DE1767363A1

DE1767363A1 - Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Nierenextraktes

Info

Publication number: DE1767363A1
Application number: DE19681767363
Authority: DE
Inventors: Yvonne Thuillier
Original assignee: Laboratoires Albert Rolland SA
Current assignee: Laboratoires Albert Rolland SA
Priority date: 1967-05-02
Filing date: 1968-05-02
Publication date: 1972-07-06
Also published as: GB1216076A; NL6806067A; SE349939B; CH512245A; DK117315B; US3683070A; LU55919A1; ES353365A1; FI48895C; FR1605010A; BE713620A; OA02800A; NO126718B; FI48895B; FR7415M

Description

Patentanwälte
Dipl.-lng. R. Beetz u.
Dipl.- Ing. Lampredit ι η ω η ο f> ο

München 22. Steintdorfstr. 10 I / U / O U O

96-13.465P 2.5.1968

Les Laboratoires Albert ROLLAND, Paris (Frankreich)

Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Nierenextraktes

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Nierenextraktes mit antihypertensiver Wirksamkeit.

Man hat bereits versucht, hypotensive oder ant!hypertensive Stoffe aus der Niere zu isolieren. Nach einem bekannten Verfahren (s. Grollman u.a., Biol. Chem. 134 (1940) 115-121) soll insbesondere ein Nierenextrakt erhalten werden, der in der Lage ist, den Blutdruck in allgemeiner Weise zu senken, und zwar werden nach diesem Verfahren Nierenextrakte hergestellt, die bei experimentell unter Hypertonie gesetzten Tieren eine Senkung des Blutdruckes bewirken. Das Verfahren umfaßt im wesentlichen eine Extraktion der Organe mit Salzsäure, Ausfällung der inerten Proteine bei etwa pH 4 mit Soda bzw. Natronlauge (soude), Filtrieren und Wiederansäuern auf etwa pH 2 bis 3 und Ausfällung eines aktiven Materials mit Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, Eine Anreicherung des aktiven Materials kann durch Extraktion mit Aceton oder Alkohol vor oder nach der Salzfällung

96-H 7591-caa 31-NoE (6)

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erreicht werden.

Bei anderen Verfahren wurde die vorgenannte Arbeitsweise später grundsätzlich wieder aufgenommen oder es wurden in allgemeiner Weise Verfahren auf der Grundlage von Nierenauszügen mit Salzlösung angewandt«

Die antihypertensive Wirksamkeit und Wirkungsdauer der nach bekannten Verfahren erhaltenen Fraktionen reichen jedoch für die therapeutische Anwendung nicht aus. Außerdem ist die Extraktions- bzw. Auszugsmethode langwierig und umfaßt viele für die industrielle Fertigung nachteilige Verfahrensschritte.

Gemäß der Erfindung wird nun ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Nierenextraktes mit antihypertensiver Wirksamkeit vorgeschlagen, das im wesentlichen aus einer Reihe von Extraktionsschritten unter Verwendung organischer Lösungsmittel besteht und das, wie die Überprüfung der Wirksamkeit bei jeder Extraktionsstufe zeigt, zu einem dem gewünschten Ziel entsprechenden, sehr wirksamen Extrakt mit verlängerter Wirkungsdauer führt. Das erfindungsgemäße Verfahren unifaßt im übrigen eine beschränkte Zahl von Verfahrensschritten und es ist industriell leicht und mit geringen Kosten durchführbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die zerkleinerten tierischen Organe oder Organteile von aufeinanderfolgenden Extraktionsschritten mit drei ver-

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BAD OHlGJNAL

sehledenen organischen Lösungsmitteln in der folgenden Reihenfolge unterwirft:

a) wiederholten Extraktionen mit Aceton bei einem insbesondere mit Salzsäure auf etwa pH 4 gebrachten Milieu;

b) wiederholten Extraktionen des eingeengten Aeetonextraktes

mit Diäthylatherj und %

c) abschließend wiederholten Extraktionen mit sekundärem Butanol bei etwa pH 5J

und schließlich den erhaltenen Extrakt einengt, wobei alle Extraktionssehritte bei einer Temperatur zwischen 0 und +5°C durchgeführt werden.

Die abschließende Konzentrierung des Extraktes kann nach verschiedenen Verfahren erreicht werden. So kann man die butanolische Lösung eindampfen und nach Zugabe von Wasser erneut bis Λ zur gewünschten Konzentration durch Verdampfen einengen.

