DE1467878B2

DE1467878B2 - Verfahren zur herstellung eines medikamentes aus schweinepankreas

Info

Publication number: DE1467878B2
Application number: DE1964E0026910
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Eurorga S.A., Villeras, Saclay, Seine-et-Oise (Frankreich)
Priority date: 1963-04-25
Filing date: 1964-04-24
Publication date: 1977-05-26
Also published as: LU45937A1; DE1467878A1; BE646804A; US3313705A; NL6404480A; GB1053702A; FR2831M

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes für die Humantherapie aus Schweinepankreas, wobei der vom Tierkörper abgetrennte Pankreas von unerwünschten Bestandteilen gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert wird.

Es gibt zahlreiche pharmazeutische Pankreaspräparate. Einige werden aus getrocknetem und entfettetem Pankreas, wie enzymatische Präparate auf Basis von »Pankreatin«, andere aus gereinigten, aus dem Pankreas extrahierten Enzymen, die "Pankreas-»Lepase« enthalten, hergestellt.

So wird in der GB-PS 1 88 660 ein Pankreaspräparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben, wobei das Verfahren darin besteht, daß man den gemahlenen Pankreas zwecks Entwässerung zur Erzielung eines trockenen Produktes mit wasserfreien Salzen, wie gebranntem Gips, wasserfreiem Natriumsulfat, Ammoniumchlorid, wasserfreiem Magnesiumsulfat oder wasserfreiem Natriumphosphat, verreibt, wobei ein fast trockenes Pulver erhalten wird, das Produkt bei tiefen Temperaturen trocknet und zerkleinert. Ein gemäß diesem Verfahren erhaltenes Produkt, das aus zermahlenem Pankreas, gebranntem Gips und verschiedenen wasserfreien Salzen in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen besteht, kann in der Humantherapie kaum Verwendung finden, da es zumindest unverdaulich ist, sicher stark abführend wirkt und sehr wahrscheinlich toxisch ist. Dieses Entwässerungsverfahren ist in der pharmazeutischen Industrie zur Erzielung wirksamer Präparate keinesfalls anwendbar.

Das aus der DT-PS 8 75 640 bekannte Verfahren, wobei dem bei der Insulinextraktion aus zerkleinerten frischen oder wohlkonservierten Pankreasdrüsen mit saurem Alkohol oder Aceton angefallenen Rückstand die Enzyme mittels eines wäßrigen Mediums, worin gegebenenfalls anwesender Alkohol oder Aceton mit einer Konzentration unterhalb 60 Volumenprozent enthalten ist, entzogen wird, resultiert in der Gewinnung von proteolytischen Pankreasenzymen aus Säugetieren. In der Pharmacopoea gallica (Codex von 1937 und 1949) wird das Pankreatin als das Produkt definiert, das erhalten wird, wenn man den Brei von Schweinepankreas bei niedriger Temperatur trocknet und anschließend

durch Behandlung mit Äther die Fettstoffe entfernt und das Material pulverisiert. Auch das »Dispensatory of the USA (based on the 12th revision of the U.S. Pharmacopoea, the National Formulary, 7th edition, and the British Pharmacopoea 1932 and addenda)« gibt an, daß nach der britischen Pharmacopoea das Pankreatin aus frischem Pankreas gewisser, üblicherweise für Ernährungszwecke verwendeter Tiere durch Extraktion mittels 4 Teilen 25prozentigen Alkohols auf einen Teil Pankreas hergestellt werden kann.

Klinische Versuche haben ergeben, daß Präparate aus frischem vollständigem Pankreas bei schweren chronischen Pankreasentzündungen wirksam sind, während die Pankreatinpräparate nicht wirksam sind.

Man muß annehmen, daß gewisse wertvolle Bestandteile des frischen vollständigen Pankreas durch die Arbeitsgänge, die bei der Herstellung von Pankreatin notwendig sind, zerstört, inaktiviert oder beseitigt werden.

Ferner wurde durch zahlreiche Arbeiten über enzymatische Stoffe des Pankreas gezeigt, daß es keine einheitliche Lipase im Pankreas gibt; es finden sich dort alle Arten von spezifischen oder nicht spezifischen Esterasen, wasserlösliche oder fettlösliche echte Lipasen und Lipoprotein-Lipasen, d. h. Verbindungen von echten Lipasen und Proteasen, insbesondere Collagenasen, speziell die Elastase des Pankreas.

