DE1667878A1 - Verfahren zur Herstellung von Thyrocalcitonin - Google Patents

Description

JR. I . M . MAAS DR. W. G. PFEIFFER

PATENTANWALT!

MÜNCHEN 13

76650 UNOItiKtTKASSE 25

£11 Lilly and Company, Indianapolis; Indiana, V. St. A.

Verfahren zur Herstellung von Thyrooaleitonin

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Die Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Thyrocalcitonin aus Schild« drUeen von Säugetieren.

Ccpp et al., Endocrinology 7O₉ 638 (1962) waren die ersten, die auf die Existenz von Thyrocalcitonin schlossen, die von Foster und Hitarbeitern in Veruffentlichungen in Lancet II 480 (1963), in Nature 202, 1303 (1964) und in anderen Zeitschriften bestätigt wurden, Thyrac*l©ltonin ist ein einkettiges Polypeptid und ein natürlich vorkommendes Flasmacalciuiii senkendes Hormon. Ss dient zur Behandlung von Fatienen mit gestreuten «al?gne», Leiden und

schwerer Hypercalcaemie (vergleiche Poster et al., Lancet I 107 (1966). Es wird angenommen, daß Tyhrocalcitonin bei bestimmten klinischen Knochenerkankungen eine Rolle spielt und daß es noch nicht erkrankte Syndrome

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gibt, die auf einen Überschuß oder einen Hangel an diesem Hormon zurlickzufUhren sind.

Verschiedene Methoden zur Isolierung von Thyrocalcitonin sind bereits veröffentlicht worden, haben aber alle schwerwiegende Nachteile, wenn es sich um die Gewinnung des Hormone in großem Haßstab handelt. So 1st beispielsweise bei den Verfahren von Gudmundsson et al«, Proc. Roy-Soc* 164 460 (1966) und Baghdiantz et al,, Nature 203,. 1027 (1964) eine Dialyse erforderlich. Bei anderen in der Literatur beschriebenen Reinigungsverfahren sind entweder mehrere Stufen nötig und/oder es wird ein Produkt mit ungenügender Reinheit erhalten.

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Thyrocalcitonin, das wirtschaftlich ist, sich für einen Betrieb in großem Maßstab eignet und das Hormon in der fUr stint klinische Anwendung erforderlichen Reinheit liefert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von .Thyrocaloitonin mit einer signifikenten Serumcalcium erniedrigenden Aktivität bei Ratten bei einer Dosierung von 5/^/kg Körpergewicht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man SäugetierechilddrUsengewebe mit einer sauren Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen

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Lösungsmittel extrahiert, aus diesem Extrakt inaktive Eiweißeetoffe selektiv ausfällt und abtrennt, aus dem erhaltenen Piltrat Thyrocalcitonin durch Zugabe eines großen Volumens eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels fällt und schließlich das so gefällte Thyrocalcitonin abtrennt und reinigt,,

Daβ erfindungagemaße Verfahren wird im einzelnen folgendermaßen durchgeführt: Ganze oder entfettete entwässerte Säugetierechilddrlisen, vorzugsweie vom Schwein oder Rind, werden mit einem angesäuerten Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Da: saure Extrakt wird von dem Gewebertiokstand abgetrennt und mit einem geeigneten Volumen Lösungsmittel versetzt, wodurch eine große Menge hormonal unwirksamer Eisweißstoffe aus· fällt, die abfiltriert und verworfen wird. Das Piltrat wird dann mit einem,größeren Volumen des Lösungsmittels versetzt, wodurch das Thyrooaleitonin gefällt wird* Statte dessen kann man auch eine pH-tfert-Froktionierung anwenden, wobei der pH-Wert auf 6,5 eingestellt, der gebildete Hiederschlag der inaktiven Eiweißsstoffe verworfen und ein großes Volumen des Lösungsmittels zur Fällung des Thyrocalcitonina zugesetzt wird. In beiden Fällen wird der Niederschlag abgetrennt und durch Gelfiltration oder Chromatographie an ,einem Po]ydextran oder anderem geeigneten Adsorbens gereinigt.

