DE19617837A1 - Dendritische Zellen transfiziert mit Muzin-cDNA als Vakzine gegen humane Tumorerkrankungen - Google Patents
Dendritische Zellen transfiziert mit Muzin-cDNA als Vakzine gegen humane TumorerkrankungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine aus immunkompetenten Zellen bestehende Vakzine gegen
Tumorerkrankungen und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete sind die Medizin und
die Gentechnik.
Zelluläre Vakzine gegen Tumorerkrankungen sind seit längerem bekannt. Die
klassische und vielfach klinisch eingesetzte Vakzine besteht aus einem Gemisch von
bestrahlten Tumorzellen und Adjuvantien wie beispielsweise Lysate von Bacillus
Calmette Guerin (BCG) oder Corynebacterium Parvum. Nach zwei Jahrzehnten
klinischer Erprobung läßt sich zusammenfassen, daß diese Vakzineform keine
reproduzierbare Wirkung zeigt (s. Übersichtsartikel. Oettgen, H. und Old, L., The History
of Cancer Immunotherapy, in: biological Therapy of Cancer, Eds. V. deVita, S.
Hellmann and S. Rosenberg, J. B. Lippincott Company 1991, S. 87-119).
In jüngerer Zeit wurden Versuche unternommen, Tumorzellen genetisch zu
modifizieren, mit dem Ziel, eine Immunantwort gegen den Tumor auszulösen.
Verwendet werden dazu vor allem Gene für Zytokine oder kostimulierene Moleküle
allein oder in Kombination (Blankenstein T., Eur. J. Cancer, 1994). Der Nachteil dieser
Vakzine besteht jedoch darin, daß zu ihrer Herstellung Tumorzellen verwendet werden
müssen. Diese stellen wiederum ein Potential für eine mögliche Metastasenbildung dar,
und somit kann die Vakzine selbst bei ihrer Anwendung ein Risiko für den Patienten
darstellen. Tumorzellen besitzen keine kostimulierenden Liganden wie CD80 und CD86,
die für eine effektive Aktivierung des Immunsystems essentiell sind. Außerdem ist nicht
klar definiert, gegen welche immunogenen Strukturen auf den Tumorzellen eine
Immunantwort ausgelöst wird. Erfolgt z. B. eine Reaktion gegen Autoantigene
(immunogene Strukturen, die nicht nur auf Tumorzellen, sondern auch auf gesunden
Zellen vorhanden sind), wäre es möglich, daß Autoimmunreaktionen durch diese Art
von Vakzine ausgelöst werden.
Deshalb wurde in letzter Zeit darauf fokussiert, tumorspezifische Strukturen zu
bestimmen. Eine solche Struktur findet sich auf dem Muzinmolekül von Tumorzellen.
(Finn, O. J. 1993. Tumor rejection antigens recognized by T lymphocytes. Current
Opinion in Immunol., 5, 701-8).
Das Glykoprotein Muzin, kodiert durch das Gen MUC1, ist sowohl auf der Oberfläche
von Pankreas-, Mamma-, Kolon- Parotis- und Ovarialkarzinomen als auch auf den
entsprechenden gesunden Zellen exprimiert. Muzin, kodiert durch MUC1 liegt besteht
zu zwei Dritteln aus 20 bis 100 "Tandem Nukleotid repeats". Ein "Tandem Nukleotid
repeat" besteht aus 60 Nukleotiden, die ein Polypeptid von 20 Aminosäuren kodieren
(s. Abb. 2).
Infolge einer unvollständigen Muzin-Glykosylierung im Fall der malignen Entartung
liegen auf Tumorzellen Peptid-Epitope frei, die vom Immunsystem, insbesondere T
Zellen, als fremd erkannt werden können (diese Peptid-Epitope sind auf gesunden
Zellen von Kohlenhydraten "verdeckt" und lösen deshalb bei normalen Zellen keine
Immunreaktion aus). Diese Muzin-Epitope sind für eine Stimulierung des
Immunsystems zur körpereigenen Abwehr gegen einen Tumor geeignet.
Es hat bereits Versuche gegeben, Muzin-Epitope mittels Gentransfer in solchen
humanen Immunzellen zur Expression zu bringen. Probleme dabei sind der Vektor, die
Transfektionsmethode sowie die richtige Wahl von geeigneten Immunzellen.
Der verwendete Vektor pDKOF/MUC1, (beschrieben in Jerome K. R., N. Domenech,
and O. J. Finn. 1993. Tumor-specific cytotoxic T cell clones from patients with brest and
pancreatic adenocarcinoma recognize EBV-immortalized B cells transfected with
polymorphic epithelial mucin complementary DNA. J. of Immunol. 151: 1654-1662 und
in Jerome K. R., D. Bu, and O. J. Finn. 1992. Expression of tumor-associated epitopes
on Epstein-Barr Virus-immortalized B-cells and Burkitt s lymphomas transfected with
epithelial mucin complementary DNA. Canc. Res. 52: 5985-5990) führt, transfiziert in
humane Zellen, nicht zu einer effizienten und stabilen Muzin-Epitop-Expression und ist
somit für die Verwendung in einer Vakzine nicht oder nicht so gut geeignet.
