DE19733193A1 - Mikroskop mit adaptiver Optik - Google Patents

Description

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Erweiterung gängiger Mikroskope um einen oder mehrere Wellenfrontmodulatoren im Beobachtungs- und/oder Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops. Der/die Modulator(en) verändern die Phase und/oder die Amplitude des Lichtes gezielt derart, daß sowohl eine Verschiebung und Formung des Fokus im Objektraum, als auch eine Korrektur von eventuellen Aberrationen bewirkt wird. Die möglichen Einsatzgebiete umfassen die konfokale Mikroskopie, die lasergestützte Mikroskopie, die konventionelle Lichtmikroskopie und die analytische Mikroskopie.

Begriffsbestimmung

Definition des Begriffes "Wellenfrontmodulator":
Im Sinne dieser Erfindung eine Einrichtung zur gezielten Beeinflussung der Phase und/oder der Amplitude einer Lichtwelle. Basierend auf einem reflektierenden optischen Element (deformierbarer Spiegel, elektrostatische Ansteuerung oder durch ein Piezoarray angesteuert oder als bimorpher Spiegel) oder einem transmittierendem optischen Element (LCD oder ähnliche Einheit). Dieses kann kontinuierlich oder segmentiert aufgebaut sein. Insbesondere können die Segmente zur Ansteuerung der jeweiligen Problemstellung angepaßt werden.

Definition der Aberrationen im Mikroskop:
Die bei einem defokussierten Betriebsmode auftretenden Aberrationen des Mikroskopobjektives lassen sich kategorisieren in prinzipiell korrigierbare und nicht korrigierbare Anteile. Ursächlich können die Aberrationen eingeteilt werden in durch das Objektiv verursachte, durch die weitere Abbildungsoptik des Mikroskops verursachte und letztlich durch das Präparat selbst verursachte Aberrationen.

Zur Ansteuerung des Wellenfrontmodulators:
Ansteuerung des Wellenfrontmodulators durch einen Rechner mit geeigneter Software. Die erforderlichen Stellgrößen sind entweder zuvor berechnet worden (offline) oder werden aus gemessenen Größen berechnet (online, z. B. durch einen Wellenfrontsensor oder durch Vermessung der Punkthelligkeit im Zwischenbild).

0. Einführung

Sowohl bei der konventionellen Licht- als auch bei der lasergestützten Mikroskopie muß der Fokus des Objektivs mit hoher Präzision sowohl entlang der optischen Achse als auch lateral verschoben werden. Bei konventionellen Mikroskopen geschieht dies durch mechanische Verschiebung des Objekttisches bzw. des Objektives. Zudem sind im Falle einer Beleuchtung mittels Laserstrahlung Verschiebungen im Objektraum notwendig. Es ergibt sich damit die Notwendigkeit einer dreidimensionalen Fokusführung im Objektraum.

Vom Prinzip des Mikroskops her können diese Verschiebungen auch an der Wellenfront des Strahlengangs vorgenommen werden. Allerdings muß diese Manipulation in einer Pupillenebene des Strahlengangs geschehen. Axiale Verschiebung des Fokus im Objekt entspricht einer sphärischen Veränderung der Wellenfront, laterale Verschiebung einer Kippung der Wellenfront. Auch Aberrationen im Strahlengang können durch Veränderung der Wellenfront ausgeglichen werden.

I. Anwendungen in der konventionellen Lichtmikroskopie 1.1 Beobachtungsstrahlengang

Um eine axiale Verschiebung des Fokus im Objektraum ohne eine Veränderung des Abstandes Objektiv zu Objekt zu erreichen muß die Wellenfront in der Pupille des Objektivs oder einer zur Pupillenebene äquivalenten Ebene sphärisch verformt werden. Eine solche Verformung kann durch einen Wellenfront-Phasenmodulator erreicht werden.