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Baa so erzeugte Produkt 1st homogen« was durch Stärkegelelektrophorese in 8 m Harnstoff mit einem pH-Wert von 2,9 nachgewiesen wird. Das gereinigte homogene -Produkt hat eine aignifikate Serumcalcium erniedrigende Aktivität bei Ratten bei Dosen von etwa 5 J*/kg Körpergewicht.

FUr die saure Extraktion im Rohem des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jede beliebige starke Säure, beispielsweise Salseäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder Schwefelsäure verwendet werden. Die wässrige Säure wird in solcher Menge eingesetzt, daß der pH-Wert der Extraktionsmischung unter 4*0 liegt. Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen 1,5 und 3,5. Ea ist twar möglich, Wasser allein als das Lösungsmittel für diese saure Extraktionsatufe eu verwenden, doch wurde gefunden, daß es durch Verwendung eine« Mischlöeungemitteleysteme, das Wasser und ein ■it Wasser mischbare β Lösungsmittel wie Sioxan, Di«*t»yiformamid, Aceton, Methanol, Isopropanol oder Ätttsnöl, vorsugsweise letBttre·,enthält, möglich ist, die Temperatur Inder Bxtrektionsstufe in starkem MaBe tu senken. Wenn als Extrakt ionsieed ium wässrige Säur« allein verwendet wird, dann liegt die flir ein· wirksaae Extraktion von Thyrocalci tonin erforderlich« Temperatur bei etwa 70⁰C, wohin-

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gegen bei Verwendung von ang»eäu«rtea/A*thenol oder Aceton oder einer ähnlichen Mischung aus wässriger Säure und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel die

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Extraktionatemperatur bei bis herab zu 5°C liegen kann-Bei diesen letztgenannten Extrektionsbedingungen wird sowohl eine eindeutig verbesserte Ausbeute als auch eine größere Reinheit des Thyrooalcitonins erzielt und eine Froteindenaturierung vermieden· Der Bereich der brauchbaren Konzentrationen dee mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels liegt zwischen 25 und 85 Volumen-$ und hängt von dem jeweils gewählten Lösungsmittel ab.· Vor züge- * weise wird Äthanol in einer Konzentration von 40 bis 85 r> angewandt. Bei den höheren Konzentrationen des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels bleibt eine größere Menge an hochmolekularem Protein und anderen Substanzen ungelöst als im unteren Teil des angegebenen Konzentrationsbereiche. Biese hochmolekularen Eiweißsatoffe brauchen dann anschließend nicht durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt zu werden.

In der »weiten Stufe d-¹'? erfindungsgemäßen Verfahrens werden die inaktiren Eiweißstoffe durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu dem sauren Extrakt fraktioniert gefällt. Nach dem Ausfällen und Abtrennen dieser inaktiven Stoffe durch Filtrieren oder Zentrifugieren wird weiteres mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in zur Fällung des Thyrocalcitonine aus reichehd.r Menge zugesetzt. Beispielsweise werden 1-3 Voluolno «Ines mit Wa.eer mischbaren organischen Lösungsmittels wie

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Aceton zu dem sauren Extrakt gegeben. Die hierdurch gefällten inaktiven Eiweißsstoffe werden durch Filtrieren abgetrennt und verworfen. Dann werden 5 bis 10 Volumina Aceton zu dem Filtrai; zugesetzt, um das Thyrocalcit"nln zu fällen, das dann seinerseits durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrenrt wird.

Bei einer anderen möglichen fraktionieren Fällungsmethode wird der pH-Wert des zunächst erhaltenen sauren Filtrats auf etwa 6,5 eingestellt. Unter diesen Bedingungen fällt das inaktive Eiweißmaterial aus und wird abfiltriert. Der Alkoholgehalt des Filtrate, das im Fall der Verwendung von angesäuerten wässrigem Äthanol als Extraktionsmittel erhalten wird, wird durch Zugabe von absolutem Äthanol auf 92 - 93 °h elngestel] Rohes Thyrocaloitonin fällt aud und wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt. Das erhaltene rohe Thyr^calcitonin kann dann durch Gelfiltration oder gleichwirkende Maßnahmen gereinigt werden, so daß man gereinigtes Thyrocalcitonin erhält, das mit dem vergleichbar ist, das bei der fraktionierten Fällung Bit Hilfe steigender Volumina des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels bei saurem pH-Wert erhalten wird.

