DE1928602A1 - Verfahren zur Herstellung von 11-Hydroxysteroiden auf mikrobiologischem Wege - Google Patents

Description

" Verfahren sur Herstellung von ll-Hydroxysteroiden auf mikrobiologischem V/ege "

Priorität« 17» Juni 1968, Y₀St₀A₀, Mr, 737 369"

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 11-Hydroxysteroiden aue IS a _S17(X -Dihydroxysteroiden«

Bekanntlich ist ee möglich, Steroide ₃ die in der Umstellung unsubstituiert sind_p auf mikrobiologischem Wege in der ll-Stel~ lung su hydroxylieren, Mese Verfahren werden allgemein als enzymatische Hydroxylierung der !!--Stellung bezeichnete tieiui diese Verfahren jedoch auf Steroide übertragen werden _p die Hydroxylgruppen in der 16Qf- und 17* -Stellung tragen_s wurde festgestellt, dass sie unter normalen Bedingungen entweder schlecht oder überhaupt nicht verlaufen»

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein neues Verfahren aur ensymatischen Hydroxylierung von 16Of ,lTOf-Mhydroxyeteroiden, insbesondere der Pregnanreihe ₉ zur Verfügung au stellen»

9098S1/1735

^tJb BAD ORIGINAL

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 11-Hydroxysteroiuen auf mikrobiologischem V/ege aus I6o< »17** ~- Dihydroxysteroiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man als Ausgangssteroici einen wasserlöslichen 16,17— Cycloboratester eines in 11-Stellung unaubstituierten 16 <X, 17 O(-Dihydroxysteroids verwendet·

Die enzymatische Hydroxylierung gömäss der Erfindung kann entweder dadurch bewirkt werden, dass &&η daß Ausgangssteroid einer wachsenden oder reifen Kultur einee die H-Steilung vcn Steroiden hydroxylierenden Mikroorganismus einverleibt, oder indem man das Steroid mit den Zellen, Sporen oder dem Mycel einer solchen Kultur behandelt, die von dem Wucäsmediura abgetrennt w«rde, oder mit den die Umstellung hydroxylierenden Enzymen behandelt, die aus den Zellen dieser Mikroorganismen abgetrennt wurden«

Geeignete Mikroorganismen zur 110(-Hydroxylierung sind Mitglieder der Gattungen Aspergillus, wie Ao ochraceus, Ehizopus, wie R«, arrhizus, Syncephalstrum, wie S. racemosum, Thamnidiunij wie T₀ elegans, Streptomyces, wie So fradiae, Sporotriohum, wie 5» epigaeum, Absidia, wie A. glauca, Aspergillus _ff wie A₀ niger und A. nidulanß, Dactylium, wie Dt dendioides, Nsurospora, wie N₀ eitophila, Sclerotina, wie S. libertiana» Gleosporium, wie G₀ k&ki, Polysporous, wie P. orientalis, Bacillus, wie E₁, cereus, Kuoor, wie M, adriaticus, Pseudomonaß₅ wie P„ fluox-euü&im, Trichothecium, wie T. roeeum, Phyouaycesj, wie I>, nitena, Penicillium, wie P. expansum, Beauvaria, wie B. basaiana,

Blakeelea, wie B₀ triepora, Cercospora, wie C. melonis,

909851/1735

Delacroixia_f wie D₀ urenata, Fusarium, wie ¥_o discolor ι Glomerella, wie Gr eingulate und Galonectria, wie C. decora.

Geeignete Mikroorganismen für die llß-Hydroacylierung sind Mit- · glieder der Gattungen Curvularia, wie G₀ lunata, Coniothyrium, wie C, hellebori, Chaetomella, wie C. oblonga, Dothichiza, wie I). ferruginosa, Spondylocladium, wie S, australe, Cunninghamella, wie G, blakesleeana, Rhodoseptoria sp«, Pycnoeporium ep«, Stachylidiuiu, wie S₀ bicolor, Botrytis_p wie B„ cinerea, Golletotrichum, wie C. phomoides, oder Gorticium, wie G. easakio

