DE1620645A1 - Verfahren zur in-vitro-Synthese biologisch aktiver intakter Nucleinsaeure und Herstellung von Replicasen,die hierfuer geeignet sind - Google Patents

Description

Der- hier verwendete Ausdruck "biologisch aktiv" umfasst die Grundlage für die unten beschriebene'Prüfmethode, die Herstellung von-infektiösen Virus-RNS und im allgemeinen Stoffe, die genetisch ausreichende Merkmale oder Informationen besitzen, die wesentlich für orga-

nisches Leben oder Lebensprozess'e sind. Diese biologisch -aktiven Stoffe sind genetisch, -hinreichend geeignet und können Informationen an ein System übermitteln, das ihren Instruktione-n folgt und "diese in biologischem Sinne

Der%i;er vervitenöefee ^;ftifsSt*Tie1c" ''i^ägen" bezieiit -sieh -auf Bafctieiriopiiagen.

-•-Lebende,

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Lebende Organismen, einschliesslich Menschen, Tiere, Pflanzen und Mikrο-Organismen, benutzen biologisch aktive Nucleinsäuren bei den Prozessen der Speicherung und Übertragung übertragungsfähiger genetischer oder erblicher Informationen oder Bötschäften und für die Synthese einer grossen Anzahl von Gewebe- und Körperproteinen. Zwei Nucleinsäuren, die unter geeigneten Bedingungen als Überträger des genetischen Codes dienen können, sind DNS (DesoxyribonucleiHsäure) und RNS (Ribonucleinsäure). Im ^Mtoetfäeii^Organi?smus Isinä töieee Nucleinsäuren im a 11-.gemeinen -unter ^Siidüng -v©n"Iferclieoproteinen mit Proteinen lcombiniiert. '"" "

Dfe^se >!DilS^ün'd^: WiS^MoSeMlIe >besteheii aus vergieieiisweise •eiafäeh: ^zu^ammengesfetzten -NiiolieotiMen - (Stiekstoffbase, -FeritOseieinheit und IPhjas^h^isgruppen),, welche zu Ketten^: ^polymerisiert ^stod, ^Me ^liUfiderte bis tausende dieser ^Nuiσl·e·Q^tiMeiiÄ©ίten-eϊItlial#έ!n, '-lÄielehe -im el !gemeinen ^;- idüt-eh -eitemisöHe SiÄungeai fiilifeeiöanldet· verbunden sind,, ■ Me *zwf sefeeii üeir ^AoispiSaife- ^!Äid ^äer 2u;elcergrup;pe bestehen.

als

öd^;er ly^pitftiidine, 9&E e Weäüä&e if st -?e»twedier Ribbs^;e ril)-ds%.-^Jfeös^pfeöi»

Se i 'VölliköinmeHer^! liyapölyse 'fergeben idie ^ DNS und

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Adenin (A) Adenin (A)

Cytosin CC) . Cytosin (C)

Guanin ;\*) ; : , Guanin. (G) - V .

Thjrniin 'T) ^: -;■ ■ . Uracil (U)

Methylc;^ct,Gsin . . - : ; .

Hydroxy r;.e thylcytosln

DesoxyriGose Ribose

Phosphorsäure Phosphorsäure ·

Es ist zu beachten, dass die Basen-Adenin (A), Cytosin (C) und uuanir« (G) sowohl den DNS als auch den RNS zukommen. In den RKS ist die Base Thymin (T) der DfIS vollkommen ersetzt durch die Base Uracil (U) * MethyIcytosin kommt in kleinen Kengen in verschiedenen Desoxyribonucleinsäuren tierischen Ursprungs vor sowie in Weizenkeimen., In den DNS verschiedener Bakteriophagen ist Cytosin vollständig

durch. Hydroniyethylcytosin ersetzt~.

Die Hydrolyse dieser Nucleinsäuren unter geeigneten Bedingungen setzt eine Gruppe von Verbindungen frei, die als Nucleotide bekannt sind. Diese Nucleotide bestehen aus einen; Purin oder Pyrimidinbasen, die an Pentoseeinheiten gebunden-sind, wobei die Zuckereinheit durch Phosphorsäure verestert ist. Diese" Nucleotide, bilden die Untereinheiten, aus denen sich die polymerenNuclein-

" "^ ■ - ""■■".-".■ '■■■■" säuren zusanaaensetzen.

Die Ribonucleinsäure-Polynucleotidstruktur kann in Diagrammforin beispielsweise wie folgt dargestellt werden:

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A	Pentose s ^	Phosphat
C	Pentose *> ~ ' "	Phosphat
G	^ <* + Pentose ^- <	Phosphat
T	Pentose ^. -· ~"	Phosphat

Die obigen unterbrochenen Linien stellen Estergruppierungen zwischen einer der freien Hydroxylgruppen der Pentose und deT Phosphatgruppen dar« Der Index η bedeutet die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten, die das spezielle Ribonucleinsäuremolekül bilden.