In der letzten Stufe des Verfahrene, in der das Thyrocalcitonin durch Gelfiltration oder Chromatographie gewonnen wird, kann,

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wie bereits angegeben, ein Polydextran (vorzugsweise Sephadex O-25F) als Gelfiltrationsmittel angewandt werden. Man kann aber auch andere vergleichbare Stoffe als Adsorbens oder Filterntlonsmittel einsetzen, sum Beispiel Polyacrylamidgele„

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Ein Volumen gefrorener Schweineschilddrüsen wird vermählen und dann durch eine dreifache Extraktion unter Verwendung

von 10 Volumina Aceton von -10⁰C für jede einseine Extraktion entfettet. Di· Acetonextrakte werden abfiltriert und verworfen. Das hinterbleibende Gewebe wird dann noch einmal durch dreimaliges Extrahieren unter Verwendung von jeweils 10 Volumine Äther von 22 bis 25 °C .entfettet. Wiederum wird vom entfetteten Gewebe abfiltriert, und die Ätherextrakte werden verworfen.

1 kg des wie oben beschrieben erhaltenen getrockneten entfetteten Sohllddrliaengewebes wird mit 20 1 eines sauren Lösungsmittels extrahiert, des durch Vermischen von 2 1 Eisessig alt 9 1 Waeeer und soviel95 £-lgta Äthanol, wie fUr tin Volumen von 20 1 er« forderlich ist, erhalten wurde« Der Extrakt wird durch filtrieren abgetrennt, und der Pilterrückstand wird verworfen. Das Thymcal . cltonin befindet sich in dem sauren FIltrat. Bas Plltrat wird mit 16 1 Aceton von -5°C vermischt und nach Zugabe von Filterhilf· abfiltriert. Der PllterrUokatand wird wiederum verworjgea, da sich das Thyrosalcitonin in Lösung in dem FiItrat befindet.

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Dieses Piltrat wird mit 19 1 i >eton von -5⁰C sowie mit Filterhilfe versetzt, und das gesa', ;e Gemlech wird erneut filtriert. Eine dritte Acetonfällung vor. inaktivem Material wird durch Zugabe von 17,5 1 Aceton bei -5°C zum PiItrat durchgeführt. Xn beiden Stufen wird daa Gemisch nach Zugabe von Filterhilfe filtriert, und das Unlösliche wird verworfen. Daa Piltrat,cdaa daa Thyrooalcitonin enthält, wird nun mit 87,5 1 Aceton von -5°C vermischt. Das erhaltene Gemisch wird Über Nacht bei 5⁰C stehengelassen, wonach die Überstehende .Flüssigkeit abgegossen un< verworfen wird. Die surUckbleibende Aufschlämmung, die daa gefällte Thyrocelcitonin enthält, wird zentrifugiert. Der Thyro« · . oaloitonin enthaltende Niederschlag wird alt Aceton gewaschen und la Yakuua getrocknet· Man erhält* 11»2 g rohes Tyrocalcitonln? 2 g dieser Substanz warden In 70 ml 1n Easigeäure gelöst, die alt 1 al 1 η Salsaäure versetzt warden, ua die Löeung daa Polypeptide* teriala zu unterstützen. Die Löeung wird auf «in» 4,7x48ea-Säul* aus Polydextran(Sephadex G-25F) aufgegeben «ftf alt der gleichen Lösung, die sua Auflösen des rohen TyrocaIcitonin· verwendet wurde, eluiert. Ea werden Fraktionen von jeweils 8,5 al aufgefangen. Dia gereinigte« Tyhrocalcitonin enthaltenden Fraktionen 45 bia 56 werden vereinigt und lyophilieiert. Die Ausbeute a: grtinigtee Thyrocalcitonin beläuft sich auf 15,3 ag/. Damit beträgt die Ausbeute an gereinigtem Thyrooalcitonin, bezogen auf die getrockneten entfetteten Schilddrüsen 85 mg/kg-

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Beispiel 2

1 kg ganzer gefrorener SchwelneschllddrUsen wird in einer Fitzmühle vermählen und danach zu 2600 ml 83 tigern Äthanol von 5 C gegeben_f das mit Phosphorsäure auf pH 2,8 eingestellt war. Die Gewebsaufschlämmung wird eine Stunde bei 5⁰C gerührt, und der pH-Wert, der etwas ansteigt, wird mit Phosphorsäure auf 2,8 nachgestellt. Das Gemisch wird Über flacht bei 5°C mäßig gerührt.