Abb. 1, Abb. 1a zeigen einen schematischen Abbildungsstrahlengang eines Lichtmikroskopes, mit einem betrachteten Objekt, einem Objektiv sowie einer Tubuslinse zur Erzeugung eines Zwischenbildes, das mit nicht dargestellten Okularen betrachtet werden kann. . Zwischen Tubuslinse und Objektiv ist ein erfindungsgemäßer Wellenfrontmodulator angeordnet.

Die nach dem Objektiv gekrümmte Wellenfront wird durch den Wellenfrontmodulator korrigiert, indem die Abberrationen des Objektivs ausgeglichen werden.

Berechnungen haben gezeigt, daß bei Krümmungsradien der Wellenfront in der Pupille zwischen -3,0 m und 1,5 m der Fokus um mehr als 1,5 mm verschoben werden kann. Dies ist abhängig vom verwendeten Objektiv, hier beziehen sich die Angaben auf das Epiplan-Neofluar 20x/0.5. Verschiebungen im Bereich einiger zehn Mikroineter in den meisten Fällen bereits aus. Wie die mathematischen Rechnungen weiter gezeigt haben wird das Intervall einer möglichen Fokusverschiebung mit steigender Vergrößerung des Objektives geringer. Da das Objektiv jedoch nicht für diese sphärisch verformte Wellenfront in der Eintrittspupille berechnet und konstruiert ist, sind Aberrationen durch das Objektiv bei der Defokussierung nicht zu vermeiden.

Eine solche Fokusverschiebung ohne mechanische Beeinflussung des Objektives hat mehrere Vorteile. Zum einen wird durch den festen Arbeitsabstand von Objektivfrontlinse zum Objekt jegliche mechanische Beeinflussung des Objektes durch das Mikroskopobjektiv eliminiert. Es wird damit z. B. erst möglich am statischen, wasserimmergierten Objekt schnittweise Bildaufnahmen mit unterschiedlicher Tiefenlage der Beobachtungsebene durchzuführen. Eine solche Technik scheiterte bisher an der mechanischen Verformung des Objektes und seiner Umgebung durch mechanischen Druck auf das Präparat.

Durch den festen Arbeitsabstand am Mikroskop ergeben sich auch Vorteile bei der analytischen Untersuchung von Proben im biomedizinischen Bereich. Bei der Verwendung von Mikrotiterplatten kann eine Korrektur von Aberrationen, die von der Mikrotiterplatte herrühren, ausgeglichen werden. Die Mikrotiterplatte kann optisch in den Strahlengang einbezogen und das Mikroskopobjektiv teilweise (so z. B. die Frontlinse) in sie integriert werden.

Fig. 1b zeigt eine Ausführung eines Lichtmikroskopes mit deformierbaren Spiegeln, die die Wellenfront in Richtung der Tubuslinse korrigieren.

Eine erste und eine zweite Modulatoranordnung werden über einen Strahlteiler zwischen Objektiv und Tubuslinse in die Abbildung einbezogen.

Vor den Modulatoranordnungen sind jeweils noch Optiken zur Pupillenanpassung vorgesehen.

Auf derartige Anordnungen wird noch in Verbindung mit Abb. 7 näher eingegangen.

Durch eine geeignete Verformung der Wellenfront durch den Wellenfrontmodulator ist auch eine Korrektur von Aberrationen durch das Präparat und die Probenumgebung möglich. Dies ist in Abb. 2 dargestellt.

Durch den zwischen Objektiv und Tubuslinse angeordneten Wellenfrontmodulator wird die durch Abberationen verzerrte Wellenfront korrigiert.

Dazu reichen jedoch die sphärischen Anteile in der Wellenfrontkorrektur nicht aus, es müssen asphärische Anteile hinzugenommen werden. Für die rotationssymmetrischen Aberrationen (alle Terme der sphärischen Aberration höherer Ordnung) reichen ringförmige Aktuatoren aus.

Für die winkelabhängigen Aberrationen müssen segmentierte Aktuatoren verwendet werden (Fig. 4). Diese können entweder miteinander im selben Wellenfrontmodulator integriert werden, oder man setzt zwei unabhängige Modulatoren in verschiedenen Pupillenebenen ein.