Bei Verwendung des MikrοOrganismus wird dieser aerob in einem geeigneten Nährboden gezüchtet» Im allgemeinen sind die Züchtungsbedingungen der Mikroorganismen für die Zwecke der Erfindung die gleichen, wie sie zur Herstellung von Antibiotika oder Vitaminen angewendet werden,, So wird der Mikroorganismus in Berührung mit (in oder auf) einem geeigneten Nährboden in Gegenwart von Sauerstoff, Z₀B. Luft, gezüchtete Ein geeigneter Nährboden besteht im wesentlichen aus einer Quelle von Stickstoffverbindungen und einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Energie_o Die Energiequelle kann ein Kohlenhydrate wie Rohrzucker, Heiasse, Glue08e, Maltose, Stärke oder Dextrin sein. Als Stickstoffverbindung en kommen organische Verbindungen, wie Sojabohnenmehl, Maiequellwasser, Fleischextrakt, die löslichen Rückstände der Alkoholdestillation, Peptone und/oder Hefeextrakt, oder synthetische Verbindungen in Frage, wie Ammoniumsalse, Alkalinitrate, Aminosäuren oder Harnstoff. ·

Als Ausgangssteroid kann jeder wasserlösliche 16,17-Cyoloborat— ester eines in der 11-Steilung unsubstituierten 16#,17CX

909851/1735

BAD ORIQINAU

aroxysteroids verwendet werden. Die bevorzugten AuEgangsstercid© leiten eich \-on der Pregranroihe s.b_P insbesondere von der 3-ICeto-.'!'· -pregnanreiJae· Zu diesen Verbindungen gehören die AlkaJ,isalzo, wie die liatriuni- wad Kaliumsalze, sov/ie die Ajnmoniutasolze der lo^rf-Cycloboratester. Besonders bevorzugte Auogsngssteroide haben die allgemeine Formel

B-O-R"

In der die 1,2- und ,6,7~Stellungen gesättigt sind oder eine Doppelbindung aufweisen^ X und X* Wasserstoff- oder Halogenatome„ Hydroxylgruppen, niedere Alkoxy- oder Allcylreete bedeuten, mindestens einer der Reste X ein Wasserstoffatom ist, Y ein Wasserstoff-, Eluor- oder Chloratom oder eine Kethy!gruppe, Z ein Wasserstoff- oder Halogenatoia, eine Hydroxylgruppe oder ein Acyloxyrest und R" ein Kation bedeutet, vorzugsweise ein Alkalioder Ammonium!on.

Geeignete Ausgangssteroide sind die Alkali- und Ammoniumsalze der lo„17-Cycloboratester von 16 C< ,17*?>-Dihydroxyprogesteron, 16 Λ , 11o\ i21-$rihy droxyproge eteron, 6 Ci-Hethy 1-16 Ol _s 17CS -dihydroxyprocQcteron, 6 *■:«Ohlor-16 ζί ,17oX-dihydroxyprogesteronp 6 c< -Pluor-lö CX, 17 Of -dihydroxyprogeeteron, 16 et, 17 Cf-Dihydr oxy-

909851/1735

BAD ORfOiNAL

21-fluorpiOgesteron, 16 Of _P17W~Dihydroxy~21-chlorproge8teron, 16(X ,lTOi-Dihydroxy-l-dehydroprogesteron, 16θ< , 1?οζ-Dihydroxy-6-. dehydroprogesteron, 6-Fluor-6-dehydro-l6 Of,17 Of-dihydroxyprogesteron, loOf-Hydroxyeortexolon, l-Dehydro-160( ~hydroxycortexolon, 6-Dehydro--l60(-hydroxycortexolon, ljö-Bis-dehydro-loOfhydroxycortexolon, 6 0f~Methyl~l6öi-hydroxycortexolon_p 6 <tf-Chlor-16 Ok-hydroxycortexolon, 6 0(-Pluor~16 ö^-hydroxycortexolon und Ester derjenigen Steroide, die eine 21-Hydroxygruppe aufweisen. Besonders bevorzugt Bind diejenigen Ester, die sich von Kohlenwasser st off car bonsäur en mit weniger als 12 C-Atoinen ableiten,¹ wie don aliphatischen Carbonsäuren mit weniger als 12 C-Atomen, den olefinisch ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren mit weniger als 12 C-Atomen, den monocyclischen»aromatischen Carbonsäuren, den durch einen monocyclischen»aromatischen Rest substituierten niederen aliphatischen Carbonsäuren, den Cycloalkan- und Gycloalköncarboneäuren»