Dann wird das Gemisch filtriert, und das Piltrat (2100 ml) wird als erster Extrakt aufbewahrt. Der GeweberUckstand wird •rneut mit 2500 ml 65 5^-igem Äthanol, das auf pH 2,8 eingestellt 1st, durch einst Undigee R Uhr β η In der Kalte extrahiert. AnecftlieBend wird filtriert, und das Piltrat (2400 ml) wird mit dem ersten Extrakt vereinigt, wodurch ein Gesamtvolumen an Rohextrakt von 4500 ml erhalten wird«

Dieser Rohextrakt wird mit soviel 14 η Ammoniumhydroxyd versetzt, wie erforderlich ist, um den pH-Wert auf etwa 6,5 cu erhöhen. Bin eich während der Zugabe des Amoniumhydroxyds bildender roter flockiger niederschlag wird durch filtrieren entfernt und verworfen. Der pH-Wert des filtrate wird dann duroh weitere Zugabe von Ammoniumhydroxyd auf 8,2 eingestellt* Der sich während dieser Maßnahme bildende weiße kristalline Niederschlag wird gleichfalls durch filtrieren abgetrennt und verworfen.

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Der pH-Wert dee Filtrate wird nun durch Zugabe von 6η Salzsäure auf 6,5 gesenkt, und durch Zugabe von 3,4 Volumina absolutem Äthanol wird die Äthanolkonzentration auf etwa 95 # erhöht. Παoh Zugabe dee Äthanols tritt eine Trübung auf, die sich nach 2 tägigem Stehenlassen der Mischung in der Kälte absetzt. Die klare Überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert, und der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen. Der Niederschlag wird mit absolutem Äthanol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 8,08 g eines helllederfarbenen Pulvers. Bei der intravenösen Verabreichung dieses Produkts in einer Dosis von 2,0 mgAg Körpergewicht an eine Gruppe von 6 WieterRatten wird eine mittlere Erniedrigung des Serumcelcium-Spiegele von 2,26 * 0,7 ag-Prosent gegenüber einer Kontrollgruppe von Ratten, denen Salzlösung injieiert wurde, erslilt. Die erhaltene Subetani kenn wie In Beispiel 1 beschrieben, weiter gereinigt werden.

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Claims (3)

1. Patentanarrtlche

   · Verfahren zur Herstellung von Thyrocalcitonin mit einer eignifikanten Serumcalcium erniedrigenden Aktivität bei Ratten bei einer Dosierung von 5f*/kg Körpergewicht, dadurch gekennzeichnet, daß nan SäugetlerechllddrUeengewebe mit tinei sauren Mischung aus Wast-er und einem mit Waseer mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, aus diesem Extrakt Inaktive Eiweißsetoffe selektiv auffällt und abtrennt,

   aus dem denn erhaltenen Piltrat durch Zugabe eines großen Volumens eines alt Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels das Thyrocalcitonin ausfällt und das so gefällte Thyrocaltcitonin abtrennt und reinigt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch j.ekennrelehnet, daß nan die inaktiven Eiweißstoff· durch Zugabe eines kleinen Volumens eines mit Wasser mischbarer organischen Lösungsmittels beroreugt ausfällt.
3. 3. Verfshren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die inaktiven Eiweißstoffe durch Einstellen des pH-Werts des Extrakts auf etwa 6,5 bevoreugt ausfällt.

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   4- Verfahren nach /nspruch 1₅ 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, do?? man als Extraktionsniedium angesäuertes wässriges Äthanol verwendet.

   5« Verfahren nach einem der Ansprüche ' bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung des erhaltenen Thyrocalcltonins durch Gelfiltration mit Hilfe von Polydextran durchfUhrtο

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