DE1902590A1 - Serum zur Entwicklung von Immunitaet gegen Antigene bei Menschen und Tieren sowie Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Serum zur Entwicklung von Immunitaet gegen Antigene bei Menschen und Tieren sowie Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
"Serum zur Entwicklung von Immunität gegen Antigene bei
Menschen und Tieren sowie Verfahren zu seiner Herstellung."
Die Erfindung bezieht sich auf eine besondere immune Ribonucleinsäure
als Serum zur Entwicklung von Immunität gegen Antigene bei Menschen und Tieren sowie auf ein Verfahren zur
Herstellung dieses Serums.
Durch systematisches Studium über die Entwicklung von Immunität wurde folgendes gefunden: Wenn immune Ribonucleinsäure
gewonnen von durch Injektion von Antigen immunisierten Tieren, einem Menschen oder heterologen Tieren injiziert
wird, kann sie Immunität entwickeln und Antikörper gegen das für die Immunisierung benutzte Antigen produzieren.
Beispielsweise kann Immunität gegen das Antigen entwickelt
werden, wenn Menschen oder Tieren Ribonucleinsäure injiziert wird, entnommen aus Makrophagen von Tieren, z.B. von
Kaninchen, Pferden, Rindern, Schweinen, Schafen und derartigen
Tieren, denen Antigen,bakterielle Vaccine, Virus-Vnccine,
Toxoide etc. injiziert wurde.
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Weiterhin wurde folgendes gefunden: Wenn Zellen mit immuner
Ribonucleinsäure behandelt werden, produzieren sie Antikörper
gegen das Antigen, das für die Bereitung der besaiten Ribonucleinsäure angewandt wurde, Danach aber werden
kaum Antikörper gegen das für die Bereitung dieser Ribonucleinsäure
angewandte Antigen entwickelt, jjuch nicht wenn sie mit einer anderen immunen Ribonucleinsäure behandelt
werden. Diese Tatsache weist auf die Möglichkeit hin, vor einem chirurgischen Eingriff zu einer Organ-Transplantation
die Organ-Zurückweisung in der Transplantation zu verhindern durch die Einführung einer immunen
Ribonucleinsäure, die unterschiedlich von derjenigen ist, die für die Transplantations-Immunität verantwortlich ist.
Wie aus den obigen Tatsachen erhellt, kann die spezifische immune Ribonucleinsäure nach der firfindung spezifische Immunität,
z.B. bakterielle Immunität, Virus-Immunität, ohne irgendwelche Nebenerscheinungen wie Allergie^, entwickeln.
Sie wird daher zur Verhinderung von Organzurückweisung bei der Transplantation als brauchbar erachtet.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der obigen Entdeckung.
Sie besteht in einem Verfahren zur Erzeugung spezifischer
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immuner Ribonucleinsäure, gekennzeichnet durch folgende
Schritte:
Injektion τοη Antigen in Tiere, Töten des Tieres nach voller
Entwicklung der Immunität, Extraktion von Ribonucleinsäure aus Makrophagen, wie sie in der Milz in Lymphknoten
(oder)
und in Bauchfell aus Scheidungen des Tiares vorkommen, Reinigung
der extrahierten Ribonucleinsäure.
Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren
zur Entwicklung von Immunität gegen Antigen in Menschen oder Tieren, durch Injizieren von immuner Ribonucle
insäure in besagte Empfänger. Diese wurde gewonnen aus Makrophagen der Milz, Lymphknoten und (oder) Bauchfellausscheidungen
eines zu besagten Empfänger-Tieres, heterologen und 4ö4 durch Injektion des Antigens immunisierten Tieres.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können für die Erzeugung
der erf indungs gemäßen immunen Ribonucle insäure bekannte»· Antigene benutzt werden, z.B. pathogene Bakterien von
Typhus und Keuchhusten, pathogene Viren wie Influenza, Virus-Hirnhautentzündung, Pocken, Tollwut, pathogene Mikroorganismen
wie Schwamm, Protozoen auch im abgeschwächten oder abgetöteten Zustand, Toxine wie Tetanus, Diphterie,
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Schlangengift, heterologe Proteine, sowie menschliche oder
tierische Organe oder deren Extrakte. Als mit Antigen zu injizierende Tiere kann jede Art von Tier benutzt werden.