Es ist möglich, daß die Abwesenheit einer oder mehrerer der vorstehend genannten Substanzen in den bekannten Medikamenten eine Erklärung für ihre Unwirksamkeit bei der Behandlung von Kranken darstellt, die unter schwerer chronischer Pankreatitis leiden, denn das Einnehmen von rohem Pankreas beseitigt die Wirkungen der totalen Pankreatectomie bei Tieren und vermindert oder beseitigt die Folgen der chronischen Pankreatitis (Ausscheidung von Nahrungsfetten und -proteiden im Stuhl). Nun ist es einerseits für die Kranken schwierig, sich jeden Tag die erforderliche Ration an frischem Schweinepankreas (ein Pankreas von 60 bis 80 g) zu beschaffen, andererseits wird infolge des abstoßenden Aussehens, des unangenehmen Geschmacks, der sich kaum überdecken läßt, und der Verderblichkeit diese Behandlung nur angewendet, wenn ein Überleben nur um diesen Preis möglich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen diese Unannehmlichkeiten beseitigt werden und ein Medikament in Form eines Pulvers hergestellt werden, das unverändert, d. h. insbesondere ohne enterischen Überzug eingenommen werden kann, und das aus noch ungeklärten Gründen ein unerwartetes Heilvermögen aufweist.

In der CH-PS 2 83 588 wird zwar ein Verfahren zur Konservierung von Organzellenpräparaten durch Entwässern mittels Lyophilisieren beschrieben, gemäß welchem die Organe nach Entfernung aus dem Tierkörper von unerwünschten Bestandteilen, wie Fettschicht, gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert werden, doch weisen auch die gemäß diesem Verfahren hergestellten Präparate, wie durch

Vergleich gezeigt wird, nicht die Wirksamkeit der Produkte auf, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes aus Schweinepankreas, wobei der vom Tierkörper abgetrennte Pankreas von unerwünschten Bestandteilen gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man den vollständigen, frischen und nicht entfetteten, spätestens eine Viertelstunde nach dem Schlachten vom Tierkörper abgetrennten Schweinepankreas zur Stabilisierung auf eine Temperatur von nicht über 8° C abkühlt, durch Vermählen zerkleinert, wobei die Temperatur nicht über 15° C steigen darf, dem gemahlenen Pankreas etwa 30 bis 100 Gew.-% Eiswasser zusetzt, das gegebenenfalls aromatisiert wurde, die erhaltene Mischung mit einem Turbomahlwerk zerkleinert und das emulgierte Produkt spätestens zwei Stunden nach dem Schlachten zur Lyophilisieren einfriert.

Unter vollständigem Pankreas ist die ganze Drüse zu verstehen, von der lediglich das Fett und die Gewebe abgetrennt werden, die ihr außen anhängen und keinen Teil der Drüse bilden. Die Eigenschaft »frisch« bedeutet, daß die Drüse so bald als möglich nach der Entnahme aus dem gerade geschlachteten Schweinekörper lyophilisiert werden soll. In der Praxis wird ein Pankreas als frisch angesehen, der spätestens eine Viertelstunde nach dem Schlachten von dem Tierkörper abgetrennt, dann auf eine 8⁰C nicht übersteigende Temperatur zur Stabilisierung abgekühlt und spätestens zwei Stunden nach dem Schlachten für die Lyophilisierung eingefroren wurde.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise wie folgt verfahren:

Frischer Schweinepankreas, der sofort nach dem Schlachten entnommen wird, wird von anhängendem Fett und anhängenden Geweben gereinigt. Ohne zwischenzeitliches Einfrieren, jedoch nach Kühlen auf eine Temperatur nicht über +8⁰C wird der auf diese Weise zugerichtete Pankreas in einem Mahlwerk behandelt, wobei die Temperatur nicht über +15⁰C ansteigen darf, dann wird dem beim Mahlen erhaltenen Produkt Eiswasser, das möglicherweise aromatisiert ist, in einer Menge von 30 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise etwa 50 Gew.-%, bezogen auf das Produkt, zugesetzt. Es ist vorteilhaft, auch etwa 1 bis 10 Gew.-% Lac.tose zuzusetzen, wodurch die Sublimierung während der-Lyophilisierung sowie die endgültige Zerkleinerung erleichtert wird. Die Gegenwart von Lactose im Endprodukt ist auf die Wirksamkeit des Präparates ohne Einfluß; die Verwendung von 1 bis 10% Lactose ist zwar verfahrenstechnisch vorteilhaft, jedoch nicht zwingend notwendig.

Es ist auch möglich, anstelle von Laktose oder zusätzlich zu Lactose Ascorbinsäure in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das anfängliche Gewicht des Pankreas, zuzusetzen.

Die Mischung wird danach in ein feineres Mahlwerk gebracht, so daß eine außerordentlich feine und gleichmäßige flüssige Paste erhalten wird. Diese Paste wird im Hinblick auf die Lyophilisierung direkt in Form von Platten eingefroren. Dieses Einfrieren kann bei —40°C erfolgen, genauso wie die Sublimierung der vereisten Substanz, die unter Vakuum bis zur vollständigen Dehydratisierung des Produktes durchgeführt wird.

