DE19608751A1 - Adeno-assoziierter Virus-Vektor zur Steigerung der Immunogenität von Zellen - Google Patents

Adeno-assoziierter Virus-Vektor zur Steigerung der Immunogenität von Zellen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Adeno-assoziierten Virus-Vektor, der sich zur Steigerung der Immunogenität von Zellen eignet, ein einen solchen Vektor enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.
Es ist bekannt, daß bei etwa 0,5% der Krebspatienten, z. B. jener des malignen Melanoms, eine vollständige Rückbildung des Tumors eintritt. Auch kommt es bei vielen Krebspatienten zu einer Kontrolle des Tumors, wodurch dieser über Jahre in einem stabilen Zustand verharrt. Dies weist darauf hin, daß das Immun­ system einen Einfluß auf den Verlauf einer Krebserkrankung hat.
Viele Versuche wurden unternommen, das Immunsystem zu aktivieren, Tumor­ zellen zu erkennen und auszuschalten. Bisher haben diese Versuche jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse gebracht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem das Immunsystem gegenüber Tumorzellen stimuliert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Adeno-assoziierter Virus-Vektor mit einer Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigern­ des Protein kodiert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß Adeno­ assoziierte Viren (AAVs) sich zur Transduktion von Tumorzellen eignen.
AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbesondere Adenoviren oder Herpesviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszell­ genom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19.
Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nicht­ strukturelles Gen kodieren. Das strukturelle Gen wird mit cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid-Pro­ teine. Das nicht-strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expres­ sion von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P19 Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u. a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.
In einem erfindungsgemäßen AAV-Vektor liegt eine Fremd-DNA vor, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert.
Der Ausdruck "AAV-Vektor" betrifft jegliches AAV, d. h. Virus-Partikel, und dessen DNA. Der AAV-Vektor kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Ferner kann er ein System aus mehreren Komponenten sein, die einzelne oder alle Funktionen von AAV und/oder seiner DNA bereitstellen. Ein solches System umfaßt z. B. einen rep-negativen AAV-Vektor und ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel. Der AAV-Vektor kann in Zellen eingebracht werden und dort in das Genom integrieren oder in episomaler Form verbleiben.
Der Ausdruck "Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert" betrifft jegliche Fremd-DNA, die in einem AAV-Vektor integriert sein kann und deren Expressionsprodukt die Immunogenität von Zellen steigern kann. Beispiele einer Fremd-DNA sind Gene, die Tumorzellen fehlen, z. B. MHC-I-Gene, Gene, die für kostimulatorische Moleküle kodieren, z. B. B7-Gene, wie B7.1 und B7.2-Gene, Gene die für sekretorische Immunstimulatoren kodieren, z. B. Zytokin-Gene, wie IL-2-, Interferon- und GM-CSF-Gene, und Gene, die für tumorassoziierte Antigene, z. B. MAGEI, Tyrosinasen oder virale Proteine, z. B. E7-Protein von humanem Papillomvirus und EBNA3-Protein von Epstein-Barr-Vi­ rus, kodieren. Vorteilhaft ist es, wenn die Expression der Fremd-DNA unter der Kontrolle eines heterologen konstitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, steht. Ferner kann die Fremd-DNA, an beliebiger Stelle des AAV-Vektors inseriert sein, wobei es vorteilhaft sein kann, wenn sie in oder anstelle des rep-Gens vorliegt. Deswei­ teren kann es günstig sein, wenn mehrere Fremd-DNAs in einem AAV-Vektor vorliegen.
Zur Herstellung eines vorstehenden AAV-Vektors können übliche Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein AAV-Vektor als Virus-Partikel wie folgt hergestellt werden: Es werden zwei Plasmide verwendet, wobei das eine Plasmid ein AAV-Plasmid ist, das eine Fremd-DNA, z. B. ein Gen für ein B7-Molekül, zwischen den 5′- und 3′-ITR-Sequenzen von AAV enthält. Dieses mit pAAV-B7-bezeichnete Plasmid kodiert jedoch nicht für die AAV-Rep und -Cap- Proteine. Diese Proteine werden allerdings von dem anderen Plasmid kodiert. Dieses enthält ferner einen SV40 "origin of replication". Letzteres Plasmid wird mit pSV40 oriAAV bezeichnet. Beide Plasmide werden in Zellen transfiziert, die ein SV40 T-Antigen exprimieren. Solche Zellen sind z. B. COS-Zellen. Durch das T-Antigen wird der SV40 "origin of replication" von pSV40oriAAV aktiviert und das Plasmid repliziert. Dadurch wird eine hohe Expression der AAV-Rep und - Cap-Proteine erhalten. Durch Infektion der COS-Zellen mit einem Helfer-Virus, z. B. Adenovirus, werden AAV-Vektoren als Virus-Partikel erhalten. Der Titer beträgt zwischen 10⁹-10¹¹-Virus-Partikel/ml.
