DE1914505A1 - Verfahren zur Herstellung von 15 N-L-Glutaminsaeure - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung, von %~L-Glutaialn3äure Sie Erfindung öotrlfft ein Verfahren zur Herstellung von

^H-L-Glutaminsäure und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung vcm ^N-L-Glutaminsäure aus ^N-L-Asparaginsäure.

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Sie ^If-L-Asparagineäure wurde bisher auf chemischem Wege synthetisiert. Bei diesen Verfahren erhält man ein DL-Raeemat, aus dem das nützliche Ir-Is ©mere durch chemische oder enzymatisch β Spaltung erhalten wird. Die Gesamtauebeuten für die chemische Synthese sind niedrig und demnach lag der Isotopengehalt an ⁵H üblicherweise unterhalb 20 $>. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von ³N-L-Asparaginsäure schließet die enzytn&tische Synthese ein, welche verschiedenartige Ausbeuten ergibt. Ea wird angenommen, dass das Versagen dieses Verfahrens auf das komplizierte System zurückzuführen ist, welches mit der Verwen dung von ganzen zurückbleibenden ZellouapansIonen verbunden ist.

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Sie Möglichkeit der Synthese von !»»Aminosäuren durch eine enzymkatalysierte Übertragung der Amino-Gruppe von einer leicht zugänglichen Aminosäure auf eine passende Ketosäure ist seit lan· gern bekannt. Akabori und Oshlo (1956), Japan, 3766 synthetisierten !»Glutaminsäure durch Transaminierung mit Phenylalanin unter Verwendung von Ganseellen-Suspensionen von Pseudomonas aarlnamla. Sin anderes Verfahren sur Synthese von L-Glutaminsäure (Sakurai und Akabori, 1956) verwendet L-Asparagiöefiure als Aminoquelle und katalysiert die Transaminierung mit einem Extrakt aus tierischer Herzauekulatur. Well dieses cweite Verfahren einen Extrakt aus tierischer Herzmuskulatur anwendet, wird es nicht als ein gutes Herstellungsverfahren betrachtet. Das erste Verfahren, wenn es auch einen einfach zu zuchtenden Organisaus benutzt, würde als Substrat das ⁵N-L-Phenylalanin erforderlich machen, welches noch nicht sugKnglleh. ist.

'H-L-Ctlutaminsäur· wurde durch eine enzymatisch« Aus taue cbreaktlon zwischen ⁵H-A*moniumchlorid und L-Olutaminsäure hergestellt. Diese» Verfahren führt «α 'SH-L-Glutaminatturev welche etwa 50 i* ¹^I enthält, und muss mehrere Male wiederholt werden, um. den Isotopengehalt auf 90 i» *N su erhöhen. Wenn jedoch das Verfahren mehrere Mais wiederholt wird, verliert der Isotopenaustausch unglücklicherweise seine wichtigste Überlegenheit Über die ehealβübe Synthese, nämlich die Verwendung des ¹⁵N-Isotops mit geringem Verlust.

Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von ·Ä-1-Glutamineäure mit einem laotopengehalt von mehr als 90 Ji ¹⁵M zu schaffen.

Es 1st ein weiteres Ziel der Erfindung ein neues Verfahren zur' Isolierung von Asparaginase und zur Synthese von ^H-L-Aspara»

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ginsäure anzugeben, welche besonders brauchbar zur Herstellung von ^H-L-GIutaminaäure ist.

Getnäse e^ner Ausführungsform der Erfindung stellt man ^N-L-Asparaginsäure her durch Umsetzen von Katrium-fumarat und ¹^K-Ammoniumchlorld, gelöst in einem neutralen Puffer, z.B. neutralem Natriumphosphat in Gegenwart einer Eneym-Zubereitung von Asparaginase. Die Mischung wird bei 37° C während einer Zeitspanne von etwa 1Θ bis etwa 30 Stunden bebrütet und zu die·» βem Zeltpunkt 1st, wie die DUnnschicht-Chromatographie bestätigt, die maximale Synthese von Asparaginsäure erzieht. Bio Umsetzung kann in folgender Weise erläutert werden:

¹⁵HH₅₁ Ϊ ³

HOOC-CH - CH-COOH + ¹⁵HH₄Cl

Sie Aeparaginase-Bneym-Zubereitung erhält man durch Züchten eines Bakterlume, te.B. Bscherichia coil, auf einem Nährmedium, bis das maximale Wachstum erzielt ist. Sie Zellen werden in einem neutralen Hatriutaphosphat-Puffer suspendiert, mit einem Puffer gew&echen und durch Zentrifugieren gesammelt. Si« gewaschenen Zellen werden zerrissen durch Vermählen mit Aluminiumoxid in einer Puffersuspension und axischliessende Verdünnung mit dem Puffer und Zentrifugieren, um das Aluminiumoxid zu ent« fernen. Aus der überstehenden Flüssigkeit werden die nucleinsäuren durch Zugabe einer Streptomyctnsulfat-Lösung gefällt und das niedermolekulare Material wird mittels Dialyse gegen kaltes Leitungswasser entfernt. Sann wird das Bialysat angesäuert und.über Nacht feti tiefer Xemperatwr gelagert und each Zentrifugieren wird die Asparaginaee-Tablette gewonnen. Sie kann in einer Pufferlösung aufgelöst und fUr spätere Verwendung bei 4⁰C gelagert t/erden.

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Sie gewünschte 'N-I-Asparsginsäure wird nach dem folgenden Verfahren isoliert! Man beendet die Umsetzung durch Kochen während weniger Minuten, entfernt das ausgefällte Protein durch Filtrieren, absorbiert dann das Filtrat an eine« stark sauren Kationenaustauscherhare, v/fischt mit Wasser und eluiert die Asparaginsäure aus dem Harz mit Hilfe eines flüchtigen Lösungsmittels. Die Asparaginaa'ure-Fraktion wird dann an einem schwach basischen Ionenaustauscherharz absorbiert und mit einer schwachen Säure eluiert. Dann engt man die Asparaginaäure-Praktion eur Trockne ein, löst in warmem Wasser und kristallisiert dann die ^N-L-Asparaginsäure durch Zusatz von Äthylalkohol zur Lösung.

ierner erhält man nach dem erfindungsgemässen Verfahren ⁷Ν-ί»~ Olutaminaäurs durch Suspendieren von ■ N-I-Asparaginaäure und Ot-Ket©glutarsäure in destilliertem Wasser und Neutralisieren des Reaktionsgemisches auf einen pH-Wert von 7,0 bis 8,0, Sem Gemisch wird Pyridoxa!-phosphat, ein echwach basisches Ionenaustauecherharz und ein Asparagin-aminotransferase-eneym eugefügt* Sie Umsetsung wird bei Raumtemperatur bebrütet und man lässt den pH-Wert abfallen, um die Oxalessigsäure zu decarboxylleren. Sie Uraseteüng ist vollständig, wenn mittels Dünnechicht-Chromatographie Asparagineaure nicht festgestellt werden kann· Der Reaktioneverlauf ist der folgendet

¹⁵HH₂ I * HOOC-CH₂Oh₂CO-COCH + HOOC-Ch₂CH-COOH

¹⁵i

HOOC-CH₂CH₂Ch-COOH + HOOC-Ch₂CO-COOH

A Basisches Ionenaustauscher-

CO₂ + CH₃-CO-COOH ^barZ

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Sie so erhaltene ¹⁵N-L-GlUtamineäure wird in folgender Welse abgetrennt: Man säuert das Reaktionsgemisch an, rührt mit Aktivkohle, filtriert dann die Suepeneion, absorbiert das FiI-trat an einem starken KationenaustauscherharZj wäscht mit Was« ser und elulert die Aminosäuren aus dem Bars mit Hilft eines flüchtigen Lösungsmittels. Die Aminosäure-Fraktion wird an einem schwach basischen lonenaustauscherhars absorbiert und die Glutaminsäure mit einer schwachen Säure eluiert, sur trockne gebracht und in warmem Wasser wieder aufgelöst. Dann kristallisiert man die ¹⁵N-Ir-Glutaminsäure durch Zusats von Äthylalkohol asur Lösung.

Di» nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne ihren Umfang au beschränken.

