DE1642658A1

DE1642658A1 - Verfahren zur Reinigung von Enzymloesungen

Info

Publication number: DE1642658A1
Application number: DE19681642658
Authority: DE
Inventors: Sidney Gutcho; Louis Laufer
Original assignee: SCHWARZ BIORES DIVISION OF BEC
Current assignee: SCHWARZ BIORES DIVISION OF BEC
Priority date: 1967-02-23
Filing date: 1968-02-22
Publication date: 1971-05-13
Also published as: GB1193756A; FR1553604A

Description

SCHWARZ BIOEESEAROH, Division of Becton, Dickinson & Company, Orangeburg, New Xork 10962 (V.St.A.)

Verfahren zur Reinigung von Enzymlösungen

Die Erfindung bezieht sich auf die Reinigung von Enzymen und insbesondere auf ein Verfahren zur Reinigung einer enzymhaltigen Lösung (enzymic solution; nachstehend als Enzymlösung bezeichnet), die Polynueleotidphosphorylase und Nucleinsäuren enthält.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung erfolgt eine Entfernung der von Nucleinsäuren gebildeten Verunreinigungen durch Zugabe einer Magnesiumionen enthaltenden Lösung zu der Enzymlöeung, wobei die Magnesiumionen in einer Konzentration zwischen etwa 0,01 und 0,1 Mol/Liter anwesend sind·, die Magnesiumionen werden mit den Nucleinsäuren zur Reaktion gebracht und fällen diese aus, worauf eine von Nucleinsäuren

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freie Enzymlösungabgetrennt und gewonnen wird.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Reinigung von Enzymen bekannt geworden. Beispielsweise werden durch Auflösung (lysis) von Zellen extrahierte Enzyme allgemein einer Reihe von Reinigungsstufen unterworfen, hierzu gehören fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat, Fällung mit Streptomycin, fällung mit Protamin, verschiedene Dialysebehandlungen zur Beseitigung kleinerer Moleküle, und häufig Säulenoder Kolonnenfraktionierungen. So erfordert die Extraktion von Polynucleotidphosphorylase aus Micrococcus lysodeikticus fünf Ammoniumsulfatfällungen, eine Protaminfällung und vier Dialysen, Diese bekannten Reinigungsverfahren benötigen lange Verarbeitungszeiten (über eine Woche) und führen zu geringen Ausbeuten an Enzym; es werden nicht mehr als 15 - 20 % des aus den Zellen herausgeholten Enzyms gewonnen.

Gemäß der Erfindung gelingt eine wesentlich bessere und einfachere Reinigung dadurch, daß man eine Enzymlösung, die Polynucleotidphosphorylase und Nucleinsäuren enthält, mit Magnesiumionen in Berührung bringt, so daß die Nucleinsäuren aus der Lösung ausgefällt werden., Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Magnesiumionen der Enzymlösung durch eine halbdurchlässige Membran zugeführt, die eine Diffusion,,der Magnesiumionen zulässt aber eine Diffusion von Molekülen hohen Molekulargewichts verhindert,

Polynucleotidphosphorylase wird im allgemeinen aus Zellen, wie Micrococcus lysodeikticus_t mit wäßrigen Salzoder Zuckerlösungen extrahiert. Bei einer derartigen Extrak-

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tion werden gleichzeitig NucleinsäurenjRibonuoleinsaure (RNS) und Desoxyribonueieinsäure (DNS), in unterschiedlichen Mengen aus den Zellen entfernt. Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung wird der Extrakt zunächst mit Ammoniumsulfat behandelt, um Proteine fraktioniert zu fällen. Das unreine Enzym, das Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure enthält, wird in einen Dialysebeutel aus einem geeigneten Dialysematerial, z.B. einer Membran" auf Cellulosebasis^ wie Viscosedialyseschlauch, eingebracht und es werden Magnesiumibnen durch Diffusion in den Beutel eingeführt. Die Magnesiumionen reagieren mit der Ribonucleinsäure und der Desoxyribonucleinsäure und führen eine praktisch vollständige Fällung derselben herbei, ohne die Enzyme anzugreifen« Die Lösung wird dann aus dem Dialysebeutel entfernt und zentrifugiert, wobei eine Enzymlösung anfällt, die im wesentlichen frei von Nucleinsäuren ist.