Man kann für die abschließende Konzentrierung auch ein

Ionenaustauscherharz verwenden, wie beispielsweise das im Handel

unter der Bezeichnung "Sephadex" bekannte Harz der Gesellschaft Pharmacia, Uppsala, Schweden.

Die Extraktionen werden bei niedriger Temperatur ausgeführt, vorzugsweise zwischen 0 und 5°C und beispielsweise liegt die Temperatur während der Gesamtheit der Extraktionsschrittc in der Gegend von +2 C.

209828/1028 _{8AD 0R1G1NAu}

Es ist absolut wesentlich, daß für die abschließende Extraktion sek.-Butanol verwendet wird, ausschließlich jeder anderen Art von Butanol oder Alkohol. Primärer Butylalkohol liefert nicht die gewünschten Ergebnisse. Auch die handelsübliehen Butanolmischungen sind als solche nicht mehr brauchbar, sondern der sek.-Butanol muß daraus extrahiert bzw. isoliert P werdenα

Art und Güte des Butanols beeinflussen die Extraktion und Wirksamkeit des erhaltenen Produktes, wie durch chromatographische Untersuchungen und UV-Spektroskopie nachgewiesen werden konnte.. Diese Versuche zeigen, daß nur dann die gewünschte vollständige Abwesenheit von Proteinen, Polypeptiden und Peptiden im Endprodukt erreicht werden kann, wenn sek.-Butanol beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.

Als animalisches Ausgangsmaterial für die Extraktionen dient die Niere von Säugetieren und vorzugsweise Schweineniere. Man kann aber auch die Niere vom Rind, Hammel, Hund oder Kaninchen verwenden. Man kann die vollständige Niere oder das Nierenmark benutzen.

Für 10 kg Niere können als Lösungsmittel und Zusätze beim erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise 28,8 1 Aceton, J52 ml konzentrierte HCl, 900 ml Äther, 2 1 sek.-Butylalkohol und 4,7 1 destilliertes Wasser gebraucht werden.

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Mit 10 kg Niere erhält man. abschließend Material für etwa 125 bis 150 Flakons (flacons) mit jeweils 60 bis 80 mg aktiven Extraktes gemäß der Erfindung»

Man kann jedoch zur Erzielung des gewünschten Produktes auch unterschiedliche Mengenverhältnisse der eingesetzten Substanzen vorsehen, M

Es folgen nichteinschränkende Beispiele zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens»

Beispiel 1:

10 kg Schweineniere werden zerkleinert und mit 20 1 Aceton mit ~j>2 ml reiner (konzentrierter) Chlorwasserstoff säure versetzt. Die erhaltene Flüssigkeit wird auf etwa +2⁰C gekühlt und für eine gleichmäßige Durchmischung mit Preßluft gerührt und über Nacht in der Kälte belassen, Λ

Am nächsten Tag wird durch Gaze und Faltenfilter, wenn möglich., in einer Kühlvorrichtung filtriert.

Der Rückstand wird mit einer Mischung aus 4,4 1 Aceton und 2,2 1 Wasser wieder aufgenommen, gerührt und über Nacht in der Kälte belassen. Am folgenden Tage wird erneut filtriert und wiederum mit der gleichen Menge der gleichen Lösung wie vorstehend behandelt und über Nacht in der Kälte belassen.

Am Tag darauf werden nach dem Filtrieren die drei erhaltenen Extraktionsflüssigkeiten vereinigt und im Vakuum bei J>Q C

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bis auf etwa 3 1 Flüssigkeit eingeengt. Diese wird über Nacht In den Kühlapparat gegeben und dann filtriert.

Das Filtrat wird dann dreimal hintereinander mit 300 ml Äther extrahiert. Der Äther wird im Vakuum vertrieben und die ätherische Extraktionsflüssigkeit bzw. -masse (jus) mit etwa 2 1 sek„~Butanol behandelt. Praktisch wird einmal mit 500 ml und dann sechsmal mit 250 ml extrahiert. Die butanolischen Extrakte werden gemischt und die wässrige Fraktion entfernt. Die butanolischen Fraktionen werden bis auf etwa 300 ml eingeengt, dann mit dem gleichen Volumen an destilliertem Wasser versetzt und erneut bis auf 300 bis 350 ml eingeengt. Der pH-Wert wird dann auf 6 bis 6,6 eingestellt und das erhaltene Produkt lyophilisiert.