Mit einem vorstehenden AAV-Vektor kann die Immunogenität von Zellen gestei­ gert werden. Günstig kann es sein, einen AAV-Vektor zu verwenden, der für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodiert. Vorteilhaft kann es ebenso sein, mehrere AAV-Vektoren zu verwenden, die für unterschied­ liche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodieren. Die Steigerung der Immunogenität kann bei Zellen jeglicher Art, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, wie HPV-transduzierte Zervixzellen, erreicht werden. Die Zellen können hierzu mit dem AAV-Vektor durch übliche Verfahren transduziert wer­ den. Liegt der AAV-Vektor als Virus-Partikel vor, ist es günstig, die Zellen mit diesem zu infizieren. Liegt er andererseits als DNA vor, ist es angeraten, die Zellen mit dieser zu transfizieren. Als Transfektionstechniken sind z. B. Elek­ troporation und Lipofektion zu nennen. Die Zellen können in einem Organismus vorliegen. Andererseits können die zu transduzierenden Zellen auch aus einem Organismus isoliert, außerhalb des Organismus transduziert und dann wieder in den Organismus zurückgeführt werden. Solche Zellen werden als autologe Zellen bezeichnet. Desweiteren können hinsichtlich des Organismus auch allogene Zellen zur Transduktion verwendet werden. Hierbei ist es günstig, wenn diese Zellen einem dem Organismus entsprechenden HLA-Typ angehören. Der Fach­ mann kennt Verfahren, Zellen einen bestimmten HLA-Typ zu verleihen. Weiterhin ist es günstig, wenn bei einem vorstehenden Verfahren die Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, vor ihrer Einführung in den Organismus inaktiviert werden. Hierfür können übliche Verfahren, wie Bestrahlung, durch­ geführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungs-Mittel, das einen vorstehenden AAV-Vektor und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Ver­ dünnungsmittel, Trägermittel, etc. umfaßt. Günstig kann es sein, wenn der AAV-Vektor für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodiert. Vorteilhaft kann es ebenso sein, wenn mehrere AAV-Vektoren vorliegen, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodie­ ren. Ferner ist es günstig, wenn das Vakzinierungs-Mittel weitere, die Immu­ nogenität von Zellen steigernde Substanzen, insbesondere tumorspezifische Antigene umfaßt. Diese Antigene können z. B. in Form von Peptiden, insbesonde­ re synthetischen Peptiden, vorliegen. Auch können die Antigene in Form von sie kodierenden Expressionsplasmiden vorliegen, die ferner für HLA-Moleküle kodie­ ren können. Besonders günstig ist es, wenn das Vakzinierungs-Mittel auch die durch den AAV-Vektor transduzierten Zellen enthält. Für diese Zellen gelten vorstehende Ausführungen. Insbesondere ist es günstig, wenn die Zellen in­ aktiviert sind.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, ganz besonders frisch isolierte Tumorzellen, mit hoher Effizienz zu transduzieren. Es wird eine Transduktionseffizienz von 85-95% erhalten. Dies bedeutet, daß unterschiedlichste Zellen eines Tumors transduziert werden, wodurch das gesamte Antigenprofil des Tumors erfaßt wird und eine klonale Selektion verhindert wird. Desweiteren wird die Transduktion der einzel­ nen Zellen bereits mit einer kleinen Anzahl von AAV-Vektor-Molekülen, wie 10-20 Moleküle pro Zelle, erreicht, was dazu führt, daß kein zytopathischer Effekt durch die Transduktion eintritt. Dies trägt maßgeblich dazu bei, daß das Immun­ system die transduzierten Zellen wie auch alle weiteren, ein gleiches Antigen­ profil aufweisenden, Zellen erkennt und ausschalten kann. Die vorliegende Erfindung eignet sich somit bestens, die Immunogenität von Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, zu steigern. Die vorliegende Erfindung ist daher prädestiniert, für eine in vivo bzw. ex vivo Gentherapie schwerster Er­ krankungen, insbesondere Krebserkrankungen, wie malignes Melanom oder Zervixkarzinom, verwendet zu werden.