Im ersten Fall skaliert die Anzahl der Aktuatoren quadratisch mit der geforderten Auflösung, im letzteren linear, was geringeren Aufwand an Ansteuerelektronik bedeutet.

Die derzeit gängigen Phasenmodulatoren sind in ihrer Amplitude und ihrem maximal erzeugbaren Phasengradienten begrenzt. Dies begrenzt wiederum die Korrekturmöglichkeiten weitab vom Arbeitspunkt des Objektives. Denkbarer Ausweg ist die Kombination von adaptiver Optik mit konventioneller Glasoptik. Letztere dient dabei zur Erzeugung eines großen Phasengradienten bzw. großer Wellenfront-Amplituden, die Feinabstimmung wird durch die adaptive Optik erreicht.

Bei einer Verschiebung zu größerem Fokusabstand tritt, bedingt durch die erforderliche konvexe Wellenfront in der Pupille, eine Vignettierung ein, die zu einer geringeren Lichtausbeute bzw. einer verringerten nutzbaren Apertur führt. Diese Einschränkung ist konstruktionsbedingt und kann im Prinzip zukünftig bei der optischen Auslegung eines Objektivs berücksichtigt werden.

Bei der Verschiebung des Fokus entstehen darüber hinaus Aberrationen im Strahlengang, die zu Verzerrungen des Bildes führen können. Zur Korrektur dieser Aberrationen können der Wellenfront wie oben angedeutet nicht-sphärische Anteile überlagert werden. Nach mathematischen Berechnungen kann bereits mit geringen rotationssymmetrischen Anteilen der Ordnung r⁴ und r⁶ (sphärische Aberration höherer Ordnung) an der Wellenfront eine erhebliche Bildverbesserung erreicht werden (Strehlverhältnis <98%).

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt im achromatischen Verhalten eines reflexions­ basierten Wellenfrontmodulators. Bei geeigneter Beschichtung des Membranspiegels kann der gesamte Spektralbereich von tiefem UV bis hin zum fernen IR phasenmoduliert werden. Chromatische Aberrationen sind (bis auf Absorptionseffekte) ausgeschlossen. Daraus ergeben sich neue Verfahren der chromatischen Korrektur in der Bilderzeugung. Die Beleuchtung wird dazu sequentiell auf unterschiedliche Wellenlängen eingestellt, wobei für jede der individuellen Wellenlängen der Wellenfrontmodulator auf die geeignete optische Korrektur eingestellt wird. Mann erhält so einen Satz von chromatisch optimal korrigierten Bildern, die überlagert eine Weißlichtaufnahme hoher Farbkorrektur ergeben, welche bei Verwendung klassischer Glasoptik so nicht erreicht werden kann. Prinzipiell kann damit ein Objektiv mit Wellenfrontmodulator auf beliebig viele Wellenlängen im optischen Spektrum optimal korrigiert werden.

Zur Verschiebung des Fokus und zur Korrektur von sphärischen Aberrationen haben die erforderlichen Wellenfronten zunächst lediglich rotationssymmetrischen Charakter. Zur Erzeugung solcher Wellenfronten in der Pupille des Mikroskopobjektivs muß die adaptive Optik eine Verteilung der Aktuatoren mit zum Rand hin zunehmender Ortsfrequenz aufweisen (Abb. 4), da am Rand der größte Gradient in der Wellenfront auftritt.

Abb. 4 zeigt verschiedene Aktuatorstrukturen, mit zunehmender Ortsfrequenz in Fig. 4a-4c (sowie mit Segmenten gemäß 4d) zur Korrektur beispielsweise von Astigmatismus und Koma.

Bei einer kameragestützten Bildaufnahme tritt besonders bei hoher räumlicher Auflösung der Effekt des Pixelmismatchings auf. Dabei ist das Mikroskopbild gegen die Kamera verschoben, so daß die einzelnen Bilder des Videosignals räumlich verschoben sind. Dieses Problem läßt sich durch einen variablen Kippanteil in der Wellenfront des abzubildenden Signals beseitigen. Durch eine geeignete Regelung können die Zitterbewegungen des Bildsignals ausgeregelt und somit ein statisches Bild erzeugt werden.