Beispiel 2:

Zu 1 kg Schweineniere wurden 2 1 Aceton, versetzt mit 3*2 ml reiner konzentrierter HCl, hinzugegeben und die Mischung bei +2⁰C über Nacht stehen gelassen und dann durch ein Gazefilter filtriert.

Der erhaltene Rückstand wurde erneut zweimal mit einer Mischung von 440 ml Aceton und 220 ml Wasser bei +2⁰C über Nacht extrahiert. Die Rückstände wurden entfernt und die erhaltenen Aceton-Extrakte gemischt. Man filtriert durch Faltenfilter und engt im Vakuum bei 35°C bis auf etwa 350 ml ein. Man erhält so eine konzentrierte Lösung, die man eine Nacht lang bei +2 C

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aufbewahrt und dann durch Faltenfilter filtriert.

Die filtrierte Lösung wird dreimal mit dem zehnten Teil ihres Volumens an Äther (d.h. jeweils mit 30 ml Äther) behandelt und der Äther wird dann eingedampft.

Die erhaltene Lösung wird 20 mal mit jeweils 11 ml sek.-Butanol extrahiert. Man vertreibt den Butanol durch Einengen ^j bis auf 30 ml. Zu der so erhaltenen butanolischen Fraktion gibt man die gleiche Menge Wasser und engt erneut auf JO ml ein.

Beispiel 3:

10 kg Schweineniere werden dem allgemeinen Extraktionsverfahren nach Beispiel 1 unterworfen.

Für die Extraktion werden 20 1 Aceton (versetzt mit 32 ml reiner HCl) verwendet. Man engt auf 2 1 ein.

Die Behandlung mit Äther umfaßt zwei Extraktionen mit jeweils 200 ml Äther. Der Äther wird vertrieben und es folgen dann Extraktionen mit sek.-Butanol und zwar eine erste Extraktion mit 500 ml sek.-Butanol und sechs Extraktionen mit 250 ml sek.-Butanol. Die butanolische Flüssigkeit wird auf 300 ml eingeengt, danach mit 300 ml Wasser versetzt und erneut auf 350 ml eingeengt.

Der erhaltene Trockenextrakt entspricht 3*8 Gew.% Niere (bzw. das Produkt enthält 3*8 Gew.% lediglich aus Nierenbestandteilen bestehende Trockensubstanz).

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Γ/67363

Beispiel 4:

In gleicher V/eise wie in Beispiel 1 werden 10 kg Schweineniere mit 20 1 Aceton und 32 ml reiner (konzentrierter) HCl extrahiert. Man engt auf 1,1 1 ein und extrahiert dreimal mit 110 ml Äther, Der Ä'ther wird vertrieben und es wird dann achtmal mit jeweils 250 ml sek.-Butanol extrahiert. Man engt auf 300 ml ein, gibt 300 ml Wasser hinzu und engt erneut auf 350 ml ein. Auf diese Weise wird der Extrakt A erhalten«

Man wiederholt die Operation mit 10 kg Schweineniere, die mit 20 1 Aceton (versetzt mit 32 ml reiner HCl) extrahiert werden. Man engt auf 2 1 ein und extrahiert mit 200 ml Äther. Der Äther wird vertrieben und (der Rest) achtmal mit jeweils 250 ml sek.-Butanol extrahiert. Man engt ein, gibt zweimal 300 ml Wasser hinzu (zur Entfernung von Butanolspuren), engt dann auf 250 ml ein und erhält so einen Extrakt B.

Die vereinigten Extrakte A und B haben einen Trockengehalt von k Gew.;» an lediglich von der Niere herstammendem· Material.

Beispiel 5:

Gemäß der allgemeinen Arbeitsweise nach Beispiel 1 werden 10 kg Schweineniere mit 20 1 Aceton (versetzt mit 32 ml HCl) extrahiert. Man engt auf 1,1 1 ein.

209828/1028 ^{BAD or}'G'nal

Daneben werden 11 kg Schweineniere mit 22 1 Aceton (versetzt mit 55j2 ml reiner HCl) extrahiert. Es wird ebenfalls filtriert und auf 90° ¹^l eingeengt.

Die beiden eingeengten Aceton-Extrakte werden vereinigt und ergeben zusammen 2 1. Diese Mischung wird mit 200 ml Äther behandelte Der Äther wird vertrieben und es wird weiter mit ^

sek,-Butanol extrahiert, und zwar zweimal mit 500 ml Butanol und fünfmal mit 400 ml Butanol«,

Man engt auf 600 ml ein, gibt J500 ml Wasser hinzu, konzentriert auf 600 ml, verdampft erneut unter Vertreibung der Butanolspuren und erreicht so ein Volumen von 470 ml.

