノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出できる。遺伝子産物は、適当なアッセイ、例えば産生されたタンパク質の免疫学的検出、例えば特異性抗体を使用する方法により、または遺伝子産物の機能的活性の免疫学的検出により検出できる。
【０１４４】
好ましい態様では、Ｔ−ｂｅｔをコーディングするレトロウイルス発現ベクターを生体内細胞内でのＴ−ｂｅｔタンパク質発現に使用し、これにより生体内のＴ−ｂｅｔタンパク質活性を刺激する。このようなレトロウイルスベクターは、当該技術分野では公知の標準方法に従って調製できる（考察は上記参照）。
【０１４５】
調節剤、例えば化学的化合物は、対象体に薬剤組成物として投与できる。このような組成物は、代表的には調節剤および薬剤的に許容できるキャリヤーを含んでなる。本明細書中に使用する場合に、用語「薬剤的に許容できるキャリヤー」は、あらゆる溶剤、分散媒体、被覆、抗細菌および抗真菌薬剤、等張剤および吸収遅延剤等を含み、薬剤投与に適するものを考える。このような媒体および薬剤の薬剤的な活性物質のための使用は、当該技術分野では周知である。活性化合物と適合しないすべての慣用の媒体または薬剤を除いて、組成物中へのこれらの使用を考える。補足の活性化合物も組成物内に混和されることができる。薬剤組成物は、上記のＩＶ項に記載のようにして調製できる。
【０１４６】
本明細書中に記載のＴｈ１細胞の発生、およびＴｈ２表現型の抑制における主要な調節剤としてのＴ−ｂｅｔの同定は、本発明の調節方法を用いて、種々の臨床状態における細胞サブセットの選択操作を可能とする。本発明の刺激方法（すなわちＴ−ｂｅｔ活性を増進するための刺激剤を使用する方法）は、ＩＦＮ−γの産生と同時にＴｈ１反応の促進およびＩＬ−２およびＩＬ−４両方の下降制御を同時に行い、従ってＴｈ２反応の下降調節をもたらす。反対に、本発明の阻害方法（すなわちＴ−ｂｅｔ活性を下降調節するための抑制剤を使用する方法）は、ＩＦＮ−γの産生の阻害と同時にＴｈ１反応の下降制御およびＴｈ２反応の促進をもたらす。従って、Ｔｈ１反応が有益な疾患状態を治療するためには、Ｔｈ１反応を促進し一方ではＴｈ２反応を下降制御するように本発明の刺激方法を選択する。あるいは、Ｔｈ２反応が有益な疾患状態を治療するためには、Ｔｈ１反応を下降制御し一方ではＴｈ２反応を促進するように本発明の阻害方法を選択する。疾患状態の治療への本発明の方法の適用は、病状の治癒、病状に関連する症状の種類および数の減少を長期または短期のいずれかでもたらすか（すなわち病状の改善）または単に対象体に一時的な有利な作用をもたらす。
【０１４７】
優勢なＴｈ１またはＴｈ２タイプの反応と関連する多数の疾患状態が同定され、これらの病状を患う個体内に存在する反応の種類の同定および調節の利益を受けるであろう。本発明の免疫調節的方法のこれらの疾患への適用をさらに以下に記載する。
Ａ．アレルギー
アレルギーは、ＩｇＧを通じて媒介され、その産生は、Ｔｈ２細胞およびこれにより産生されるサイトカインの活性により調節される。アレルギー反応において、ＩＬ−４がＴｈ２細胞により産生され、これはＩｇＥ抗体の産生およびアレルギー反応を媒介する細胞、すなわちマスト細胞および好塩基球の活性化をさらに刺激する。ＩＬ−４は、好酸球媒介炎症反応にも重要な役割を演じる。従って、本発明の刺激方法は、病原性ＩｇＧ抗体の産生を下降制御する手段として、アレルギー患者におけるＴｈ２関連サイトカイン、特にはＩＬ−４の産生を阻害することができる。刺激剤は、対象体に直接投与してもよく、または細胞（例えばＴｈｐ細胞またはＴｈ２細胞）を対象体から入手し、刺激剤と生体外で接触させそして対象体に再投与してもよい。さらに、ある種の状態では、アレルゲンを刺激剤または刺激剤を用いて処置した細胞と一緒に対象体に同時投与して、アレルゲン特異性反応を阻害（すなわち脱感作）すると有益である。処置は、他のＴｈ１−促進剤、例えばサイトカインＩＬ−１２またはＴｈ２−関連サイトカイン（例えば抗ＩＬ−４抗体）に対する抗体を、Ｔｈ１タイプ反応をさらに刺激するために十分な量でアレルギー対象体に投与してさらに促進してもよい。
Ｂ．ガン
Ｔｈ２−促進サイトカインの発現は、ガン患者内で上昇すると報告されており（例えばYamamura, M., et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 1005-1010; Pisa, P., et al. (1992) Proc Natl. Acad, Sci. USA 89:7708-7712) そして悪性疾患はしばしば疾患の経過の悪化に従ってＴｈ１タイプ反応からＴｈ２タイプ反応にへのシフトが関連している。従って、本発明の刺激方法は、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトに対抗して作用する手段としてガン患者内のＴｈ２関連サイトカインの産生を阻害し、これにより患者内で起きているＴｈ１反応を促進し、疾患の経過を改善するために使用できる。刺激方法は、ガンを有する対象体への刺激剤の直接投与でも、または対象体から得た細胞（例えばＴｈｐまたはＴｈ２細胞）の刺激剤を用いる生体外処置および引き続いての対象体への細胞の再送達のいずれでも可能である。処置は、他のＴｈ１促進剤、例えばサイトカインＩＬ−１２またはＴｈ２−関連サイトカインへの抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）を、レシピエントに、Ｔｈ１タイプ反応をさらに刺激するために十分な量で投与してさらに促進してもよい。
Ｃ．感染疾患
Ｔｈ２−促進サイトカインの発現は、ＨＩＶ感染、肺炎、リューシマニア症、住血吸虫症、糸状線虫感染および腸管線虫感染を含む種々の感染疾患の間に増加すると報告されており（例えばShearer, G.M. and Clerici, M. (1992) Prog. Chem. Immunol. 54:21-43; Clerici, M. and Shearer, G.M. (1993) ImmunologyToday 14:107-111; Fauci, A.S. (1988) Science 239:617-623; Locksley, R.M. and Scott, P (1992) Immunoparasitology Today 1: A58-A61; Pearce, E.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:159-166; Grzych. J-M., et al. (1991) J. Immunol. 141:1322-1327; Kullberg, M.C., et al. (1992) J. Immunol. 148:3264-3270; Bancroft, A.J. et al. (1993) J. Immunol. 150:1395-1402; Pearlman, E. et al. (1993) Infect. Immun. 61:1105-1112; Else, K.J., et al. (1994) J. Exp. Med. 179:347-351 参照) 、そしてこのような感染疾患は、免疫反応におけるＴｈ１からＴｈ２へのシフトと関連もしている。従って、本発明の刺激方法は、感染疾患を有する対象体内に、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトに対抗する手段として使用して、Ｔｈ２関連サイトカインの産生を阻害して、これにより患者内の進行しているＴｈ１反応を促進し感染の経過を改善することができる。刺激方法は、感染疾患を有する対象体への阻害剤の直接投与または対象体から得た細胞（例えばＴｈｐまたはＴｈ２細胞）の刺激剤を用いる生体外処置、その後の対象体への細胞の再投与のいずれかを含むことができる。処置は、他のＴｈ１促進剤、例えばサイトカインＩＬ−２またはＴｈ２関連サイトカインへの抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）をレシピエントへ、Ｔｈ１タイプ反応をさらに刺激するために十分な量で投与してさらに促進してもよい。
Ｄ．自己免疫疾患
本発明の阻害方法は、Ｔｈ２タイプ機能不全と関連する自己免疫疾患の処置に治療的に使用できる。多数の自己免疫疾患は、自己の組織に対して反応性でありそして失陥の病理に関するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適当な活性化の結果である。Ｔ−ヘルパー−タイプ反応の調節は、自己免疫疾患の経過に影響することができる。例えば、実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、疾患の誘導期間におけるＩＬ−４の投与によるＴｈ２−タイプ反応の刺激は、自己免疫疾患の強度を低下する(Paul, W.E., et al. (1994) Cell 76: 241-251)。さらに、疾患から動物の回復は、Ｔｈ２−タイプ反応の増加と関連することが示され、これはＴｈ２特異性サイトカインの増加により証明される(Koury, S.J., et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1355-1364) 。さらに、ＥＡＥ分泌を抑制できるＴ細胞は、Ｔｈ２特異性サイトカインを分泌する(Chen, C., et al. (1994) Immunity 1: 147-154) 。ＥＡＥにおけるＴｈ２タイプ反応の刺激は、疾患に対する保護作用を有するので、多発性硬化症（ＥＡＥがこれのモデルである）を有する対象体内のＴｈ２反応の刺激は、治療的に有益であるらしい。本発明の阻害方法は、このような低下を起こさせるために使用できる。
【０１４８】