Die lyophilisierten Pankreaskuchen werden anschließend (ohne Entfettung) gemahlen, so daß ein vollständiges Pankreaspräparat erhalten wird, in dem alle Eigenschaften des frischen Pankreas erhalten sind. Das erhaltene Pulver kann gesiebt und in Fläschchen gefüllt werden, die unter Vakuum oder einem inerten Gas geschlossen werden und mit einem dehydratisierenden Stopfen versehen sind.

Zur Aromatisierung kann das eingesetzte Eiswasser mit frisch ausgepreßtem Orangensaft versetzt werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Frischer Pankreas, der aseptisch gewonnen und gekühlt worden ist, wird zunächst in einem Turbomahlwerk mit einer Lochplatte mit 2 mm großen Löchern gemahlen. Infolge eines sehr schnellen Durchgangs ist die Ausgangstemperatur des Mahlguts wenig höher als die Eingangstemperatur (beispielsweise 14° C anstelle von 8° C).

Das Mahlgut wird anschließend mit 25 Gew.-% Wasser (davon 10% in Form von Eis), 2,5% Lactose und 0,1% Ascorbinsäure versetzt. Um das Präparat zu aromatisieren, setzt man zu diesem Zeitpunkt 30 Gew.-% frisch ausgepreßten Orangensaft zu.

Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird wieder in das Turbomahlwerk /CS gebracht, das diesmal jedoch mit einer Lochplatte mit einem Lochdurchmesser von 0,8 mm versehen ist, und das die Zerkleinerung der Fasern beendet und die ganze Masse innig emulsioniert (das Eis verhindert hierbei jede Erwärmung).

Die Suspension wird nun in Schalen gebracht und in zwei Stunden in einem Gefriergefäß, das bei — 6O⁰C gehalten wird, auf — 40⁰C gefroren.

Die Schalen werden in eine Sublimierungsvorrichtung gestellt, in der die folgenden Bedingungen herrschen:

1. Teildruck in der Größenordnung von 0,2 mm Hg,

2. Temperatur des Produktes auf -30⁰C eingestellt. Die Sublimationsdämpfe kondensieren an einer

Kühlschlange bei -6O⁰C. Eine elektrische Heizung gleicht die Wärmeverluste durch Sublimierung aus. Es stellt sich ein Gleichgewicht ein, das die Einhaltung einer konstanten Temperatur ermöglicht. Nachdem die eigentliche Sublimierung (etwa 20 Stunden) beendet ist, beträgt die restliche Feuchtigkeit noch 4 bis 5%.

Das Pankreasmaterial wird nun auf +35⁰C erwärmt, und der Teildruck wird auf einen Maximalwert von 0,01 mm Hg herabgesetzt. Nach Ablauf von 4 Stunden ist die restliche Feuchtigkeit auf etwa 0,5% gefallen.

Die Pankreasscheiben werden dann in schmale Streifen geschnitten und in ein Turbinenmahlwerk gebracht. Die zentrale Turbine wirft das Pankreasmaterial gegen einen Rost mit ovalen 0,2 mm χ 0,5 mm großen Löchern und zerkleinert es. Nach einem zweiten Durchgang wird ein feines Pulver erhalten.

Mit einer Pulverdosiervorrichtung werden Fläschchen mit 10 g gefüllt und anschließend in das Sublimierungsgefäß gestellt. Man erzeugt ein Hochvakuum (unter 0,01 mm Hg) und erhitzt 4 Stunden bei 35⁰C.

Beim Aufheben des Vakuums läßt man trockenes Argon in das Gefäß ein, wodurch nicht nur jede Wiederaufnahme von Feuchtigkeit (Luftfeuchtigkeit) vermieden, sonderen auch die Desorption erleichtert wird.

Die Fläschchen werden sofort nach der Entnahme mit einer Polyäthylenkappe verschlossen, die mit einer Tablette eines dehydratisierenden Materials versehen sind, und mit einer Aluminiumkapsel umgeben.

Das erhaltene Produkt hat die Form eines Pulvers, das in einer Menge von etwa 14 g bei Behandlung eines Pankreas von 60 bis 80 g gewonnen wird. Das Verhältnis von Aminstickstoff zu Gesamtstickstoff zeigt, daß die Proteide keine Autolyse erlitten haben. Im allgemeinen beträgt der Gesamtstickstoffgehalt 8,6% ±0,8% und der Gehalt an Lipiden 30,5% ±3%. Ferner wurden bei sechs Präparaten Histamingehalte von 3, 5, 3, 7, 3 bzw. Ay pro g lyophilisiertes Produkt festgestellt, was weit unter den Werten liegt, die bei handelsüblichen Pankreatinpräparaten erhalten werden.

