WO1997032988A1 - Adeno-assoziierter virus-vektor zur steigerung der immunogenität von zellen - Google Patents

Adeno-assoziierter virus-vektor zur steigerung der immunogenität von zellen Download PDF

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Michel Hallek
Christoph Bogedain
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to an adeno-associated virus vector which is suitable for increasing the immunogenicity of cells, a vaccination agent containing such a vector and the use of both.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which the immune system can be stimulated against tumor cells.
  • the present invention thus relates to an adeno-associated virus vector with a foreign DNA which codes for a protein which increases the immunogenicity of cells.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that adeno-associated viruses (AAVs) are suitable for the transduction of tumor cells.
  • AAVs adeno-associated viruses
  • AAVs are single-stranded DNA viruses belonging to the parvovirus family. For their replication, AAVs need helper viruses, in particular adenoviruses or Herpes viruses. In the absence of helper viruses, AAVs integrate into the host cell genome, in particular at a specific location on chromosome 19.
  • the genome of AAVs is linear and has a length of approximately 4680 nucleotides. This comprises two reading frames which code for a structural and a non-structural gene.
  • the structural gene is called the cap gene. This is under the control of the P40 promoter and codes for three capsid proteins.
  • the non-structural gene is referred to as the rep gene and codes for the Rep proteins, Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40. The former two are expressed under the control of the P5 promoter, while the expression of Rep 52 and Rep 40 is under the control of the P1 9 promoter.
  • the functions of the Rep proteins include in the regulation of replication and transcription of the AAV genome.
  • an AAV vector according to the invention there is foreign DNA which codes for a protein which increases the immunogenicity of cells.
  • AAV vector refers to any AAV, i.e. Virus particles and their DNA.
  • the AAV vector can be in wild-type or modified form. The latter also means that it has expressible E4 sequences, especially the
  • foreign DNA refers to any foreign DNA that can be integrated in an AAV vector and whose expression product can increase the immunogenicity of cells.
  • foreign DNA are genes whose expression products are missing or down-regulated in tumor cells, for example MHC-I genes, genes which code for costimulatory molecules, for example B7 genes such as B7.1 and B7.2 genes, genes which code for secretory immunostimulators, for example cytokine genes, such as IL-2, interferon and GM-CSF genes, and genes which are responsible for tumor-associated antigens, for example MAGE1, tyrosinases or encode viral proteins, for example E7 protein from human papilloma virus and EBNA3 protein from Epstein-Barr virus. It is advantageous if the expression of the foreign DNA under the MHC-I genes, genes which code for costimulatory molecules, for example B7 genes such as B7.1 and B7.2 genes, genes which code for secretory immunostimulators, for example cytokine genes, such as IL-2, interferon and GM-
  • the foreign DNA can be inserted at any point in the AAV vector, and it can be advantageous if it is present in or instead of the rep gene. Furthermore, it can be favorable if there are several foreign DNAs in one AAV vector.
  • AAV vectors are obtained as virus particles.
  • the titer of between 10 6 - 10 9 virus particles / ml.
  • Electroporation and lipofection are examples of transfection techniques.
  • the cells can be in an organism.
  • the cells to be transduced can also be isolated from an organism, transduced outside the organism and then returned to the organism. Such cells are called autologous cells.
  • allogeneic cells can also be used for transduction with regard to the organism. It is advantageous if these cells belong to an HLA type corresponding to the organism. The person skilled in the art is familiar with methods of giving cells a specific HLA type.
  • the cells, in particular tumor cells or pre-tumor cells are inactivated before they are returned to the organism in the above method. Conventional methods, such as radiation, can be carried out for this purpose.
  • the vaccine may also be convenient to irradiate the vaccine, e.g. X-ray or gamma radiation.
  • Transduce efficiency A transduction efficiency of 85-95% is obtained. This means that a wide variety of cells of a tumor are transduced, whereby the entire antigen profile of the tumor is recorded and clonal selection is prevented. Furthermore, the transduction of the individual cells is already carried out with a small number of AAV vector molecules, such as 1 0 -
  • the present invention is therefore particularly suitable for the immunogenicity of cells, in particular
  • the present invention is therefore predestined to be extremely difficult for in vivo or ex vivo gene therapy.