同様に、マウス内のタイプＩ糖尿病におけるＴｈ２タイプ反応の刺激は、疾患に対する保護作用を与える。実際に、ＩＬ−４（これはＴｈ２反応を促進する）を用いるＮＯＤマウスの処置は、これらのマウス内に通常は発生するタイプＩ糖尿病の発症を防止または遅延する(Rapport, M.J., et al. (1993) J. Exp. Med. 178:87-99) 。従って、糖尿病を患っているかまたは疑いがある対象体内のＴｈ２反応の刺激は、疾患の作用を改善するかまたは疾患の発症を阻害するであろう。
【０１４９】
Ｔｈ２タイプ反応が有益であるさらに別の自己免疫疾患は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）である。研究から、リウマチ様関節炎を有する患者は滑膜組織中に優勢なＴｈ１細胞を有することが示された(Simon, A.K., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5862-5866)。ＲＡを有する対象体内でＴｈ２反応を刺激して、有害なＴｈ１反応が同時に下降調節され、これにより疾患の影響を改善することができる。
【０１５０】
従って、本発明の阻害方法は、Ｔｈ２タイプ反応が疾患の経過に有益である自己免疫疾患を患っているかまたは疑いがある対象体内にＴｈ２−関連サイトカインの産生を刺激するために使用できる。この阻害方法は、対象体への阻害剤の直接投与または対象体から得た細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ細胞）の生体外処置およびその後の対象体への細胞の再投与のいずれかを含むことができる。処置は、さらに他のＴｈ２促進剤、例えばＩＬ−４自体またはＴｈ１−関連サイトカインに対する抗体を、Ｔｈ２タイプ反応をさらに刺激するために十分な量で対象体に投与して促進してもよい。
【０１５１】
Ｔｈ２反応が望ましい上記の自己免疫疾患とは反対に、別の自己免疫疾患は、Ｔｈ１−タイプ反応により改善されることもある。このような疾患は、本発明の刺激剤を用いて改善できる（ガンおよび感染疾患に対する上記のように）。この処置は、Ｔｈ１−促進サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を対象体にＴｈ１−タイプ反応をさらに刺激するために十分な量で投与してさらに促進してもよい。
【０１５２】
自己免疫疾患処置のための薬剤の効力は、ヒト疾患の上記の動物モデルで試験できる（例えば多発性硬化症のモデルとしてのＥＡＥおよび糖尿病のモデルとしてのＮＯＤマウス）かまたは別の良く特性が知られたヒト自己免疫疾患の動物モデルで試験できる。このような動物モデルは、エリテマトーデスに対するモデルとしてのｍｒｌ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス、リウマチ様関節炎に対するモデルとしてのネズミコラーゲン誘発関節炎、およびネズミ実験重症筋無力症を含む(Pauled., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp840-856 参照）。本発明の調節（すなわち刺激または阻害）剤を試験動物に投与し、そして試験動物内の疾患の経過を、使用した特定のモデルに対する標準方法により監視する。調節剤の有効性は、未処置動物（または対象薬剤で処置した動物）と比較して、薬剤を用いて処置した動物内の疾患状態の改善により明らかとなる。
【０１５３】
本発明に従って処置してもよい自己免疫疾患および自己免疫成分を有する疾患の限定的でない例は、真性糖尿病、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身エリテマトーデス、自己免疫甲状腺症、皮膚炎（アトピー性皮膚炎おおび湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーングレン症候群、シェーングレン症候群に従属する乾性角結膜炎を含む、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、クローン疾患、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、結腸炎、ゼンソク、アレルギー性ゼンソク、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病拮抗反応、血節性紅斑らい。自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死出血性脳障害、特発性両側進行性感覚神経性難聴、再生不全性貧血、真性赤血球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウエグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、偏平舌癬、クローン症、重症眼障害、サルコイドーシス、初期両側肝硬変、後部ぶどう膜炎、および間質性肺繊維症を含む。
Ｅ．移植
移植片拒絶および移植片受容は、グラフトレシピエント内の特定のＴ細胞サブセット（例えばＴｈ１またはＴｈ２細胞）の作用にのみ帰することはできないけれども（考察に関しては、Dallen, M.J. (1995) Curr. Opin. Immunol. 7:632-638参照）、多数の研究は、長期間の移植片持続における優勢なＴｈ２反応または移植片拒絶における優勢なＴｈ２反応を示している。例えば、移植片受容はＴｈ２サイトカインパターンの産生に関連しおよび／または移植片拒絶はＴｈ１サイトカインパターンの産生に関連する（例えばTakeuchi,T. et al. (1992) Transplantation 53: 1281-1291; Tzakis, A.G. et al., (1994) J. Pediatr. Surg. 29:754-756; Thai,N.L. et al. (1995) Transplantation 59: 274-281参照）。さらに、Ｔｈ２サイトカイン表現型を有する細胞の養子移入は、皮膚移植片持続を延長し(Maeda, H. et al. (1994) Int. Immunol. 6, 855-862)、そして移植片体宿主病を低下する(Fowler, D.H. et al. (1994) Blood 84: 3540-3549; Fowler, D.H. et al. (1994) Prog. Clin. Biol. Res. 389:533-540) 。さらに、Ｔｈ２分化を促進するＩＬ−４の投与は、心臓同種移植片持続を延長し(Levy, A.E. and Alexander, J.W. (1995) Transplantation 60: 405-406）、一方、Ｔｈ１分化を促進する抗ＩＬ−１０抗体と組み合わせたＩＬ−１２の投与は、皮膚同種移植片拒絶を増進する(Gorczynski, R.M. et al. (1995) Transplantation 60: 1337-1341)。
【０１５４】
従って、本発明の阻害方法は、移植レシピエント内にＴｈ２−関連サイトカインの産生を刺激して移植片持続を延長することができる。この阻害方法は、固体臓器移植および骨髄移植（例えば移植片対宿主病を阻害する）の両方に使用できる。阻害方法は、移植レシピエントに対する阻害剤の直接投与でもまたは対象体から得た細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ細胞）の阻害剤を用いる生体外処置および引き続く対象体への細胞の再投与のいずれも含むことができる。処置は、さらに他のＴｈ２促進剤、例えばＩＬ−４自体またはＴｈ１−関連サイトカインに対する抗体をレシピエントに、Ｔｈ２タイプ反応をさらに阻害するために十分な量で投与してさらに促進できる。
【０１５５】
上記の疾患状態に加えて、本発明の調節方法は、他の目的にも有用である。例えば、本発明の刺激方法（すなわち刺激剤を用いる方法）は、Ｔｈ１促進サイトカインの商業的産生のための生体外Ｔｈ１促進サイトカイン（例えばインターフェロン−γ）の産生を刺激するために使用できる（例えば、細胞を生体外で刺激剤と接触させてインターフェロン−γ産生を刺激でき、そしてインターフェロン−γは培養物上清から回収でき、必要な場合にはさらに精製し、そして商業使用のために包装する）。
【０１５６】
さらに、本発明の調節方法は、対象体内の関係する抗原に対するＴｈ１またはＴｈ２反応のいずれかを促進するワクチン接種に適用できる。すなわち、本発明の薬剤は、Ｔｈ１反応またはＴｈ２反応のいずれかのワクチンに対する免疫反応を指令するアジュバントとして役立つことができる。例えば、関係する抗原に対する抗体反応を促進するために（すなわちワクチン接種の目的で）、抗原および本発明の阻害剤を対象体に同時投与して対象体内の抗原に対するＴｈ２反応を促進でき、それはＴｈ２反応が有効なＢ細胞ヘルプを提供しそしてＩｇＧ１産生を促進するからである。あるいは、関係する抗原に対する細胞免疫反応を促進するために、抗原および本発明の刺激剤を対象体に同時投与して対象体内の抗原に対するＴｈ１反応を促進でき、それはＴｈ１反応が細胞媒介免疫反応（例えば遅延した過敏性反応）の発生を有利とするからである。関係する抗原および調節剤は、単一の薬剤組成物内に一緒に、または別々の組成物内に調剤できる。好ましい態様では、関係する抗原および調節剤は、対象体に同時に投与される。あるいは、ある状況では、抗原を最初に、次いで調節剤を投与するか、または逆が望ましいこともある（例えば、本来的にＴｈ１反応を引き起こす抗原の場合には、最初に抗原を単独で投与して反応を刺激し、次いで阻害剤を単独または抗原のブーストと一緒に投与して免疫反応をＴｈ２反応にシフトされると有益である）。
【０１５７】
本発明は、さらに下記の実施例で説明され、これらは限定的と解釈してはならない。この明細書中に引用したすべての引用文献、特許および公開特許の内容は、引用することにより編入される。さらに、本明細書中で言及した公開データベース内に寄託されたすべてのヌクレオチドおよび核酸配列も、引用することにより編入される。
【０１５８】