Das lyophilisierte Pulver des vollständigen Pankreas findet seine Hauptanwendung bei chronischen Pancreatitiszuständen, die eine totale Substitutionstherapie rechtfertigen, denn:

— es kann die Drüse bei den schwersten Erkrankungen ergänzen, und das Leben der am stärksten benachteiligten Kranken verändern;

— es kann in den Fällen eingesetzt werden, in denen die anderen im Handel erhätlichen Pankreatinpräparate sich als unzureichend erweisen;

— seine Wirkung ist mit der des frischen Pankreas absolut identisch, an dessen Stelle es infolge der leichten Absorption, guten Konservierung und genauen Dosierung mit Vorteil verwendet wird.

Es findet weiterhin eine wichtige Anwendung bei Pankreasfisteln, weil

— es imstande ist, die Drüse zur Ruhe zu bringen, wodurch eine rasche Schließung der Fistel möglich wird,

— und es andererseits vorübergehend die Drüse ersetzt, wodurch die Protein-Lipid-Verdauung sehr verbessert wird.

Schließlich kann das lyophilisierte Pulver des vollständigen Pankreas

— nach Entfernung großer Teile des Pankreas, indem es den exokrinen Mangel mildert, den solche Eingriffe als unmittelbare Folge haben können,

— bei der Behandlung der Aerophagie und der Substitutionsbehandlung des senilen Pankreas,

— wie auch bei starker Unterernäherung infolge funktioneller externer Unzulänglichkeit des Pankreas, die allein durch diätetische Behandlung manchmal nicht kompensiert werden kann,

Anwendung finden.

Um die volle Wirksamkeit des auf die vorstehende Weise erhaltenen Pulvers zu bewahren, soll es vorzugsweise unverändert, so wie es ist, auf'oralem Wege eingenommen werden; man kann es jedoch auch in Form von Körnchen, Tabletten oder Dragees ohne enterischen Überzug verabreichen.

Im allgemeinen werden Dosierungen in der Größenordnung von 10 g pro Tag bei einer totalen Substitutionstherapie und Dosierungen in der Größenordnung von 0,5 bis 1 g pro Tag bei leichteren Beschwerden des Verdauungsweges angewendet.

Es wurden bereits eine große Anzahl unerwarteter Ergebnisse registriert:

Kranke, die unter schwerer chronischer Pankreatitis litten und bei denen der Pankreas keine Funktion mehr ausübte, mußten täglich eine Insulininjektion erhalten und jeden Tag einen frischen und rohen Schweinepankreas zu sich nehmen. Der letztere wurde durch das vorstehend definierte lyophilisierte Produkt in einer Dosis von 10 bis 14 g pro Tag ersetzt. Dieses Pulver rief bei den Kranken kein Gefühl des Widerwillens wie der rohe Pankreas hervor; sie aßen anscheinend mit größerem Appetit und ihr Allgemeinzustand hatte sich nach einmonatiger Behandlung deutlich verbessert.

Einer der Kranken unterwarf sich einem Versuch, der darin bestand, daß anstelle des vollständigen Pulvers das gleiche, jedoch mit Petroläther entfettete Pulver verwendet wurde; zwei Tage später wurden unverdaute Fettstücken in seinem Stuhl gefunden. Bei Wiederaufnahme der Behandlung mit dem nicht entfetteten Pulver hatten die Kranken wieder normalen Stuhl (Konsistenz, Geruch, Abwesenheit von unverdautem Fett).

Ferner zeigte das lyophilisierte Pulver des vollständigen Pankreas in einem sehr schweren Fall von chronischer Pankreatitis durch Verkalkung infolge Alkoholismus, bei dem die im Handel erhältlichen Pankreasextrakte (Pankreatin) sich als unzulänglich erwiesen, ganz überraschende Ergebnisse.

Bemerkenswerte Ergebnisse wurden bei der Behandlung von blähender Dyspepsie, Aerocolie, Aerogastrie, Colophanie mit Fermentierung, durch das Pulver erzielt, das ohne Veränderung, so wie es ist, in einer Dosis von 3 bis 5 g eingenommen wurde. Selbst ohne enterischen Überzug sind die in dem Pulver enthaltenen Enzyme also gegen die Zerstörung durch die Verdauungssäfte geschützt.

Untersuchungen der Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Produkte im Vergleich zu gemäß bekannten bzw. gemäß bekannten Verfahren hergestellten Produkten.

1) Im Rahmen der pharmakologischen Experimente mit dem erfindungsgemäßen Präparat und Vergleichspräparaten wurden bei Ratten Leerdarmfilsteln angelegt. Diesen Ratten wurde mit einer fetthaltigen Nahrung (Olivenöl) der vollständige lyophilisierte Pankreas verabreicht. Mit Hilfe der aus der Leerdarmfilstel gewonnenen Flüssigkeit wurde die lipolytische Aktivität des Präparates bestimmt und mit der verglichen, die man unter gleichen Versuchsbedingungen mit handelsüblichem Pankreatin erhält. In der folgenden Tabelle wurden die Ergebnisse zusammengestellt. Wie daraus ersichtlich, wurde mit dem vollständigen lyophilisierten Pankreas eine viel höhere Aktivität erzielt, da der lyophilisierte Pankreas beim Passieren des Magens im Gegensatz zum Pankreatin von der Magensäure nicht denaturiert wird.