Ein anderes Problem der kameragestützten Bildaufnahme ist die Bildfeldwölbung. Durch die Verwendung eines Wellenfrontmodulators im Abbildungsstrahlengang kann während des Betriebes die Bildfeldwölbung auf Kosten anderer Parameter wie chromatische Korrektur verbessert werden.

1.2 Beleuchtungsstrahlengang

Im Strahlengang der Beleuchtung lassen sich durch den Einbau adaptiver Optik eine flexible Auslegung der Optik, Verbesserung der optischen Eigenschaften des Mikroskops, sowie neue Beleuchtungstechniken realisieren. In ähnlicher Weise wie im Beobachtungsstrahlengang kann ein Wellenfront-Phasenmodulator die Abbildung des Beleuchtungsbrenners (oder ggf. des Lasers) in die Objektebene optimieren. Ebenso kann bei kritischer Beleuchtung eine gleichmäßige Ausleuchtung des Objektraumes eingestellt werden. Abb. 3 zeigt einen Wellenfrontmodulator zwischen Kollektor und Kondensor, die einem Beleuchtungsbrenner nachgeordnet sind.

Mit einem Wellenfront-Amplitudenmodulator kann die Beleuchtungsintensität in der Objektebene räumlich bezüglich Intensität und Homogenität optimiert werden. Prinzipiell ist so ein Pupilleneingriff machbar. Durch gezielte Veränderung des Kippanteiles der Wellenfront kann eine schiefe Beleuchtung des Objektraumes erreicht werden.

2. Anwendungen in der konfokalen Mikroskopie und im LSM

In der konfokalen Mikroskopie sind durch die Verwendung von Laserlicht zur Beleuchtung die Anwendungen noch leichter realisierbar als in der klassischen Lichtmikroskopie.

Beleuchtung

Bei der Verwendung eines Lasers in der Beleuchtung hat der Einsatz eines Wellenfront­ modulators bereits bei der Einkopplung in die Beleuchtungsfaser Vorteile. Hier sind variable Anpassungsoptiken realisierbar, deren Brennweiten und Abbildungsverhältnis abhängig von den Strahleigenschaften des (der) Laser(s) und der verwendeten Faser(n) einstellbar ist, um eine optimale Fasereinkopplung zu erreichen. Anordnungen auf demselben Prinzip können auch bei der Kopplung von Beleuchtungslasern auf die Mikroskopoptik eingesetzt werden. Durch die Schnelligkeit der Modulatoren sind auch zeitaufgelöste Messungen und Multiplex­ verfahren realisierbar, um zwischen einem oder mehreren Lasern und verschiedenen Fasern umzuschalten.

Bei der konfokalen Abbildung kann die Transmission durch das definierende Pinole dynamisch angepaßt werden. Sowohl Lage als auch Durchmesser des Fokus ist in weiten Grenzen variabel. Der oder die Beleuchtungslaser können so optimal gemäß der jeweiligen Anforderungen justiert werden. Weiter kann auch die Kontur der Lichtverteilung des Fokus dem Pinole angepaßt werden. Nicht nur rotationssymmetrische sondern auch andersgeartete Umrisse wie rautenförmige oder rechteckige Aperturen, wie sie in real verwirklichten Pinholes immer vorkommen, können damit angepaßt und auf maximale Transmission oder minimale Beugungsverluste optimiert werden. Eine solche Optimierung kann einerseits statisch durch zuvor berechnete Parameter eingestellt werden oder während des Betriebs auf bestimmte, zu optimierende Parameter geregelt werden.