ｐＪＧ４−５ベクターのＥｃｏＲＩ部位内にクローンされたマウスＴ−ｂｅｔｃＤＮＡを含んでなる核酸分子は、American Type Culture Collection (Manassas, VA) に１９９９年１１月９日付けで寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−９３０が割り当てられた。ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローンされたヒトＴ−ｂｅｔｃＤＮＡ（ヒトＴｈ１クローンＲＯＴ−１０からのＲＮＡから調製）含んでなる核酸は、American Type Culture Collection (Manassas, VA) に２０００年１月２８日付けで寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１３３９が割り当てられた。両方の寄託物はブダペスト条約の規定に準拠してなされた。
【０１５９】
実施例
下記の実験手順を実施例で使用した。
マウス、細胞系統、サイトカイン、抗体およびプラスミド
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Jackson Laboratoriesから入手し、ＤＯ１１．１０ＴｃＲ−トランスジェニックマウス(Jacobson, N.G., et al. 1995, J. Exp. Med. 181, 1755-1762)、およびＭＢＰＴｃＲトランスジェニックマウス(Lafaille, J.J., 1994, Cell 78, 399-408)が記載されている。マウスは５〜６週齢で使用した。細胞系統(line)および一次細胞は、１０％ウシ胎児血清(HyClone Laboratories)、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ（１００ｍＭ）およびβ−ＭＥ（５０μｇ）を補足したＲＰＭＩ１６４０を含む完全培地内で維持した。ＪｕｒｋａｔはヒトＴｈ１リンパ腫、ＥＬ４はマウスＴｈＯ胸腺腫、ＮＫ３．３はヒトＮＫ細胞系統(Ye, J., 1995, J. Leuko. Biol. 58.225-233; Kornbluth, J., 1982, J. Immunol. 129.2831-2837)、ＹＴはヒトＮＫ細胞系統(Yodoi, J., 1985, J. of Immuno. 134, 1623-1630) 、ＡＥ７はマウスＴｈ１クローン、Ｄ１０はマウスＴｈ２クローンそしてＭ１２はＢ細胞リンパ腫系統である。組換えＩＬ−４はＤＮＡＸから入手し、ヒトｒＩＬ−２はChiron Corp.から入手した。ｒＩＬ−１２はHoffman LaRoche から入手し、そしてｒＩＬ−１８はPeprotech Inc.から購入した。モノクローナル抗ＩＬ−１２、モノクローナル抗ＩＦＮ−γおよびモノクローナル抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）も使用した(Ohara, J. and Paul, W.E., 1985, Nature 315, 333-336) 。ラビット内で産生したＴ−ｂｅｔポリクローナル抗血清およびｍＡｂは両方共に全長組換え細菌産生Ｔ−ｂｅｔに対して作製した。ｍＡｂは、マウスからの脾細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫(myleoma) に融合して作製そしてＩｇＧ１サブタイプである。発現プラスミドは、ｃ−Ｍａｆ（ｐＭｅｘ−ｍａｆ）(Ho, I-C., et al, 1996, Cell 85, 973-983) 、ＮＦＡＴｐ(Hodge, M.R., et al. 1996, Immunity 4, 1-20)およびｐ６５を含んでおり、後の２者はｐＣＤＮＡベクター内にクローンした。
ＣＤ４＋Ｔ細胞精製および生体外培養
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ節（ＬＮ）からＰＥ−接合抗ＣＤ４（ＲＭ４−４）(Pharmingen)を用いるフローサイトメトリーにより精製しそしてＦＡＣＳ(Mo Flo, Becton Dickenson)を用いて純度９８〜９９％まで選別した。生体外活性化のために、２ｘ１０⁶ ／ｍｌのＣＤ４＋細胞を完全培地内に再懸濁しそしてプレート結合１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（２Ｃ１１）および２μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８(Pharmingen)を用いて３日間、１００単位／ｍｌのＩＬ２の存在下で活性化した。次いで細胞を完全培地に１：４スプリットし、そして４日間、１００単位／ｍｌのＩＬ２の存在下で培養した。一次刺激の７日後に、細胞を採取し、２回洗浄しそして１μｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３を用いて１ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌで１、３および６時間再刺激した。Ｔｈ１およびＴｈ２分化培養のために、非−トランスジェニックまたはＤＯ１１．１０ＬＮおよび脾細胞をプールし、１ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌ完全培地内に再懸濁しそしてＴｈ１（１０ｍｇ／ｍｌ抗ＩＬ４〔１１Ｂ１１〕、１０ｎｇ／ｍｌｒＩＬ１２）またはＴｈ２（１０ｍｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γ、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ４）条件下、１μｇ／ｍｌプレート結合抗ＣＤ３を用いて培養した。細胞を３日目に、完全培地＋１００ｕ／ｍｌＩＬ２を用いて１：４スプリットした。７日目に、細胞を１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３を用いて４時間再刺激しそしてＲＮＡ調製のために採取した(Jacobson, N.G., et al. 1995, J. Exp. Med. 181, 1755-1762)。上清を２４時間目に採取しサイトカインを試験した。
ノーザンおよびウエスタンブロット分析
全ＲＮＡを休眠から単離しそしてＴＲＩＺＯＬ試薬(Gibco/BRI) を用いて細胞を刺激しそしてそれぞれの試料１０μｇを１．２％アガロース６％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、２０ＸＳＳＣ中のＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ膜（ＮＥＮ）上に一晩移行し、そしてＵＶＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ(Stratagene)を用いて共有結合した。ブロットのハイブリダイゼーションは、３２Ｐ：Ｔ−ｂｅｔ、γ−アクチンを用いて標識した下記のｃＤＮＡプローブを用いて記載(Hodge, M.R.,et al. 1996, Immunity 4, 1-20)に従って４２℃で行った。ウエスタンブロット分析のための核および細胞質抽出物をＡＥ７、Ｄ１０およびＮＫ３．３細胞から調製した。核を記載(Dolmetsch, R.E., et al. 1997, Nature 386, 855-858) に従って単離した。抽出したタンパク質を８％ＰＡＧＥにより分離し、次いでニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーし、そしてＴ−ｂｅｔに特異性のｍＡｂを用いてプローブし、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗マウスＩｇＧによりプローブしそしてメーカー(Amersham)の指定に従って化学発光を促進した。
一過性トランスフェクションアッセイ
ＥＬ４およびＪｕｒｋａｔ細胞を、５μｇレポータープラスミドおよび５〜１０μｇ発現プラスミドを用いてトランスフェクション当たりに０．４ｍｌＲＰＭＩ中の細胞５ｘ１０⁶ 個を用いるBioRadエレクトロポレーター（２８０Ｖ、９７５μＦ）を用いてトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイは、２４時間後に各試料の２０％内でルシフェラーゼ活性を用い、指定に従って測定した(Promega) 。ＩＦＮ−γレポータールシフェラーゼ構築物は、全ヒトＩＦＮ−γ遺伝子を含むプラスミドｐＢ９から誘導した(P. Gray and D.V. Goeddel, 1982, Nature, 298:859) 。ｐＧＬ２ルシフェラーゼ遺伝子をｐＢ９．ＩＬ−２プロモーター−レポーター構築物の第一エキソン内に挿入した。ＩＬ−４プロモーター−レポーター構築物、ＩＬ−４Ｌｕｃ、は、ネズミＩＬ−４遺伝子の８０７ｂｐ上流を含む。
レトロウイルス構築物および形質導入
ＧＦＰ−ＲＶビシストロン性ベクターは、Ｐｈｅｎｉｘ−Ｅｃｏパッケージング細胞系統(Kinoshita, S. et al. 1998, Cell, 95, 595-604)を有するとして記載されている(Ouyang, W. et al, 1998, Immunity 9: 745-755) 。ＧＦＰ−ＲＶベクターは、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム入口配列（ＩＲＥＳ）およびＧＦＰ対立遺伝子をＭＳＣＶ２．２レトロウイルスベクター(Ouyang, W. et al, 1998, Immunity 9: 745-755) またはＩＬ−２−ＭＳＣＶベクター内に挿入して構築した。両方のベクターは２個のｃＤＮＡ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＦＰをコードするｃＤＮＡを、ＩＲＥＳを使用して同時に発現しそれぞれのｍＲＮＡの翻訳を個別に開始した。パッケージング細胞系統のトランスフェクションおよび一次Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入は、本質的に記載の通りに行った(Ouyang, W. et al, 1998, Immunity 9: 745-755) 。