Neuere chemische Forschungen haben gezeigt, dass das DNS-Molekül eine Doppelstrang-Kette aufweist, die, wenn sie dreidimensional aufgezeichnet wird, zwei Ketten besitzt, die zu einer doppelten Helix gewunden sind. Jede Kette besteht aus alternierenden Nucleotiden, wobei zehn Nucleotide in ^eder Kette pro Windung der Helix vorliegen und wobei diese aus zehn Nucleotiden bestehende Kette eine Länge von etwa y\ 8 besitzt. Beide Ketten sind rechtsläufige Helices; Diese Helices werden offensichtlich zusammengehalten durch Wasserstoffbindungen, die zwischen den Wasserstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffatomen der betreffenden Ketten ausgebildet sind. Die Struktur des DNS-Moleküls, wie sie sich ergibt auf Grund der Basensequenzen in dem Molekül, wird z.Z.aufgeklärt* Diese Strukturuntersuchungen sind insofern wichtig, als im allgemeinen angenommen wird, dass die Basensequenz

909887/1691 . _der

BAD ORIGINAL

Ööde ist,-, mit dessenJHiire das MS-MoIeMl s ¹ infopffiafeion welieilölte-fe feziWi überträgt*

Öhemiker haben nunmehr aufgezeigt*, dass die HIiS im. . allgemeine^ eine, Struktur mit -einem einzelnen Strang ist, der in seiner Grundkefcte den aus 5 Kohlenstoffatomen '■, übsteilenden; Zücker Rifeose anstelle deä Äudkers Desoxjr- . i*ilsöse aufweist., der sidh-in dea* DNS finde^ Wie in den BHS sind die v;ersahiedenen Üücleotide durch die Phosphat* gruppea miteinander verbürideri unter Bildung einer langen Kette und bilden so ein RES^Moiekül von hdhem Mölekülargewichfe* Die RHS-Moleküle Scheinen nicht so hoch polymerisiert zu sein wie die DNS^Mölekülei und ©bviohl An* zeichen dafür existiereni dass Was.ser'stoffbindungeh-z sche'n den RfiS-Basen in einigen Viren vorliögehi Mrd angenommen^ dass hier keine Heiix-Strukfeür vorliegt*' Bezüglic'h den DNS sind ^orschuhgen über die Säs'ehse^' im Ganges \ ^ ' "* '"

in dgn.G&herLi den Speichernder irbfäktoreh lebender , 2ellih und Vir^h^ besteheil=&1ά speziellen- getietisßhiii: „ informationen in den Nucle^tidsequgh^hi diä .i$ Mn DNif und ,RiiS^Möiekülen erscheinehi Diese Sequen^eh; worden. . überi^ägetti verschlüsselt' und _;in vivB durch Ifebendi ,":. ■ · Qj?gan,ismen reproduziert* Wenn ke^ihe Mpdifikatiöh der , , _: öder· RM; stattfindet>. wird ein gönaueijS, plipiikatj-.. eine genaue Wijedörgabe der·, S&qMöh^ iaht wi#d&r;Ufti ein· gentueS; ßupiikat öder ie

Wiedergabe eines speziellen Proteinmoleküls produziert* Wenn jedoch in den DNS- oder RNS-Molekülen eine Veränderung stattfindet> die durch bestimmte Einwirkungen.,, wie z«B, Bestrahlung,- einen fremden chemischen Reaktions-* teilnehmer usw.j hervorgerufen werden kann, findet eine Mutation statt, wobei die veränderten. DNS- oder RNS-MölekÜie die "neue" DNS- oder RNS verdoppeln oder vervielfältigen, und diese wiederum produziert »cue oder P veränderte Proteine, wie das von der veränderten Nucleotidstruktur vorgeschrieben wird. .■■ ;

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren und' Systeme, die geeignet sind, für die in-vitro*Synthese von biologisch aktiven Nucleinsäuren, die Herstellung einer gereinigten Enzymkomponente dieser Systeme sowie der gebildeten gereinigten Enzymkomponenten, welche frei von nachweisbaren Mengen abbauender Enzyme und Enzyminhibitoren öindjsowie die dadurch hergestellten biologisch aktiven W Nucleinsäuren«

Die vorliegende Erfindung schlägt insbesondere ein Verfahren zur in-vitro^Synthese biologisch aktiver intakter NüGleinsäure vor, das dadurch gekenrizelöhnet ist, dass ein aktiviertes System gesehaffen wird, -welches imstande ist, biologisch aktive Nucleinsäure für längere oder ausgedehnte Zeiträume zu synthetisieren,- wobei dieses System biologisch aktive Nucleinsäure, die spezifische Repliöäse für diese Nucleinsäure, '"welche frei^: ist von

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. ' nachweis-

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nachweisbaren zersetzenden Verunreinigungen, undeine NucleOtidbasen-Komponente oder -Komponenten umfasst, und wobei die synthetisierte Nucleinsäure aus dem System gewonnen wird., ' .. ;

Gemäss einer "'weiteren, Ausführungsform der Erfindung ist das beim erfindungsgemässen Verfahren verv/endete aktivierte System im -wesentlichen' frei von nachweisbaren Mengenanteilen ah Virus-Infektionsfähigkeit, um eine erhöhte Vervielfältigungsaktivität sicherzustellen*

Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es möglich, beispielsweise ein Ribonucleinsäuremo.lekül (BNS)kontinuierlich über ausgedehnte Zeiträume, v^eiches identisch ist mit der intakten "Schablone" (die Schablone ist das Modell für die Vervie If alt igung)., zu synthetisieren, bis oder vienn nicht eine willkürliche oder gezielte Unterbrechung der Synthese stattfindet. Diese Selbstvervielfältigung umfasst die tatsächliche und vollkommene übertragung bzw. Übersetzung von der intakten ■ Schablone auf die liueleotide, wobei die-Nucleotide strukturelii in der gleichen Sequenz'zusammengesetzt sind, die die intakte: Schablone kennzeichnet. Das intakte synthetisierte Produkt kann entweder selektiv markiert

- ■ "'S ■■'.'■'. -..■■■-■"■ - - ■■'■'■'.■:" (z.B. radioaktiv) oder nicht markiert werden und in

einer Form,-die frei von nachweisbaren Verunreinigungen

zusammen oder anderen Stoffen ist, mit denen/es sieh sonst In

der Natur f indet.