Als Transfektionsmethode wurde dabei die Elektroporation angewandt, eine nicht immer
erfolgreiche Methode, bei der sehr viele Zellen absterben.
Als Immunzellen wurden bisher EBV-immortalisierte B-Zellen benutzt und mit MUC1-
Vektoren transfiziert und zur Stimulation des Immunsystems benutzt (beschrieben in
Jerome K. R., N. Domenech, and O. J. Finn. 1993. Tumor-specific cytotoxic T cell
clones from patients with breast and pancreatic adenocarcinoma recognize EBV-
immortalized B cells transfected with polymorphic epithelial mucin complementary DNA.
J. of Immunol. 151: 1654-1662 und in Pecher G. and Finn O.J. 1996. Induction of
cellular immunity in chimpanzees to tumor-associated antigen mucin by vaccination with
MUC1 cDNA-transfected EBV-immortalized autolougous B-cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93: 1699-1704 sowie Patentanmeldung von G. Pecher: Vakzine gegen
Tumorerkrankungen Aktenzeichen 19516673.6 vom 28. 4. 1995). EBV-immortalisierte B-
Zellen produzieren jedoch auch immunsupprimierende Faktoren wie Interleukin 10 und
zu ihrer Herstellung werden humanpathogene Viren (EBV= Epstein-Barr-Virus)
verwendet.
Die Erfindung hat das Ziel, die Nachteile der bisher bekannten zellulären Vakzinen zu
überwinden. Es soll gentechnisch eine Vakzine entwickelt werden, die das
Immunsystem gegen bereits im Körper vorhandene Tumorzellen spezifisch stimuliert
und zur Verkleinerung bzw. Beseitigung des Tumors führen soll. Anstelle von
Tumorzellen sollen "professionelle" Immunzellen zur Expression von tumorassozierten
Epitopen zur Konstruktion einer Vakzine verwendet werden. Bestimmte "professionelle"
Immunzellen exprimieren, im Gegensatz zu Tumorzellen, die für eine optimale T-
Zellaktivierung notwendigen kostimulierenden Liganden, wie z. B. CD80 und CD86.
Die erfindungsgemäße Vakzine wird realisiert durch Anspruch 1, die Unteransprüche
sind Vorzugsvarianten.
Die Vakzine besteht aus humanen autologen dendritischen Zellen, die mit
einer Teilsequenz des humanen Muzin-MUC1-Gens, die mehrere "Tandem Repeat
Nukleotid Sequenzen" von MUC1 enthält, mittels Lipofektion unter Verwendung des
Plasmids transfiziert sind, und die durch die Behandlung mit dem
Glykosylierungsinhibitor Phenyl-N-Acetyl-α-D-Galactosaminid tumorassoziierte Epitope
exprimieren.
Die MUC1 transfizierten Zellen werden mit dem Glykosylierungsinhibitor Phenyl-N-
Acetyl-α-D-Galactosaminid für 24 bis 36 Stunden behandelt, damit die immunogenen,
tumorassoziierten Muzin-Epitope ausgebildet werden. Die Expression kann durch eine
FACS-Analyse mittels Muzin-Epitop-spezifischen Antikörpern überprüft werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch der Vektor pCMV/MUC1 gemäß Abb. 1 zur
Transfektion der dendritischen Zellen, der aus folgenden wesentlichen Bestandteilen
besteht:
- - immediate early Promotor von CMV für Muzin-MUC1-Genabschnitte,
- - Teilsequenz des Muzin-MUC1-Gens.
Die Vakzine enthält keine Tumorzellen, sondern ein klar definiertes Antigen (MUC1).
Zur Konstruktion der Vakzine verwendete Immunzellen sind dendritische Zellen.
Autologe dendritische Zellen als Immunzellen stellen, anders als Tumorzellen oder
EBV-immortalisierte Zellen, für den Patienten kein Risiko dar. Sie exprimieren in idealer
Weise die für die T-Zellaktivierung notwendigen kostimulatorischen Liganden wie CD80
und CD86. Sie produzieren immunstimulierende Stoffe, wie Interleukin 12. Als weiteren
Vorteil produzieren dendritische Zellen im Gegensatz zu beispielsweise EBV-
immortalisierten B-Zellen, keine immunsupprimierenden Stoffe wie Interleukin 10.