細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳ分析
サイトカインの細胞内染色は記載の通りに行った(Ouyang, W. et al, 1998, Immunity 9: 745-755) 。指定通りの種々の期間にわたってレトロウイルスを用いて感染した一次トランスジェニックまたは非−トランスジェニックＴ細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１ｕＭ）を用いて２時間刺激し、そしてブレフェルジン(Brefeldin) Ａ１０ｕｇ／ｍｌをさらに２時間で加えた。
【０１６０】
実施例１．新規の転写因子、Ｔ−ｂｅｔのクローニング
ＩＬ−２プロモーターのＴｈ１−特異性領域は良く定位されているので(Brombacher, F. et al., 1994,, Int. Immunol. 6: 189-197; Rooney, J., et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 6299-6310; Lederer, J.A.,et al. 1994, J. Immunol. 152, 77-86; Durand, D., et al. 1988, Mol. Cell Biol. 8, 1715-1724; Hoyos, B., et al.Science 244, 457-450) 、ＩＬ−２プロモーターレポーターおよびＯＦ６Ｔｈ１クローンから作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる酵母ワンハイブリッド法を、Ｔｈ１特異性転写因子を同定するために選択した。この方法を実証するために、ＩＬ−４プロモーターのＴｈ２特異性領域を酵母内で発現しそしてｃ−Ｍａｆの導入によりトランス活性化され、数種の他の転写因子（例えばＮＦＡＴ）ではされないことを実証した。ｃ−Ｍａｆトランス活性化は、ｃ−Ｍａｆ反応要素（ＭＡＲＥ）が変異した場合には起きなかった。従って、酵母ワンハイブリッド法を使用した。
【０１６１】
ＥＧＹ４８酵母株をＩＬ−２プロモーター／ヒスチジン構築物を用いて安定に組込みそして抗−ＣＤ３活性化Ｔｈ１細胞クローン、ＯＦ６から作製したｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換した。スクリーニングした５．６ｘ１０⁶ 個のクローン中、４８８個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニングで試験した２１０個のクローン中、７２個がＩＬ−２プロモーターに特異性であることが証明された。陽性クローンの数を減らすために、我々は酵母クローンｃＤＮＡを、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞系統内で分化的に発現したｃＤＮＡとハイブリダイズした。これらのＴｈ１−Ｔｈ２およびＴｈ２−Ｔｈ１ｃＤＮＡをClontechＰＣＲ選択キットを用いて作製し、放射能標識しそして最初にパイロット実験に使用して最も強い陽性のクローン１６個をスクリーニングした。これらのクローン１６個の中で、８個がＴｈ１（ＰＬ１７）特異性ｃＤＮＡ産物プローブと陽性であり、Ｔｈ２（Ｄ１０）特異性ｃＤＮＡ産物プローブとはそうではなかった。代表差異分析（ＲＤＡ、例えばLisitsyn, 1993,, Science, 259:946; O'Neill and Sinclair, 1997, Nucleic Acids Res. 25:2681; Hubank and Schatz,1994, Nucleic Acids Res. 22:5640; Welford et al. 1998 Nucleic Acids Res. 26:3059）をＴｈ１−Ｔｈ２プローブを用いて１６個の陽性クローンに関し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４に対するプローブの対照ハイブリダイゼーションを用いて行った。Ｔｈ１およびＴｈ２差し引きｃＤＮＡプローブの特異性は、それぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γ対ＩＬ−４の検出により証明された。
【０１６２】
制限酵素分析および配列決定データは、クローンのすべて８個が関連することを明らかにした。これらは５’および３’非翻訳領域内の差異に基づいて３群に分類され、これらの群のそれぞれは独立したｃＤＮＡ分子を表す。これらのクローンの配列をＮＣＢＩジーンバンク配列データベースと比較すると、転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーとの相同性が得られた。図１は、Ｔ−ｂｅｔの核酸およびアミノ酸配列を示す。
【０１６３】
実施例２．Ｔ−ｂｅｔは、Ｔ−ｂｏｘファミリーメンバーＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミン (eomesodermin) と相同の領域を共有する
ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＴは、Ｔ−ｂｏｘと呼ばれる２００アミノ酸ＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子のファミリーの創始メンバーである（総説はSmith, J. 1997, Current Opinion in Genetics & Development 7, 474-480; Papaioannou, and Silver, 1998, Bioassay, 20:9; Meisler, M.H. 1997, Mammalian Genome 8, 799-800）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ギリシャ語で「短尾」）突然変異は、短くて少しねじれた尾を持った異型接合動物内で、１９２７年に最初に記載された(Herrmann, B.G., 1990, Nature 343 , 617-622)。今ではＢｒａｃｈｙｕｒｙを含まないマウス中の８種のＴ−ｂｏｘ遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ〜６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）およびいまではＴ−ｂｅｔを含み、それぞれ明確で通常は複雑な発現パターンを有する。転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーは、ＤＮＡ結合ドメイン内のファミリーメンバーの相同性により定義される。Ｔ−ｂｅｔＤＮＡ結合ドメイン（ネズミＴ−ｂｅｔの残基１３８−３２７）は、ネズミＴ−ｂｒａｉｎのＴ−ｂｏｘドメインおよびゼノプスエオメソデルミンのＴ−ｂｏｘドメインに最も類似し、従ってＴ−ｂｏｘ遺伝子ファミリーのＴｂｒ−１サブファミリー内にＴ−ｂｅｔを位置させる。ネズミＴ−ｂｅｔタンパク質のヒト同族体は、マウスＴ−ｂｅｔに約８８％一致する。図１Ａは、Lipman-Pearsonタンパク質整列(G penalty設定 4およびlength penalty設定12）を用いて誘導した。類似性指数は、８６．６と算出された(Gap number 2 、gap length 5およびconsensus length 535）。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔ−ｂｏｘファミリーメンバーのＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデリウムを相同の領域を共有する。ネズミＴ−ｂｅｔＤＮＡ結合ドメインは、ネズミＴ−ｂｒａｉｎのＴ−ｂｏｘおよびゼノプスエオメソデリウムに最も類似している。３個のＴ−ｂｏｘ領域間で約６９％のアミノ酸一致がある。Ｔ−ｂｅｔはＴ−ｂｏｘドメインの外では他のＴ−ｂｏｘファミリーメンバーと配列相同性を持っていない。
【０１６４】
実施例３．Ｔ−ｂｅｔは共通Ｔ−ｂｏｘ部位に結合してトランス活性化しそして５’および３’領域の双方をマップする機能的に重要なドメインを有する
組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は、ＩＬ−２プロモーター内の共通Ｔ−ｂｏｘ部位およびＴ−ｂｅｔ部位に結合し、そして抗−ＣＤ３−刺激ＡＥ７Ｔｈ１細胞からの核抽出物内に存在する複合体は、共通（ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣ）Ｔ−ｂｏｘオリゴヌクレオチドプローブに特異的に結合する。Ｔ細胞内のＴ−ｂｅｔの活性を試験するために、下記の実験を行った。ＪｕｒｋａｔＴｈ１細胞にＴ−ｂｅｔとルシフェラーゼレポーター構築物とを同時トランスフェクションした。図２Ａは、共通Ｔ−ｂｏｘ部位の４コピーを有するかまたは有していない最少チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを含むルシフェラーゼレポーター構築物のＪｕｋａｔ細胞内の基底レベル（中空棒）およびＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）プラスイオノマイシン（１ｕＭ）誘発（黒棒）プロモーター活性を示す。それぞれのレポーター構築物は、図中に示すように、空のｐＣＤＮＡベクターまたは全長Ｔ−ｂｅｔｃＤＮＡを含むｐＣＤＮＡと同時トランスフェクションされた。示したデータは、３回の独立した実験の代表である。図２Ｂは、最少ＴＫプロモーターを含むルシフェラーゼレポーター構築物を用いて一時的にトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞および棒グラフの左側に示したＴ−ｂｅｔｃＤＮＡの指定領域を含む多量体化した共通Ｔ−ｂｏｘ部位およびｐＣＤＮＡベクターを示す。ルシフェラーゼ活性は、感染の２４時間後に測定した。実験を３回反復して同じ結果を得た。得られた基底レベル（中空棒）およびＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）プラスイオノマイシン（１ｕＭ）誘発（黒棒）プロモーター活性は、Ｔ−ｂｅｔがＴ細胞内で活性であり、そしてその活性が刺激によりさらに増加できることを証明した。