Der erhaltene Trockenextrakt entspricht 4,87 Gew.% Niere (de rein seul). Man verdünnt den Extrakt auf J>,3 % Nierengehalt (650 ml) und gibt dann 22,75 g Lactose (entsprechend 3*5 Gew.% bezogen auf den endgültigen Extrakt) hinzu. \

Mit den gemäß der Erfindung erhaltenen hypotensiv wirksamen Fraktionen der Nieren wurden die folgenden pharmakologischen Untersuchungen durchgeführt:

Zunächst wurde die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Extraktes mit derjenigen bekannter Produkte unter den weiter unten angegebenen Bedingungen verglichen. Man gelangt so zu folgenden Schlußfolgerungen:

l) Der erfindungsgemäße Nierenextrakt führt JO bis 45 Minuten nach Injektion einer bestimmten Dosis zu einer Drucksenkung

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- ίο -

um 1 bis 3> Einheiten (beim maximalen systolischen Druck),

2) Lediglich die Wirkungsdauer hängt von der angewandten Dosis ab,

3) Die Injektionen führen bei den Tieren zu keinerlei Störungen oder Beschwerden.

Diese Peststellungen konnten anhand von Versuchen getroffen werden, die mit Gruppen von experimentell unter Hypertonie (renale Hypertonie) gesetzten Affen von jeweils 4 bis 6 kg durchgeführt wurden. Für die Druckmessungen diente ein "Giono-Chevillard-Krauthamer-Oszillometer". Die angegebenen Einheiten bedeuten cm Hg. Injiziert wurde intraperitoneal der in etwa 5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöste Wirkstoffinhalt von J5 bis 8 Plakons.

In einem zweiten Abschnitt wurden die Auswirkungen einer Kur mit erfindungsgemäßem Nierenextrakt mit dem gleichen Material wie oben untersucht.

Zu diesem Zweck wurden zwei Meßreihen durchgeführt, und

l) eine Meßreihe mit einer starken Anfangsdosis (6 Flakons) bei der ersten Injektion, während bei den nachfolgenden Injektionen eine Woche lang pro Tag der Wirkstoffinhalt von 2 Flakons injiziert wurde und

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2) eine weitere Meßreihe mit einer relativ geringen Anfangsdosis O Flakons) und nachfolgenden Injektionen von je einem Flakon pro Tag.

Jeweils unmittelbar vor den Injektionen, die jeweils etwa zur gleichen Stunde erfolgten wurde der Druck bestimmt.

Bei diesen Meßreihen wurden folgende Ergebnisse erzielt: %

Bei der ersten Meßreihe wurde vor Einstellung bzw. Beendigung der Injektionen vom 2. Tag an eine deutliche Drucksenkung (2 Einheiten beim systolischen Druck) beobachtet, die sich in den folgenden Tagen verstärkt und bis zu einer Drucksenkung um Einheiten nach dem dritten Tag geht. Das Tier befindet sich dann im Zustand der Hypotension.

Nach Einstellung der Injektionen hält die Drucksenkung

über mehr als 15 Tage nach der letzten Injektion an. In der ^ ersten, der Einstellung der Injektionen folgenden Woche beobachtet man eine maximale Senkung des systolischen Druckes um 3 4 Einheiten; die Abnahme des diastolischen Druckes erreicht sogar bis zu 5 Einheiten. Das Tier befindet sich noch unter Hypotension. Danach findet eine allmähliche Zunahme des Druckes statt, der sich stabilisiert, jedoch auf einen gegenüber dem Anfangsdruck geringeren Wert. Zwischen der letzten Injektion und der Stabilisierung des Druckes vergeht eine Zeit von etwa 15 Tagen. Durch mehrfache Wiederholung der ersten Meßreihe konnte

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festgestellt werden, daß sich der Druck am Ende stets auf einen Wert einstellt, der geringer ist als der Anfangsdruck:. Bei den durchgeführten Versuchen lagen die am Ende erreichten Druckwerte um zumindest eine Einheit beim systolischen Druck und um zumindest zwei Einheiten beim diastolischen Druck niedriger.