Ba die im Verfahren der Erfindung eingesetzten Ausgangesteroide im Gegensatz zu den herkömmlich verwendeten Steroiden in Wasser sehr gut löslich sind, können sie dem Reaktionemedium in Form wässriger Lösungen oder als feste Stoffe oder in einer nicht wässrigen Lösung einverleibt werden» In jedem Falle bleiben sie im Fermentationsmedium in Lösung« Infolge ihrer LöslichJceiteeigen8Chaften ist das Verfahren der Erfindung gegenüber dem bekannten Verfahren vorteilhaft, da das Ausgangasteroid in höherer Konzentration im Reaktionsgemisch vorliegt» als es bisher möglich war. Nach dem bekannten Verfahren wurde das Steroid,vorzugsweise gelöst in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, zugegebene Diese organischen Lösungsmittel hemmen die enaymati-

^909851/1735 ' BWOfWWAL

sehe !!-Hydroxylierung, und aus diesem Grunde blieb die Konzentration des Steroids im ll~Hydroxylierungssystem beschränkte Das Steroid wurde auch in fester Form dem Reaktionsgemisch zugegeben» In diesem Pail hing die Reaktionsgeschwindigkeit und der Umsatz von der Losungsgeschwindigkeit und letztlich der Löslichkeit des Steroids ab_o Bei Verwendung der 16,17-Cycloboratester lassen sich jedoch im Verfahren der Erfindung Konzentrationen von bis zu 0,0125 molar erreichen _t \iMmi das Substrat zu einer verdünnten Kultur des Mikroorganismus gegeben wird. Die SteroidsubstratlcojtizeEtration kann bis zu 0,1 molar betragen, wenn das Substrat zu einem System gegeben wird, das abgetrennte konzentrierte Zellen oder das ll-HydroxylierungeeEEjm enthält« Vorzugsweise beträgt die Steroidkonzentration im System mit abgetrennten konzentrierten Zellen etwa 0,0002 bis etwa 0,002 molar, und im Enzymsystem etwa 0,0002 bis etwa 0,025 molar.

Das Ausgangssteroiü wird in wässriger oder wässrig-alkoholischer Lösung entweder vor oder während der Züchtung des Mikroorganismus zugegeben, wenn der Mikroorganismus selbst verwendet wird, oder zu einem wässrigen Medium, des die abgetrennten Zellen, Sporen oder das zellfreie ll~Hydroxylierwngsenzym enthält, wenn dieses Verfahren angewandt wird. Hach etwa 1 bis etwa 120 Stunde». 1st die Umsetzung praktisch beendet ο Dies hängt von der Konzentration des Steroids und des Kßsyms ab. Der erhaltene 16,17-Cyoloborateeter des ll-Bydroxystero&cLs kanu ansc&Liessend isoliert werden· Vorzugsweise wird Jedoch das Eeaktionsgemisete nach Abtrennung der Seilen oder des Hyoels, wenn ein Mikroorgaaisaus verwendet wird, auf eine» p^-Wert von mindestens 4,5 und

vorzugeweise auf etwa 1,5 bis etwa 3,5, »öS· durch Behandeln mit

909851/1735

. BAD OPJQINAL

einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, angesäuert. Hierdurch wird die löslT-Cycloboratestergruppe hydrolytisch abgespaltene Man erhält das freie 16 (X ,17Ot-Dihydroxysteroid«, Dae gewünschte Steroid kann hierauf in üblicher Weise isoliert werden, Z₀B₀ durch Pil- ' tration oder Zentrifugieren (wenn die Verbindung ein Feststoff ist_t oder durch GegenBtromverteilung).

Dl© Beispiele erläutern die Erfindung»

Beispiel 1

11 <x β 16 o( -Dihydroxycortexolon

Aspergillue ochraceue (Kultur Hr₀ 405 im Northern Regional Research Laboratory Collection) wird 7 Tage bei 25 C auf einem Schrägagar folgender Zusammensetzung gezüchtets

Agar 20 g

Glucose 10 g

Hefeextrakt 2 »5g

K₂HPO₄ Ig

Destilliertes Wasser auf 1 Liter
30 Minuten Autoklavieren bei 121⁰C ■

1 ml Anteile einer Suspension, die durch Waschen der Oberfläche eines Schrägagare mit 5,0 ml sterilem Nasser erhalten wird₈ werden zum Beimpfen von 50 ml des folgenden Nährmediums verwendet, das in einen 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben abgefüllt istj