  • diseases especially cancer, such as malignant melanoma or cervical cancer.
  • Example 1 Production of an AAV vector according to the invention
  • the homogenate was adjusted to a density of 1.4 g / cm 3 with CsCl and centrifuged at 38,000 rpm for 24 h. Fractions were removed and those with an index of 1.375-1.371 were pooled, centrifuged, and dialyzed against Tris buffer. The titer of the AAV virus particles was determined.
  • Example 2 Transduction of tumor cells with an AAV vector according to the invention
  • Primary melanoma tissue was isolated from human skin metastases.
  • the melanoma tissue was incubated 2 x 30 min in a 2% antibiotic solution (antibiotic / antifungal) before it was cut into small fragments. The fragments were passed through a metal sieve and the cell suspension obtained was pipetted through a fine sieve into a centrifuge tube. Erythrocytes and dead cells were removed using a Ficoll gradient before the living melanoma cells were washed twice with PBS. The melanoma cells were then taken up in a suitable medium (RPMI 1 640, 1% glutamine, 10-20% fetal calf serum, 1% penicillin streptavidin) and placed in tissue culture dishes. Before the transduction, the melanoma cells were characterized with the aid of antibodies (S100, HNB-45 from DAKO).
  • 3 x 1 0 5 melanoma cells were placed in a 24-well tissue culture dish.
  • 3 ⁇ 10 6 AAV virus particles from Example 1, which code for a B7 molecule, were placed on the melanoma cells in 250 ⁇ l serum-free medium. After an incubation period of 1 h, 1.5 ml of serum-containing medium were added and the cells were incubated in the incubator.
  • mice-anti-human B7.2 monoclonal antibodies (Pharmingen) were applied to the cells, which were then bound with a FITC-conjugated goat-anti-mouse antibody. Non-specific bindings were excluded by isotype controls. A minimum of 10000 live melanoma cells were used for each analysis. The percentage of positive cells was defined as the fraction outside the 99% region of the control group.
  • a primary tumor was removed from a tumor patient and treated as described in Example 2.
  • 1 x 10 6 tumor cells were sown and infected with a "multiplicity of infection" of 10 after prior gamma irradiation by 30 Gy with B7.1 - AAV and GM-CSF-AAV.
  • the expression rate of the foreign genes for B7.1 and GM-CSF was determined by means of Facs-Flow or ELISA.
  • 20 ml of peripheral blood were taken from the patient.
  • Peripheral blood lymphocytes were isolated by density gradient centrifugation with Ficoll-Histopaque.
  • 1 x 10 7 lymphocytes were co-cultivated in RPMI1 640 medium containing 10% heat-inactivated human serum, 2 mM glutamine, nonessential amino acids, 2 mM sodium pyruvate and 100 ⁇ g / ml gentamycin or kanamycin with the AAV-infected tumor lines stimulate a tumor-specific immune response using cytotoxic T cells.
  • 20 U / ml of recombinant human interleukin-2 was added to the medium.
  • more of the tumor cells infected with the AAV vectors were added to the culture in a ratio of 1:10 to the lymphocytes. After three weeks of cultivation, the
  • mice C57 / B1 6 mice were infected with 5000 living B1 6-F10 tumor cells (mouse melanoma model) in each case into the tail vein. These tumor cells led to the formation of metastases, which after about 20 days were mainly detectable in the liver and lungs by autopsy. On days 3, 10 and 17 after the tumor cell injection, some of the mice were immunized with 300000 B1 6-F10 tumor cells which had previously been transduced with an AAV virus particle coding for a B7 protein.
  • the molecule B7 was thus on the surface of the tumor cells.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen AAV-Vektor mit einer Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert. Ferner betrifft die Erfindung ein einen solchen Vektor enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.

Description

"Adeno-assoziierter Virus- Vektor zur Steigerung der Immunogenität von Zellen"
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Adeno-assoziierten Virus-Vektor, der sich zur Steigerung der Immunogenität von Zellen eignet, ein einen solchen Vektor enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.