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Insbe-

-■■' 'BAD ORIGINAL

Insbesondere liefert das kontrollierte System der Erfindung zur Synthese von intakter biologisch aktiver Nucleinsäure in einem enzymatischen in-vitro-System aus Nucleotidbasen biologisch aktive Nucleinsäure, und zwar unter Verwendung einer ausgewählten intakten 'biologisch, aktiven Nucleinsäuren die frei von nachweisbaren Mengen von zerstörenden Stoffen ist, als Schablone (z.B. als Zuführungsschabrone). Wenn das System biologisch aktive Vervielfältigungen (identische Kopien des gleichen Molekulargewichts.) der Nuclelnsäureschablone produziert, soll sich das Verfahren auf ein solches unter Einschluss dieser Vervielfältigung beziehen. Der Enzymkatalysator soll eine Polymerase oder Repliease sein; wenn der Enzymkatalysator eine RIiS-abhängige RNS-PoIyraerase ist, dann ist diese eine Replicase,

Das Verfahren be zw.- System der Erfindung ist insbesondere gut geeignet zur in-vitro-Synthese biologisch aktiver Ribönucleinsäure (RNS) aus Ribonucleotidbasen- . ■ Komponenten (Substrate) mit hoher Bindungsenergie unter Verwendung, einer intakten homologen (enthaltend die Information für ihre spezielle Replicase) biologisch aktiven RKS-Schablone," einer homologen Replicase, welche das Strukturprogramm oder die Botschaft der Schablone selektiv erkennt, xxZzxs. katalytische Wirksamkeit zur Synthese biologisch aktiver RNS aus Ribonucleotiden besitzt und vollständig frei ist von"nachweisbaren"Mengen

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an

BAD QRIG'NAI

an Ribonucleaseaktivitat .und nachweisbaren Mengen andere*¹ aeräetzenöer enzyfflatischer Aktivitäten^ sowie; ;-unter· Verwendung eines Cofaktors, der Zweiwertige ionen liefert, die bei dem Vervielfaitigungss/stem ■ nicht verbraucht werden..

Die spezielle "Übersetzung" des Programmes der, Schabione . durch die Eeplicase hängt von Faktöfsn ab, die naöft* stehend erörtert werden«

Die Replicase für die' Vlrus-RMS wird erhalten-entweder" durch Einführung einer ausgewählten Virus-Hueleinsäure (ζ.B* Bakteriophagen)j die frei,ist von allen VGrIIe^ •genden proteinartigen Schutzüberzügenj in eine nicht *- infizierte Gastbaktefienzelie> um ein Enzym zu* synthe-'tisiereni von dem angenommen wird> dass es;nicht vorher in der Gastzelle vorhanden'war> oder vorzugswet§e düröh Einführung eines intakten Bakteriophagen (VirusSeilöhen) in die.Bäkterienzelle, um dieses Enzym zu synthetisieren»

Die eingeführte oder eingedrungene RMS besitzfe ein ' " Struktürprogrammi das eine Bo;tschaft definie^ti' Sie in das Enzymprotein übersetzt und Während dieser Über¹-* setzung konserviert wird. Öieses Inzyräj eine

veränderten Zellen isoliert und" dann gereinigte Entfernung naöhweisbärei* Mengen des g

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tenden.Ribonucleaseaktivität und anderer zersetzenden und störenden Enzymaktivitätenj die sich in der Bakterienzelle finden« ■ ..

Das erhaltene teilweise gereinigte Enzym Replicase erkennt scharf unterscheidend das intakte homologe RNS-Genorn seines Ursprungs und benötigt dieses als Schablone für die normale synthetische Vervielfältigung* Die gereinigte Replicase zeigt also eine einmalige und beson- ^ dere Abhängigkeit gegenüber und Bevorzugung tüte seiner homologenViren-RNS., indem es eine polymerisierende Aktivität (Synthese und/oder Vervielfältigung) für Viren-

RNS aufweist. Die. Repliease zeigt die einmalige und wertvolle Fähigkeit zur Lieferung der Vervielfältigung von . nur intakten" Virus-RNS- und liefert- keine Vervielfältigung von.Fragmenten oder fremden Sequenzen- oder unvollständigen Kopien seines eigenen Genoms. Der Ausdruck "Genom" bezieht sich auf die gesamte Genausstattung in einer Zelle. Die Gene bilden einen Speicher gene.tischer ™ ' Information für lebende Zellen und Viren»