Wie bei der klassischen Lichtmikroskopie auch läßt sich die chromatische Korrektur abhängig vom verwendeten Beleuchtungslaser einstellen. Durch die Verwendung schneller, synchron angesteuerter Wellenfrontmodulatoren in der Lasereinkopplung, der Beleuchtungs- sowie der Aufnahmeoptik können sequentiell Bilder bei unterschiedlicher Wellenlänge, jeweils optimal chromatisch korrigiert aufgenommen werden.

3. Realisierung

Wellenfrontmodulatoren sind derzeit in verschiedenen Ausführungen erhältlich (Abb. 5). So sind etwa transmittierende Modulatoren auf LCD-Basis (Abb. 5d) erhältlich oder reflektierende Modulatoren mit beweglichen Membranen. Diese wiederum können nach der Art ihrer Stellelemente unterschieden werden: Piezogesteuert (5b), elektrostatische (5a) und bimorphe Membranen (5c). Obwohl sich die Erfindung auf Wellenfrontmodulatoren allgemein bezieht, steht hier der elektrostatische Membranspiegel wegen seiner zahlreichen Vorteile im Vordergrund.

Ein solcher mikrofabrizierter monolithischer Membranspiegel, näher in Fig. 6a, b, mit Membran M und Ansteuerelektroden E dargestellt, zeichnet sich durch hohe Ebenheit und gute optische Qualität der reflektierenden Fläche (besser λ/20), geringe Baugröße (2-20 mm), hysteresefreie Ansteuerung mit niedrigen Spannungen (kleiner 100 V), hohe mechanische Grenzfrequenz der Membran (mehrere MHz), großer Hub (≈ 100 µm) und damit kleiner Krümmungsradius (bis herunter zu 1 m) und in weiten Grenzen variabler Aktuatorstruktur mit hoher räumlicher Dichte aus. Die minimale Aktuatorgröße ist letztlich nur durch die Bedingung begrenzt, daß diese größer sein muß als der Abstand Elektrode zu Membran.

Der große Vorteil des elektrostatischen Membranspiegels liegt in der Tatsache, daß zur Einstellung einer parabolischen Form lediglich ein konstantes Potential an die Aktuator­ elektroden angelegt werden muß. Die parabolische Form des Spiegels ergibt sich bei konstanter Ansteuerung der Elektroden aus dem physikalischen Verhalten der Membran (konstante Flächenkraft). Man kann also mit geringer Dynamik in der Steuergröße, also der angelegten Spannung, eine große Dynamik in der Stellgröße (Spiegelhub) erreichen.

Abb. 7 zeigt ein Laser Scanning Mikroskop mit einem Kurzpulslaser, insbesondere zur Mehrphotonenanregung.

Dies wird im Folgenden näher erläutert.

Nichtlineare Prozesse

Bei nichtlinearen Prozessen hängt das detektierte Signal von der n-ten Potenz der Anregungsintensität ab. Zur Anregung sind hohe Intensitäten nötig. Diese hohen Intensitäten erzielt man durch den Einsatz von Kurzpulslasern und die anschließende beugungsbegrenzte Fokusierung mit Mikroskopobjektiven. Ziel der Anordnung ist es deshalb den Fokus möglichst klein (d. h. ideal) und die Pulslänge möglichst kurz in der Probe zu realisieren. Somit können hohe Intensitäten in der Probe erzielt werden. Nichtlineare Prozesse sind zum Beispiel die Multi-Photonen-Absorption, Generierung der Oberflächen Zweiten Harmonischen (SSHG) sowie der Zweiten Harmonischen (SHG), zeitaufgelöste Mikroskopie, OBIC, LIVA usw. Die Erfindung soll im Folgenden näher anhand der Zwei-Photonen Mikroskopie erläutert werden.

Aus WO 91/07651 ist ein Zwei-Photon-Laser-Scanning-Mikroskop bekannt, mit Anregung durch Laserpulse im Subpicosekundenbereich bei Anregungswellenlängen im roten oder infraroten Bereich.