Es ist bekannt, daß bei etwa 0,5 % der Krebspatienten, z.B. jener des malignen Melanoms, eine vollständige Rückbildung des Tumors eintritt. Auch kommt es bei vielen Krebspatienten zu einer Kontrolle des Tumors, wodurch dieser über Jahre in einem stabilen Zustand verharrt. Dies weist darauf hin, daß das Immun¬ system einen Einfluß auf den Verlauf einer Krebserkrankung hat.
Viele Versuche wurden unternommen, das Immunsystem zu aktivieren, Tumor¬ zellen zu erkennen und auszuschalten. Bisher haben diese Versuche jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse gebracht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu¬ stellen, mit dem das Immunsystem gegenüber Tumorzellen stimuliert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Adeno-assoziierter Virus- Vektor mit einer Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigern¬ des Protein kodiert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß Adeno- assoziierte Viren (AAVs) sich zur Transduktion von Tumorzellen eignen.
AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbesondere Adenoviren oder Herpesviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszell¬ genom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 1 9.
Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nicht¬ strukturelles Gen kodieren. Das strukturelle Gen wird mit cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid- Proteine. Das nicht-strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expres¬ sion von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P1 9 Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u.a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.
In einem erfindungsgemäßen AAV-Vektor liegt eine Fremd-DNA vor, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert.
Der Ausdruck "AAV-Vektor" betrifft jegliches AAV, d.h. Virus-Partikel, und dessen DNA. Der AAV-Vektor kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Letzteres bedeutet auch, daß er exprimierbare E4-Sequenzen, insbesondere den
ORF6 der E4-Sequenzen, von Adenovirus umfaßt. Ferner kann er ein System aus mehreren Komponenten sein, die einzelne oder alle Funktionen von AAV und/- oder seiner DNA bereitstellen. Ein solches System umfaßt z.B. einen rep-negati¬ ven AAV-Vektor und ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel. Der AAV- Vektor kann in Zellen eingebracht werden und dort in das Genom integrieren oder in episomaler Form verbleiben.
Der Ausdruck "Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert" betrifft jegliche Fremd-DNA, die in einem AAV-Vektor integriert sein kann und deren Expressionsprodukt die Immunogenität von Zellen steigern kann. Beispiele einer Fremd-DNA sind Gene, deren Expressionsprodukte in Tumorzellen fehlen oder herunterreguliert sind, z.B. MHC-I-Gene, Gene, die für kostimulatorische Moleküle kodieren, z.B. B7-Gene, wie B7.1 und B7.2-Gene, Gene die für sekretorische Immunstimulatoren kodieren, z.B. Zytokin-Gene, wie IL-2-, Interferon- und GM-CSF-Gene, und Gene, die für tumorassoziierte Antigene, z.B. MAGE1 , Tyrosinasen oder virale Proteine, z.B.E7-Protein von humanem Papillomvirus und EBNA3-Protein von Epstein-Barr- Virus, kodieren. Vorteilhaft ist es, wenn die Expression der Fremd-DNA unter der
Kontrolle eines heterologen konstitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, steht. Ferner kann die Fremd-DNA, an beliebiger Stelle des AAV-Vektors inseriert sein, wobei es vorteilhaft sein kann, wenn sie in oder anstelle des rep-Gens vorliegt. Deswei- teren kann es günstig sein, wenn mehrere Fremd-DNAs in einem AAV-Vektor vorliegen.
Zur Herstellung eines vorstehenden AAV-Vektors können übliche Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein AAV-Vektor als Virus-Partikel wie folgt hergestellt werden: Es werden zwei Plasmide verwendet, wobei das eine
Plasmid ein AAV-Plasmid ist, das eine Fremd-DNA, z.B. ein Gen für ein B7- Molekül, zwischen den 5'- und 3'-ITR-Sequenzen von AAV enthält. Dieses mit pAAV-B7-bezeichnete Plasmid kodiert jedoch nicht für die AAV-Rep und -Cap- Proteine. Diese Proteine werden allerdings von dem anderen Plasmid kodiert. Dieses enthält ferner einen SV40 "origin of replication". Letzteres Plasmid wird mit pSV40 oriAAV bezeichnet. Beide Plasmide werden in Zellen transfiziert, die ein SV40 T-Antigen exprimieren. Solche Zellen sind z.B. COS-Zellen. Durch das T-Antigen wird der SV40 "origin of replication" von pSV40oriAAV aktiviert und das Plasmid repliziert. Dadurch wird eine hohe Expression der AAV-Rep und - Cap-Proteine erhalten. Durch Infektion der COS-Zellen mit einem Helfer-Virus, z.B. Adenovirus, werden AAV-Vektoren als Virus-Partikel erhalten. Der Titer beträgt zwischen 106 - 109-Virus-Partikel/ml.