Beispiel 1
Herstellung des Enayms

Man züchtet S. coli-Zellen (N.φ.C 9001) auf Agar, wie es von Wu und Bittenberg beschrieben ist. Die Asparaginase wird mittels eines Verfahrene isoliert, welches die saure Fällungestufe elnachliesst, die von Virtanen und ElIfolk angewandt wurde. Bas nachfolgende Reinigungsverfahren wird an Zellen aus 19 Roux-Xolben ausgeführt,

Jedem Roux-Kolben fügt man etwa 10 ml 0,001m Natriumphosphatpuffer mit dem pH-Wert 7,4 eu, suspendiert die Zellen durch vorsichtiges Schütteln, zentrifugiert die vereinigten Zellensuapenslonen bei 10 000 g während 10 Hinuten, suspendiert die Zell-Sablette neuerlieh in 20 ml Puffer, fügt 2jroJipAnar^ru- ^ mlniumoxld au und vermählt die erhaltene Paste während 20 Minu»

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ten in einem Mörser. Die Paste wird mit 100 ml Puffer verdünnt und wie zuvor zentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit setzt man 5 ^ige Streptomycln-Bulfat^Lösung zu, bis dia überstehende Flüssigkeit 1 $> Streptomycin-sulfat enthält, trennt nach 30 Minuten die ausgefällten Nucleinsäuren durch Zentrifugieren bei 10 000 s während 10 Minuten ab, dialysiert die überstehende Flüssigkeit während 18 3tunden gegen 3 Liter 0,001ia Natriumphoephatpuffer mit dem pH-Wert 7,4 bei 4°, säurert das Dialysat mit 10 #iger Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,4 an und lagert über Nacht bei 4°. Die Suspension wird wie zuvor zentrifugiert, die Überstehende Flüssigkeit verworfen und die Asparaglnase-Tahlette löst man in 45 ml O₁OOIm Natriumphosphatpuffer mit äera pH-Wert 7,4 durch langsames Rühren während 45 Minuten. Es iat notwendig, den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01n Natriumhydroxid-Lösung wiederum auf 7t4 einzustellen. Einiges verbleibende unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Di« überstehende Flüssigkeit stellt die Ensye-Zubereltung dar, welche bela Lagern bsi 4° als wenig« stena 1 Monat stabil befunden wird.

Beispiel

Zu 9*0 »1 0,005m Natriiraphoephatpuffer mit dem pH-Wert 7,4 fügt aan 1,5 g Hatriramfuearat und 0,4 g Ammoniuachlorid zu, überprüft den pH-Wert, setst dann 3,5 al Aeparaginase-Zubereltung eu und bebrütet das Gemisch bei 37° während der erforderlichen Zelt, üblicherweise etwa 72 Stundet

wird verfolgt durch Entnehmen von Proben und Auf« bringen auf TLC-Bogen (Eastman Chromogram K301R); die Chromatcgranme werden mit Butanol/Beaigaäure/Waaaer {80ϊ20:20 vol/vol) entwickelt und mit 0,2 i» Hiahydrin in Butanol besprüht« In ein-

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zelnen Fällen werden halbquantitative Schätzungen der Asparaginsäure ausgeführt durch Aufbringen der Proben in mehreren Verdünnungen und Vergleichen dieser Flecken gegen eine Standard-Probe eur gleichen Zeit. Der Standard 1st 1 mg/ml Asparagin» säure in 0,15m Essigsäure.

Beispiel 3

Man kocht das Heaktionsgemisch während 1 Minute schwach mit 250 mg Aktivkohle der Handelsbezeichnung Darco Γ**, filtriert dann durch Glaspapier auf einem Büchner-Trichter, verdünnt das Filtrat mit destilliertem Wasser auf das dreifach© seine 3 ursprünglichen Volumens und abeorbiert an einer Säule (3»8 χ 28,5 cm) mit Harz der Handelsbezeichnung Dowex 50 Vfß? 0_s297 bis 0,149 mm {50 bis 100 mesh), welche mit H⁺~Ionen beladen ist. Die Säule wird mit 300 ml destilliertem Wasser gewaschen und die ^H^L^kgpayaginaaure wird durch O,75n Ammoniucshydroriö«· Lösung ersetzt. Sie Fraktion, welche die ^^N-L-Asparaginssure enthält, wird der Rapidverdampfung zur Trockne unterworfen, um überschüssiges Ammoniak zu entfernen, in 3CO ml Wasser gelöst und an einer Säule (4,5 x 38,0 cm) mit Harz CG~45®» welches mit Acetat beladen 1st, absorbiert. Nach dem Durchleiten von 300 ml 0,05m Essigsäure durch die Säule eluiert man die ¹⁵N-L-Asparaginsäure mit 0,25m Essigsäure· Die Asparaginsäure-Lösung wird der Rapidverdampfung zur Trockne (40°) unterworfen, in einem minimalen Volumen heiaeen Wassers gelöst und die ¹5u-L~Asparaginsäurewird^us_der Lösung durch Zugabe von 0,5 Volumina absolutem Äthylalkohol kristallisiert. Das Produkt wird auf Filtrierpapier gesammelt, über Pg^V^n einem-Jixsikkator getrocknet und gewogen.