Die Nucleotidbasen oder Substratkomponenten für die

en

Virus-RNS-Vervielfältigung soll/eine genügend hohe Bindungsenergie für die Vervielfältigung aufweisen» Eine befriedigende Vervielfältigung von Virus-RNS ist erzielt worden bei vier Ribösidtriphosphaten, nämlich Adenosinferiphpsphat (Αϊ?)-, Guanosintriphosphat; (QT?) Cyti- -

und Uridiritriphosphat (ÜTP),

' -■ ' Bei SAD ORiGiNAL

Bei der Vervielfältigung, von,infekfeiöseri Virus-RNS in · vitro, vierden zwei verschiedene RKS-Replicasen in- einem Stamm an- Eseherlchla coli induziert., und.zwar durch zwei serologisch unterschiedliche RNS-Bakteriophagen"". (KS.-2. ■undQß), und gereinigt* Die Ensyß:proteinpräparate,. die nachsteiiend im einzelnen, beschrieber, werden,.' waren frei von nachweisbaren Mengen störender RKS-ase (Hibonuclease), Fhqsphorylase und DNS-abhängiger.RMS-Polyperase (Trans- <irl-ptase). Diese isolierten Enzyme (Replleasen) zeigten sov/ohl ein obligatorisches Bedürfnis für die Schabionen-RNS und die Fählgiceit^. eine lang anhaltende und ausgedehnte .Gesamtsynthese von Polyribonucieotid (HiS)- zu bewerkstelligen. Die beiden Repllessen zeigten eine einmalige Suharf unterscheidende Äusviahlfähigkeit bezüglich ihrem Ansprechen auf zugesetzte RNS,_; ^TJhter'sonst optimalen Bedingungen-waren beide Replicäsen tatsächlich inaktiv bei heterologen RNS elnschliessllch Ribosorftennd s-RNS des Gastes.-, Keine, der:beiden Eeplieaseri arbeitete, wenn die RNS der anderen als Schablone verwendet ;. ™ vnirde. Jede Repllcase ericannfee nur das RKS-GenGir. seines Ursprungs und benötigte es ausschllesslich als Schablone für ihre synthetische Aktivität. '.. - --■;■'-,

Es liegen Hinweise^vor, dass die Repllcase die spezielle -Sequenz von Nucleotiden zu Beginn und anrSnde der biologisch aktiven VIrus-RNS-Schablone iin Verlauf. der Yervielfältigung erkennt/ Aus älesea Erkennungsmuster

903887/1Β9Ί ist

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ist abzuleiten, dass der -'dazwischenliegende Teil der/ RNS-Schablone nicht wesentlich ist für die Richtung oder die Instruktion, die in dem vorliegend erörterten Mechanismus bei der Vervielfältigung gefunden wurde. Diese Tatsache legt nahe, dass die yervielfäl.tigungssequenz von Nucleotiden, die zu Anfang und am Ende eines biologisch aktiven RNS-Schablonen-Moleküls vorliegt, selektiv an sonst nicht biologisch aktive oder nicht-Viren-RNS gebunden sein kann, um ein synthetisches biologisch aktives RNS-Produkt herzustellen. Es 'wird.angenommen, dass die RNS einen Kreisbildet und dass' diese zwei Erkennungssequenzen des Moleküls-einander überlappen unter Bildung von Dappelstrang-Bereichen;, derartige überlappte Bereiche können daher eine. Identifizierung des RNS-Moleküls in einem einzigen schnellen Abtastvorgang liefern. _; .. .

Die RNS-Schablone eines in vitro-Vervierfältigungssystems kann in" situ gebildet werden. Werin-man z.B. fremde Basen _: "oder Nucleotide (z.B. Analoge von'bekannten Basen oder Nucleotiden) in "das· vorliegende Vervielfäitigungssystem einführen würde,' körinte eine Mutänte gebildet werden, die die biologisch gebildete Schablone für die Vervielfältigung mit den "gleichen*"Basen" öder Nucieotiden'sein· würde; in diesen' '"fällen'"'Würde man in vitro Mutanten in bekannter ^:We£sei^; synthetisieren. Demerits'prechend ist darauf hinzuweisen, 'daä-s'die hier' beschriebene' In^vitro-

e9J ^{: ; :} Synthese

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Synthese von biologisch aktiver intakter Nuoleinsäure die Verwendung und/oder die Synthese einer mutanten RNS einschliesst.

Vom praktischen Standpunkt aus gesehen erlaubt die Ver-. fügbarkeit von relativ reiner Replicase gemäss der Erfindung den Zugang zu Forschungsgebieten, die bisher noch nicht zugänglich waren. So kann man nunmehr die Wirkung kleiner oder grosser Veränderungen in dem Repli- ' case-Molekül auf seine Fähigkeit zur Synthese von RNS*und die Veränderung der biologischen Aktivität der so hergestellten JiNS durch die veränderte Heplicase bestimmen.

Da sie ein Protein ist und deshalb aus einer Reihe von '.. [ ■ Aminosäuren besteht, lässt sich nunmehr die Struktur der Replicase untersuchen,und die Beziehung ihrer Struktur zur "Struktur der produzierten RNS kann wichtige Informationen geben bezüglich einer vis-a-vis Struktur- ' aktivität-BeZiehung. Da die Replicase ein grosses Mole- ,· kül ist undverschiedenen Graden der Hydrolyse durch - : · chemische oder enzymatisohe Massnahmen unterworfen ist, ™ wird es von Interesse sein, die Wirkung einer solchen ■Hydrolyse, oia sie nun verhältnismässig klein oder grosser ist, auf die biologische Aktivität des zurückbleibenden Moleküls zu bestimmen. Ausserdemkann das Proteinmolekül verschiedenen Graden: chemischer Veränderung unterworfen werden, wie z.B. der Acetylierung seiner ümsetzungsfähigen Amino* oder Hydroxylgruppen»der Halo-

909887/1691 . genierung

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genierung,Nitrierung oder Sulfonierung; die Umsetzung mit Salpetersäure wird die freien Aminogruppen des Proteins in Hydroxylgruppen umwandeln, wiederum unter gewisser Veränderung hinsichtlich der Aktivität.