Mit einem vorstehenden AAV-Vektor kann die Immunogenität von Zellen gestei- gert werden. Günstig kann es sein, einen AAV-Vektor zu verwenden, der für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodiert. Vorteilhaft kann es ebenso sein, mehrere AAV-Vektoren zu verwenden, die für unterschied- liehe die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodieren. Die Steigerung der Immunogenität kann bei Zellen jeglicher Art, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, wie HPV-transduzierte Zervixzellen, erreicht werden. Die Zellen können hierzu mit dem AAV-Vektor durch übliche Verfahren transduziert wer- den. Liegt der AAV-Vektor als Virus-Partikel vor, ist es günstig, die Zellen mit diesem zu infizieren. Liegt er andererseits als DNA vor, ist es angeraten, die Zellen mit dieser zu transfizieren. Als Transfektionstechniken sind z.B. Elek- troporation und Lipofektion zu nennen. Die Zellen können in einem Organismus vorliegen. Andererseits können die zu transduzierenden Zellen auch aus einem Organismus isoliert, außerhalb des Organismus transduziert und dann wieder in den Organismus zurückgeführt werden. Solche Zellen werden als autologe Zellen bezeichnet. Desweiteren können hinsichtlich des Organismus auch allogene Zellen zur Transduktion verwendet werden. Hierbei ist es günstig, wenn diese Zellen einem dem Organismus entsprechenden HLA-Typ angehören. Der Fach- mann kennt Verfahren, Zellen einen bestimmten HLA-Typ zu verleihen. Weiterhin ist es günstig, wenn bei einem vorstehenden Verfahren die Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, vor ihrer Rückführung in den Organismus inaktiviert werden. Hierfür können übliche Verfahren, wie Bestrahlung, durch¬ geführt werden.
Vorstehende Zellen, die außerhalb eines Organismus transduziert worden sind, können auch mit auf den Organismus bezogenen autologen und/oder allogenen nuklearen Blutzellen, insbesondere Lymphozyten, kokultiviert werden. Die nuklearen Blutzellen werden dadurch stimuliert. Sie können dann alleine oder zusammen mit den transduzierten Zellen in den Organismus eingeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungs-Mittel, das einen vorstehenden AAV-Vektor und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Ver¬ dünnungsmittel, Trägermittel, etc. umfaßt. Günstig kann es sein, wenn der AAV-Vektor für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodiert. Vorteilhaft kann es ebenso sein, wenn mehrere AAV-Vektoren vorliegen, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodie- ren. Ferner ist es günstig, wenn das Vakzinierungs-Mittel weitere, die Immuno¬ genität von Zellen steigernde Substanzen, insbesondere tumorspezifische Antige¬ ne umfaßt. Diese Antigene können z.B. in Form von Peptiden, insbesondere synthetischen Peptiden, vorliegen. Auch können die Antigene in Form von sie kodierenden Expressionsplasmiden vorliegen, die ferner für HLA-Moleküle kodie¬ ren können. Besonders günstig ist es, wenn das Vakzinierungs-Mittel auch die durch den AAV-Vektor transduzierten Zellen und/oder die durch diese Zellen stimulierten nuklearen Blutzellen enthält. Für die Zellen gelten vorstehende Ausführungen. Insbesonders ist es günstig, wenn die Zellen inaktiviert sind. Desweiteren ist es günstig, wenn das Vakzinierungsmittel einen replikations- defekten Adenovirus enthält, dessen E4-Sequenzen funktionsfähig sind. Auch können exprimierbare E4-Sequenzen auf einem Vektor oder ein E4-Protein vorliegen. Ferner ist es günstig, wenn das Vakzinierungsmittel eine die Replika¬ tion von DNA fördernde Substanz enthält. Dies ist z.B. Hydroxy-Harnstoff, ein Toposiomerase-Inhibitor oder ein DNA-Synthese-Inhibitor in geringer Menge.