Maisquellwasser 40 g

Glucose 20 g

Destilliertes Jrfaseer auf 1 Liter

P_n mit 2 η NaOH auf 6,5

50 Minuten Autoklavieren bei 121°C,

909851/1735

Der beimpfte Kolben wird mit einem Baumwollstopfen verschlossen und auf eine Drehsehüttelmasehine mit einem Hub iron etwa 5 ca ge«- geben, die mit 280 U/Min, rotiert. Hach 24 Stunden bei 25⁰C wird eine 5 volo-5k-ige Übertragung auf einen anderen 250 ml fassenden Kolben durchgeführt, der 50 ml des folgenden Nährmediuras enthält:

Maiequellwasser 10 g

Glucose 5 g ■

Destilliertes Wasser auf 1 Liter P_H mit 2 η HaOH auf 6,5

30 Minuten Autoklavieren bei 121°C.

Der zweite Kolben wird in gleioher Weise inkubiert wie der erste Kolben, jedoch unter Zusatz von wasserlöslichem 16 ö<-Hydroxyeortexolon, das folgendermaesen hergestellt wurde» 112,2 mg 16 Of-Hydroxycortexolon werden mit 0,23 ml einer wässrigen Boraxlösung (62,5 mg/ml) sowie 0,3 ml einer Kaliumhydroxydlösung in Äthanol (14 mg/ml) versetzte Die Verbindung wird'durch Erwärmen auf etwa 40 bis 50⁰C in Lösung gebrachte Danach wird das Heaktionsgemisch mit 95 ^-igem Äthanol auf 1,12 ml aufgefüllt. Ein 0,40 ml Anteil der Steroidlösung wird zur Beimpfungsseit in den Erlenmeyer-Kolben gegebene Nach 48 Stunden und 72 Stunden nach der Beimpfung wird weiteres Kaliumsalz des 16 Gf-Hydroxycortexolon-16,17-cycloborateeterB zugegebene Eine Zusammenstellung der Steroidzugaben ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.

909851/173 5

!Tabelle Steroid, als 16 Crf-Hydroxyoortexoloi; zugegeben

Zeitpunkt der
Zugabe, Std.

48 72

zugesetztes Steroid, Gesamtmenge an zuge-

ug/ral setztem Steroide.. Mg/ml

800
1250
1430

800 2050 3480

Die Menge des gebildeten 11Ä,160<-Dlhydroxycortexolons wird durch Ansäuern eines Aliquote der Gärmaische mit verdünnter Schwefelsäure auf p_H 2,5» Verdünnen mit destilliertem Wasser (1/3 für 48 alte, 1/6 für 72 Stunden alte und 1/10 für 120 Stunden alte Proben), Extraktion von 5 ml der verdünnten Gärmaische mit 2,0 ml Methyiieobutylketon und Papierchromatographie der Methylisobutylketonextrakte in einem Benzol-Äthanol-WasBer-Syetem ( 2 ί 1 : 2 ) geschätzt. Die Analysenergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben»

Tabelle

	Bildung von	lift„lSöi-Dihydroxycortexolon	Produkt, jag/ml	Umsatz,
	Äquivalente xycortexolon	16a-Hydro~
SSüehtungs- dauer, Std,	zugesetzte Menge, li^/al	zugesetste GeeamtmejQge, ^Jg/ml	546	67
O	800	800
48			1152	56
48	1250	2050
. 72			2040	59
72	1430	. 3480
120		• ■■ ..

909851/1735

Sobald analytisch festetent,, dass das gesamte Ausgangesteroid"in das Produkt umgewandelt ist, wird die Kulturbrühe durch Diatomeenerde auf einem Büchnertrichter abgesaugt. Der Filterkuchen wird in situ mit einer 0,1 #-igen vilissrigen Katriumtetrabaratlö-Bung gewaschene FUr jeweils 100 ml der Gärmaische werden etwa 10 bis 20 ml Waschlösung verwendet« Das vereinigte Filtrat und die Waschlösung werden bei einer !Peiaperatur swischen 5 und 10⁰C mit 10 j&--iger Salzsäure auf p™ 5_sü eingestellt. Das Produkt fällt kristallin aus der Lösung aus« Aus insgesamt 3»48g Substrat wer·=- den etwa 2,0 g Rohprodukt erhalt en α Nach Urakristallisation aus Äthanol werden 1,4 g reine Verbindung erhaltene

Wenn man das Verfahren von Beispiel 1 mit freiem 16 ß^-Hydroxycortexolon durchführt, kann man dieses Steroid in einer Konzen«=

5Q0-

t rat ion von höchst ens/jug/ml anwenden, und die Gesamtausbeute beträgt nach 120 Stunden etwa 40 # der !Sheorie.