EP 666473 A1, WO 95/30166, DE 44 14 940 A1 beschreiben Anregungen im Picosekundenbereich und darüber, mit gepulster oder kontinuierlicher Strahlung. Ein Verfahren zum optischen Anregen einer Probe mittels einer Zwei-Photonen-Anregung ist in DE C2 4331570 beschrieben.

DE 296 09 850 der Anmelderin beschreibt die Einkopplung der Strahlung von Kurzpulslasernin in einen mikroskopischen Strahlengang über Lichtleitfasern.

Zwei-Photonen Mikroskopie

Bekanntermaßen eröffnet die Zweiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie gegenüber der konventionellen Einphotonen-Fluoreszenzmikroskopie grundsätzlich folgende Möglichkeiten:

• 1. Realisierung einer nichtlinearen Anregungswahrscheinlichkeit I_2hv = A.I_exc ² mit folgenden Vorteilen:
• - 3D-Diskriminierung, d. h. Tiefendiskriminierung ohne Verwendung einer konfokalen Blende
• - Ausbleichen bzw. Zerstörung der Zellen findet - wenn überhaupt - nur im Fokus statt
• - Verbessert es Signal-/Rauschverhältnis
• - Einsatz neuer Detektionsmethoden wie z. B. non-descanned detection
• 2. Die NIR-Anregung mit Femtosekunden-Lasern besitzt für die Untersuchung von biologischen Präparaten nachstehende Vorzüge:
• - Arbeiten im Bereich des optischen Fensters für biologische Präparate (700-1400 nm) wegen geringer Absorption; Daher ist diese Methode auch zur Untersuchung von Lebendpräparaten geeignet.
• - Niedrige Belastung der Zellen wegen geringer mittlerer Anregungsleistung
• - Hohe Eindringtiefen infolge geringer Streuung
• 3. Die Anregung von sog. UV-Farbstoffen ohne Verwendung von UV-Licht bedeutet, daß keine UV-Optiken nötig sind.
• 4. Bei der Zweiphotonen-Anregung liegen breitbandige Anregungsspektren der Farbstoffe vor.
  Daher ist die Anregung verschiedenster Farbstoffe mit nur einer Anregungswellenlänge möglich.

Beim Durchgang ultrakurzer Pulse durch ein dispersives Medium, z. B. Glas oder Präparat treten insbesondere folgende Effekte:

1. Group Velocity Dispersion (GVD)

Femtosekunden-Laserimpulse besitzen eine spektrale Breite von mehreren Nanometern. Die rot verschobenen Wellenlängenanteile propagieren schneller durch ein positiv dispersives Medium (z. B. Glas) als die blau verschobenen Wellenlängenanteile. Dadurch kommt es zu einer zeitliche Verbreiterung der Pulse und damit zu einer Verringerung der Peakleistung bzw. des Fluoreszenzsignales.

Eine Prechirp Einheit (Prismen-, Gitterpaar oder Kombination aus beiden) stellt ein negativ dispersives Medium dar, daß heißt blau verschobene Wellenlängenanteile propagieren schneller als rot verschobene. Mit Hilfe einer Prechirp Einheit kann somit die Group Velocity Dispersion kompensiert werden.

2. Propagation Time Difference (PTD)

Die Glaswege entlang des Strahlquerschnittes sind unterschiedlich siehe Abb. 4. Dadurch kommt es zu einer räumlichen Vergrößerung des Fokusses wodurch eine Verringerung des Auflösungsvermögens und der Peakleistung bzw. des Fluoreszenzsignales eintritt.

Die Kompensation dieses Effektes kann mit Hilfe eines Wellenfrontmodulators (adaptiven Spiegels) erfolgen. Mit so einem Modulator kann die Phase und die Amplitude der Lichtwelle im Anregungsstrahlengang gezielt beeinflußt werden. Als Modulator ist ein reflektierendes optisches Element (z. B. deformierbarer Spiegel) oder ein transmittierendes optisches Element (z. B. LCD) denkbar.