Auch kann es günstig sein, das Vakzinierungsmittel zu bestrahlen, z.B. Röntgen- oder Gamma-Bestrahlung.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, ganz besonders frisch isolierte Tumorzellen, mit hoher
Effizienz zu transduzieren. Es wird eine Transduktionseffizienz von 85 - 95 % erhalten. Dies bedeutet, daß unterschiedlichste Zellen eines Tumors transduziert werden, wodurch das gesamte Antigenprofil des Tumors erfaßt wird und eine klonale Selektion verhindert wird. Desweiteren wird die Transduktion der einzel- nen Zellen bereits mit einer kleinen Anzahl von AAV-Vektor-Molekülen, wie 1 0 -
20 Moleküle pro Zelle, erreicht, was dazu führt, daß kein zytopathischer Effekt durch die Transduktion eintritt. Dies trägt maßgeblich dazu bei, daß das Immun¬ system die transduzierten Zellen wie auch alle weiteren, ein gleiches Antigen¬ profil aufweisenden, Zellen erkennt und ausschalten kann. Die vorliegende Erfindung eignet sich somit bestens, die Immunogenität von Zellen, insbesondere
Tumorzellen oder Prä-Tumorzellen, zu steigern. Die vorliegende Erfindung ist daher prädestiniert, für eine in vivo bzw. ex vivo Gentherapie schwerster Er- krankungen, insbesondere Krebserkrankungen, wie malignes Melanom oder Zervixkarzinom, verwendet zu werden.
Die Erfindung wird durch die vorliegenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Herstellung eines erfindungsgemäßen AAV-Vektors
2 x 108 COS-Zellen wurden mit je 800 μg eines 1 : 1 Gemisches von pSV40ori AAV und pAAV-B7 (vgl. Beschreibung, vorstehend) in 2,5 ml RPMI aufgenom- men und 10 min in Eis inkubiert, bevor eine Elektroporation in einem Gesamt¬ volumen von 0,5 ml durchgeführt wurde. Danach wurden die Zellen 10 min auf Eis gehalten, bevor sie in Gewebekulturschalen gegeben wurden. Nach 24 h wurde das Medium gewechselt und nach weiteren 24 h wurden die Zellen 1 h mit Adenoviren (10 infektöse Adenoviren/COS-Zelle) inkubiert. Nach weiteren 72 h wurden die Zellen geerntet und pelletiert. Das Zellpellet wurde resuspendiert und homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit CsCI auf eine Dichte von 1 ,4 g/cm3 eingestellt und bei 38.000 rpm 24 h zentrifugiert. Fraktionen wurden entnommen und solche mit einem Index von 1 ,375 - 1 ,371 gepoolt, zentrifu¬ giert, und gegen Tris-Puffer dialysiert. Der Titer der AAV-Virus-Partikel wurde bestimmt.
Beispiel 2: Transduktion von Tumorzellen mit einem erfindungsgemäßen AAV- Vektor
Aus menschlichen Hautmetastasen wurde primäres Melanomgewebe isoliert.
Das Melanomgewebe wurde 2 x 30 min in einer 2-%igen Antibiotikalösung (Antibiotikum/Antimykotikum) inkubiert, bevor es in kleine Fragmente zerschnit¬ ten wurde. Die Fragmente wurden durch ein Metallsieb passiert und die erhalte¬ ne Zellsuspension wurde durch ein feines Sieb in ein Zentrifugenröhrchen pipet- tiert. Erythrozyten und tote Zellen wurden über einen Ficoll-Gradienten entfernt, bevor die lebenden Melanomzellen 2 x mit PBS gewaschen wurden. Die Mela- nomzellen wurden dann in einem geeigneten Medium aufgenommen (RPMI 1 640, 1 % Glutamin, 10-20 % Fötales Kälberserum, 1 % Penizillin-Streptavidin) und in Gewebekulturschalen gegeben. Vor der Transduktion wurden die Mela¬ nomzellen mit Hilfe von Antikörpern charakterisiert (S100, HNB-45 Firma DA¬ KO).