【０１６５】
実施例４．Ｔ細胞内のＴ−ｂｅｔ発現はＴｈ１サブセットに限定されそしてＴｃＲを介して伝達されるシグナルにより調節される
Ｔ−ｂｅｔをＴｈ１ｃＤＮＡライブラリーから単離しそして複数の臓器のノーザンブロット分析は、肺、胸腺および末梢リンパ器官内にのみ存在するＴ−ｂｅｔ転写物を明らかにした。
【０１６６】
図３Ａは、Ｔ−ｂｅｔがダブルネガティブ(double negative) （ＤＮ）胸腺細胞内に優先的に発現し、ダブルポシティブ(Double positive) （ＤＰ）およびシングルポジティブ(single positibe) （ＳＰ）細胞内では発現しないことを示す。培地またはプレート結合抗ＣＤ３（２Ｃ１１）を用いて６時間処理されたＴｈ１細胞クローン（ＡＥ７およびＤ１．１）またはＴｈ２クローン（Ｄ１０およびＣＤＣ３５）から単離された全細胞ＲＮＡのノーザンブロット分析は、Ｔｈ１クローン内のみでＴ−ｂｅｔ転写物が明らかになった。全細胞ＲＮＡは、培地またはプレート結合抗ＣＤ３（２Ｃ１１）を用いて６時間処理されたＴｈ１細胞クローン（ＡＥ７およびＤ１．１）またはＴｈ２クローン（Ｄ１０およびＣＤＣ３５）から単離された。全ＲＮＡは、培地またはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１ｕＭ）を用いて６時間処理されたＭ１２（Ｂ細胞リンパ腫）およびＥＬ４（Ｔ細胞リンパ腫）からも単離された。ノーザンブロット分析は、標準方法を用いてレーンあたりに全ＲＮＡ１０ｕｇを用いて行い、そして全長Ｔ−ｂｅｔｃＤＮＡを用いてプローブした。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１クローン中に優先的に発現された。さらに、Ｔ−ｂｅｔ発現のレベルは、ＴｃＲを介して伝達されたシグナルにより増加し、これは抗−ＣＤ３によるＴ−ｂｅｔ転写物の誘導により証明された。Ｔ−ｂｅｔ転写物は、細胞を培地またはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１ｕＭ）を用いて６時間処理した場合に、Ｍ１２、Ｂ細胞リンパ腫内、Ｔ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ内またはＥＬ４、Ｔｈ０細胞胸腺腫内のいずれでも検出されなかった。
【０１６７】
一次Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔのタンパク質レベルを決定するために、ＤＯ１１．１０ＴｃＲトランスジェニック脾細胞をＴｈ１またはＴｈ２極性化条件下で培養した。７２時間後に、２００Ｕ／ｍｌＩＬ−２を有する新しい培地内で細胞を３倍に拡大した。一次刺激から７日目に、核およびサイトゾル抽出物を、休息またはＰＭＡ／イオノマイシン活性化（１時間）バルクカルチャーＤＯ１１．１０Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から調製した。核抽出物も休息していたＭ１２、ＥＬ４、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＫ３．３およびＹＴ細胞から調製した。図３Ｃに示すように、細胞系統中で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質はＹＴ細胞内にのみ存在した。図３Ｃは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質がＴｈ１細胞およびＮＫ細胞内のみに限定されていることを示す。ウエスタンブロット試験を、休息またはＰＭＡ／イオノマイシン活性化（１時間）したバルクカルチャーＤＯ１１．１０Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から上記のように調製した核およびサイトゾル抽出物に関して行った。要約すると、ＤＯ１１．１０テルトランスジェニック(tertransgenic) 脾細胞を、Ｔｈ１表現型発生を促進するためには１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−１２および１０ｕｇ／ｍｌ抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、Ｔｈ２表現型発生を促進するためには１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４および１０ｕｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γの存在下で、３ｘ１０⁶ 細胞／ｍｌのＯＶＡペプチド（３２３−３３９）を用いて活性化した。７２時間後に、細胞を２００Ｕ／ｍｌＩＬ−２を用いて新しい培地中で３倍に拡大した。一次刺激から７日目に、核およびサイトゾル抽出物を、休息またはＰＭＡ／イオノマイシン活性化（１時間）バルクカルチャーＤＯ１１．１０Ｔｈ１およびＴｈ２細胞から調製した。核抽出物も休息していたＭ１２細胞、ＥＬ４、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＫ３．３、およびＹＴから調製した。核およびサイトゾル抽出物の３０ｕｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ゲル）により分離し、ニトロセルロースへ移行し、そして抗Ｔ−ｂｅｔ抗血清を用いてプローブした。一次Ｔ細胞中で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質が、Ｔｈ１駆動Ｔ細胞内で選択的に発現され、Ｔｈ２経路では発現されず、これは上記のＴ細胞クローンおよび一次Ｔ細胞のノーザンブロット分析と一致する。
【０１６８】
Ｔ−ｂｅｔに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＦＡＣＳ分析によりＴ−ｂｅｔタンパク質の直接可視化を可能とした。図３Ｄは、Ｔ−ｂｅｔが、活性化されたＡＥ７Ｔｈ１細胞内でのＦＡＣＳにより可視化できることを示す。Ｄ１０（Ｔｈ２）またはＡＥ７（Ｔｈ１）細胞を、培地またはイオノマイシン（１ｕＭ）を加えたＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）中で２時間および２ｎＭモネムシンでさらに３時間用いて処理した。細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．５％サポニンを浸透させ、そして培地（破線）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（点線）またはアフィニティー精製した抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体α３Ｄ１０（実線）を用いて染色し次いでヤギ−マウスＩｇＧ１−ＰＥ染色した。ＦＡＣＳキャリバー(Calibur) 上のフローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。マウスモノクローナル抗体は、細菌産生Ｔ−ｂｅｔに対して作製した。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、Ｄ１０細胞中では検出できず、非刺激ＡＥ７細胞中には低いレベルで存在しそして刺激ＡＥ７細胞中では増加したレベルで存在した。これらを総合すると、ここに詳細に記載した実験は、Ｔ細胞中で、Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１細胞内で選択的に発現されここれ発現のレベルはＴｃＲに由来するシグナルにより調節されることを証明する。
【０１６９】
実施例５．Ｔ−ｂｅｔ発現はＮＫおよびＢ細胞中のＩＦＮ−γ誘導と相関する
ＩＬ−２プロモーター中のＴ−ｂｏｘ部位への結合によりその単離と連結するＴ−ｂｅｔのＴｈ１限定発現は、Ｔ−ｂｅｔがＩＬ−２遺伝子の転写を活性化するのではないかと示唆する。しかし、２種のＩＬ−２産生細胞系統、ＪｕｒｋａｔおよびＥＩ．４がＴ−ｂｅｔを発現せず、一方、ＩＦＮ−γを産生するがＩＬ−２はしないＮＫ細胞系統ＹＴは、Ｔ−ｂｅｔを発現することは謎である。さらに、ＩＬ−２プロモーター中の優れたＴ−ｂｏｘ部位の存在にもかからわず、予備的実験は、Ｔ−ｂｅｔによるＩＬ−２遺伝子のトランス活性化を証明しなかった。他のＴｈ１特異性サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよびＬＴを含む。Ｔ−ｂｅｔの発現は、ＩＦＮ−γの発現と良く相関する。さらに、Ｔ−ｂｏｘ部位は、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子の第三イントロン内に存在することが分かった。Ｔｈ１特異性ＤＮアーゼ過敏性部位がこの領域に位置決定されたので、このことは特に注目に値する。
【０１７０】
Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γ遺伝子の発現を制御する可能性を試験するために、Ｔｈ１細胞以外の細胞内でのＴ−ｂｅｔの発現およびＩＦＮ−γの発現を測定した。ＩＦＮ−γは、天然キラー（ＮＫ）細胞内で低レベルで発現し、そしてＩＬ−２およびＩＬ−１２を用いる処理で高レベルに誘導される(Kornbluth, J., et al. 1982, J. Immunol. 129:2831; Ye et a l. 1995, J. Leuko. Biol. 58:225)。従って、ＮＫ３．３細胞系統を２４時間、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−２＋ＩＬ−１２を用いて処理し、溶解物を調製しそして上記のようにＴ−ｂｅｔｍＡｂを用いてウエスタンブロット試験を行った。図４ｂは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の協力誘導およびＮＫ３．３細胞内でのＩＦＮ−γの分泌を示す。ＮＫ３．３細胞系統を２４時間、ＮＫ細胞内でＩＦＮ−γを誘導することが知られている試薬、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−２＋ＩＬ−１２を用いて処理し、溶解物を調製し、そして上記のようにＴ−ｂｅｔｍＡｂを用いてウエスタンブロット試験を行った。細胞から採取した上清上でＥＬＩＳＡを行った。
【０１７１】
基底でＩＦＮ−γを産生しないＢ細胞は、抗ＣＤ−４０抗体およびＩＬ−１２およびＩＬ−１８の組み合わせを用いる処理により、大量のＩＦＮ−γを産生するように駆動できる(Yoshimoto, T., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3948-3953)。精製したＢ細胞を７２時間、抗−ＣＤ４０ｍＡｂ、ｒＩＬ−１２およびｒＩＬ−１８を用いて処理し、ＲＮＡを単離し、そして上記のようにＴ−ｂｅｔｃＤＮＡを用いてノーザンブロットを行った。図４Ａは、この試薬の組み合わせを用いて処理したＢ細胞内のＴ−ｂｅｔｍＲＮＡの誘導を示し、そしてこれらの細胞内のＩＦＮ−γ転写物の誘導を確認した。結論として、いずれの細胞タイプもＴ−ｂｅｔを構成的に発現しないが、ＮＫ３．３細胞およびＢ細胞の両者は、ＩＦＮ−γ産生ももたらす条件下でそのように誘導できる。従って、Ｔ−ｂｅｔの発現のパターンは、ＩＦＮ−γ遺伝子の転写と良く相関する。
【０１７２】
実施例６．Ｔ−ｂｅｔはＴｈ細胞内のＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化する
ＩＦＮ−γ遺伝子の調節領域に関してはこれまでほとんど知られていない。特に、組織−特異性発現を指令する遺伝子の領域は生体外でも生体内でも同定されていない。上流配列の５００ｂｐまたは３ｋｂを含むレポーター構築物がＴｈ１およびＴｈ２細胞内で発現されることが証明された(Young, H.A., 1994, J. ofImmuno. 153:3606-3610)。ＩＦＮ−γプロモーターまたはイントロン中のＡＴＦ−２、ＮＦκＢ、ＡＰ−１およびＳｔａｔ４部位は、機能的に重要と考えられるが、しかし明らかに組織特異性発現には関与しない(Young, H.A., 1994, J. ofImmuno. 153:3606-3610; Sica, A., 1997, J. Biol. Chem. 272,30412-30420; Penix, L. 1993, J. Exp. Med. 178, 1483-1496; Penix, L. A., 1996, J. Biol. Chem. 271, 31964-31972)。同様に、Ｔｈ１優先ＤＮアーゼ過敏部位が第一および第三イントロンの両方の中で認められているが、これらのイントロン中に位置する関連ｃｉｓ要素は同定されていない(Young, H.A., 1994, J. of Immuno. 153:3603-3610; Agarwal, S. and Rao, A. 1998, Immunity 9, 765-775) 。従って、全ＩＦＮ−γ遺伝子を含むレポーター構築物をこの研究に使用した。使用されたＩＦＮ−γレポーター遺伝子は、上流配列３ｋｂ、３種すべてのイントロンを有する全コーディング配列、および下流の１．５ｋｂを含む(Xu, X., et al. 1996, Science 273, 794-796) 。
【０１７３】
ＪｕｒｋａｔヒトＴｈ１リンパ腫およびマウスＥＬ４Ｔｈ０胸腺腫(tyymoma) 内のＩＦＮ−γ遺伝子の９ｋｂを含むルシフェラーゼレポーター構築物の活性を試験した。それぞれのレポーター構築物（１０ｕｇ）を空のｐＣＤＮＡベクターまたは全長Ｔ−ｂｅｔｃＤＮＡ、ｃ−Ｍａｆ、ＮＦＡＴｐまたはｐ６５（１０ｕｇ）を含むｐＣＤＮＡを用いて同時トランスフェクションした。構築物は−４００〜−４０ＩＬ−２およびＩＬ−４ルシフェラーゼレポーターも含む。
【０１７４】
ＩＬ−２およびＩＬ−４を産生するがしかしＩＦＮ−γは産生しないＴｈ０マウスＴ細胞胸腺腫ＥＬ４を、Ｔ−ｂｅｔｃＤＮＡ発現プラスミドおよびＩＦＮ−γルシフェラーゼレポーターを用いてトランスフェクションした（図５）。Ｔ−ｂｅｔ発現プラスミドの導入は、空のベクター単独と比較して、ＩＦＮ−γ遺伝子の（約２０〜３０倍）トランス活性化をもたらした。これは、２種の他の因子、すなわちＴｈ２−特異性転写因子ｃ−ＭａｆおよびＴｈ−非−選択性転写因子ＭＦＡＴによるトランス活性化が存在しない場合と対照的である。興味あることには、ＮＦκＢファミリーメンバーｐ６５は、それ自体上のＩＦＮ−γレポーターをトランス活性化しないけれども、Ｔ−ｂｅｔおよびｐ６５の構築物は、共同作用活性化をもたらす。
【０１７５】
ＩＬ−２プロモーターの試験をＴｈ１−特異性であると知られているプロモーターの領域を用いて行った(Lederer, J.A., et al. 1994, J. Immunol. 152, 77-86)。Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬ−２プロモーターの活性を約１０倍抑制した。これは特にＰＭＡおよびイオノマイシンを用いるプロモーターの活性化の場合に著しい。前と同様に、ＩＦＮ−γ遺伝子の本質的なトランス活性化が認められた。Ｔ−ｂｅｔ活性は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ遺伝子に対して特異性であり、それはＩＬ−４プロモーター（図５）またはＴＮＦ−αプロモーターのトランス活性化に対する作用が存在しないからである。これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γ遺伝子の転写を特異的に活性化し、そしてＩＬ−２遺伝子の転写を抑制することを証明する。
【０１７６】
内因性遺伝子発現を試験するために、ＥＬ−４細胞を一時的にＴ−ｂｅｔまたは空ベクターを用いてトランスフェクションし、そしてＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡにより、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いる刺激の４８時間後に測定した（図５）。上記のトランス活性化データと一致して、ＥＬ４細胞内のＴ−ｂｅｔのエピトープ性発現は測定可能なＩＦＮ−γ産生に導き、一方対照ベクターを用いたトランスフェクションは検出可能なＩＦＮ−γをもたらさなかった。
【０１７７】
実施例７．一次Ｔｈ細胞内へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子媒介転移は、増加したＩＦＮ−γ産生をもたらす
上記の実験は、ＩＦＮ−γ遺伝子の転写制御におけるＴ−ｂｅｔの重要な役割を強く主張する。
【０１７８】
ウシコラーゲン特異性Ｔｈ０ハイブリッドを、Ｔ−ｂｅｔＧＦＰまたはＧＦＰのみを含むレトロウイルス構築物を用い、ＴｃＲ誘導可能ＩＬ−２プロモーターの制御下で形質導入した。形質導入した集団をＧＦＰ上で２回ＦＡＣＳ選別し、休息し次いで抗ＣＤ３を用いて刺激しそして６０時間後に上清を集め、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生を測定した（図６）。作用を受けなかった対照レトロウイルスベクターは、アンチセンスＴ−ｂｅｔを含んでいた。
【０１７９】
Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γの組織特異性発現の原因であるかどうかをさらに試験するために、非−トランスジェニックおよびＴｃＲトランスジェニックの両方の一次Ｔ細胞内に、Ｔ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子媒介転移を行った。Ｔ−ｂｅｔおよびＧＦＰの両者を発現する２種の異なるビシストロン性レトロウイルスを使用した。第一はＩＬ−２誘導可能プロモーターの制御下でＴ−ｂｅｔを発現し、そして第二はＭＳＣＶＬＴＲの制御下でＴ−ｂｅｔを発現する。両方の構築物で類似した結果が得られた。
【０１８０】
抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８による一次活性化の３６時間後にＢＡＬＢ／ｃＣＤ４Ｔ細胞を感染し、７日目に採取しそして細胞内ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２染色をＰＭＡおよびイオノマイシン刺激の５時間後に、実験手順に記載の方法で行った。データは、ＣＤ４の発現に関してゲートを設けたイベントのＧＦＰ発現（ＦＬ１）対細胞内サイトカイン（ＦＬ２）を示す二色プロットである。ＭＢＰＴｃＲトランスジェニックマウスからの一次Ｔ細胞を６ｕＭのＭＢＰ（Ａｃ１−１１）を用いて刺激しそして感染は１日目にＩＬ−２／ＧＦＰおよびＩＬ−２／Ｔ−ｂｅｔ／ＧＦＰを用いて行った。７日目に、ＧＦＰ発現に関して細胞を選別し、１日休息し、次いでＰＭＡおよびイオノマイシンを用いる刺激の５時間後に細胞内サイトカイン分析を行った。
【０１８１】