Versuchstiere	Pro 3 ml Flüssigkeit	Versuchstiere	Pro 3 ml Flüssigkeit
	der Leerdarmfistel		der Leerdarmfistel
	freigesetzte Fettsäure		freigesetzte Fettsäure
	Pulver Gesamtpankreas		Pankreatin entfettet
Ratte 1	15,2 mg	Ratte Ti	8
Ratte 2	13	Ratte T2	10
Ratte 3	18	Ratte T3	11
Ratte 4	12,5	Ratte T4	9
Ratte 5	14,8	Ratte T5	8
Ratte 6	13,3	Ratte Te	7

7 Fortsetzung	1467	878	8
Versuchstiere	Pro 3 ml Flüssigkeit der Leerdarmfistel freigesetzte Fettsäure Pulver Gesamtpankreas	Versuchstiere	Pro 3 ml Flüssigkeit der Leerdarmfistel freigesetzte Fettsäure Pankreatin entfettet
Ratte 7 Ratte 8 Ratte 9	15,2 12,4 17 Mittelwert 14,6	Ratte T7 Ratte Ts Ratte T9	9 12 10,3 Mittelwert 9,36

Die überlegenen Ergebnisse erreicht man mit einer Menge von 10 bis 15 g Präparat pro Tag. Durch die Lyophilisierung wird außerdem eine ausgezeichnete Stabilität des Präparates erzielt

Die klinischen Versuche bestätigen den Erfolg der Tierversuche. Die obige Menge von 10 bis 15 g hat die gleiche Wirkung wie etwa 40 bis 60 g roher Pankreas bei der Behandlung chronischer Pankreatitis, Pankreasfisteln, Folgeerscheinungen einer Pankreasextirpation oder Magenresektion. Auf die Nachteile der Verwendung roher Drüsen wurde in der Beschreibung bereits hingewiesen.

Das Verhalten verschiedener Patienten wurde an sogenannten Fäkalogrammen untersucht, die den Gehalt der Fäces, insbesondere an Stickstoff und Lipioden während 48 Stunden aufzeichnen und damit Aufschluß geben über den Grad der Pankreasinsuffizienz. Die folgende Tabelle zeigt die Entwicklung von Steatorrhöe und Kreatorrhöe unter dem Einfluß des lyophilisiertenGesamtpankreaspulvers.

Diagnose	Steatorrhöe	nach der	Kreatorrhöe	nach der
	(g/24 Stdn.)	Behandlung	(g/24 Stdn.)	Behandlung
	vor der	vor der
	Behandlung	Behandlung

Chronische Pankreatitis durch Verkalkung
Chronische Pankreatitis durch Verkalkung
Chronische Pankreatitis
Duodeno-Pankreatektomie
Magenresektion und Fistel D. P.
Magenresektion und Duodeno-Pankreatektomie
Pankreatitis bei cystischer Fibröse

77	20,5	9,9	5,97
9,7	2,5	2,3	1,04
17,5	3,3	6,5	1,85
20,6	3,3	4,6	0,63
51,7	16,2	13,6	2,9
58,8	31,3	5,4	3,2
14	11,6	3,2	1,9

Man hat in einigen Fällen, sich stützend auf biologische Gegebenheiten, die Wirkung der entfetteten Pankreatine mit der des rohen Pankreas und der des lyophilisierten Gesamt-Pankr^aspulvers vergleichen können.

Bei einem Patienten mit chronischer Pankreatitis durch Verkalkung auf Grund von Alkoholismus war bereits eine Pankreatomie durchgeführt worden. Er litt beträchtlich an Diarrhöe verbunden mit Steatorrhöe und Kreatorrhöe. Er erhielt nach und nach alle handelsüblichen Pankreaspräparate. Die Ergebnisse des Fäkalogramms sind folgende:

Stuhlgewicht Steatorrhöe Kreatorrhöe

Vor den Behandlungen

a) Pankreatin 14 Tabletten/Tag

Roher Pankreas 60 g/Tag

Erfindungsgemäß hergestelltes Medikament, 15 g/Tag

650 g	77 g	9,9 g
620 g	56,5 g	11,7 g
350 g	24 g	4,32 g
320 g	20,65 g	5,97 g

Die Beispiele zeigen die Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Medikamentes aus lyophilisiertem Pankreas auf die Diarrhöen auf Grund von Pankreasinduffizienz schwerster Art Sie zeigen gleichzeitig, daß das erfindungsgemäß hergestellte Medikament eine dem rohen Pankreas vergleichbare Aktivität besitzt, auch im Hinblick auf die pharmakodynamische Wirkung, und handelsüblichen Präparaten überlegen ist.