Die Erfindung wird durch die vorliegenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen AAV-Vektors
2 × 10⁸ COS-Zellen wurden mit je 800 µg eines 1 : 1 Gemisches von pSV40ori AAV und pAAV-B7 (vgl. Beschreibung, vorstehend) in 2,5 ml RPMI aufgenom­ men und 10 min in Eis inkubiert, bevor eine Elektroporation in einem Gesamt­ volumen von 0,5 ml durchgeführt wurde. Danach wurden die Zellen 10 min auf Eis gehalten, bevor sie in Gewebekulturschalen gegeben wurden. Nach 24 h wurde das Medium gewechselt und nach weiteren 24 h wurden die Zellen 1 h mit Adenoviren (10 infektöse Adenoviren/COS-Zelle) inkubiert. Nach weiteren 72 h wurden die Zellen geerntet und pelletiert. Das Zellpellet wurde resuspendiert und homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit CsCl auf eine Dichte von 1,4 g/cm³ eingestellt und bei 38 000 rpm 24 h zentrifugiert. Fraktionen wurden entnommen und solche mit einem Index von 1,375-1,371 gepoolt, zentrifu­ giert, und gegen Tris-Puffer dialysiert. Der Titer der AAV-Virus-Partikel wurde bestimmt.
Beispiel 2 Transduktion von Tumorzellen mit einem erfindungsgemäßen AAV-Vektor
Aus menschlichen Hautmetastasen wurde primäres Melanomgewebe isoliert. Das Melanomgewebe wurde 2 × 30 min in einer 2-%igen Antibiotikalösung (Antibiotikum/Antimykotikum) inkubiert, bevor es in kleine Fragmente zerschnit­ ten wurde. Die Fragmente wurden durch ein Metallsieb passiert und die erhalte­ ne Zellsuspension wurde durch ein feines Sieb in ein Zentrifugenröhrchen pipet­ tiert. Erythrozyten und tote Zellen wurden über einen Ficoll-Gradienten entfernt, bevor die lebenden Melanomzellen 2 × mit PBS gewaschen wurden. Die Mela­ nomzellen wurden dann in einem geeigneten Medium aufgenommen (RPMI 1640, 1% Glutamin, 10-20% Fötales Kälberserum, 1% Penizillin-Streptavidin) und in Gewebekulturschalen gegeben. Vor der Transduktion wurden die Mela­ nomzellen mit Hilfe von Antikörpern charakterisiert (S100, HNB-45 Firma DA­ KO).
3 × 10⁵ Melanomzellen wurden in eine 24-Loch Gewebekulturschale gegeben. 3 × 10⁶ AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1, die für ein B7-Molekül kodieren, wurden in 250 µl serumfreiem Medium auf die Melanomzellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden 1,5 ml serumhaltiges Medium zugegeben und die Zellen im Brutschrank inkubiert.
Es wurde eine FACS-Analyse der B7-Transduktion durchgeführt: Maus-anti­ humane B7.2 monoklonale Antikörper (Pharmingen) wurden auf die Zellen gegeben, die danach mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus Antikörper gebunden wurden. Nicht-spezifische Bindungen wurden durch Isotypkontrollen ausgeschlossen. Für jede Analyse wurde ein Minimum von 10 000 lebenden Melanom-Zellen eingesetzt. Der Prozentsatz an positiven Zellen wurde definiert als Fraktion, die außerhalb der 99% Region der Kontrollgruppe liegt.
Es wurde eine B7-Transduktionseffizienz von 85-95% erhalten. Parallelver­ suche, in denen ein AAV-Virus-Partikel, das für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierte, bzw. in denen mehrere AAV-Virus-Partikel, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodier­ ten, zur Transduktion der Tumorzellen verwendet wurden, ergaben gleiche Transduktionseffizienzen für die einzelnen Proteine.