Pferde, Rinder, Schweine und Schafe sind brauchbare Tiere, Die Seren von Anti-Diphterie-Toxin, Anti-Tetanus-Texin'· ..: ;
und Gegengift (Antivenin) werden gewöhnlich':^;o®id,en obengenannten Tieren gewonnen, denen die obigen;,ffi®xine: inji-
ziert wurden. Die Milz, Bauchfellabsonderungen, Lymphknoten der so immunisierten Tiere ergeben -geeignetes Material für die Herstellung von Ribonucleinsäure, die die
Immunität gegen diese Antigene entwickelt. Die Injektion von Antigen in Tiere wird ein-oder mehrere Male durchgeführt
bis ausreichende Immunität entwickelt worden ist. Nachdem die genügende Entwicklung von Immunität durch Injektion
von Antigen in Tiere sichergestellt ist, werden Milz, Bauchfellabsonderungen und Lymphknoten der besagten
Tiere, in denen eine genügende Menge von Makrophagen vorhanden ist, gesammelt und daraus Ribonucleinsäure
extrahiert.
Ribonucleinsäure kann extrahiert werden durch Verfahren,
wie sie für die Extraktion von Ribonucleinsäure bekannt
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sind nach dem Verfahren von Kidsone oder Kirby (J. Mol.
Biol» 2, 312 - 315, 1966). Danach werden gesammelte Organe
oder Zellen in einer Flüssigkeit, die ein Schutzmittel (inhibitor) eines Ribonucleinsäure zersetzenden Enzyms
enthält, zermahlen und wiederholt mit Phenol extrahiert. Die so extrahierte Ribonucleinsäure kann dann gereinigt
werden, indem man proteolytische Enzyme einwirken läßt,
wie Trypsin, Pronase (Prolinase) und ähnliche,»' zur Beseitigung
von Protein mit anschließender Kolonnen.Chromatographie
oder Super-Zentrifugierung·
IAe so gereinigte immune Ribonucleinsäure kann i-ienschen
oder Tieren injiziert werden, z.B. in der folgenden Art:
Die gereinigte Ribonucleinsäure wird in physiologischer rlstrium-ühlorid-LÖsung aufgelöst. Im allgemeinen kann diese
Losung subkutan oder intrakutan einmal oder mehrere Male in Abständen von fünf Tagen injiziert werden in einer Menge
von etwa 1 - Io mg für Erwachsene, bei Kindern etwa die iiälfte der oben angegebenen Menge Ribonucleinsture. Diese
Anwendung kann in der gleichen Weise erfolgen, unabhän- if'^T von eier Art der Krankheiten, die Immunität entwickeln.
—6—
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Es wurde erstmalig gefunden, daß Ribonucleinsäure, aus den Makrophagen immunisierter Tiere gewonnen, Immunität
hervorrufen kann, sogar wenn sie Menschen oder heterologen Tieren injiziert wird.
Die vorliegende Erfindung wird in folgenden Beispielen näher erläutert.
Ratten wurden mit lebenden Vaccinen von- Typhus-SaImonellen
gespritzt. Nachdem die Ratten genügend immunisiert waren, wurde Ribonucleinsäure mittels Phenol aus der Milz
der Ratten durch folgendes Verfahren gewonnen.
Zwei Gramm isolierter Milz aus immunisierten Mäusen wurden mit Hilfe eines Rasiermessers in kleine Stücke geschnitten.