Die intakte Virus-RNS, die als Initiator-Schablone beim Verfahren der Erfindung verwendet wird, wurde aus einem gereinigten Virus isoliert. Sie wurde erhalten durch Enteiweissung der RNS mit Phenol und Reinigung der RNS mittels eines Sucrose-Gradienten. Sie wurde nicht ■ erhalten aus den virus-infizierten Bakterien, jedoch aus den kompletten Virus-Teliehen (MS-2 und Qß).

Die Replicasen wurden erhalten durch Einführung von Virus-RNS in einen isolierten mutanten Hfr-Stamm von E. coli (Q-I3). Das Molekulargewicht der Qß-Repliease. betrug 1^0.000. ; .>,- i, ,.· =

Die Schablone wurde beispielsweise in vitro mit einem

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Paktor von 10 reproduziert. Das bedeutet für jedes

^ Molekül der intakten Schablone, die erfindungsgemäss

synthetisiert wurde, 10 Vervielfältigungen. Weiterhin wurden 5 Mikrogramm (z.B. 3 x 10 Stränge) von synthetisierter Viren-RNS in jeweils 20 Minuten pro 0,25 ml des Umsetzungsgemisches hergestellt.

Es wurden Prüfversuche mit den Replicasen durchgeführt, die die folgenden Hauptmerkmale der Polymerase-Reaktion ergaben: (1) Die Replioasen können nicht in geeigneter 909887/1691 Weise

BAD ORIGiNAt.

Weise ärbef ten mit '.'Fragmenten von homologen RNSj die Replicase kann "daher weder'fremde"Sequenzen noch unvollständige Kopien ihres eigenen Genoms vervielfaltigen; (2). die Replicaseenzyme erzeugen Polynucleotide von dem gleichen Molekülargewicht wie die Schablonen-Virus-RNS; - (>)■ Reaktionen, die mit der Schablone bei Konzentrationen unterhalb der Sättigung der Replieaseenzyme eingeleitet wurden^ zeigen eine autokatalytische Synthese von RfJSj (4) das gereinigte Replicase-Enzymprodukt kann als Schablone dienen mit der gleichen Wirksamkeit wie diejenige von Virus-RNSι (5) die durch das Enzym Replicase produzierteRNS-sind biologisch aktiv, wie anhand von Infektibnsfähigkeitsprüfungen gezeigt wurdej (6) die hergestellte RNS war genauso vollständig wirksam (wie sich anhand der Ausbeute und des Grades der Infektionsfähigkeit ergab) wie die ursprüngliche RNS bei der Programmierung der Synthese von vollständigen Virusteilchen.

Die erhaltenen Werte zeigten, dass die SelbstVermehrung ^: vollständiger Virusgenome in einem wässrigen System eintrat, das sich >aus einem Puffer; gereinigter Replicase, intakter RNS-Schablone, Nucleotiden und Magnesiumionen zusammensetzte. Die im vorliegenden Falle zur Verfügung stehenden Hinweise^eigen, dass jeder der verschiedenen oben erwähnten Bestandteile in dem Reaktionsgemisch vorliegen muss, um den Vervielfältigungszyklus zu vervollständigen.

.~;7V;._ 909887/1891 ^Die

BAD

Die Isolierung und Reinigung einer RNS-abhängigen RNS-Polymerase (Replicase) aus E. coli, die mit dem RNS-Bakteriophagen MS-2 infiziert worden waren, liefert ein gereinigtes Enzym, das ein obligates Bedürfnis für zugesetzte RNS zeigt und weiterhin eine einmalige Bevorzugung seiner homologen RNS erkennen lässt. Ribosome- und s-RNS des Gastes bilden keinen Ersatz als Schablone, und keine dieser cellularen RNS-Typen ^ zeigt irgend eine Fähigkeit, die Schablonenfunktion der Virus-RNS zu stören.

Die Fähigkeit der Replicase, scharf zu unterscheiden, löst ein Hauptproblem für ein RNS-Virus, idas versucht, seine eigene Duplikation in einer Umgebung, die mit anderen RNS-Molekülen überfüllt ist, auszurichten. Durch Herstellung einer Polymerase, die die Masse der vorher vorliegenden cellularen RNS ignoriert. Wird eine Garantie dafür geschaffen, dass die Vervielfälti- W gung auf den einzelnen Strang der neu eintretenden ^! Virus-RNS, dem letztlichen Fortpflanzungsursprung, brennpunktartig vereinigt wird.

Die Sequenzerkennung durch das Enzym kann nicht nur für da.s Virus von Wert sein, sondern auch für die vorliegende Erfindung. Die Suche nach Virus-RNS-Replicasen muss notwendigerweise aus einer Reihe von hochaktiven cellularen.Polymerasen erfolgen, die imstande sind, Polyribonucleotide; zu synthetisieren. Wenn das sohliesslloh isolierte Enzym das geeignete Bedürfnis

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= ■■"·■"■·>-'viAS _BAD -original' hinsieht-

: ■·:■■ 1120641

hinsichtlich derSchablone besitzt, dann ist die ausreichende Sicherheit gegebenj, dass der erfolgte Aufwand und die erhaltene Information tatsächlich anwendbar sind für ein Verständnis der Virus-Vervielfältigung. Arbeitsmässig erfordert dieser Gesichtspunkt, dass bei ,der Nachprüfung hinsichtlich der Polymeraseaktlvität Virus-RNS zu verwenden sind bei sämtlichen Fraktionierungs-Sohritten, -