ナイーブＭＢＰトランスジェニックまたは非−トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃＣＤ４Ｔ細胞を、ＭＢＰ１−１１および抗ＣＤ３を用い、非−極性化条件下で活性化し、そして一次活性化の１日目後にレトリウイルスを用いて記載(Ouyang, W. et al., 1998, Immunity 9:745-755) のようにして感染させた。細胞を７日間培養し、次いでＧＦＰ発現を測定して感染された細胞の割合を決定した。ＧＦＰ陽性細胞を選別しそしてサイトカイン産生を、ＰＭＡおよびイオノマイシンを用いる刺激からさらに４時間後に細胞内染色により測定した。ＭＢＲ−ＴｃＲトランスジェニックおよび非トランスジェニックＴ細胞のＴ−ｂｅｔを用いる形質導入は、ＧＦＰ単独で形質導入した細胞と比較してＩＦＮ−γを産生する細胞の数および細胞あたりに産生されるＩＦＮ−γの量の両方で印象的な増加をもたらした（図７）。
【０１８２】
刺激の後の初期のナイーブＴｈｐ細胞は大量のＩＬ−２を産生し、次いでこれはエフェクターサイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−４により極性化Ｔｈ細胞中に逐次置換される。極性化Ｔｈ１細胞はＩＬ−２を産生するが、しかしナイーブＴｈｐよりも著しく少ない量である。極性化Ｔｈ２細胞はＩＬ−２産生を遮断する。Ｔ−ｂｅｔ形質導入Ｔｈ細胞は、ＧＦＰ／ＲＶ対照形質導入細胞よりいくらか少量のＩＬ−２を産生し、これは我々がＥＬ−４細胞内で観察したＴ−ｂｅｔによるＩＬ−２プロモータートランス活性化の抑制と一致する。Ｔ−ｂｅｔによるＩＬ−２の抑制は、ナイーブ前駆体細胞から完全に分化したエフェクター細胞への系統コミットメントの駆動におけるＴ−ｂｅｔに対する機能と一致する。
【０１８３】
実施例８．Ｔ−ｂｅｔは、発生中のＴｈ２細胞においてＩＦＮ−γを活性化しそしてＩＬ−４ー産生を抑制する。
【０１８４】
上記の実験は、Ｔ−ｂｅｔが非偏向(unskew)Ｔｈ細胞をＴｈ１経路へ指令できることを証明する。通常はＴｈ２経路へ駆動する刺激がない場合でもＴｈ１経路に沿って遺伝プログラムを指令するようにＴ−ｂｅｔがＴｈ細胞を強制できることを試験した。図８の実験において、ＢＡＬＢ／ｃＣＤ４＋Ｔ細胞をｒＩＬ−４ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２に対する抗体の存在下で抗−ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて活性化し、レトロウイルス感染を３６時間後に行い、細胞をＩＬ−２を用いて拡大し、ＧＦＰ陽性細胞を７日目に選別し、そしてＰＡＭ＋イオノマイシンを用いる刺激のさらに４時間後にサイトカイン産生を細胞内染色により測定した。ＧＦＰ−ＲＶ単独を用いる形質導入は、１３．４％ＩＬ−４産生細胞および０．９％ＩＦＮ−γ産生体を含む集団をもたらした（図８）。期待の通りに、Ｔｈｐ細胞は、この時点では完全には極性化されていない。Ｔ−ｂｅｔ／ＧＦＰ／ＲＶの導入は、ＴｈｐのＴｈ１経路への実質的なシフトを生み、これはＴｈ１分化を阻害する条件下（ｒＩＬ−４および抗ＩＬ−１２）でもＩＦＮ−γを産生する多数の細胞（５０％）およびＩＬ−４を産生する細胞の数（３．５％）の低下により証明された。従って、Ｔ−ｂｅｔは、サイトカインにより送られるＴｈ２−促進シグナルを克服してＴｈ細胞発生をＴｈ１経路内に駆動できる。
【０１８５】
実施例９．Ｔ−ｂｅｔは極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路に転向する
Ｔｈ１およびＴｈ２集団の可逆性が極性化条件下での長期刺激の後に失われることが証明された。可逆性は、一週間後に大部分が排除され、３週間後には完全に失われる(Murphy, E. et al., 1996, J. Exp. Med. 183, 901-913)。Ｔ−ｂｅｔがすでに極性化されたＴｈ２細胞の純粋の集団のコミットメントを転向できるかどうかを決定するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上記のように培養しそしてレトロウイルス遺伝子性質導入を増殖の９日目に行った。Ｔｈ２極性化条件下で９日間培養したＴｈ細胞中で、対照ＧＦＰ／ＲＶ形質導入細胞は、実際的にすべてＩＬ−４およびＩＬ−５産生体（２３％および１１％）であり、ほとんど検出できないＩＦＮ−γ産生細胞（６％）を伴っていた（図９）。従って、期待の通りに、ほぼ完全な極性化が起きた。注目すべきは、これらの完全に極性化したＴｈ２細胞中へのＴ−ｂｅｔの導入は、これらを極性化Ｔｈ１細胞に転向または変換し、これはＩＦＮ−γ発現の誘導およびＩＬ−４およびＩＬ−５発現の欠失により証明された。この変換は、外因性ＩＬ−４の存在下で起きた。Ｔ−ｂｅｔ−形質導入Ｔｈ２細胞の７７％全部がここでＩＦＮ−γを産生し、一方ＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する細胞の割合は、それぞれ１３％および１％に低下した。従って、これらのＴ−ｂｅｔ形質導入細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の両方を産生するＴｈ０細胞ではない。従って、Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ２細胞内で単にＩＦＮ−γ発現を誘導するだけでなく、実際にＴｈ２細胞を反対のＴｈ１サブセット内に再プログラムする。
実施例１０．Ｔ−ｂｅｔは極性化Ｔｃ２細胞もＴｈ１経路に転向する
最大の注目はＣＤ＋４Ｔリンパ細胞に向けられているけれども、細胞毒性ＣＤ＋８Ｔ細胞もＩＦＮ−γ産生（Ｔｃ１）およびＩＬ−４産生（Ｔｃ２）サブセットに分裂することも明らかである。完全に極性化されたＴｃ２細胞をＴｃ１経路に転向するＴ−ｂｅｔの能力を試験した。従って、精製したＣＤ＋８Ｔ細胞をＴｃ２極性化条件下で９日間分化させて完全な分化に達した。図１０は、Ｔ−ｂｅｔがＴｃ２細胞を形質導入し、これはＴ−ｂｅｔがＣＤ４を形質導入したと類似していたことを示している。Ｔｈ２細胞はＩＦＮ−γを産生し（８５％対１５％）、そしてＩＬ−４およびＩＬ−５産生を抑制（それぞれ３％対３４％および１％対４５％）するようにプログラメされた。従って、Ｔ−ｂｅｔは完全に分化したＣＤ＋８Ｔｃ２細胞をＴｃ１細胞に転換できる。
【０１８６】
実施例１１．Ｔ−ｂｅｔはチロシンリン酸化である
Ｔ−ｂｅｔがチロシンリン酸化タンパク質であるかどうかを決定するために、ＡＥ７Ｔｈ１細胞からの全細胞溶解物を、ペルバナデート(pervanadate) を用いるインキュベーションの０、５、１０、３０分後に調製した。溶解物をＴ−ｂｅｔ抗血清を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ゲル）により分離し、ニトロセルロースに移行し、そして抗ホスホチロシンｍＡＢ４Ｇ１０を用いてプローブした。暴露の後、ブロットをストリップしそして抗Ｔ−ｂｅｔ抗血清を用いて再プローブした。図１１に示すように、Ｔ−ｂｅｔは明らかにＴ細胞内でチロシンリン酸化されたタンパク質である。
【０１８７】
実施例１２．優性陰性Ｔ−ｂｅｔ分子の創成
キメラｃＤＮＡ分子を、Ｔ−ｂｅｔＤＮＡ結合ドメイン（残基１３８−３２７）およびショウジョウバエタンパク質ｅｎｇｒａｉｌｅｄのレプレッサードメインを用いて作製した。ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質は、転写の強力で活性なレプレッサーである(Taylor, D., 1996, Genes Dev. 10,2732; Li, J. Thurm,. H. et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10885)。多量体化Ｔ−ｂｏｘ共通部位／ＴＫ最少プロモータールシフェラーゼレポーター構築物を生体外で用いたＴ−ｂｅｔ−ｅｎｇｒａｉｌｅｄ構築物。図１２に示すように、Ｔ−ｂｅｔ／ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、Ｔ−ｂｏｘレポーター構築物を５：１比でトランス活性化するｗｔＴ−ｂｅｔの能力を特異的かつ著しく抑制し、それぞれＮＦＡＴｐおよびｐ６５発現構築物によるＮＦＡＴおよびＮＦκＢレポーターのトランス活性化を抑制しない。
【０１８８】
実施例１３．ＩＬ−２プロモーターのＴ−ｂｏｘの変異はＩＬ−２プロモーター活性を低下する
最近、ＤＮＡに結合したＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子のＴ−ｂｏｘ領域の結晶構造が解明されそして特異性ＤＮＡコンタクト(contact) またはマイナーコンタクトに本質的なアミノ酸部分が誘導された。ヒトおよびネズミＩＬ−２近位プロモーターの検査は、Ｔ−ｂｏｘファミリーメンバーを結合するために重要なヌクレオチドが存在することを示す。具体的には、ネズミＩＬ−２プロモーターの−２４０〜−２２０ｂｐは共通Ｔ−ｂｏｘ部位に強い類似性を有する。共通Ｔ−ｂｏｘ部位は、ＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴ
Ｔを含んでなる、ヒトＩＬ−２プロモーターは、ｇＡｇｃＴａｔＣＡＣ
ＣＴＡａＧＴＧＴＧｇｇｃＴａを含んでなる。ネズミＩＬ−２プロモー
ターは、ＡＡａｃＴｇｃＣＡＣＣＴＡｇＧＴＧＴＧｇｇｃＴａ
を含んでなる。変異Ｔ−ｂｏｘｍＩＬ−２プロモーターは、ＡＡａｃＴｇｃｔｇｔＣＴＡａａｃａＴＧｇｇｃＴａを含んでなる（ＤＮＡコンタクトは太字、マイナーコンタクトは下線を付した）。ＤＮＡ−タンパク質相互作用に本質的な結晶構造により示されるトランスバージョンナル・ヌクレオチド置換は、この推定Ｔ−ｂｏｘ部位内に、ネズミ−４４０〜−４０ｂｐＩＬ−２プロモーターの範囲内で作製された。ＩＬ−２リシフェラーゼレポーター構築物のＪｕｒｋａｔ細胞（左）またはＡＥ７Ｔｈ１クローン（右）内の基礎レベル（中空棒）およびＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）プラスイオノマイシン（１ｕＭ）誘導（黒棒）プロモーター活性を示した（図１３）。