Nach Hinzufügung von Io ml gekühltem o,5$-.
igen Natrium-Naphtalin - 1,5-Disulfonat (NDS) wurdez4 der
Stoff (Gewebe) homogenisiert durch einen Glas-Homogenisierer auf einem Eisbad. Das Homogenat wurde mit der gleichen
Menge von 9o#-igem (v/v) Phenol vermischt, das o#l$
(w/v) 8-Oxyehinolin (Ph-HQ) im Kalten enthielt. Zu der
Masserphase (gewöhnlich ungefähr 9 ml), abgetrennt durch Zentrifugieren, wurde einee gleiche Menge von lo^-iger
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(w/v) Natrium p-Aminosalicylat, enthaltend 2$ (w/v) riatrium-Dodecylsulfat
(PAS-SDS) hinzugefügt und die Mischung wieder extrahiert durch Zufügung γοη Ph-HQ mit dem halben
Volumen der Wasserphase. Ph-li^-Wäsche wurde mehr als vier
mal (gewöhnlich 5 mal) durchgefülirt bis keine sichtbaren Bestandteile zwischen der Wasser- und Phenol-Phase vorhanden
waren. In der Endstufe wurden ungefähr 7,5 ml der Wasserphase erzielt. Zwei Volumen von kaltem Äthanol wurden
der letzten Wasserphase zugefügt. Der gebildete Niederschlag wurde in einer kleinen Menge von o,l M rl a Cl,
enthaltend 2 M g/ml Kaiium-Polyvinylsulfat (PVS) gelöst,
erneut niedergeschlagen und wiederholt mit Äthanol ausgewaschen. Alle Verfahren wurden bei 4 G durchgeführt.
Das Äthanol wurde durch Zentrifugieren und Verdampfen ausgeräumt, der trockene !Niederschlag wurde in 3 ml von kaltem
o,öl λ Tris-rlCl Puffer, pn 7,5, enthaltend Io Ja /IgCl,-,
gelöst. Drei Zehntel ml von 5o/«* g/ml Desoxyd-Mbonuclease
wurden dieser Losung zugefügt und dann während 3o Minuten
bei 4° C stehen gelassen, «sch Zugabe von 1,5 ml von
SDS-PAS und 1,5 ml von l#-igem ^DS, wurde die Hibonucleinsäure
erneut mit Ph-IIQ, durch das oben beschriebene Verfahren
—α—
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extrahiert und durch Äthanol niedergeschlagen. Mach fünf
(absolute)
Auswaschungen mit Äthanol wurde die reine Äthanol-Suspension des letzten Niederschlages vor Gebrauch bei -2o° C
aufbewahrt. Pie immune Ribonucleinsäure wurde Hatten,
Meerschweinchen und Mäusen durch Intraperitoneal-Injektion
(Bauchfell-Injektion) verabreicht. Die Immunität entwickelte sich, abgesehen von Ratten, in Meerschweinchen
und Mäusen als heterologe Tiere.
Empfanger von immuner Menge der injizierten Entwicklung
Ribonucleinsäure Ribonucleinsäure von Immuni-
( /Ug/ je Kopf) tat
| Mäuse | loo |
| Meerschweinehen | looo |
| Ratten | looo |
Der obige Extrakt wurde weiter gereinigt durch ein unten beschriebenes Verfahren. Der gereinigte Extrakt wurde in der
gleichen Weise wie oben besehrieben geprüft. Die ähnliche Entwicklung von Immunität wurde bewiesen.
Sukrose-Dichte-&radient-Zentrifugierung. Zwei mg von immuner
Ribonucleinsäure in 1 ml von o.ol A Azetat-Puffer, ρ.ί
5#o, enthaltend o.l M iiaGl, Io 'ή HgCl^ und ? α g/ml r'/S
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OADORiGiNAL
wurden oben auf 3o ml eines 5- bis 2o$-igen linearen
Sukrose-Gradienten, der in demselben Puffer bereitet wurde, geschichtet. Die Röhren wurden in einem Hitachi
RP3-25 Schwing-Becher-Eotor (Type 55-PA, Hitachi Ltd.,
Tokio, Japan) während 16 Stunden bei 24.ooo UpM zentrifugiert.