Beispiel 3 Stimulierung der Immunogenität von Zellen durch einen erfindungs­ gemäßen AAV-Vektor
  • (a) Die Stimulierung der Immunogenität von Zellen wurde an Hand der Induk­ tion einer zytotoxischen T-Zellantwort bestimmt.
    Von verschiedenen Tumorpatienten wurde Melanommaterial entnommen. Gleichzeitig wurde Blut entnommen und die T-Zellen wurden angereichert. Die Tumorzellen wurden, wie vorstehend beschrieben, isoliert und mit AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1 transduziert. Anschließend wurden die T-Zellen mit den transduzierten Tumorzellen stimuliert. Als Kontrolle wurden nicht-transduzierte Tumorzellen zur Stimulation der T-Zellen verwendet.
    Es zeigte sich, daß die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen durch Stimula­ tion mit einem erfindungsgemäßen AAV-Virus-Partikel deutlich gesteigert werden kann.
  • (b) C57/BI6-Mäuse wurde mit jeweils 5000 lebenden B16-F10 Tumorzellen (Maus-Melanommodell) in die Schwanzvene infiziert. Diese Tumorzellen führten zu Metastasenbildungen, die nach ca. 20 Tagen durch Obduktion hauptsächlich in der Leber und in die Lunge nachweisbar waren. Am Tag 3, 10 und 17 nach der Tumorzell-Injektion wurde ein Teil der Mäuse mit 300 000 B16-F10 Tumorzellen immunisiert, die vorher mit einem, für ein B7-Protein kodierenden AAV-Virus-Partikel transduziert worden waren. Auf der Oberfläche der Tumorzellen befand sich somit das Molekül B7.
    Es zeigte sich, daß durch die Immunisierung mit einem erfindungsgemä­ ßen AAV-Virus-Partikel die Metastasenbildung inhibiert werden kann.
    Parallelversuche, in denen ein AAV-Virus-Partikel, das für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierte bzw. in denen mehrere AAV-Virus-Partikel, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierten, zur Transduktion der Tumorzel­ len verwendet wurde, ergaben eine deutliche Steigerung der Inhibierung der Metastasenbildung.
  • (c) C57/BI6-Mäusen wurden jeweils 100 000 B16-F1 0 Tumorzellen subkutan in den Rücken injiziert. Dies führte zur Bildung eines Tumors, der nach 10 Tagen einen Umfang von 0,3-0,5 cm aufwies. Zu diesem Zeitpunkt wurde das AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1 (10⁶-10⁸ Partikel) direkt in den Tumor injiziert.
    Es zeigte sich, daß nach Transduktion mit einem erfindungsgemäßen AAV-Virus-Partikel die Tumorzellen vom Immunsystem erkannt werden und der Tumor eliminiert wird.

Claims (14)

1. AAV-Vektor mit einer Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert.
2. AAV-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA ein in Tumorzellen fehlendes Gen, ein für ein kostimulatorisches Molekül kodierendes Gen, ein für einen sekretorischen Immunstimulator oder ein für ein tumorassoziiertes Antigen bzw. virales Protein kodierendes Gen umfaßt.
3. AAV-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Fremd-DNAs vorliegen.
4. AAV-Vektor nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA unter der Kontrolle eines heterologen konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.
5. AAV-Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Gewebe- und/oder Tumor-spezifischer Promotor ist.
6. Vakzinierungs-Mittel, enthaltend den AAV-Vektor nach einem der Ansprü­ che 1-5 und übliche Hilfsstoffe.
7. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mehre­ re AAV-Vektoren vorliegen, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodieren.
8. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß weitere die Immunogenität von Zellen steigernde Substanzen vorliegen.
9. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen tumorspezifische Antigene sind.
10. Vakzinierungs-Mittel nach einem der Ansprüche 6-9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der AAV-Vektor in Zellen vorliegt.
11. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Tumorzellen und/oder Prä-Tumorzellen sind.
12. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen und die Prä-Tumorzellen inaktiviert sind.
13. Verwendung des AAV-Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und des Vakzinierungsmittels nach einem der Ansprüche 6-12 zur Steigerung der Immunogenität von Zellen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellen Tumorzellen und/oder Prä-Tumorzellen sind.
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