3. Wellenfrontdistorsion durch Streuung und Diffraktion/Refraktion

Diese Störungen können zum einen durch die verwendeten Optiken selbst und zum anderen durch das Präparat verursacht werden. Durch die Wellenfrontdistorsion kommt es wie beim zweiten Effekt ebenfalls zu Abweichungen vom idealen Fokus. Auch dieser Effekt kann mit einem Wellenfrontmodulator (siehe unter 2) kompensiert werden.

Die oben aufgeführten Effekte sind in der Regel abhängig von der Eindringtiefe in das Präparat.

Die Vorrichtung hat die Aufgabe, die Effekte:

• - GVD
• - PTD und
• - Wellenfrontdistorsion

synchron als Funktion der Eindringtiefe in das Präparat zu kompensieren, um im Fokus des Präparats, auch bei hohen Eindringtiefen, kurze Pulslängen und einen möglichst ideal kleinen Fokus zu erzielen.

Ein möglicher Aufbau der Vorrichtung ist in Abb. 7 gezeigt.

Die Strahlung eines Kurzpulslasers KPL gelangt in eine Prechirping-Einheit PCU und von dieser über Strahlteiler ST1 und Strahlteiler ST2, ST3 auf zwei adaptive Bauelemente AD1, AD2 kommen hier zum Einsatz. Das erste, AD1 (coarse) wird für die Grobeinstellung der Wellenfront eingesetzt. Damit ist es möglich den Fokus in z-Richtung zu verschieben. Mit dem zweiten, AD2 (fine) werden die Wellenfrontdistorsionen und die PTD-Effekte ausgeglichen.

Das Laserlicht gelangt über Strahlteiler DBS, x/y - Scaneinheit, Optik SL, TL und Spiegel SP und das Objektiv OL auf das Objekt. Das vom Objekt kommende Licht gelangt zurück über Strahlteiler DBS, Linse L, Pinole PH und Filter EF auf einen Detektor, hier ein PMT, der seinerseits wie auch PCU, AD1, AD2 mit einer Controleinheit verbunden ist.

Hierdurch kann beispielsweise die Einstellung der adaptiven Elemente AD1, AD2 sowie der Prechirping-Unit erfolgen, bis am Detektor PMT ein maximales Signal anliegt.

Besonders vorteilhaft ist der dargestellte Strahlengang für ein inverses Mikroskop, bei dem die Beobachtung "von unten" erfolgt, dadurch, daß die Probe für eventuelle Manipulationen voll zugänglich bleibt.

Abb. 6 zeigte bereits den prinzipiellen Aufbau eines adaptiven Spiegels. Er besteht aus einer hochreflektierenden Membran (z. B. Silizium Nitrat) und aus einer Struktur mit Elektroden. Durch eine gezielte Ansteuerung der einzelnen Elektroden kann die darüberliegende Membran deformiert werden und so die Phasenfront des Laserstrahles beeinflußt werden. Es können somit die Deformationen des Phasenfront, die beim Durchgang der Pulse durch das System und die Probe entstehen, kompensiert werden.

Die Prechirp-Einheit kann aus einem oder mehreren Prismen oder Gittern oder aus einer Kombination beider bestehen. Abb. 8 zeigt mögliche Anordnungen, in 7a mit Prismen, in /b mit Gittern und in /c mit Prismen und Gittern. Die Funktionsweise soll anhand eines Prismenkompressors in /a näher erläutert werden. Die spektrale Breite eines Femtosekunden- Laserpulses beträgt mehrere Nanometer. Beim Durchgang des Laserstrahles durch das erste Prisma wird der Strahl spektral in seine Komponenten zerlegt. Anschließend durchlaufen die spektralen Komponenten im zweiten Prisma unterschiedliche Glaswege. Dadurch werden rotverschobene Wellenlängenanteile gegenüber den blauverschobenen zeitlich verzögert. Die Prechirp-Einheit wirkt somit wie ein negativ dispersives Medium und eine Kompensation der GVD ist mit möglich.