Die Herstellung humaner dendritischer Zellen erfolgt aus peripherem Blut von
Patienten oder Gesunden unter Verwendung von Interleukin 4 und Granulozyten-
Makrophagen-Colonie-stimulierendem Faktor. Das ist ein einfaches und leicht
praktikables Verfahren.
Transfektionsmethode ist die Lipofektion. Dabei wird eine hohe Gentransferrate in
dendritischen Zellen erreicht. Die Methode ist einfach durchzuführen und
reproduzierbar.
Als Vektor für den Gentransfer wird pCMV/MUC1 gemäß Abb. 1 verwendet. In den
Vektor wurde die entsprechende Muzin-cDNA unter dem immediate early Promotor von
CMV kloniert. Der Vektor enthält keine cDNA für eine Resistenz gegenüber Antibiotika
o. ä. Der Vektor erfüllt somit hohe Sicherheitsanforderungen für die Anwendung am
Menschen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vakzine besteht darin, daß die Erkennung
der Muzin-Peptid-Epitope durch zytotoxische T Zellen, folgt nicht dem bisher bekannten
klassischen Weg der Erkennung von kurzen Peptid-Epitopen in Verbindung mit dem
HLA-Komplex. Die Muzin-Peptid-Epitope werden ohne "Hilfe" des HLA-Komplexes von
den T Zellen erkannt. Diese Besonderheit bei der Erkennung der tumorassoziierten
Muzin-Epitope erklärt sich aus der oben genannten besonderen "Tandem repeat"-
Struktur des Moleküls sowie der hohen Dichte des Antigens auf der präsentierenden
Zelle. Die mehrfache Wiederholung des immunogenen Peptid-Epitop-Motivs führt zu
einer Aktivierung der T Zellen durch ein "Crosslinking" des T-Zell-Rezeptors ohne daß
der HLA-Komplex vorhanden sein muß. Das ermöglicht den Einsatz einer möglichen
Vakzine, die die entsprechenden Muzin-Epitope enthält, bei jedem Patienten,
unabhängig vom HLA-Typ. Das bedeutet einen Vorteil gegenüber Vakzinen, die Epitope
anderer Antigene außer Muzin enthalten, und die nur Patienten mit dem jeweiligen
passenden HLA-Typ verabreicht werden können.
Durch Kombination dieser Neuerungen wird die Konstruktion einer optimalen Vakzine
erreicht.
Infolge der unvollständigen Glykosylierung des Glykoproteins Muzin im Fall der
malignen Entartung liegen auf Tumorzellen Peptid-Epitope frei, die vom Immunsystem
als fremd erkannt werden können. Die dadurch ausgelöste Aktivierung des
Immunsystems reicht bei Tumorpatienten nicht aus, um den Tumor zu beseitigen, weil
(durch die fehlende Expression von CD80 und CD86 auf Tumorzellen) keine
Kostimulation von T-Zellen erfolgt. Mit der erfindungsgemäßen Vakzine wird eine
effiziente, tumorspezifische Immunantwort, die auf der Aktivierung Muzinepitop
spezifischer, zytotoxischer T-Zellen beruht, ausgelöst. Diese T-Zellen führen zur
Verkleinerung bzw. Beseitigung der Tumorzellen. Werden dendritische mit MUC1 (Kopien der "Tandem Nukleotid-Sequenz" von MUC1 kloniert in den Vektor) transfiziert
und mit dem Glykosylierungsinhibitor Phenyl-N-Acetyl-α-D-Galactosaminid behandelt,
exprimieren diese die tumorassozierten Epitope. Die auf diesem Wege erreichte
Kombination von Bereistellung von kostimulierenden Liganden und einer genügenden
Anzahl von tumorassoziierten Epitopen führt zu einer Aktivierung von Muzinepitop
spezifischen T-Zellen, die für eine Tumorabstoßung erforderlich sind.
Aus humanem peripherem Blut werden Lymphozyten per Ficoll-Gradienten-
Zentrifugation gewonnen und in Kultur gehalten. Dendritische Zellen werden durch die
Zugabe von Interleukin 4 und Granulozyten.Makrophagen-Colonie stimulierendem
Faktor und durch die Adhärenz zu Platik selektioniert. Die dendritischen Zellen werden
mittels Liposomen mit dem MUC1-Vektor transfiziert. Die Muzin-Expression wird mittels
Westem-Blot-Verfahren sowie FACS-Analyse mit monoklonalen Muzin-Antikörpern
überprüft. In das Kulturmedium der transfizierten Zellen wird Phenyl-N-Acetyl-α-D-
Galactosaminide (Konzentration 5 mM) für 36 Stunden gegeben. Die Expression der
dadurch erzeugten tumorassoziierten Muzin-Peptid-Epitope hält für 72 Stunden an und
wird mit monoklonalen Muzin-Peptid-Antikörpern mittels FACS-Analyse überprüft. Die
Vakzine wird innerhalb dieser 72 Stunden dem Patienten appliziert.