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Beispiel 4

Zu 75 ml destilliertem Wasser fügt man 1,5g ⁵N-L-Aaparaginsaure (96,5 £ 15N) und 2,1 g #.-Ket©glutarsäure zu, rührt die Suspension langsam und löst die Reaktionsteilnehmer durch Zugabe von 4n Natriumhydroxid-Lösung, bie der pH-Wert 7,6 betragt, ββ tat wenige Milligramm Pyridoxal-phosphat und 50 mg Bars der Handelsbezeichnung CG-45® (mit Acetat beladen) eu, fügt etwa 2 ag Asparaginat-Aeinotraneferase zu, bebrütet die Mischung bsi 25° , überprüft den pH-Wert jede Stunde und stellt ihn alt 1n Chlorwasseretoffsaure-Iiösung auf 7,6 ein» Nach 6 Stunden wird der pH-Wert mit 10 ^iger Essigsäurelösung auf 6,5 gebracht und das Reaktionsgemisch wird langsam über Nacht gerührt. Nach 18 Stunden wird der pH-Wert wiederum mit 4n Na» . triumhydroxld-Lösung auf 7,6 gebracht und während 6 Stunden bei diesem Wert gehalten. Es wird ein Dünnechicht»Chromatogramm ausgeführt, welches zeigt, dass sehr wenig Asparaginsäure zurückgeblieben ist. Dann wird der pH-Wert mit 10 ^iger Easlgsäurelösung auf 5,0 gebracht, und das Reaktionsgemisch wird während 30 Minuten mit 200 mg Aktivkohle der Handelsbeseich·» nung Darcο X™ gerührt. Die Suspension wird durch Glaspapier

* filtriert. Die ⁵N-L-Asparaginsäure wird gereinigt und abgetrennt durch Ionenaustauscher-Chromatographie an Harssen der Handelsbezeichnung Dowex 50 W ^ und CG-45 ® , wie es in Beispiel 3 beschrieben 1st.

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Claims (4)

19H505 061 J 21. Mara 1969 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von ■'N-L-Glutaminaäure, dadurch

gekennzeichnet, dass man ^H-L-Aeparaginsäura und o£-Ketoglutarsäure in einem neutralen Medium in Gegenwart von Pyridoxal-phosphat und einem Aaparagin-Anisiotransferase-Enzym miteinander umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Reaktionsgemisch ein achwach basisches Ionenaustauscher harz zusetzt.

3. Verfahren aaeo Anspruch 1„ daäus^M gekennzeichnet, dass man den pH-Wert des Reaktionsgesisshsa aauer werden lässt, um auf dieee Weis· dl· Ite^:©arü®3yli®rung der gebildeten Oxalesfiigsäure zu

4. Verfahren iur Herstellung von ^I-L-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man ^N-Ir-Aaparaginsäurβ mit Ot -Ketoglutarsäure in einem wässrigen Medium zusammenbringt, welches auf einen pH-Wert zwischen 7 und 3 eingestellt ist, Pyridoxalphosphat und eine schwache Ionenaustauacherharz-Base dem Gemisch zusetzt, dazu eine Aaparagin-Aminotrassferase-Base mischt, das Medium bebrütet und den pH-Wert des Mediums auf schwach sauer einstellt, um auf dieae Weise die Decarboxylierung der Oxaleesigsäure, wie sie sich im Reaktionegemisch findet, zu bewirken.

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ORIGINAL INSPECTED