Die Dialyse kann in einem breiten Temperaturbereich^ z.B. von etwa 0° bis etwa 65°C» und in. einen!breiten Konzentrationsbereich der Magnesiumionen in dem Dialysiermittel (dialysand), z.B. von etwa 0,01 bis etwa 0,10 Mol/l,durchgeführt werden. Das die Magnesiumionen enthaltende Dialysiermittel wird im allgemeinen bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,0 und etwa 8,5 gehalten, und zwar durch Anwendung eines geeigneten Puffers. Im allgemeinen hat die zu reinigende wäßrige Enzymlösung eine Proteinkonzentration zwischen etwa 10 und etwa 40 mg/ml. ._,..=

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird nachstehend

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anhand der Gesamtbehandlung zur Herstellung von Polynucleotidphosphorylase aus Microcoecus lysodeikticus weiter veranschaulicht, die Erfindung ist aber nicht auf diese besondere Verarbeitungsweise beschränkt.

Zerreißen der Zellen und Extraktion des Enzyms

Es wurden 175 g getrocknete Zellen von Microcoecus lysodeikticus anteilweise in einen 4—Liter Becher eingebracht, der 8,75 g Natriumchlorid, gelöst in 1750 ml destilliertem Wasser =(in Glas destilliert), enthielt. Das Gemisch wurde etwa

" eine halbe Stunde mechanisch gerührt, um die Zellen vollständig zu dispergieren.

Die Zellsuspension wurde durch Zugabe von ungepuffertem 0,5 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan (nachstehend zur Vereinfachung auch als "Tris¹¹ bezeichnet) auf einen pH-Wert von 8,1 gebracht und die Suspension wurde unter mildem Rühren in einem Bad von 37°C erwärmt. Nachdem die Temperatur der Suspension 37 0 erreicht hatte, wurde eine Lösung zugegeben, die 4-38 - 440 mg Lysozym (Handelsprodukt Worthington 2Σ kristallisiert, salzfrei), gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, enthielt; weitere 10 ml destilliertes Wasser wurden zum Einspülen des Lysozyms benutzt. Die Suspension wurde mit einem mechanischen Bührer schwach gerührt, bis eine deutliche Verdickung (curding) eintrat und eine erhöhte Eührgeschwindigkeit keine Mischwirkung hatte. Zu diesem Zeit punkt wurden 865 ml einer vorausgehend bereiteten kalten gesättigten Ammoniumsulfatlösung unmittelbar zugegeben und in

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die Suspension eingemischt.

Der die Suspension enthaltende Becher wurde in ein Eiswasserbad eingesetzt und die Suspension wurde unter Fortsetzung des Rührens mit geringer Geschwindigkeit auf 10 - 15 C •gekühlt. Die kalte Suspension wurde bei Höchstgeschwindigkeit (etwa 7500 IT/min) etwa 20 Minuten lang zentrifugiert und danach wurde die klare orange gefärbte Lösung sorgfältig von den Zellresten dekantiert. Eine genaue Messung des Volumens ergab etwa 2000 ml.

Reinigung der Enzymlösung;

Die in der vorstehend erläuterten Weise hergestellte Enzymlösung wurde in ein Eisbad eingesetzt und es wurden 21,7 g Ammoniumsulfat $e 100 ml Lösung (65 %ige Sättigung) zugegeben, d.h. 4-34- g Ammoniumsulfat- auf 2000 ml Lösung. Das Salz wurde unter Rühren zugegeben, wobei das Rühren mit einer solchen Geschwindigkeit vorgenommen wird, daß keine Luft in die Lösung gezogen wird. Das Ammoniumsulfat löst sich in der Lösung und das Rühren wurde danach über etwa 20 Minuten fortgesetzt, wobei die Temperatur bei 5 ~ S⁰O gehalten wurde. Die sich ergebende Suspension wurde bei Höchstgeschwindigkeit 20 Minuten zentrifugiert. Die wolkige überstehende Flüssigkeit würde durch Dekantieren entfernt und abgestellt.

Der nach Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit verbliebene Feststoff wurde in 100 - 125 ml 0,1 m Trischlorid, pH-Wert 8,1 (Tris-Puffer), gelöst, wobei die Lösung kalt gehalten wurde. Die Festatoffanteile wurden aus den

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Flaschen entfernt, indem etwa 25 - 35 ml der Pufferlösung in eine Flasche eingefüllt wurden und die Lösung dann.von Flasche zu Flasche gespült wurde, um sie in einer einzigen Flasche. zu sammeln. Dies wurde mit dem verbliebenen Anteil der Pufferlösung wiederholt.

