DE1909965A1

DE1909965A1 - Verwendung von biologischen Proteasen-Inhibitoren zur Konservierung von Organen,Geweben und Nahrungsmitteln

Info

Publication number: DE1909965A1
Application number: DE19691909965
Authority: DE
Inventors: E Grundmann; G Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1969-02-27
Filing date: 1969-02-27
Publication date: 1970-09-17
Also published as: ES376974A1; BE746644A; NL7002860A; FR2032476A1; CA932664A; NO129768B; CH557138A; AT297395B; DK126895B; FR2032476B1; IL33870A0; JPS5133995B1; GB1233876A; BR6915369D0; US3682776A; SE376710B; IE34180L; IL33870A; IE34180B1; DE1909965B2

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKUSEN-Bayeiwerk 25· Febr. 1969 Patent-Abteilung Si/Rb '

Verwendung von biologischen Proteasen-Inhibitoren zur.Konservierung von Organen, Geweben und Nahrungsmitteln

Bei der Aufbewahrung von Organen und Geweben, vor allem von solchen, die für Transplantationen bestimmt sind, treten, häufig Schwierigkeiten dadurch auf, daß diese Organe und Gewebe durch postmortale Autolyse mehr oder weniger zerstört und dadurch für den genanntenZweck unbrauchbar werden. Auch Pilze und Bakterien, welche Proteasen enthalten, können den gleichen ungünstigen Effekt bewirken. Ähnliche Verhältnisse liegen bei Nahrungsmitteln vor, welche ebenfalls durch die Einwirkung von Proteasen unbrauchbar werden können.

Die genannten unerwünschten Effekte können zwar durch bekannte Konservierungsmittel mehr oder weniger verhindert werden, der Nachteil solcher Verfahren liegt jedoch darin, daß viele der gebräuchlichen Konservierungsmittel vom Organismus nicht gut vertragen werden.

Es wurde nun gefunden, daß man Organe, Gewebe und Nahrungsmittel mit biologischen Proteasen-Inhibitoren konservieren kann.

Diese biologischen Proteasen-Inhibitoren haben den großen Vorteil, daß sie vom Organismus praktisch ohne Komplikationen angenommen werden. Vor allem aber zeigen sie den gewünschten Konservierungseffekt in hohem Maße.

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Unter biologischen Proteasen-Inhibitoren werden hier Inhibitoren aus tiefischen Organen, vor allem der bekannte Kallikrein-Trypsin-Inhibitor, ferner die Proteasen-Inhibitoren pflanzlichen Ursprungs, z. B. aus Kartoffeln und aus Leguminosen, verstanden.

Als Organe und Gewebe, die erfindungsgemäß konserviert werden können, kommen vor allem Leber, Niere, Herz, Pankreas, Lunge, Baut und Knochenmark in Frage.

Die genannten Inhibitoren werden vorzugsweise in wässrigen Lösungen angewandt. Man kann die zu konservierenden Organe, Gewebe und Nahrungsmittel in diese wässrigen Lösungen einlegen, man kann jedoch auch die wässrigen Lösungen in diese Organe usw. injizieren oder diese mit ihnen durchströmen. Außerdem ist es"jedoch möglich, die Inhibitoren in fester Form, gegebenenfalls mit Trägersubstanzen» mit den zu konservierenden Organen usw. in Berührung: zu bringen.

Wendet man zur Durchführung der erfindungsgemäßen Konservierung wässrige Lösungen an, so genügen bereits geringe Konzentrationen zur Erreichung des gewünschten Effektes. In Abhängigkeit vom besonderen Fall kann es sich jedoch' auch als zweckmäßig erweisen, höhere Konzentrationen anzuwenden.

Beispiel 1

Frische Nieren von gesunden Ratten werden entnommen und durch einen Mittelschnitt in 2 Teile geteilt. Die eine Gruppe der Nierenhälften wird in physiologische Kochsalzlösung und die andere in Kochsalzlösung, die mit dem Kallikrein-Trypsin-Inhibitor (KTI) in einer Konzentration von 8 mg pro ml versetzt ist, gebracht. Die Nierenhälften werden bei Zimmer-/ temperatur in diesen Lösungen unter sterilen Bedingungen aufbewahrt, zu verschiedenen Zeiten nach Beginn des Ver-■suches steril entnommen und mittels histologischer Routinemethoden sowie durch Methoden der Fermenthistochemie auf

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auf ihre Intaktheit untersucht. Die Gewebstüeke werden entweder für die spezielle Fermenthistochemie auf dem Kryostaten geschnitten oder mit neutralem gepuffertem Pormol bzw. nach WOIMAN fixiert. Das WOLMAN-fixierte Material wird über Methylbenzoat in Paraffin eingebettet und zur Routine-Histologie verwendet. Das in Pormol fixierte Material wird gefriergeschnitten und dient der .Darstellung der Hydrolasen..

