DE1642597A1

DE1642597A1 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1642597A1
Application number: DE1968B0096571
Authority: DE
Inventors: Evans Gordon Homer
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1967-02-22
Filing date: 1968-02-09
Publication date: 1971-05-06
Also published as: GB1206466A; BE711141A; DE1642597B2; DE1642597C3; FR1554423A; NL6801846A

Description

PATEN FAN vVÄÜ E

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES D1PL.-CHEM. ALEK VON KREiSLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLOPSCH

KDLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 25. Mal I970 Kl/En

The British Petroleum Company Limited,. Britannic House, Moor Lane, London E.G.2 / England

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Brühe einejün Mikroorganismus, der auf wenigstens einigen geradkettigen Kohlenwasserstoffen zu wachsen vermag, in Gegenwart eines Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterials, das wenigstens teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kontinuierlich kultiviert, wobei der Kohlenwasserstoff in einer solchen Geschwindigkeit zugeführt wird, daß die Konzentration des Kohlenwasserstoffs in der Kulturbrühe weniger als 0,5 g/l beträgt.

Die Kultivierung wird vorzugsweise nach dem Anfahren ohne Zusatz oiLnes Mikroorganismus zur Brühe durchgeführt.

Das Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial enthält vorzugsweise wenigstens 90 Gew.~;ä$ Normalparaffine.

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Neue Unterlagen (Ai*7SlAt*2Nr.18«te3<to*Jto<l«runiwe*.v.4»9.1i

Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind im erfindungsgemäß verwendeten Einsatzmaterial gewöhnlich als Paraffine vorhanden. Sie können jedoch auch als Olefine anwesend sein. Ebenso können Gemische verwendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten.

Als Einsatzmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich n-Paraffinfraktionen, die durch Behandlung von Destillatfraktionen aus Erdöl, z.B. Leuchtpetroleum (Kerosin) oder Gasöl, mit Molekularsieben erhalten worden sind. Vorzugsweise wird eine Erdölfraktion verwendet, die ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht.

Unter den hier gebrauchten Ausdruck "Mikroorganismus" fallen auch Gemische von Mikroorganismen. Die gemäß der Erfindung kultivierten Mikroorganismen können Hefen, Pilze oder Bakterien sein.

Die in dieser Beschreibung genannten Bakterien sind nach dem Klassifizierungssystem eingestuft, das in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" von R.S. Breed, E.G.D. Murray und N.R. Smith, 7· Auflage, herausgegeben von Williams and Wilkins (Baltimore, USA, 1957)* beschrieben ist. Die Hefen sind nach dem Klassifizierungssystem eingestuft, das in "The Yeasts a Taxonomic Study" von Lodder und Kreger-van Rij, herausgegeben von North Holland Publishing Company (Amsterdam, 1952), beschrieben ist.

Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoideae. Gegebenenfalls können jedoch auch beispielsweise ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet werden. Die bevorzugten Gattungen der Unterfamilie Cryptocoocoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt), Candida

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und Mycoderma. Bevorzugte Hefestämme werden nachstehend genannt. Besonders bevorzugt wird die Verwendung der nachstehend zusammen mit den Hinterlegungsnummern genannten Stämme. Die mit CBS gekennzeichneten Stämme sind beim Centraal Bureau voor Schimmelcultureε, Baarn, Holland, die mit CMI gekennzeichneten Stämme beim Commonwealth Myeological Institute, Kew, England, und die NCYC gekennzeichneten Stämme bei der National Collection of Yeast Cultures, Nutfield^ England, hinterlegt.