Diese Zusammenhänge lassen erwarten, dass RNS-Replieasen, die durch andere RNS-Viren induziert worden sind, eine ähnliche Bevorzugung für ihre homologen Schablonen zeigen. Eine ,Möglichkeit, die Sicherheit dieser Vorhersage zu prüfen, ergab sich bei der Isolierung eines neuartigen und nicht verwandten RNS-Bakteriophagen (Qß) im Laboratorium von Professor X» Watanabe (Nihon Rinsho, 22_f 24? (1964)). Eine Abandoning des Verfahrens, das zur Isolierung der MS-2-Repliaase benutzt wurde, war aus* reichend, um eine hQohvgereinigte und aktive §ß-R#pl3.ease S5U gewinnen*

Die eindeutige Analya»

erfopöerfe den Beweis,, dasss die zu erforsehenäe tafcsäohlieiv derar^ge VervielfIltigungeri erzeugt. Wenn es sii?h im feesonderen yjn äi# Syntliese einer Virus^iiuoie insäure handelt, sind Paten bezüglich der Basenzusammen setzung und 4er ejsgsfcta JNs^

809887/16«

reichend» Es muss der letzte Beweis erbracht werden, dass das PolynucleotidRrodukt die Information erhält, die notwendig ist zur Produktion des entsprechenden VirusfceiiehenSin einem geeigneten Prüfverfahren-System.

Diese Bedingungen legen der Art der Versuchsdurchführung schwere Beschränkungen auf, wenn diese annehmbar sein soll für die Lieferung eines Ergebnisses, das unwider-

ist
legbar zutreffend/bezüglich der Art und Weise des Ver-

^ vielfältigungsmechanismus. Das verwendete Enzymsystem muss frei sein von störenden und unerwünscht wirkenden Aktivitäten, so dass man die Reaktion in einem einfachen Gemisch studieren kann, welches nur die benötigten Ionen, Substrate und Schablonen enthält. Pa die biologische Aktivität des Produktes wahrscheinlich vollkommen zerstört wird selbst durch eine Bruchstelle (bread ?) im Molekül, muss die Ausschaltung der Nucleaseaktivität " ganz aussergewöhnlich streng sein» Der erforderliche Reinheitsgrad macht es notwendig, dass die enzyroolo^ gischen Gesichtspunkte der Erforschung absolut vollständig gegeben sein müssen, bevor eine sichere Prüfung des Mtehantsmus erfolgen kann»

Insgesamt sseigen^ie gereinigten Replieasen folgende Unterscheidungsmerkmale*; (a) Freiheit von nachweisbaren Mengen.der DNS-abhängigen RNS-Polymerase, Ribonuclease I (J,

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. ■ - 19 ■>■■"■■ ^{; :} ■...■■'■

(J.Biöl. Chem., 259, 3716-3726 (1964)) undRNS-Phosphoryla'se; (b) vollständige Abhängigkeit von zugesetzter RNS für die synthetische Aktivität; (c) Befähigung zur längeren (mehr als 5 Stünden) Synthese von RNSj (d) die Fähigkeit zur vielmaligen Synthese der Einführungs-Schablonen; (e) Sättigung bei einem niedrigen Niveau der RNS (l·/ RNS/40 η/ Protein); (f) tatsächliches und ausschliessliches Bedürfnis für die intakte Homologe Schablone unter optimalen Ionenbedingungen.

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Die scharfe Unterscheidungsfähigkeit der Repllcase erlaubt eine einfache Prüfung in Bezug auf die Ähnlichkeit zwischen Schablone und Produkt. Wenn man die Reaktionen bei einer Schablonenkonzentration unterhalb derjenigen beginnt, die zur Sättigung des Enzyms erforderlich ist, folgt die RNS-Synthese einer autokatalytlsehen Kurve. Wenn das Sättigungskonzentrations-Niveau erreicht ist, wird die Kinetik linear. Das autokatalytische Verhalten unterhalb der Sättigung des Enzyms bewirkt, dass das neu synthetisierte Produkt wiederum als Schablonen für die Reaktion dienen kann. Um diese Schlussfolgerung direkt zu prüfen, wurde das Produkt -gereinigt aus einer Reaktion, die man solange hat fortschreiten lassen, bis sich ein 65-facher Zuwachs der Einführungs-RNS angereichert hätte-. Die Fähigkeit der neu synthetisierten RNS, die Reaktion zu starten, wurde bei einem Sättigungsversuoh geprüft, und es würde gefunden, dass sie Identisch ist mit der RNS, welche aus Virusteilchen

9098877T691 isoliert

isoliert wurde;. Es ist klar, dass die zur Erkennung durch das Enzym verwendeten Sequenzen wahrheitsgetreu kopiert werden.müssen.

Besondere Aufmerksamkeit wurde der scharfen Unterscheidungsfähigkeit geschenkt, die von den beiden Replicasen bezüglich ihres Ansprechens gegenüber hinzugefügter RNS gezeigt wurde. Keine der Replicasen kann mit der RNS
der anderen arbeiten.· Jede erkennt das RNS-Genom ihres fe Ursprungs und benötigt dieses als eine Schablone für
ihre synthetische Aktivität. Die gezeigte Spezifität

wirft Fragen auf bezüglich des Mechanismus, der von der Replicase verwendet wird bei der Unterscheidung ihrer Schablone von anderen RNS-Molekülen. Der augenscheinliche Gedanke liegt nahe, dass eine beginnende Sequenz erkannt wird, eine Möglichkeit, die einer einfachen Prüfung zugänglich ist, wenn man die Wirkung der Replicase auf Fragmentpräparate der homologen RNS herausfordert. Wenn die Anfangssequenz das einzige Bedürfnis ist, dann sollten RNS, die zu halben und viertel Teilen zerbrochen sind, in angemessener Weise als Schablonen dienen.