2)i) Um die vorteilhafte Wirkung der Emuigierung des Pankreasgewebes vor der Lyophilisierung (d.h. des erfindungsgemäßen Verfahrens) auf die Lipaseaktivität des erhaltenen Produkts im Vergleich zu derjenigen der Extrakte gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588, die ohne vorheriges_ Emulgieren aus Drüsenstücken hergestellt wurden, zu demonstrieren, wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt:

Sechs Schweine-Bauchspeicheldrüsen, die erst vor etwa 20 Minuten geschlachteten Schweinen entnommen wurden, wurden mit einem Messer in kleine Stücke von 0,5 bis 1 cm (Breite) zerschnitten. Die Stücke wurden vermischt bevor sie in zwei Proben aufgeteilt wurden: die Probe »T« (Vergleichsprobe) und die Probe »E« (Testprobe). Die Stücke der Probe »T« wurden auf eine Gefrierplatte gebracht, wo sie anschließend lyophilisiert wurden (gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588), während die Stücke der Probe »E« in einem »ultra-turax«-Mahlwerk emulgiert wurden. Erst nach dieser Emuigierung wurde die so erhaltene sehr feine

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Masse auf eine Gefrierplatte gebracht, um sie anschließend zu lyophilisieren (Verfahren gemäß der vorliegenden Patentanmeldung).

Nach der Lyophilisierung wurden die Proben »T« und »E« sowie eine Probe lyophilisiertem Pankreas, der der laufenden Produktion entnommen wurde (Probe P.L.E.), bei 5° C mit einer wäßrigen Lösung von 0,15molarem Natriumchlorid extrahiert.

Nach der Sedimentation (immer noch bei 5° C) wurde eine Konzentrierung der Lipasenaktivität bei jedem der drei erhaltenen Extrakte gemäß dem Verfahren von Melius (P) und Simmons (W. S.) Biochim. Biophys. Acta, 1965, 105, 600 vorgenommen; das Verfahren besteht darin, daß man eine Butanol-Extraktion der Natriumchloridphase der Extrakte durchführt und dann eine Ausfällung mit Ammoniumsulfat und anschließend mit kaltem Aceton bei einem pH-Wert von 5,6 vornimmt.

Erneute Lösung der Acetonniederschläge in 8%igem Butanol (V/V) bei einem pH-Wert von 8,9 und Wiederausfällung mit Ammoniumsulfat (Niederschläge PT₁PE₁PLE).

Bei je einer aliquoten Fraktion der so erhaltenen Niederschläge wurde einerseits der gesamte Stickstoffgehalt und andererseits die Lipasenaktivität nach üblichen Verfahren bestimmt (Desnueile P. et al, Potentiometrische Technik zum Messen der Aktivität der Pankreaslipase, Bull. Soc. Chim. Biol. 1955,37,285).

Die spezifische Lipasenaktivität jeder der drei Niederschläge ist der Mittelwert aus 5 aufeinanderfolgenden Bestimmungen, und sie ist ausgedrückt durch Lipaseeinheiten (U) pro mg Proteine (gesamter Stickstoff χ 6,25), die in jedem der drei Niederschläge enthalten waren.

Lipaseeinheit (U) wird definiert als die Enzymmenge, die unter den Versuchsbedingungen 1 Mikroäquivalent Säure pro Minute freisetzt.

Ergebnisse

(Mittelwerte aus
5 Bestimmungen)

Probe »T«
Probe »E«
Probe »P.L.E.«

352 U/mg
1047 U/mg
1122 U/mg

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, wurde die spezifische Lipasenaktivität durch die Emulgierung des Pankreasgewebes, die vor der Lyophilisierung durchgeführt wurde, sei es mit einer Laboraparatur, wie »ultra-turax« (Probe E) oder mit einer industriellen Lochplatten-Kolloidmühle, (Probe P. L. E.), im Verhältnis zu dem gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588 von N i e h a η s beschriebenen Verfahren (Probe »T«), das keine Emulgierung des Pankreasgewebes vor der Lyophilisierung vorsieht, etwa verdreifacht

Modifizierung der chemischen Natur der Lipase
im Laufe der Emulgierung des Pankreasgewebes

Ein anderer aliquoter Teil jeder der drei Niederschläge PT, PE und PLE wurde in einer Lösung aus Calciumchlorid (0,01 molares CaCl₂) und 0,5% Natriumtaurocholat suspendiert. Man konnte beobachten, daß sich einmal in den Fällen der Proben PE und PLE eine Lösung und ein Niederschlag bildete, während man bei der Probe PT eine homogene Pseudolösung erhielt. Zur Beurteilung der chemischen Natur der bei den Proben PE und PLE erhaltenen Niederschläge wurden die Niederschläge jeweils in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (85 :35 :5) V/V gelöst, um einer Dünnschicht-Chromatographie auf einer Silicagelplatte mit einem Glycerid (Triolein), einer Fettsäure (Oleinsäure) und einem Phospholipid (Lecithin) als Kontrollsubstanzen unterworfen zu werden.