3 x 1 05 Melanomzellen wurden in eine 24-Loch Gewebekulturschale gegeben. 3 x 106 AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1 , die für ein B7-Molekül kodieren, wurden in 250//I serumfreiem Medium auf die Melanomzellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden 1 ,5 ml serumhaltiges Medium zugegeben und die Zellen im Brutschrank inkubiert.
Es wurde eine FACS-Analyse der B7-Transduktion durchgeführt: Maus-anti¬ humane B7.2 monoklonale Antikörper (Pharmingen) wurden auf die Zellen gegeben, die danach mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus Antikörper gebunden wurden. Nicht-spezifische Bindungen wurden durch Isotypkontrollen ausgeschlossen. Für jede Analyse wurde ein Minimum von 1 0000 lebenden Melanom-Zellen eingesetzt. Der Prozentsatz an positiven Zellen wurde definiert als Fraktion, die außerhalb der 99 % Region der Kontrollgruppe liegt.
Es wurde eine B7-Transduktionseffizienz von 85 - 90 % erhalten. Parallelver¬ suche, in denen ein AAV-Virus-Partikel, das für mehrere die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierte, bzw. in denen mehrere AAV-Virus-Partikel, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodier¬ ten, zur Transduktion der Tumorzellen verwendet wurden, ergaben gleiche Transduktionseffizienzen für die einzelnen Proteine.
Beispiel 3: Stimulierung der Immunogenität von Zellen durch einen erfindungs¬ gemäßen AAV-Vektor
(a) Die Stimulierung der Immunogenität von Zellen wurde an Hand der Induk¬ tion einer zytotoxischen T-Zellaπtwort bestimmt. Von verschiedenen Tumorpatienten wurde Melanommaterial entnommen. Gleichzeitig wurde Blut entgenommen und die T-Zellen wurden angerei¬ chert. Die Tumorzellen wurden, wie vorstehend beschrieben, isoliert und mit AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1 transduziert. Anschließend wurden die T-Zellen mit den transduzierten Tumorzellen stimuliert. Als Kontrolle wurden nicht-transduzierte Tumorzellen zur Stimulation der T-Zellen verwendet.
Es zeigte sich, daß die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen durch Stimula- tion mit einem erfindungsgemäßen AAV-Virus-Partikel deutlich gesteigert werden kann.
In einem weiteren Versuch wurde einem Tumor-Patienten ein primärer Tumor entnommen und, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt. 1 x 106 Tumorzellen davon wurden ausgesät und mit einer "multiplicity of infec- tion" von 10 nach vorheriger gamma-Bestrahlung durch 30 Gy mit B7.1 - AAV und GM-CSF-AAV infiziert. Vier Tage nach Infektion wurde die Ex¬ pressionsrate der Fremdgene für B7.1 und GM-CSF mittels Facs-Flow bzw. ELISA bestimmt. Dem Patienten wurden 20 ml peripheres Blut ent- nommen. Periphere Blut-Lymphozyten wurden durch Dichtegradientenzen- trifugation mit Ficoll-Histopaque isoliert. 1 x 107 Lymphozyten wurden in RPMI1 640-Medium, enthaltend 10 % Hitze-inaktiviertes Humanserum, 2 mM Glutamin, nichtessentielle Aminosäuren, 2 mM Natriumpyruvat und 100 μg/ml Gentamycin oder Kanamycin, mit den AAV-infizierten Tumor- zeilen kokultiviert, um eine tumorspezifische Immunantwort durch zytoto- xische T-Zellen zu stimulieren. Nach einer Woche Kokultivierung wurde dem Medium 20 U/ml rekombinantes humanes lnterleukin-2 zugegeben. In Abständen von 10 Tagen wurden der Kultur weitere der mit den AAV- Vektoren infizierten Tumorzellen in einem Verhältnis von 1 : 10 zu den Lymphozyten zugegeben. Nach drei Wochen Kultivierung wurden die
Lymphozyten im Zytotoxizitätstest (Chrom-Freisetzungstest oder Europi¬ um-Freisetzungstest) auf ihre Fähigkeit überprüft, die Tumorzellen zu lysieren. 1 x 107 Lymphozyten wurden dem Patienten intravenös reinfu- diert.