Erst durch die Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung können die Vorteile der Anregung nichtlinearer Prozesse vollständig genutzt werden und eine Verwendung von Low- Power Femtosekunden-Lasern auch bei höheren Eindringtiefen in die Probe wird möglich.

Es können somit hohe Peakleistungen bei Verwendung von geringen mittleren Anregungsleistungen technisch realisiert werden, so daß die Belastung der biologischen Präparate bzw. der Proben gering gehalten, ein hohes Signal-/Rauschverhältnis und eine hohe Auflösung in axialer und lateraler Richtung erzielt werden.

Für alle beschriebenen Anordnungen kann vorteilhaft über einen Wellenfrontsensor, der über einen Strahlteiler (nicht dargestellt) mit dem Mikroskopstrahlengang in Verbindung steht, die Wellenfrontanpassung erfaßt und kontrolliert bzw. definiert eingestellt werden.

Anwendungen adaptiver Optik in der Mikroskopie Bisherige Patentveröffentlichungen

US 4408874, W. Zinky, L. Rosenberg (1981/83):
Mechanisch oder pneumatisch deformierbares optisches Element zur astigmatischen Vergrößerungseinstellung für Abbildungssystemen in der Lithographie.

EPO 0098969 B1, J. Arnaud (1983/87):
Deformierbares optisches Element zur astigmatischen Korrektur. Die Dicke der Spiegelmembran variiert über die Fläche, so daß beim Durchbiegen durch externe Kräfte die Membran eine zuvor berechnete Form annimmt.

EPO 0307354 B1, H. Choffat (1988/92):
Ringanordnung aus bimorphen Piezoschichten zur axialen Feinverstellung von Komponenten, z. B. Mikroskopobjektive.

US 5142132, B. MacDonald, R. Hunter, A. Smith (1990/92):
Adaptiv gesteuertes optisches System zur Waferherstellung (Stepper).
Das adaptive Element steuert den Fokus und korrigiert Aberrationen. Das Fehlersignal für die Korrektur wird aus dem vom Waffel rückreflektierten Licht durch Interferenz mit dem ursprünglichen Licht gewonnen. Genaues Verfahren zur Aberrationskorrektur wird nicht angegeben.

DP DE 34 04 063 C2, A. Suzuki, M. Kohno (1984/93):
Gekrümmte durchlässige Membran im Strahlengang eines Abbildenden Systems zur Korrektur von Abbildungsfehlern, besonders der lateralen Fokusablage.

US 5504575, R. Stafford (1993/96):
Spektrometer, basierend auf räumlichem Lichtmodulator und dispersivem Element. Verwendet Fasern und optische Schalter/flexiblen Spiegel um das Licht nach Durchgang durch das dispersive Element auf den Detektor zu schalten.

EPO 167877, Bille, Heidelberg Instruments (1985 angemeldet) Ophtalmoskop mit adaptivem Spiegel.

Claims (3)

1. Anordnung adaptiver Optik im Beobachtungsstrahlengang eines Lichtmikroskops
Unteransprüche zu 1.

• - zwischen Objektiv und Tubuslinse transmittierender Wellenfrontmodulator
• - zwischen Objektiv und Tubuslinse über Strahlteiler eingekoppelter reflektiver Wellenfrontmodulator

2. Im Beleuchtungsstrahlengang eines Lichtmikroskops angeordneter Wellenfrontmodulator
Unteransprüche zu 2.

• - zwischen Lichtquelle und Kondensor angeordnet
• - transmittierender Wellenfrontmodulator

3. Laser-Scanning-Mikroskop mit mindestens einer dem Laser nachgeordneten adaptiven Optik
Unteransprüche zu 3.

• - erste und zweite adaptive Optik zur Grob- und Feineinstellung
• - adaptive Optik ist reflektierender Wellenfrontmodulator
• - Laser ist Kurzpulslaser
• - zusätzlich Prechirp- Unit vorgesehen
• - Kombination Prechirp-Unit und adaptive Optik im Strahlengang eines Laser-Scanning- Mikroskops mit Kurzpulslaser zur Mehrphotonenanregung.