Die Lösung wurde in einen Dialysebeutel eingebracht; es wurde entweder mit Viscosedialyseschlauch (Größe Nr. 36) zur Bildung eines langgestreckten Beutels oder mit einem kürzeren Beutel (Größe Nr. 1 7/8) gearbeitet; der Beutel wurde vorausgehend mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und hydratisiert. Der Schlauch wurde zugebunden und die darin enthaltene Lösung wurde in einem kalten Raum unter magnetischer Rührung des Beutels in der nachstehenden Weise dialysiert:
'(a) Über Nacht gegen 18 Liter eines Dialysiermittels mit einem Gehalt von 0,01 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH-Wert8,1, 0,001 m Äthylendiamintetraacetat (EDTA) und 0,001 m ß-Mercaptoathanol, mit oder ohne 0,1 m Natriumchlorid;

(b) 3-4· Stunden gegen 18 Liter eines Dialysiermittels mit einem Gehalt von 0,01 m Tris-chlorid, pH-Wert 8,1, 0,001 m ß-Mercaptoäthanol und 0,Q5 m Magnesiumacetat;

(c) 3 - ^ Stunden gegen eine frische Lösung gemäß (b);

(d) Über Nacht gegen eine frische Lösung gemäß (b).

Nach der vorgenannten Dialysebehandlung wurde der Beutel mit destilliertem Wasser gewaschen und die Suspension wurde daraus entfernt. Die Suspension wurde eingefroren, um inerte Bestandteile zu koagulieren, die sonst in geklärten und einge-

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frorenen Lösungen erscheinen, und nach der Verfestigung wurde die. Suspension bei einer Temperatur von 10 - 15⁰O aufgetaut. Die Suspension wurde bei 5°C in sechs 50 ml Rohren etwa 20 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 20.000 U/min zentrifugiert. Es wurde eine klare dunkel orange gefärbte Enzymlösung (etwa 150 - 200 ml) erhalten, die im wesentlichen frei von Nucleinsäuren war; diese wurde in eingefrorener Form in Kolben aufgehoben, die vorausgehend mit Salpetersäure und destilliertem Wasser gewaschen worden waren.

Wenngleich die Ausfällung von Nucleinsäuren mit Magnesiumionen vorzugsweise durch Dialyse herbeigeführt wird, kann diese !fällung auch durch direkte Zugabe von Magnesiumionen zu der Enzymlösung vorgenommen werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung eignet sich auch für die Desaktivierung von Nucleasen in der aus den Zellen extrahierten Enzymlösung. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wird die Nucleasen enthaltende Enzymlösung nach Entfernung von Nucleinsäuren in einen Dialysebeutel eingebracht und es werden Quecksilber(II)ionen in den Beutel eindiffundiert, um die Nucleasen zu inaktivieren. Die überschüssigen Quecksilber(II)ionen werden durch Dialyse gegen eine geeignete Pufferlösung aus dem Beutel entfernt, wobei eine Enzymlösung anfällt, die praktisch keine Nucleaseaktivität zeigt.

Die Dialyse kann bei einer Temperatur durchgeführt werden, bei der keine Schädigung des gewünschten Enzyms eintritt, z.B. etwa 1 bis etwa 20⁰C, wobei ein breiter Eon-

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zentrationsbereich an Quecksilber(II)ionen in dem Dialysiermittel angewendet werden kann, ζ.B* von etwa 0,1 bis etwa 0,3 Millimol/1 (mM per liter). Die Dialyse wird bei einem pH-Wert durchgeführt, der nahe bei dem optimalen pH-Wert des gewünschten Enzyms liegt, und allgemein bei einem pH-Wert, der innerhalb von etwa zwei pH-Einheiten um den optimalen pH-Wert liegt, wobei der gewünschte pH-Wert durch Anwendung eines geeigneten Puffermittels aufrecht erhalten wird. Bei der Inaktivierung von Nucleasen in einer Enzymlösung, die Polynueleotidphosphorylase enthält, wird der pH-Wert allgemein zwischen etwa 6,0 und etwa 8,5 gehalten.

Es ist ersichtlich, daß eine Polynucleotidphosphorylase enthaltende Enzymlösung einer Reihe von Dialysebehandlungen unterworfen werden kann, um verschiedene Verunreinigungen zu entfernen, wobei das Dialysat zwischen den Dialysen gewaschen wird, um irgendwelche überschüssigen Ionen aus der vorhergehenden Dialyse zu entfernen. So kann beispielsweise eine aus M. lysodeikticus gewonnene EnzymXösung zunächst einer Dialyse gegen Magnesiumionen unterworfen werden, um Bibonucleinsäure und Desoxyribönucleinsäure zu entfernen, gefolgt von einer Dialyse gegen QuecksilberCII)ionen, um Nucleasen zu inaktivieren.