Versuche haben gezeigt, dass Virus-RNS-Fragmente völlig unwirksam sind, um die Replicase zu synthetischer Aktivität anzuregen, wodurch aufgezeigt wird, dass der Erkennungsmechanismus mehr als die Anfangssequenz umfasst. Dieser ist offensichtlich so ausgerichtet, dass

die 909887/1691 ~

BAD ORIGINAL

die Vervielfältigung von Fragmenten ihres eigenen Genoms vermieden wird* selbst wenn diese die Änfahgs-■ sequenz enthalten» ■ '

Die durch dieRepliease produzierte RNS ist vollständig imstande, die Herstellung kompletter Virusteilchen zu ' programmieren. Die gereinigte; Repliease aus E, coil r Bakterien, die mitfeinem RNS-Bakteriophagen-(Qß) infiziert waren, erzeugte ein Bolynuoleotid des gleichen Molekulargewichtes wie die Virus-RNS, und die Repliease kann nicht unterscheiden die Virus-RNS von seinem eigenen RNS-Genom. Durch Startreaktionen mit Ei-nfÜhrungsverhältnlssen unterhalb des Sättigungsniveaus der Schablone zum Enzym wurde eine autokatalytische Kinetik des RNS^-Zuwachses beobachtet. Es ist offensichtlich, dass die Selbstvermehrung von vollständigen Virus-Genomen oder Vervielfältigungen der Einführungs-RNS in diesem einfachen System vor sich ge.ht.

Die vorstehend genannten Eigenschaften lassen zwelfelsr frei erkennen^ dass das erforschte Enzympräparat tatsächlich identische Vervielfältigungen der Einführungsschablonen erzeugt.

Bei einer weiteren AusfÜhrungsfofm der Erfindung"sind die: Replicasepräparate, welche verwendet werderij, im wesentlichen frei von nachweisbaren Mengen an Virus-Infektionsfähigkeit^ um -eine erhöhte VervielfSifeigungs*

wirksamkeifc sicherzustellen.« , ^

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Die serienmässigen Übertragungsversuche in vitro, wie sie.oben erwähnt wurden, benötigen Prüfverfahren für die Infektionsfähigkeit der Umsetzungsgemische. Eine technische Schwierigkeit wird durch das Vorliegen von lebensfähigen Virusteilchen in den Replicasepräparaten eingeführt. Ihr chemischer Beitrag zu dem RNS-Gehalt ist nichtssagend verglichen mit den synthetisierten Mengen. Da sie jedoch eine weitaus grössere Infektionswirksamkeit haben als freie RNS, können selbst massige * ' Verunreinigungen mit intakten Teilchen in dem Material nicht geduldet werden, das entweder bezüglich infektiöser RNS geprüft werden soll oder das zur Einführung

in einen Gast benutzt wird. Um diesen Schwierigkeiten aus dem Wege zu gehen, werden sämtliche synthetisierten Produkte mit Phenol gereinigt und auf vollständige Virusteilchen geprüft, ehe die Messung auf Infektionsfähigkeit vorgenommen wird. Dies jedoch macht das Prüfverfahren sowohl aufwendig als mühsam und schliesst seine einfache Anwendung" in Laboratorienversuchen oder als therapeutisches Mittel aus.

Die Abtrennung von Virusteilchen aus der Virus-Replicase kann erreicht werden, indem man ihre Verschiedenheiten hinsichtlich dervGrösse und Dichte vorteilhafterweise heranzieht. Das Qß-Virus /"*J.Bacteriol., 91, 44-2 (1966)_7 «^{afc ein} Molekulargewicht von 4,2 χ 10 und eine Dichte von 1,43 gm/om , Es. war unwahrscheinlich,

dass

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, BADORlGiNAL

dass die Replicase eine solche Grosse oder Dichte aufweist. Die erfolgreiche Reinigung der Replicase anhand der Grosse und Dichte erzeugte einen Effekt, der über ein bequemes Ausschalten von Virüsteilchen hinausging. Das gleiche Verfahren nämlich entfernte auch freie RNS und Replicase, die komplex gebunden ist an vorausgesetzte "repllcative Formen" /fcf. Fed. Proceed., 23,

1285 (19)_7

Nachstehend wird die weitere Reinigung von Qß-Replicase

beschrieben durch Behandlung (banding) mit CsCl- A

Gradienten und nachfolgendem Zonen-Zentrifugieren in linearen Sucrose-Gradienten. Das erhaltene Enzym ist im wesentlichen frei von Virus-Teilchen und verhält sich bei den Fraktionierungen wie eine einzelne Komponente. Sein Molekulargewicht (110.000) und seine Dichte (1,26) schliesssn eine Assoeiierung mit den sogenannten "replicativen Formen" oder "negativen" Strängen aus.. Seine Fähigkeit, auf Qß-RNS durch synthetisierende infektiöse Kopien anzusprechen, bleibt unverändert. Die Daten weisen nicht auf eine verborgene -

Funktion von vorher vorliegenden RNS (doppelt- oder einzelsträngig) bei der zu untersuchenden Reaktion hin.