Nach der Chromatographie, mit dem gleichen Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Wasser oder dem System Hexan/Diäthyläther/Essigsäure (80:20:1) V/V, ermöglichten die Rf-Werte der Wanderung einmal der Bestandteile der Calciumtaurochol-Niederschläge der Proben PE und PLE und zum anderen der Kontrollsubstanzen (Triglycerid, Fettsäure, Lecithin), jeweils in jedem der Niederschläge PE und PLE eine wesentliche Fraktion Phospholipide, begleitet von kleinen Glycerid- und Fettsäurefraktionen sowie von nicht identifizierten Lipidbestandteilen zu identifizieren.

ii) Bestimmung der Lipasen-Aktivität

Der Pankreas eines 100 kg wiegenden ausgewachsenen Schweines wurde noch im Schlachthaus aus dem Tierkörper entfernt und sofort in einen Gefrierbehälter gebracht Eine Stunde später (die Transportzeit zum Labor) wurde er in zwei gleiche Teile A und B zerteilt.

Behandlung des Pankreasteils A

Mit einer Rasierklinge wurde dieser Teil A in »kleine Teile« von höchstens der Größe eines Weizenkorns zerteilt

1 g dieser Teile wurde mit 5 g Natriumchlorid in einen 200-ml-Kolben gebracht, der dann mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde. Nach Rühren mittels eines Magnetrührers wurden der erhaltenen Aufschlämmung aliquote 0,5 ml Teile entnommen, um die Lipasen-Aktivität gemäß der nachfolgend beschriebenen Methode zu bestimmen.

Behandlung des Pankreasteils B

Dieser Teil B wurde in die Schale einer Laborkolloidmühle gebracht und 2 Minuten bei 15 000 U/min emulgiert 1 g dieser Emulsion wurde mit 5 g Natriumchlorid in einen 200-ml-Kolben gebracht der dann mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde.

Nach Rühren mittels eines Magnetrühres wurde die Lipasen-Aktivität dieser Aufschlämmung, wie beschrieben, bestimmt.

Diese Lipase-Bestimmung wird durch Potentiometermessung bei konstanter Temperatur und konstanten pH-Werten durchgeführt. (Desnuelle, P. Co η s t a η t i η, H. J.; B a 1 d y, J.; Bull. Soc. Chim. Biol. 1955, 37,285).

a) Prinzip

Die von Lopase während der Hydrolyse einer Triglycerid-Emulsion freigesetzte Säure wurden mit einer Sodalösung titrimetrisch bestimmt.

Die Mikroäquivalente der Säure wurden in dem Maße neutralisiert, wie sie freigesetzt wurden, und die zur Erhaltung des konstanten pH-Wertes verwendete Sodamenge wurde automatisch registriert.

Eine internationale Lipase-Einheit ist die Enzymmenge, die pro Minute bei pH 9 und 37° C unter den Versuchsbedingungen ein Mikroäquivalent Säure freisetzt.

b) Versuchsgerät

Kombititrator (vom Typ 3 D Metrohm) mit:
einem pH-Statometer

einer automatischen 10-ml-Bürette mit direkter Aufzeichnung auf Papierstreifen
einem 50-ml-Thermostatgefäß
einer Dauerschüttelvorrichtung.
Dieses Gerät registrierte die Ergebnisse, die mit einer Mikroelektrode, die in das Reaktionsmedium eingetaucht ist, ermittelt wurden.

c) Reaktionsteilnehmer
Olivenölemulsion

15 g Gummiarabicum wurden in 200 ml siedendem destilliertem Wasser gelöst und durch Glaswolle filtriert.

In die Schale eines Mixers wurden

Gummi-arabicum-Lösung
Neutrales Olivenöl
Reines Natriumbenzoat

100 ml
100 ml
0,2 g

Destilliertes Wasser
Olivenölemulsion
Pufferlösung
Natrium-desoxycholatlösung

8,5 ml
10 ml
9 ml
2 ml

gebracht.

Das Gemisch wurde auf +4⁰C abgekühlt und dann bei Höchstgeschwindigkeit des Mixers 2 Minuten gerührt und anschließend auf die Temperatur von +4⁰C gebracht.

Es wurde erneut 2 Minuten gerührt und dann bei +4⁰C konserviert.

5%ige Natrium-desoxycholatlösung

2,5 g reines Natirum-desoxycholat (durch Chromatographie erhalten) wurden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und dann bei +4⁰C konserviert.

pH 9-Pufferlösung

665 mg Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan wurden in ml destilliertem Wasser gelöst und mit N/10-Salzsäure auf pH 9 eingestellt

Mit destilliertem Wasser wurde auf 1000 ml aufgefüllt und bei +4⁰C konserviert.