【０１８９】
Ｔ−ｂｅｔの役割は、Ｔｈ細胞の分化を駆動することであり、これは同時にＩＦＮ−γ遺伝子を誘導およびＩＬ−２遺伝子を抑制するその能力により証明される。抗原を未経験のＴｈｐ細胞はＩＬ−２のみを産生する。刺激を受けると、ＩＬ−２産生は低下しそしてＴｈ成熟エフェクターサイトカインの産生により置換される。特に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４を産生する能力を取得するとＩＬ−２産生を停止し、そして同時にＩＦＮ−γを誘導そしてＩＬ−２遺伝子を抑制するＴ−ｂｅｔの能力は、Ｔｈ２細胞内に特に顕著である。同時にＩＦＮ−γプロモーターをトランス活性化しそしてＩＬ−２プロモーターを抑制するＴ−ｂｅｔの能力は、従ってナイーブＴｈｐの分化の推進におけるＴ−ｂｅｔの役割と一致する。Ｔ−ｂｅｔは、上流プロモーター配列の３ｋｂのみを含む構築物をトランス活性化することが示され、これは位置−２３００〜−２２９１および−１９５７〜−１９４８における２個のＴ−ｂｏｘ部位の存在と一致する。しかし、プロモーターのこの領域はＴｈ１−特異性ではないので、第三イントロン内のＴ−ｂｏｘ部位も重要でありそして遺伝子のどこかに追加のＴ−ｂｏｘ部位が存在すると考えられる。
【０１９０】
Ｔ−ｂｏｘドメインは、最近ＤＮＡと同時結晶化されそしてメジャーおよびマイナーグルーブ両方の中でタンパク質がＤＮＡに接触している新規の配列特異性ＤＮＡ認識構造を証明した(Mueller, C.W. and Herrmann, B.G., 1997, Nature389,884-888)。生体外標的部位選択により規定された共通Ｔ−ｂｏｘ結合部位は、パリンドローム５’−ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣ−３’であった。ＩＬ−２プロモーターの検査は、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質が結合するＮＦκＢ部位の５’の−２４０〜−２２０丁度にある優れたＴ−ｂｏｘ部位を明らかにした。ＩＬ−２プロモーターへのＴ−ｂｅｔの結合は、酵母ワンハイブリッドスクリーンにおけるその単離を説明し、ここで、リードアウトは、ＩＬ−２プロモーター内のＴ−ｂｏｘ部位へのＴ−ｂｅｔの結合に単に依存して人工レポーターを駆動する。Ｔ−ｂｅｔによるＩＬ−２活性の明瞭な抑制にもかかわらず、Ｔ−ｂｏｘ部位の変異の際のＩＬ−２プロモーター活性の低下が観察された。しかし、そのＴ−ｂｅｔはＴ−ｂｏｘ部位が変異されたＩＬ−２プロモーター構築物のトランス活性化をまだ抑制できる。これは、ＩＬ−２プロモーター中の別のＴ−ｂｏｘ部位の存在か、または近くで結合する別の正に作用する因子との干渉のいずれかの存在を示唆する。この因子の良い候補は、Ｔ−ｂｏｘ部位に丁度隣接する部位ＴＧＧＧＣＣに結合するRothenbergらが記載した活性である(Chen, D. and Rothenberg, E.V., 1994, J. Exp. Med. 179,931-942) 。
【０１９１】
さらに、Ｔ−ｂｅｔはＴｈｐおよびＴｈ２細胞内のＴｈ２プログラムを抑制する。これは、ＩＦＮ−γとＩＬ−４との間の前者に有利な不均衡の直接の結果ではないと考えられる。Ｔｈ２プログラムを抑制し、同時にＴｈ１プログラムを促進するＴ−ｂｅｔの作用は、ＧＡＴＡ−３およびｃ−Ｍａｆの記憶であり、この両者ともに間接的にＩＦＮ−γ発現を抑制し、前者はＩＬ−１２受容体β２鎖の発現への影響を通じる(Ho, I-C., et al. 1998, J. Exp. Med. 188:1359-1366;Ouyang, W. et al., 1998, Inhibition of Th1 developmental mediated by GATA-3 through an IL-4 independent mechanism. Immunity 9: 745-755) 。しかし、ＧＡＴＡ−３およびｃ−Ｍａｆとは異なり、Ｔ−ｂｅｔは実際に反対経路内に完全に極性化したエフェクターＴｈ細胞を変換できる。
【０１９２】
均等事項
当該技術分野の熟練者は、日常的な実験を越えることなく、本明細書中に記載した本発明の特定の態様に等価な多数の事項を認め、または確認できるであろう。このような等価事項は、別記の特許請求の範囲内に包含されると考える。
【図面の簡単な説明】
【図１】１ＡはネズミおよびヒトＴ−ｂｅｔのヌクレオチド配列整列を示す。この整列は、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて作製された。１Ｂは、Lipman Pearsonタンパク質整列プログラムを用いて作製したネズミおよびヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸配列整列を示す。Ｔ−ｂｏｘ配列を太字で示す。チロシンリン酸化部位は下線を付けた。核局在化部位は矢印で示す。
【図２】２ＡおよびＢは、５’および３’の両方に位置する機能的に重要なドメインを有する共通Ｔ−ｂｏｘ部位にＴ−ｂｅｔが結合しトランス活性化することを示す。
【図３】３Ａは、Ｔ−ｂｅｔがダブルネガティブ胸腺細胞内で優先的に発現されることを示す。パネルＢは、Ｔｈクローンの探索において、Ｔ−ｂｅｔ発現がＴｈ１細胞に限定されることを示す。パネルＣは、Ｔ−ｂｅｔのウエスタンブロット分析を示す。パネルＤは、Ｔ−ｂｅｔ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図４】４ＡおよびＢは、Ｔ−ｂｅｔ発現が、ＮＫおよびＢ細胞内のＩＦＮ−γ誘導と相関することを示す。
【図５】Ｔ−ｂｅｔがＴｈ細胞内のＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化することを示す。
【図６】Ｔ−ｂｅｔのレトロウイルス遺伝子形質導入がＩＦＮ−γ産生を増加しそしてＩＬ−２産生を抑制することを示す。
【図７】Ｔ−ｂｅｔが、一次Ｔ細胞内でＩＦＮ−γ産生を活性化しそしてＩＬ−２産生を抑制することを示す。
【図８】Ｔ−ｂｅｔが、発生中のＴｈ２細胞内でＩＦＮ−γ産生を誘発しそしてＩＬ−２産生を阻害することを示す。
【図９】Ｔ−ｂｅｔが極性化Ｔｈ２細胞をＴｈ１経路内に転向することを示す。Ｔｈ偏向は、上記のように実行されそしてレトロウイルス感染は培養の９日目に行った。
【図１０】Ｔ−ｂｅｔが極性化Ｔｃ２細胞をＴｃ１経路内に転向することを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭｏＦｌｏにより精製しそして上記のＴｈ２偏向条件で培養しそしてレトロウイルス形質導入は培養の８日目に行った。
【図１１】Ｔ−ｂｅｔがチロシンリン酸化されていることを示す。
【図１２】Ｔ−ｂｅｔ優性陰性変異体の活性を示す。
【図１３】ＩＬ−２プロモーターのＴ−ｂｏｘ要素の変異体がＩＬ−２プロモーター活性を低下することを示す。
【配列表】

Claims

配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子または該核酸分子の全鎖長を通して該核酸分子に対して相補的である単離された核酸分子。
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１の全鎖長を通して該ヌクレオチド配列に対して相補的である、請求項１記載の核酸分子。
配列番号３のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３全鎖長を通して該ヌクレオチド配列に対して相補的である、請求項１記載の核酸分子。
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子を含んでなるベクター。
発現ベクターである、請求項４記載のベクター。
請求項４記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項６記載の宿主細胞を、Ｔ−ｂｅｔタンパク質が産生されるまで適当な媒体内で培養することを含んでなる、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を産生するための方法。
媒体または宿主細胞からＴ−ｂｅｔタンパク質を単離することを含んでなる、請求項７記載の方法。
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる、請求項９記載のポリペプチド。
配列番号３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる、請求項９記載のポリペプチド。
異種ポリペプチドと操作可能に連結した請求項１記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドを含んでなる融合タンパク質。
特異的に請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドを結合する抗体。
ポリクローナル抗体である、請求項１３記載の抗体。
モノクローナル抗体である、請求項１３記載の抗体。
検出可能な物質にカプリングしている、請求項１３記載の抗体。
配列番号２または４のペプチドをコードする導入遺伝子を有する細胞を含む非−ヒトトランスジェニック動物。
細胞を細胞内のＴ−ｂｅｔ活性が調節されるようにＴ−ｂｅｔ活性を調節する薬剤と接触させることを含んでなる、細胞内のＴ−ｂｅｔ活性を調節するためのインビトロの方法であって、該薬剤が配列番号２のポリペプチドをコードする核酸分子、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対してアンチセンスである核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する細胞内抗体、またはそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、上記方法。