Folgende Permente werden dargestellt: NADH-Cytochrom-c-Reduktase (NADH-C-R)₁ Laktatdehydrogenase (LDH), Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH), Succinodehydrogenase (SDH), Cytochromoxydase (CO), unspezifische Esterasen (UE), alkalische Phosphatasen (AP) und saure Phosphatasen (SP). Die histochemischen Nachweise der Hydrolysen werden durchgeführt nach A.G.E. PEARSE /""Histochemistry; Theoretical and Applied", 3rd Edition; J. ä. A. Churchill Ltd. (London 1968)_7 ^{und die der} übrigen Enzyme nach T. BARKA und P.J. ANDERSON /""Histochemistry; Theory, Practice, and Bibliography"; Harper and Row, Publishers, Inc.; New York (196327· An histologischen Färbungen werden die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) und die GOLDNER-Färbung durchgeführt.

Nach 6 Stunden Inkubation in physiologischer Kochsalzlösung färbte sich mit HE das Plasma .wesentlich schwächer an; die Tubuluszellen erscheinen verquollen. Es kommt im gesamten Gewebe zu einer starken Auflockerung. Die Aktivität an LDH, NADH-C-R und SDH hat noch nicht eindeutig abgenommen, jedoch zeigen sich bereits Unregelmäßigkeiten in Form und Dichte der Granula. Bei der G6PDH werden ähnliche Veränderungen, besonders in der iuxtamedullären Zone, beobachtet. Der.CO-Nachweis ergibt eine fleckige Anfärbung. Bei den UE finden sich im tubulären Apparat unregelmäßige Farbstoff verteilung und -verklumpung; im Mark hat die Aktivität abgenommen. Die Anfärbung der SP ergibt eine reduzierte Aktivität und gröbere Granulation. Nach 6-stündiger Aufbe-

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Währung in KTI-Iösung ist es zu einem nur geringen Verlust der Anfärbbarkeit mit HE gekommen, jedoch erfolgt immer eine klare Darstellung; eine ^uellung ist kaum zu beobachten. Die Lumina der Tubuli sind schärfer abgegrenzt. Die Anfärbung für die genannten Enzyme ergibt allgemein keine · wesentliche Abweichung vom Normalbild. Die Aktivität ist stark und regelmäßig verteilt. Die Farbstoffgranula sind allgemein gut erhalten.

Nach 24 Stunden findet man ohne KTI ein weiteres Fortschreiten der Autolyse. Die Kerne verdämmern und sind zum großen Teil, besonders in den inneren Abschnitten der Gewebestücke» nicht mehr färbbar. Die Tubuli zeigen nur noch dünne Wandungen. Das Lumen stellt sich nicht mehr geschlossen dar. Der gesamte Gewebebereich zeigt beginnende Auflösungserscheinungen; auch das interstitielle Bindegewebe ist weitgehend aufgelöst. Nach Anfärbung auf LDH, NADH-C-R, SDH' und CO sind die Farbstoffpartikel zu homogenen Massen zusammengelagert, und die Kerne sind im Farbstoffbereich nicht mehr deutlich abgegrenzt. Die Aktivität an G6PDH ist stark abgesunken. Die UE sind völlig verschwunden. Die AP sind zwar teilweise noch in starker Aktivität vorhanden, stellen sich Jedoch nur in Form verklumpter Klekse dar. Die SP zeigen eine homogene Anfärbung mit stark verminderter Aktivität. Unter KTI-Einwirkung sind nach 24 Stunden die Kernstrukturen noch fast alle gut erhalten. Es machen sich zwar erste Anzeichen beginnender Autolyse bemerkbar, jedoch erscheint das Gewebe geschlo-ssen, und das Interstitium ist noch gut erhalten. Die Farbstoffverteilung der angefärbten Enzyme ist allgemein regelmäßiger. Die Aktivität ist wesentlich besser erhalten. Allerdings ist bei der G6PDH eine abfallende Tendenz bereits zu erkennen, und die UE sind nicht mehr nachweisbar. Der Unterschied zur Kontrolle ohne KTI ist besonders deutlich bei den SP, die in Aktivität und Struktur noch gut erhalten sind.