Die Vakzine ist für die Therapie bei Patienten mit Muzin (MUC1)
exprimierenden Tumoren einsetzbar. Bevorzugt ist die Behandlung von Mamma-,
Pankreas-, Ovarial-, Kolon- und Parotistumoren. Die Anwendung dieser Vakzine kann
ebenfalls bei Gesunden zur Vorbeugung eines Muzinepitope exprimierenden Tumors
erfolgen.
Claims (8)
1. Vakzine gegen humane Tumorerkrankungen, bestehend aus
- - humanen, autologen dendritischen Zellen, die mit einer
- - Teilsequenz des humanen Muzin-MUC1-Gens, die mehrere "Tandem Repeat Nukleotid Sequenzen" von MUC1 enthält, transfiziert sind,
- - und bei denen durch die Anwendung eines Glykosylierungsinhibitors tumorassoziierte Epitope, bevorzugt auf der Zelloberfläche, ausgebildet sind.
2. Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz des
humanen Muzin-MUC1-Gens mittels Liposomenpräparationen in die dendritischen
Zellen transfiziert wird.
3. Vakzine nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz des
humanen Muzin-MUC1-Gens mit dem Vektor pCMV/MUC1 mit folgenden wesentlichen
Bestandteilen gemäß Abb. 1 transfiziert wird:
- - immediate early Promotor CMV für Muzin-MUC1-Genabschnitte,
- - Teilsequenz des Muzin-MUC1-Gens.
4. Vakzine nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz des
humanen Muzin-MUC1-Gens im Vektor 12-40 "Tandem Nukleotid-repeats" enthält,
wobei ein repeat die Nukleotid-Sequenz gemäß Abb. 2 aufweist.
5. Vakzine nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz des
humanen Muzin-MUC1-Gens im Vektor 22 "Tandem Nukleotid-repeats" enthält.
6. Vakzine nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als
Glykosylierungsinhibitor Phenyl-N-Acetyl-α-D-Galactosaminide verwendet wird.
7. Vakzine nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die dendritischen
Zellen aus peripherem Blut von Patienten oder gesunden Personen unter Verwendung
der Zytokine Interleukin 4 und Granulozyten.Makrophagen-Colonie stimulierendem
Faktor gewonnen werden, daß die so gewonnenen dendritischen Zellen die
Oberflächenmarker CD1a, CD80, CD86 exprimieren und, daß auf den dendritischen
Zellen nach Transfektion mit MUC1 und nach Anwendung des Glykosylierungsinhibitors
nach Anspruch 6 die tumorassoziierten Epitope auf der Oberfläche nachweisbar sind.
8. Verwendung der Vakzine nach Anspruch 1 bis 7 zur Behandlung von Muzin
exprimierenden Tumoren, wie Mamma-, Pankreas-, Ovarial-, Kolon- und
Parotistumoren.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19617837A DE19617837A1 (de) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Dendritische Zellen transfiziert mit Muzin-cDNA als Vakzine gegen humane Tumorerkrankungen |
| EP97922844A EP0906444A1 (de) | 1996-04-19 | 1997-04-14 | Gentransfizierte humane dendritische zellen, ihre herstellung und ihre verwendung, bevorzugt als vakzine |
| PCT/DE1997/000772 WO1997040182A1 (de) | 1996-04-19 | 1997-04-14 | Gentransfizierte humane dendritische zellen, ihre herstellung und ihre verwendung, bevorzugt als vakzine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19617837A DE19617837A1 (de) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Dendritische Zellen transfiziert mit Muzin-cDNA als Vakzine gegen humane Tumorerkrankungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19617837A1 true DE19617837A1 (de) | 1997-10-23 |
Family
ID=7793269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19617837A Withdrawn DE19617837A1 (de) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | Dendritische Zellen transfiziert mit Muzin-cDNA als Vakzine gegen humane Tumorerkrankungen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19617837A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001024832A2 (de) * | 1999-09-27 | 2001-04-12 | Gabriele Pecher | Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung und prophylaxe von humanen tumoren, die das tumorantigen muzin und/oder das carcinoembryonale antigen (cea) exprimieren und ihre verwendung |
-
1996
- 1996-04-19 DE DE19617837A patent/DE19617837A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001024832A2 (de) * | 1999-09-27 | 2001-04-12 | Gabriele Pecher | Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung und prophylaxe von humanen tumoren, die das tumorantigen muzin und/oder das carcinoembryonale antigen (cea) exprimieren und ihre verwendung |
| WO2001024832A3 (de) * | 1999-09-27 | 2002-04-18 | Gabriele Pecher | Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung und prophylaxe von humanen tumoren, die das tumorantigen muzin und/oder das carcinoembryonale antigen (cea) exprimieren und ihre verwendung |
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