Beispiel 2

Eine 7 Tage alte Agar-Schrägkultur von Aspergillus ochraceus gemäes Beispiel 1 wird zum Beimpfen eines 500 ml fassenden Srlenmeyex>»Kolben» "^«2rweiiÄ·t, der ein Sahrmediua folgender Zusammeneetzung enthält:

Versaahlenen Mais 15 g

verdünntes Maisquellwasser
(20 ml Maisquellwasser,

50 i> iestetoffe, mit

Leitungswasser auf 300 ml <

verdünnt) 15 ml

60 Minuten bei 121⁰O an awei
aufeinanderfolgenden Tagen
autoklaviert

909851/1735

BAD

Der beimpfte Kolben wird 5 Sage bei 25⁰C in einem gut gelüfteten Raum mit eingestellter Luftfeuchtigkeit ohne Schütteln inkubiert. Die Sporen (Konidien) werden durch Zusatz von 50 ml einer O_r85 S^-igen Kochsalzlösung, die 0,1 # Natriuialauryleulfat enthält, geerntete Die geernteten Sporen werden bei 15 000 g bei 5⁰C zentrifugiert und durch zweimaliges Suspendieren in 0,05 η Pho8phatpuffer_f p_H T_t0_s gewaschen. Nach federn Waschvorgang wird zentrifugiert,, Die nach dem dritten Zentrifugieren erhaltene Sporenpaste wird bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.

Zur Umwandlung des Steroids v/erden 0_{2 g der feuchten Zellenpaste in 100 ml 0_s05 η Phosphatpuffer, Pjj 7_s0, mit 3 # Glucose, in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben resuspendierto Der Cycloboratester wird gemäes Beispiel 1 hergestellt und zugegeben. Es muss nicht aseptisch gearbeitet werden« Die Inkubation der nicht-proliferi er enden Sporen zusammen m:.t dem Steroid wird . aerob gemäss Beispiel 1'auf-der Drehschüttelmaschine bei 25⁰C durchgeführt. Sobald die Anzahl der Sporen im Reaktionsgemisch etwa IO /ml beträgt, werden etwa 150/ig Steroid/ml innerhalb 24 Stunden in der lic/-stellung hydroxyliert* Durch Erhöhung der Sporenzahl auf 10 /ml werden innerhalb 24 Stunden etwa 1000 ^Jg Steroid hydroxyliertο Die Sporen keimen nicht während der Reaktion« Das hydroxylierte Steroid kann aus dem Reaktionegemiech gem&ss Beispiel 1 isoliert werden·

Beispiel 3

Gemäss Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Rhizopus arrhizus AXCC 11 145 anstelle von A. ochraceue, wird der Ι6θί-Hydroxycortexolon-lojlT-cycloborateeter in das 11 <X,16CC-Dihydroxycortexolon verwandelt. _QnoflC1/1,,_t

909851/1735

In gleicher Weise kann man da8 Kaliumsalz des l6,17~Cycloborat~ esters von 16 Οί-Hydroxycortexolon mit den nachstehend genannten Mikroorganismen in das 11C<,16« -^lhydroxyoortexolon umwandeln« Syncephal8trum racemosua, Thamnidium elegan8_P Streptomyces fradiae, Tiporotrichiuu epigaeuin, Absidia glauca_t Aapergillus ni~ ger, Aepergillue nidulans, Uactyliurn dendioides, Neuroepora eitophila, Sclerotiiia libertiana, Gleosporiuin lcaki, Polysporoue nrientalie, Bacillus cereuo, Hucor adriaticua, feeudomonas fluorescene_P Trichotlieciura roeeura_t Phycomyces nitens, Penicillium expansura, Beauvaria bassiana, Blakeelea trispora, Cercoßpora melonis, Uelacroixia urenata, Fuearium di8color_f (Jlomerella cingulata und Calonectria decora.

Beispiel 4

11 (X «16 (X . 17 g-l'rihydr oxy protester on

Gemäße Beispiel 1, jedoch unter Verwendung einer äquivalenten Menge des Natriumsalzee des 16,17-Cycloborateeterfl von 16 0(,170(-Dihydroxyprogeβteron anstelle des Kaliumsalzes des 16,17-Cycloboratesters von 16# -Hydroxycortexolon, wird das 11Ä _fl60( ,YI(A-Trihydroxyprogeeteron erhaltene

In ähnlicher Weise wird bei Verwendung des Kaliumsalzee des 16,17-Cycloboratesters des nachstehend angegebenen Steroids anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Äusgangssteroide das angegebene Produkt erhalten.