Die Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit Ausführungsbeispielen weiter veranschaulicht, sie ist aber nicht auf diese besonderen Durchführungsformen beschränkt.

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Beispiel 1 ■·

Dieses Beispiel Veranschaulicht die Entfernung von Nucleinsäuren aus einer Inzynilösung, Die Entfernung von .Nucleinsäuren wurde verfolgt durch das Verhältnis von Ultraviolett ab Sorptionsmessungen bei 280 mn und. 260 jap» Das 280/260-Verhältnis von reinen Nucleinsäuren beträgt 0,50 und von reinem Protein 1,70. Ein zwischen diesen Werten liegendes Verhältnis zeigt das Ausmaß der Säureentfernung an. .. . - ',/■■:■"■■■ -..,:. .. ^:~~-'y'~ '"'■■--

Eine Suspension von 160 g 15. lysodeikticus in 1600 ml 0,5 ^iger Natriumchloridlösung wurde mit ungepuffertem 0,5 m Tris(hydro3q7methyl)aminomethan auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die Suspension wurde auf 37⁰G erhitzt und 400 mg kristallines lysozym, gel|>st Un 16 ml Wasser, wurden in die Suspension eingerührt» Die X»ysis wurde bei 37°Q etwa 15 Minuten lang mit zeitweili^eja Rühren ablauf en gelassen. Die Lösung wurde Viskos und käsig (curdy).

Die Suspension wurde in ein Eiswasserbaä eingesetzt xuid es wurden 800 ml einer kalten gesättigtenJ&ösung von Ammoniumsulfat unter raschem Hühren zugegeben» Die kalte Suspension mit einer lemperatüi? von 10 «- 15°ö wurde 15 Minuten bei 20.000 IVmin zentrifugiert γ es wurde «ine klare gelbbraune Lösung (1650 - 1750 ml) gewonnen»Dhb 280/260- UltraviölettverhältniB bttrug etwa 0,90,

Die gewonnene Lösung wurd>| ®x£ 0 V^⁰Q abgekühlt und es wurden 21,7 S festes Ammoniumsulf*t^e 100 ml Lösung unter Rühytn zugesetzt,, um die Losung auf eine Sättigung von

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65 % zu bringen. Das Rühren wurde etwa 20 Hinuten fortgesetzt und die sich ergebende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren bei 20.000 U/min über 15 Minuten gewonnen.

Der Niederschlag wurde in so viel Tris-chlorid (Tris-Puffer), pH-Wert 8,1, gelöst, daß sich eine lösung ergab, die etwa 35 mg Protein je ml enthielt. Sie Lösung wurde bei 0 - 4⁰C gegen 0,01 m Tris, pH-Wert 8,1, mit einem Gehalt von 0,001 m ß-Mercaptoäthanol, 0,001 m ithylendiamintetraacetat und 0,1 m Natriumchlorid dialysiert, bis das Dialysat frei von Ammoniumsulfat war. Die Dialysemembran bestand aus Cellulose mit einer Dicke von etwa 0,02 mm (0,0008 inch).

Das Dialysiermittel wurde dann durch eine Lösung ersetzt, die 0,001 m Ithylendiamintetraacetat (EDIA) und 0,05 m Magnesiumacetat enthielt, und die Dialyse wurde zwei Stunden lang fortgesetzt. Die Dialyse wurde über weitere zwei Stunden mit frischer Lösung wiederholt, es ergab sich eine reichliche Fällung in dem Dialysebeutel. Nach öffnung des Beutels wurde eine klare überstehende Flüssigkeit von der Ausfällung durch Zentrifugieren abgetrennt.

Die überstehende Flüssigkeit hatte ein 280/260-Ultraviolettverhältnis von 1,30 und einen Proteingehalt von etwa 30 mg/1. Die Ausbeute an Polynucleotidphosphorylase betrug etwa 200 Einheiten je g getrockneter Zellen oder genug Enzym zur Bildung von 170 mg Polymer je g getrockneter Zellen bei einer 35 #igen Umwandlung von Nucleosiddiphosphat zu Polymer.

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- 11 Beispiel 2

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch zum Inaktivieren von Nucleasen angewendet werden.

Nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde eine Enzymlösung hergestellt und anschließend an die letzte Dialyse wurde der Inhalt des Dialysebeutels gegen eine Lösung dialysiert, die 0,05 m Magnesiumacetat und 0,002 m Quecksilber(II)acetat enthielt. Die Dialyse erfolgte über zwei Stunden bei O - 4°C und dann wurde das Dialysiermittel durch 0,01 Tris, pH-Wert 8,1, mit einem Gehalt von 0,002 m Quecksilber(II)acetat und 0,05 m Magnesiumacetat ersetzt und die Dialyse über weitere zwei Stunden durchgeführt. Dann wurde das Dialysiermittel durch 0,01 m Iris, pH-Wert 8,1, mit einem Gehalt von 0,05 m Magnesiumacetat, 0,001 m ß-Mercaptoäthanol und 0,001 m Äthylendiamintetraessigsäure (EDIA) ersetzt. Die Dialyse wurde zwei Stunden lang durchgeführt und dann noch zweimal über jeweils zwei Stunden mit frischer Lösung wiederholt. Nach öffnung des Dialysebeutels wurde die ausgefällte Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure durch Zentrifugieren abgetrennt. Die gewonnene überstehende Flüssigkeit hatte keine Nucleaseaktivltät und war praktisch frei von Nucleinsäuren.

Das Verfahren gemäß der Erfindung bedeutet eine wesentliche Verbesserung gegenüber den bisher bekannten Reinigungsmethoden. Die Behandlung ist wesentlich einfacher, z.B. erfordert die Reinigung von iPolynucleotidphosphorylase nur eine Fällung mit Ammoniumsulfat und eine Dialyse, im Vergleich

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zu der bisher angewendeten zeitraubenden und umständlichen Verarbeitung. Darüber hinaus wird die Ausbeute an Enzym aus • den Zellen wesentlich gesteigert, um. so hohe Beträge wie 500 - 700 %. Weiterhin ist das Verfahren sehr anpassungsfähig, indem es in einem breiten Temperaturbereich durchgeführt werden kann und sowohl die Entfernung von Verunreinigungen als auch eine Desaktivierung von im Einzelfall gewünschten besonderen Enzymen gestattet.

Die bevorzugte Arbeitsweise gemäß der Erfindung,

b bei der eine Dialyse für die Reinigung der Enzymlösung angewendet wird, h* insbesondere folgende Vorzüge: Wirksame Regelung der Temperatur über einen breiten Temperaturbereich über einen langen Zeitraum5 verbesserte Regelung der Reaktionsrate zwischen den zugeführten Ionen und den Enzymverunreinigungen durch Regelung der Diffusion der Ionen durch die Membran; leichte und schnelle Entfernung von überschüssigen Ionen aus der Enzymlösung durch Diffusion überschüssiger Ionen aus dem Inneren des Dialysebeutels in den Außenraum; geringstmögliche Handhabung der Enzymlösung mit entsprechender Verringerung der Möglichkeit eines Eindringens von atmosphärischen Verunreinigungen in die Lösung.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist vorstehend zur Veranschaulichung anhand bevorzugter Ausführungsforanen erläutert worden, es ist jedoch ersichtlich, daß nach Maßgabe des Einzelfalles entsprechende Änderungen oder Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen,

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung von Enzymlösungen, die Polynucleotidphosphorylase und als Verunreinigung Nueleinsäure, wie Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure oder Gemische davon, enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung mit einem Gehalt an Magnesiumionen in einer Konzentration zwischen etwa 0,01 und 0,1 Mol/l zu der Snzymlösung zusetzt, die Magnesiumionen mit den Nucleinsäuren unter Ausfällung umsetzt und den Niederschlag aus der Lösung zur Gewinnung einer von Nucleinsäuren im wesentlichen freien Enzymlösung abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Magnesiumionen der Lösung mittels Dialyse durch eine halbdurchlässige Membran zuführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zuführung der Magnesiumionen bei einer Temperatur zwischen etwa 0° und etwa 65°0 vornimmt,

4-, Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zuführung der läagnesiümionenjbei einem pH-Wert zwischen etwa 7fO und etwa 8,5 vornimmtl

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Enzymlösung mit einer Proteinkonzentration zwischen etwa 10 und etwa 40 mg/1 verwendet.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Enzymlösung verwendet, die außerdem ITuclease enthält, die von Nucleinsäuren befreite Enzymlösung gegen eine Lösung dialysiert, die Quecksilber(II)-ionen in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und etwa 0,3 Millimol/l (mM per liter) enthält, die Dialyse bei einer Temperatur zwischen etwa 1 und etwa 20 C und einem pH-Wert zwischen etwa 6,0 und etwa 8,5 durchführt, hierdurch mittels der Quecksilber(II)ionen die Huclease inaktiviert, überschüssige Quecksilber(II)ionen aus der Enzymlösung abtrennt und eine von Mucleaseaktivität im wesentlichen freie Enzymlösung gewinnt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine durch Extraktion von Micrococcus lysodeikticus erhaltene Enzymlösung verwendet.

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