Spezies

Bevorzugter Stamm

Candida	'brumptii	guilliermondii	magnoliae	CBS CMI NCYC	Nr. Nr. Nr.	2078; Nr. 599 937^3 376; Nr. 153
Il	catenulata	Rhodotorula glutinis
Il	clausenii	Torulopsis famata		CMI	Nr.	83350. NCYC N
ti	humicola	Il
Il	intermedia
It	crusei
ti	lipolytica		NCYC	Nr.	4
Il	melibiosi	CMI	Nr.	233I
It	parapsilosis
Il	pulcherrima
Il	rugosa
It	stellatoidea	CBS	Nr.	2084j Nr₀ 203
It	tropicalis
3t	utilis
ti	blankii
Bebaryomyces kloeckeri
Hansenula anomala
Piohia

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Von den vorstehend genannten Stämmen werden Candida lipolytica und C.tropicalis besonders bevorzugt.

Als Mikroorganismen können auch Pilze kultiviert werden» Geeignet sind Pilse der Familie Moniliaceae. Geeignet sind Pilze der Gattung Penicillium. Vorzugsweise wird Penieillium expansura verwendet. Eine weitere geeignete Gattung ist Aspergillus.

Gegebenenfalls können als Mikroorganismen auch Bakterien gezüchtet werden. Die Bakterien gehören zweckmäßig zu den Ordnungen Pseudomonodales, Eubacteriales und Actinomycetales. Vorzugsweise werden Bakterien der Familien Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actinomycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae verwendet. Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Stämme sind:

Achromobacter sp. Nocardia minima Brevibacterium sp. " opaca

Corynebacterium sp. " polychromogenes

Flavobacterium sp. " rubra

Micrococcus sp. " rubropertincta

Pseudomonas sp. Streptomyces grlseolus •Macobaoterium smegmatis " rimosus

¹¹ sp. " sp.

Nocardia erythropolis

Für das Wachstum des Mikroorganismus sind außer dem Einsatzmaterial ein wäßriges Näbrmeüium und Sauerstoff, vorzugsweise in Form von Luft* erforderliche

Bevorzugte Verfahren, die bei der Kultivierung der Mikroorganismen und bei der Gewinnung des Produkts angewendet werden können* Bind in den britischen Patentschriften 914,567, 914.568,

1 0 9 8 1 9 / 1 I₁ B 0

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1.017.584 und I.OI7.585, in den französischen Patentanmeldungen 924.254 und 925.327 sowie in den folgenden deutschen Patentanmeldungen beschrieben:

B 74„851 IVd/23b B 85.075 IVa/6a

B 79.323 IVa/6b B 87.713 IVa/6a

B 85.071 IVa/6a B 89.462 IVd/23b

B 85.072 IVd/23b B 91.002 IVd/23b

B 85.073 IVb/23b B 9I.OO3 IVd/23b

B 85.074 IVa/6a B 91.093 IVd/23b

Die Erfindung wird durch die folgenden Versuche und Beispiele weiter erläutert. Die Versuche wurden nicht in der erfindungsgemäßen; Arbeitsweise durchgeführt und dienen nur zum Vergleich.

Versuch 1

120 1 eines wäßrigen mineralischen Mediums der nachstehenden Zusammensetzung wurden in einen mit Rührer versehenen 200 1-Permenter gegeben:

(NH₄)HPO₄ 2 g

KCl 1,15 g

MgSO₄·7Η₂0 0,65 g

ZnSO₄*7H₂O 0,31 g

.MnSO₄ ο4H₂O 0,068 g

PeSO₄·7Η₂0 0,125 g Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 g.

In den Fermenter wurden 250 Teile/Million Hefeextrakt, dann 50 g Candida lipolytica in Form einer wäßrigen Creme, die 20 Gew.-% Trockensubstanz enthielt, und dann 3 1 eines Gemisches von η-Paraffinen mit 14 bis 17 C-Atomen im Molekül gegeben. Nachdem die Kultur die für kontinuierlichen Betrieb erwünschte Konzentration von Hefezellen erreicht hatte, wurde mit der kontinuierlichen Zufuhr des wäßrigen mineralischen Me-

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diums und der η-Paraffine begonnen. Die Temperatur wurde bei 30⁰C und der pH-Wert des Mediums durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak bei 5*5 gehalten. Die zugeführten Mengen wurden so eingestellt, daß eine Verdünnungsrate der Brühe von 0,1 und ein n-ParaffinÜberschuß in der Brühe von 5*2 g/l aufrechterhalten wurden. Hierzu mußten zugeführt v/erden: wäßriges Nährmedium 12 l/Stunde Kohlenwasserstoffgeraisch 325 ml/Stunde

Unter kräftigem Rühren wurde Luft in einer Menge von 0,5 V/V/Minute in die Brühe eingeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle nach den Beispielen angegeben.