^ Bei der zweiten Meßreihe wurde nach einer Anfangsdosis von J> Plakons vier Tage lang pro Tag ein Flakon mit aktivem Produkt injiziert. Vom zweiten Tag an zeigte sich eine Druckabnahme, die in diesem Falle jedoch maximal nur zwei Einheiten beim systolischen Druck und 3 Einheiten beim diastolischen Druck erreichte.

Nach Einstellung bzw. Beendigung der Injektionen stieg der Druck allmählich wieder an und stabilisierte sich dann auf den gleichen Wert wie zu· Beginn. Zwischen der Einstellung der * Injektionen und der Stabilisierung verging etwa eine Woche.

Aufgrund der Ergebnisse dieser Meßreihen kann festgestellt werden:

l) Bei einer Behandlung mit erfindungsgemäßem Nierenextrakt mit einer hohen Anfangsdosis wird bei den Versuchstieren vom zweiten Tag an eine deutliche Erniedrigung des Blutdruckes beobachtet. Diese Drucksenkung bleibt (qualitativ) während der gesamten Behandlung und danach erhalten.

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~ 13 -

2) Je nach angewandter Anfangsdosis und den folgenden Behandlungsdosen wird (auf die Dauer) entweder eine Druckerniedrigung (bei starken Dosen) oder einfach eine Normalisierung des Druckes beobachtet.

3) Die plötzliche Einstellung der Injektionen führt nicht

zu einem Verschwinden der Wirkung des Produktes. Diese Wirkung Λ hält je nach angewandter Dosis bzw. Dosen über eine mehr oder minder lange Zeit an,

4) Es wurden weder vor noch nach Einstellung der Injektionen bei den Tieren irgendwelche Störungen oder Beschwerden beobachtet Die Tiere zeigen keinen Gewichtsverlust und keinen Appetitmangel»

5) Selbstverständlich können Dosen verabreicht werden, die geringer oder stärker sind als die vorgenannten und man kann vor allem die Kur für eine endgültige Druckstabilisierung ein- oder mehrmals wiederholen. '

In den nachfolgenden Tabellen I und II sind die Ergebnisse der beiden vorstehend beschriebenen Meßreihen zusammengefaßt.

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- 14 Tabelle I

Zeitliche Änderung des Blutdruckes von unter experimentelle Hypertonie gesetzten Affen bei Verabreichung von erfindungsgemäßem Nierenextraktes

Erste Meßreihe *

Tage systolischer - diastolischer Injizierte Dosis

Druck

6 Plakons 2 ^M 2 " 2 ⁿ 2 ⁿ 2 "

1	13	17
2	11	16
3	10	15
4	9	14
5	9	13
6	9	13
7	9	13
8	9	13
9	9	12
10	9	12
11	10	13
12	10	13
13	10	13
14	9	12
15	11	13
16	12	14
17	12	14
18	12	15
19	12	15
24	12	15

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Tabelle II

Zeitliche Druckänderung Zweite Meßreihe *

Tage

systolischer - diastolischer Druck

Injizierte Dosis

13 -	16
12	16
12	16
11	13
11	13
11	13
12	15
12	16
12	16

3 Plakons 1 Flakon 1 " 1 " 1 "

* Bemerkung;

Der Druck wurde jeden Tag unmittelbar vor den jeweils etwa zur gleichen Stunde stattfindenden Injektionen gemessen.

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Claims

- 16 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Nierenextraktes mit antihypertensiver Wirksamkeit, dadurch gekennzeich· net, daß man die tierischen Organe oder Organteile nach dem Zerkleinern aufeinanderfolgenden Extraktionen mit drei organisehen Lösungsmitteln in der folgenden Reihenfolge unterwirft:

a) wiederholten Extraktionen mit Aceton bei einem auf etwa pH gebrachten Milieu;

b) wiederholten Extraktionen des eingeengten Aceton-Extraktes mit Diäthyläther; und

c) wiederholten Extraktionen des ätherischen Extraktes bei etwa pH 5 mit sek.-Butylalkohol;

und schließlich den erhaltenen Extrakt einengt, wobei alle Extraktionsschritte bei einer Temperatur von 0 bis +5 C ausgeführt werden.

2ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Butanol-Extrakt abschließend nach Zusatz von Wasser durch Eindampfen eingeengt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Butanol-Extrakt abschließend mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes eingeengt wird.

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^. Pharmazeutische Mittel mit antihypertensiver Wirksamkeit, gekennzeichnet durch einen Gehalt an vollständig protein-, polypeptid- und peptidfreiem Nierenextrakt, der nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten worden ist.

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