90985t/173 5

BAD ORIGINAL

	- 13	1928602	Produkt
Beispiel	Ausgangesteroid	11 (K, 16 Oi, 17 Ot 121-Tetra- hydroxyprogeeteron
5	16 Of, 17 Of, 21-Trihydroxy- progesteron	6 ot -Methyl-11 o<, 16 α , 17 o( -, trihydroxyprogesteron
6	6 Ot ~Methyl-l6 Of , 17 Ct -di- hydroxyprogesteron	6 of-Chlor-11 α ,16 0« ,17 of - trihydroxyprogeeteron
7	6 Of-Chlor-16 Ot, 17 0/-di- hydroxyprogesteron	6 of-piuor-ll Oi ,16 « ,17 Of- trihydroxyprogesteron
8 .	6 Oi -Fluor-16 α , 17 <X-di hydroxy progesteron	21-Fluor-ll Oi, 16 «,17cX- trihydroxyprogesteron
9	21-Pluor-16 Λ ,17 Oi -di hydroxy progesteron	21-Chlor-ll a,16 of ,17 Oi- trihydroxyprogesteron
10	21-Chlor-16 Oi t17 0f-di- hydroxyprogesteron	11Λ »16 Oi,17 0i-Trihydroxy-1- dehydroprogesteron
11	16 Ot, 17 Of-Dihy droxy-1- dehydroprogesteron	11 <X ,16 Oi, 17 <X-Trihydroxy-6- dehydroprogesteron
12	16 a,17 0i-Dihydroxy-6- dehydroprogesteron	6-?luor-6-dehydro-110f j 16 α,17 «-trihydroxy- progeeteron
13	6-KLuor-6-dehydro-16 Ot - 17 Λ-dihydroxyprogeste- ron	1-Dehydro-ll«,16 a-di- hydroxyoortexolon
14	l-Dehydro-16 rt-hydroxy- qortexolon	6-Dehydro-ll 0» ,16 «-di hydroxy oortexolon
15	6-I)ehydro-16 oi -hydroxy- cortexolon	1,6-Bis-dehydro-llÄ,16 Ä- dihydroxyoortexolon
16	1,6-Bis-dehydro-l6 <X- hydroxycortexolon	6 o( -He thyl-11 C*, 16 a -di- . hydroxycortexolon
17	6 CX-Me thy 1-16 Ol -hydroxy- oortexolon	6 O(-Chlor-ll 0(,16 0(-di- hydroxyoortexolon
18	6 Ot -Chlor-16 CX -hydroxy- cortexolon	6 0(-Pluor-ll Of, 16 Ct-di- hvdroxvcortexolon
19	6 Ot-Fluor-16 öl -hydroxy- cortexolon

BAD

909851/1735

Beispiel 20

16 Of-Hydroxy hydrocortison

Curvularia lunata (ATCC Nr, 12017) wird 7 Tage bei 25⁰C auf einem Schrägagar folgender Zusammensetzung gezüchtet!

Agar 20 g

Glucose 10 g

Hefeextrakt 2,5 β

K₂HPO₄ 1 g

Destilliertes Wasser auf 1 Liter

30 Minuten bei 121⁰C autoklav!ert.

Oberflächenwachstum des Schrägagars wird zum Beimpfen von 100 ml des folgenden Nährmediums verwendet:

Maisquellwasser 6g

NH₄H₂PO₄ 3 g

Hefeextrakt 2,5 g

Glucose 10 g

CaCO₃ 2,5 g

Destilliertee Wasser auf 1 Liter P mit 2 η NaOH auf 7,0 eingestellt

30 Hinuten bei 121⁰C autoklariert.

Dieses Nähmedium ist in einem 500 al fassenden Erlenmeyer-Kolben enthalten. Der beimpfte Kolben wird 38 Stunden bei 25⁰C auf einer Drehschüttelmaschine mit einem Hub von 5 cm bei 280 U/Min, inkubiert. Dann wird eine 5 vol.-s6-ige Übertragung auf einen zweiten, 500 el fassenden Kolben durchgeführt, der 100 ml des gleichen Nährmediuns enthält. 0er zweite Kolben wird in gleicher Weise inkubiert wie der erste Kolben. Sann wird eine Losung des Kaliumsalzes von. 16Di-Hydroxycortexolon-16,17-cyclot)orat, hergestellt