Versuch 2

Die unter Versuch 1 genannten Bedingungen wurden wie folgt geändert? Ein Permenter mit einem effektiven Fassungsvermögen von 2000 1 wurde verwendet. Die Menge des Impfmaterials wurde proportional erhöht. Die n-Paraffine wurden in einer Menge von 5*2 l/Stunde zugeführt, wodurch der Kohlenwasserstoff Überschuß im Fermenter 10,6 g/l betrug.

Beispiel 1

Die unter Versuch 1 genannten Bedingungen wurden wie folgt verändert: Die Zufuhr der η-Paraffine wurde auf 200 ml/Stunde begrenzt, wodurch der n-ParaffinÜberschuß in der im Fermenter enthaltenen Brühe nur 0,35 g/l betrug. Alle übrigen Bedingungen waren unverändert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Beispiel 2

Die unter Versuch 1 genannten Bedingungen vmrden wie folgt verändert: Die Zufuhr der n-Paraffine wurde auf 20 l/Stunde begrenzt, wodurch der n-ParaffinÜberschuß in der im Fermenter

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enthaltenen Brühe 0,49 g/l betrug. Alle übrigen Bedingungen
waren unverändert.

	n-Paraffin- überschuß in der Brühe, g/l	Ausbeute faktor	Kohlenwasser stoffausnut" sung
Versuch 1	5,2 ·	0,95	0,74
Versuch 2	10,6	0,86	0,75
Beispiel 1	0,35	1,05	0,98
Beispiel 2	0,49	0,95	0,98

Der Ausbeutefaktor wird definiert als das Verhältnis des Gewichts der erhaltenen Trocicenhefe zum Gewicht des Kohlenwasserstoffeinsatzes in der Zeiteinheit, so daß ein höherer Ausbeutefaktor wirtschaftlich vorteilhaft ist» Die Kohlenwasserstoff ausnutzung gibt den Anteil des zugeführten Kohlenwasserstoffs an, der vom Mikroorganismus verbraucht wird und sonit nicht verlorengeht.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, die auf
wenigstens einigen geradkettigen Kohlenwasserstoffen zu
wachsen vermögen, in Gegenwart eines Kohlenwasserstoff-Einsatzinaterials, das wenigstens teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und in Gegenwart eines
wäßrigen Nährmediums sowie.eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivie:?ung in kontinuierlicher Verfahrensführung unter Zuführung der Kohlenwasserstoffverbindungen in solcher Geschwindigkeit
durchgeführt wird, daß die Konzentration der Kohlenwasserstoffe in der Kulturbrühe weniger als 0,5 g/l beträgt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein wenigstens 90 Gew.-% η-Paraffine enthaltendes Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial zugeführt wird, wobei dieses Einsatzmaterial vorzugsweise eine n-Paraffinfraktion ist, die durch Molekularsiebbehandlung einer Erdöldestillationsfraktion erhalten worden ist.

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenwasserstoffeinsatzmaterial eine Erdölfraktion verwendet wird, deren mittleres Molekulargewicht wenigstens 10 C-Atomen pro Molekül entspricht.

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3# dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Hefe, vorzugsweise der Familie
Cryptococcaceae, insbesondere der Unterfamilie Cryptococcoideae, eingesetzt wird, wobei die Gattungen Torulopsis oder Candida, insbesondere Candida lipolytica oder Candida tropicalis, bevorzugt sind.

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Bakterien eingesetzt werden.

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