Abseheidungen (1 ml jeweils) wurden nach automatischer
Messung der Absorption (absorbaney) bei 254 m/H
durch einen ISSO- Dichte-Gradient-Abscheider (Modell 16o,
Instrumentation Specialties Company Inc., Nebraska, USA) gesammelt. Die so gesammelten Abscheidungen wurden kondensiert
mittels negativer Druck-Dialyse durch Zellophan (j/3o Zoll, Zellulose-Röhren, Yisking G. Chicago, USA)
gegen o.l5 M NaCl Lösung, enthaltend 2 At g/ml PVS und niedergeschlagen
durch Äthanol,
Um Antiserum zu erhalten, wurde Diphterie-Toxoid in Pferde
injiziert. Die immune Ribonucleinsäure wurde aus der Pferdemilz
extrahiert, die den Titer von Antikörpern in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhöht hat. Die immune
lübonucleinsäure wurde Meerschweinchen, Mäusen und Kaninchen
verabreicht, wobei die Bildung von Antikörpern beobachtet -vi- wurde. -lo- 909835/1426
BAD OBlGiNAL
| Empfänger von immuner Ribonucleinsäure |
Injektionsmenge von immuner Ribonuclein säure ( /< g/pro Kopf) |
Antikörper, die Zellen gegen Diphterie-To- xoide bilden |
Milz zel len |
Antikörper, die Zellen gegen Te- tanus-Toxoide bilden |
Milz zellen |
| 5o 5oo 5ooo |
Bauchfell aus sehe idungs- zellen |
Io75o 15oo 174oo |
Bauchfell- ausschei- dungs zel len |
O O O |
|
| Meerschweinchen Mäuse Ratten |
1224 4o4 92o |
Ü O O |
| O | co |
| O | O |
| co | |
| 00 | |
| P- | co |
| 2* | in |
| co | -^ |
| T) | |
| m | «_& |
| ο | ^. |
| ro | |
| ο |
XD
CD
ro
OI CO O
-U- 17. Jan. 1969/R.-
Durch dieses Experiment wurde es bestätigt, daß der Anti-*
körper lediglich gegen Dipliterie-Toxoide wirksam ist und
daß die immune Ribonucleinsäure unabhängig von der Art der
Tiere Antikörper gegen das benutzte Antigen hervorbringen kann.
909835/1421 ORIGINAL INSPECTED
Claims (4)
1. Serum zur Entwicklung von Immunität gegen Antigene bei
Menschen und Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß es aus immuner Ribonucleinsäure besteht, gewonnen aus Makrophagen
in Milz, Lymphknoten und (oder) BauchfellausScheidungen
eines Tieres, das den Empfängertieren heterolog
und durch Injizieren des genannten Antigens immunisiert ist.
2. Serum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Antigen pathogene Bakterien und/oder pathogene Viren sind, gegebenenfalls im abgeschwächteil oder abgetöteten
Zustand7oder durch sie produzierte Toxoide.
3. Serum nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Toxoid eine Diphterie-Toxoid ist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Serums nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
Injizieren von Antigen in Tiere bis zur genügenden Entwicklung von Immunität, Schlachten der Tiere, Extrahieren
von-Ribonucleinsäure aus Makrophagen, die in Milz,
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Lymphknoten und (oder) Bauchfell aus Scheidungen "besagter
Tiere entstehen;und Reinigen der Ribonucleinsäure durch
Einwirkung von proteolytischen Enzymen mit folgender Kolonnen-Chromatographie oder Super-Zentrifugierung.
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|---|---|---|---|
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- 1969-01-20 GB GB1234121D patent/GB1234121A/en not_active Expired
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Biol.J., 64, 1956, 405 * |
| Med.Mikrobiol.Immunol., 152, 1966, S. 112-133 u. 262-272 * |
| Ref. Annal of Biochem., 26, 1957, Abs. 3, 499 * |
| Science, 146, 1964, 934-936 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE1902590C2 (de) | 1984-04-26 |
| JPS4920489B1 (de) | 1974-05-25 |
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| GB1234121A (de) | 1971-06-03 |
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