909851/1735

E: Beicpicl l_s nach 5 Stunden biß zu einer Konzentration von ICOO jug/ml zubegeben_c Ein weiterer Anteil der Steroidlöeung wird nach 24 Stunden in einer Konzentration von 1000/lg/ml zugegebene Insgesamt v/erden also 2000 /Ag/ml lGOV -Hydroxycortexolon eingesetzte

Die Menge des gebildeten 16 Of-Hydroxyhydrooortisons wird bestimmt, indem man einen Aliquot der Gärraaieche mit verdünnter Schwefelsäure auf p,, 2_f5 einrtellt, mit destilliertem Wasser auf 1 : 6 verdünnt, 5*0 ml der verdünnten Gärmaische mit 2,0 ml Methylisobutylket :n extraliiert und den Methylieobutylketonextrakt papierchromatographiech analysierte Hach 48 Stunden ist lediglich das lOiX-Hydroxyliydrocortison erkennbar,. Es wird in einer Konzentration von etwa 1 500jug/ml erhalten«. Der Umsatz beträgt etwa 75 #o

Gemäss Beispiel 1 werden aus 1 Liter der Gärmaische, die etwa 1,5 g Produkt enthält, 740 mg umkristallisiertes 16OC-Hydroxyhydrocortieon erhaltene

Wenn man das Verfahren von Beispiel 20 wiederholt, jedoch das freie 16a -Hydroxycortexolon als Ausgangssteroid verwendet, kann man dieses in einer Konzentration von köchetens 300 /ig/ml zugeben, und die maximale Gesamtausbeute nach. 144- Stunden beträgt etwa20 ¹Po

Beispiel 21

Gemäss Beispiel 20, jedoch unter Verwendung von Coniothyrium hellebori ATCC Nr₀ 12522 anstelle von Co lunata, wird der l6a-Hydroxycortexolon-16,17-cycloboratester in das 16Oi-Hydroxyhydrocortison umgewandelt. 9 0 9851/1735

BAD ORIGINAL

Die naciiötei end genannten Mikroorganismen -wandeln in gleicher Wei&e das Kaliumaalis des 16_f 17-OycloborateBters von 16 o< -Hydroxjcorteiolon in das 10 r^^HjdroxyhydrocortiQon ura:

Cheetoraella obluji^.a, .!)>*·thichiza ierrugino8a,Spondylochadium auatrale_f Guiaxin^hamella blakesleeana, ^hodoBeptoria sp_nf Pycnoeporium sp^, Ctooliylidium bicolor, Botrytis cinerea_f ColletütricJaum phomoides oder Corticium ßasakio

909851/1735

Claims (1)

1. Patentansprüche

   E^? Verfahren zur Herstellung von 11-Hydroxysteroiden auf mikrobiologischem Wege aus 16 Ot ,17Qr-Dihydroxysteroiden, d a durch gekennzeichnet; daos man als Ausgangs» steroid einen wasserlöslichen l6,17~Cycloboratester eines in der 11-Stellung unsubstituierten 16 <X_txjo( -Dihydroxysteroids verwendet.

   2, Verfahren nach Anspruch Γ, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid einen wasserlöslichen 16_p17~Cycloboratester eines in der 11-Stellung unsubstituierten 16«,17ot-Dihydroxypregnans verwendet.

   3ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangssteroid ein Alkalisalz eines löj^-Cycloboratesters eines in der 11-Stellung unsubstituierten 16 Of,17O(~Dihydroxy-3~keto~A-pregnan verwendete

   4o Verfahren naoh Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausgangssteroid in der llß-Steilung hydroxyliert.

   5ο Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die llß-Hydroxylierung mit einem Mikroorganismus der Gattung Curvularia lunata durchführt_o

   6, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausgangssteroid in der HiX-Stellung hydroxylierto _BAD ORIGINAL

   909851/1735

   7o Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e η η *·-. zeichnet, daae man die 11Oi -Hydroxylierung mit einem Mikroor^anißQiUß der Gattung Aspergillus ochraceua durchführt _a

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Auogangssteroid das Alkalisalz von 16&-~Hydroxycortexolon~16,17~cycloborat verwendete

   909851/1735