(b) C57/B1 6-Mäuse wurde mit jeweils 5000 lebenden B1 6-F10 Tumorzellen (Maus-Melanommodell) in die Schwanzvene infiziert. Diese Tumorzellen führten zu Metastasenbildungen, die nach ca. 20 Tagen durch Obduktion hauptsächlich in der Leber und in die Lunge nachweisbar waren. Am Tag 3, 10 und 1 7 nach der Tumorzell-Injektion wurde ein Teil der Mäuse mit 300000 B1 6-F10 Tumorzellen immunisiert, die vorher mit einem, für ein B7-Protein kodierenden AAV-Virus-Partikel transduziert worden waren.
Auf der Oberfläche der Tumorzellen befand sich somit das Molekül B7.
Es zeigte sich, daß durch die Immunisierung mit einem erfindungsgemä¬ ßen AAV-Virus-Partikel die Metastasenbildung inhibiert werden kann. Parallelversuche, in denen ein AAV-Virus-Partikel, das für mehrere die
Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierte bzw. in denen mehrere AAV-Virus-Partikel, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodierten, zur Transduktion der Tumorzel¬ len verwendet wurde, ergaben eine noch stärkere Inhibierung der Meta- stasenbildung.
(c) C57/B1 6-Mäusen wurden jeweils 100000 B16-F1 0 Tumorzellen subkutan in den Rücken injiziert. Dies führte zur Bildung eines Tumors, der nach 10 Tagen einen Umfang von 0,3 - 0,5 cm aufwies. Zu diesem Zeitpunkt wurde das AAV-Virus-Partikel von Beispiel 1 ( 106-1 08 Partikel) direkt in den Tumor injiziert.
Es zeigte sich, daß nach Transduktion mit einem erfindungsgemäßen AAV-Virus-Partikel die Tumorzellen vom Immunsystem erkannt werden und der Tumor eliminiert wird.

Claims

Patentansprüche
1 . AAV-Vektor mit einer Fremd-DNA, die für ein die Immunogenität von Zellen steigerndes Protein kodiert.
2. AAV-Vektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA ein Gen, dessen Expressionsprodukt in Tumorzellen fehlt oder herunter¬ reguliert ist, ein für ein kostimulatorisches Molekül kodierendes Gen, ein für einen sekretorischen Immunstimulator oder ein für ein tumorassoziiertes Antigen bzw. virales Protein kodierendes Gen umfaßt.
3. AAV-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Fremd-DNAs vorliegen.
4. AAV-Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA unter der Kontrolle eines heterologen konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.
5. AAV-Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Gewebe- und/oder Tumor-spezifischer Promotor ist.
6. Vakzinierungs-Mittel, enthaltend den AAV-Vektor nach einem der Ansprü¬ che 1 -5 und übliche Hilfsstoffe.
7. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mehre¬ re AAV-Vektoren vorliegen, die für unterschiedliche die Immunogenität von Zellen steigernde Proteine kodieren.
8. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß weitere die Immunogenität von Zellen steigernde Substanzen vorliegen.
9. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen tumorspezifische Antigene sind.
10. Vakzinierungs-Mittel nach einem der Ansprüche 6 - 9, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der AAV-Vektor in Zellen vorliegt.
1 1 . Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Tumorzellen und/oder Prä-Tumorzellen sind.
12. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen und die Prä-Tumorzellen inaktiviert sind .
13. Verwendung des AAV-Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und des Vakzinierungsmittels nach einem der Ansprüche 6 - 1 2 zur Steigerung der Immunogenität von Zellen.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellen Tumorzellen und/oder Prä- Tumorzellen sind.
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