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BAD ORIGINAL

Nach. 5 Tagen ist es ohne KTI zu völliger Auflösung der Strukturen gekommen. Das Präparat ist mit HE fast farblos, nur vereinzelte Kerne sind noch dargestellt. Konturen sind nicht mehr zu erkennen. Die Anfärbung auf LDH und NADH-C-R ergibt nur noch homogene Massen. CO und AP sind nicht mehr . nachweisbar. Die SP zeigen noch Aktivität, aber ohne Strukturierung. Nach 5-tägiger Aufbewahrung mit KTI sind noch deutliche Strukturen des Rindengewebes zu erkennen; die Tubuli sind zum großen Teil noch in der Form erhalten. Die Anfärbung auf IDH und NADH-C-R zeigt noch deutliche Granulierung. Bei der LDH-Färbung sind die Glomeruli noch immer durch ihre Negativität abgegrenzt. CO ist noch deutlich nachweisbar. Die Aktivität der SP ist. stärker und besser verteilt als bei den Kontrollen.

Beispiel 2

Lebergewebe von gesunden Ratten wird in Würfel von 5 mm Kantenlänge zerschnitten und wie bei Beispiel 1 in Kochsalzlösungen ohne und mit Zusatz des KTI aufbewahrt. Die weitere Aufarbeitung und Untersuchung erfolgt wie bei Beispiel 1 beschrieben.

Nach 6 Stunden findet man bei der LDH, NADH-C-R und SDH fleckenförmige Aktivitätsabnahmen. Die G6PDH hat bei den meisten Zellen wesentlich abgenommen; die Strukturierung und die Negativität der Kerne sind aber noch erhalten. Bei den UE kommt es zu fleckigen Ausfällen. Bei den SP ist die Begrenzung der Kapillaren unscharf und die Aktivität erscheint unregelmäßig verteilt. Nach 6-stündiger Aufbewahrung in KTI-haltiger Lösung weisen LDH, NADH-C-R, SDH und G6PDH noch keinerlei Veränderungen auf. Die UE zeigen geringere Ausfälle. Die SP sind schärfer begrenzt und regelmäßiger verteilt als bei den Kontrollen.

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Nach 24 Stunden kommt es ohne KTI zu einer ötrukturauflösung. Die Läppchen sind nicht mehr deutlich abgegrenzt; die Sinus sind unregelmäßig begrenzt und zeigen tiefe Einbuchtungen. Die Aktivität an LDH, NADH-C-R, SDH und besonders an G6PDH hat abgenommen. Bei der Anfärbung auf SP tritt neben ■ einer starken Aktivitätsabnahme eine beginnende Auflösung der Kanälchensysteme zutage. Nach 24-stündiger Aufbewahrung in KTI-Lösung ist die Begrenzung der Läppchen und Sinus regelmäßiger. Die*Aktivität an LDH, NADH-G-R, SDH und G6PDH ist allgemein noch verhältnismäßig stark. Auch nach der Anfärbung auf SP ist die Aktivität noch wesentlich stärker, und die Kanalchensysterne erscheinen besser erhalten.

Nach 5 Tagen ist ohne KTI bei LDH, NADH-C-R und SDH nur noch minimale homogene oder fleckig dargestellte Aktivität zu finden. Nur die SP zeigen noch mäßige Farbstoffbeladung. Auch bei Aufbewahrung in KTI-Lösung hat nun eine gewisse Strukturauflösung eingesetzt. Es zeigen aber LDH, NADH-C-H und SDH noch deutliche Aktivität. Die Aktivität der SP ist wesentlich stärker als die der Kontrollen.

Beispiel 3

Man entnimmt dem menschlichen Sternum mit einer Punktionskanüle 2 bis 4 ml Knochenmark. Dieses suspendiert man im doppelten Volumen Tyrodelösung, der pro ml 15 mg Kallikrein-Trypsin-Inhibitor zugesetzt sind. Man bewahrt die Suspension bei etwa -2O⁰C auf. Vergleicht man die Suspension nach einem Jahr mit einer entsprechenden Suspension von Knochenmarkzellen, die ohne Inhibitorzusatz, aber im übrigen gleich hergestellt wurde, so findet man in dieser nach Anfärbung mit Trypanblau oder Eosin mehr tote Zellen als in der erfindungsgemäßen. '

Beispiel 4

Eine menschliche Leber, die für die Transplantation vorgesehen ist, perfundiert man durch die Pfortader und die

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Arteria hepatica mit Tyrodelöaung, der pro ml 10 mg Kartoffel-Inhibitor zugesetzt sind. Das Lebergewebe bleibt besser erhalten als das einer anderen Leber, die unbehandelt geblieben ist. Die histologisch sichtbaren autolytischen Veränderungen werden deutlich zurückgehalten.

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Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von biologischen Proteasen-Inhibitoren zur Konservierung von Organen, Geweben und Nahrungsmitteln.

2. Verwendung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitörs zur Konservierung von Organen, Geweben und Nahrungsmitteln.

3· Verwendung von pflanzlichen Proteasen-* Inhibitoren zur Konservierung von Organen, Geweben und Nahrungsmitteln*

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