Decarbonisierte und genau titrierte
N/50-Soda-Lösung

Alle Reaktionsteilnehmer müssen unmittelbar hergestellt werden.

d) Enzymlösung

Wie vorstehend beschrieben (Teil A oder B).

e) Arbeitsweise

Der pH-Statometer wurde auf pH 9 eingestellt. In den Thermostatbehälter wurden

Der Verbrauch der N/50-Soda-Lösung, der notwendig ist, um den pH-Wert 5 Minuten auf 9 zu halten, wurde registriert.

f) Berechnung

Von der erhaltenen Kurve ausgehend wurde der Verbrauch der N/50-Soda-Lösung pro Minute mit η bezeichnet.

Da 1 ml N/50-Soda pro Minute 20 Mikroäquivalente Säure neutralisieren kann, wurden die Ergebnisse für 1 g Pankreas durch folgende Rechnung ermittelt:

η · 20 · 1000

2,5

Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse der enzymatischen Aktivitäten sind in internationalen Einheiten für Lipase pro Gramm Pankreas ausgedrückt. Gemäß der Enzymkommission der Internationalen Vereinigung für Biochemie (Commission des Enzyms de l'Union Internationale de Biochimie) entspricht eine internationale Einheit der Enzymmenge, die beim Angriff auf ein Mikromol des Substrates pro Minute 1 Mikroäquivalent Säure freisetzt.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

gebracht.

Das Gemisch wurde mit einem Magnetrührer gerührt bis es eine Temperatur von 37° C erreichte.

Durch automatischen Zusatz von N/50-Soda wurde der pH-Wert bei 9 gehalten.

Wenn pH-Wert und Temperatur stabilisiert waren, wurden 0,5 ml der Enzymlösung (entsprechend 2,5 mg Pankreas) in das Reaktionsmedium gebracht.

Pankreas A

(in kleine Teile zerlegt)

Pankreas B (emulgiert)

5880 i.EVg
29200 i.E7g

Dieser Versuch zeigte also ausdrücklich, daß das gleiche Pankreasgewebe abhängig von der Art seiner Zerkleinerung

a) Zerschneiden in kleine Teile nach der in der CH-Patentschrift 2 83 588 beschriebenen Methode oder

b) Emulgieren in der Kolloidmühle wie im erfindungsgemäßen Verfahren

sehr verschiedene Lipase-Aktivität besitzen kann.

Bestimmung der Stabilität der Lipoprotein-Enzyme

Die Stabilität der Lipoprotein-Enzyme, die aus den Protein-Enzymen erhalten werden, wurde folgendermaßen bestimmt:

Die Pankreas-Teilchen von höchstens der Größe eines Weizenkorns und der emulgierte Pankreas wurden unter gleichen Bedingungen entfettet, und zwar mit Äthyläther. In beiden Fällen wurden pro g Pankreas 10 ml Äthyläther, bei einer Rührzeit von 10 Minuten, verwendet.

Es ist bekannt, daß Protein-Enzyme von Äther in großem Maße denaturiert werden und daß vor allem Pankreas-Lipase durch ihn ihre Aktivität verliert.
Die Ergebnisse, die mit den beiden Präparaten A und B erhalten wurden, ausgedrückt in internationalen Einheiten für Lipase pro 1 g Pankreas, waren wie folgt:

Pankreas A

(in »kleine Teile«) 320 E/g

Pankreas B (emulgiert) 720 E/g

Man kann also feststellen, daß eine vorhergehende Emulgierung des Pankreasgewebes die Lipase teilweise vor der denaturierenden Wirkung des Äthyläthers schützt, und daß die Menge der verbliebenen aktiven Enzyme in dem emulgierten Pankreas mehr als doppelt so hoch ist als die in dem in kleine Teile zerteilten Pankreas.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes aus Schweinepankreas, wobei der vom Tierkörper abgetrennte Pankreas von unerwünschten Bestandteilen gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man den vollständigen, frischen und nicht entfetteten, spätestens eine Viertelstunde nach dem Schlachten vom Tierkörper abgetrennten Schweinepankreas zur Stabilisierung auf eine Temperatur von nicht über 8° C abkühlt, durch Vermählen zerkleinert, wobei die Temperatur nicht über 15° C steigen darf, dem gemahlenen Pankreas etwa 30 bis 100 Gew.-% Eiswasser zusetzt, das gegebenenfalls aromatisiert wurde, die erhaltene Mischung mit einem Turbomahlwerk zerkleinert und das emulgierte Produkt spätestens zwei Stunden nach dem Schlachten zum Lyophilisieren einfriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen dem ersten und dem zweiten Mahlen außerdem Lactose in einer Menge von etwa 1 bis 10 Gew.-% und/oder Ascorbinsäure in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das anfängliche Gewicht des Pankreas, zusetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eiswasser mit frisch ausgepreßtem Orangensaft aromatisiert.