An diesem Punkt des Reinigungsverfahrens liegen noch

.'■■""■ \ . ■ ■ ". .·■■■■." Verunreinigungen durch andere biologisch inaktive Stoffe vor, obwohl das Enzym (Replicase) im wesentlichen frei von verunreinigenden Phagenteilehen und anderen Enzymen

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ist. Der Prozentsatz an Enzym (bezogen auf Aktivitätsmessungen) liegt an diesem Punkt in dem Produkt im Bereich von etwa 0,05 bis 0,5 Gew.-%. Weitere Reinigung des Enzyms durch Entfernung von nicht-enzymatisch. biologisch inaktiven Stoffen wird erreicht durch Verwendung einer oder mehrerer der folgenden Arbeitsweisen:

(1) Absorption an Cy-Aluminiumoxyd (Aluminiumhydroxydgel)

(2) isoelektrische Ausfällung ; (j5) Fraktionieren mit Ammoniumsulfat und (²O Adsorption und Elution mit

fc DEAE-Cellulose. Derartige gereinigte Präparate behalten in der Gesamtheit ihrer Eigenschaften diejenigen des oben efcwähnten vervielfältigenden Enzyms und besitzen ausserdem folgende Merkmale:

(1) Das Replicase-Präparat ist frei von wesentlichen Mengenanteilen an Virus-Tnfektionsfähigkeit;

es ist deshalb im wesentlichen nicht infektiös und nicht behaftet mit einer wesentlichen Konzentration an verunreinigenden RNS-Molekülen.

(2) Wenn eine zufriedenstellende Reinigung durchge-™ führt worden ist unter Erzielung eines praktisch

gereinigten Replicase-Präparates, wie oben beschrieben, dann sind aus der Replicase wesentliche Mengen an biologisch inaktiven Verunreinigungen entfernt worden.

Die beiliegenden Zeichnungen seien wie folgt erläutert:

Pig. 1

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BAD ORIGINAL

Fig. 1 zeigt einen V/ergieich der Diagramme des Proteins und der Enzymaktivität der Präparate (vgl« Beispielί, Teil 5), die von infizierten und nicht«infizierten Zellen stammen (vgl* Beispiel I, Teil 7). Die Vollständige Abhängigkeit von Q,ß-RNS zeigt, dass das Enzym keine Nucleinsäure enthält, welche innerhalb der Versuchszeit zur Anregung der Enzymaktivität dienen kann. Eine entsprechende Fraktion von nicht-infizlerten Zellen ze.Jgt ähnliche Elutionseigenschaften, besitzt Jedoch 'keine nachweisbare RNS-Synthesefähigkeit. V

Fig.2 (vgl, Beispiel I, Teil 7) zeigt das kinetische Verhalten der Replicaseaktivität in einem Reaktionsgemisch, welches Sättigungsmengen der RNS-Sehablone (Ιμβ- RNS pro 40 μg Protein) enthält. Durch Veränderung der Menge an zugesetzter RNS sowie der Zeit, die zur Synthese zügelassen wurde, ist tatsächlich Jeder erwünschte. MehrfachzuwaehS des Äusgangsmaterials erzielt worden* -

(Beispiel Ί* Toil f) zeigt die Wirkung gesetzter Pröteinmengen"bei einer festgesetzten Mengö dei« RNS^Schablöfte ( 5 μ§ MS/p, 25 ffll.). Es ist ersiöht; lichjVdass die Reaktion lineal? veilaiift^ wöduröh die Abwesenheit von^störenden verunreinigungea int gerei»

Enzym aögez6igii,viird'* .

Fig* 4 zeigt das kinetische Verhalten &e? MS-Synthese

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und vergleiöht das Auftreten sowohl der neuen RNS und der infektiösen Einheiten bei verschiedenen Zeiträumen (Beispiel III, Teil 1). Das Anwachsen der hergestellten RNS geht parallel mit einem Anstieg der Anzahl der infektiösen Einheiten.

In Pig. 5 werden die neu synthetisierte HNS und die infektiösen Einheiten bei den Schritten eines serlenmässigen Übertragungsversuches verglichen (Beispiel III, Teil 2). Die neu synthetisierte RNS ist in derselben Weise vollständig geeignet wie die ursprüngliche Virus-RNS zur Programmierung der Synthese von Virusteilchen und um als Schablone für die Erzeugung weiterer Kopien zu dienen.

Fig. 6 zeigt das Ansprechen der Replicase auf intakte und fragmentartige QB-RNS (Beispiel IV, Teil 2). Die fragmentartige Qß-RNS ist nicht imstande, die Replicase bis zu einem Grad anzuregen, der auch nur annähernd der vollen Aktivität entspricht.

Fig. 7 zeigt die Wirkungen der Grosse der RNS-Schablone und des Mn⁺* auf die Kinetik der RNS-Synthese und die anomalen Abweichungen, die bei der Reaktion entweder durch brüehstüefcarfcige RNS oder das Vorliegen von Mn⁺* hervorgerufen werden (Beispiel IV, iteil 2). ^; Die Synthese äer MS verlauffc während längerer Zeiträume

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■ . -.'■ ■ - 27 - - .· ' ■■'■-■■

räume linear in Gegenwart von sättigenden Mengen der intakten Schablone und Mg⁺⁺. Wenn Mn⁺⁺ in das Reaktionsgemisch eingeführt wird, hört die Umsetzung in etwa 60 Minuten auf, selbst wenn die 28S-RNS als Schablone verwendet wird. Das Ansprechen des Enzyms auf eine fragmentartige Schablone verläuft derart, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit geringer als des Normalen ist und hört in JO Minuten vollständig

auf, ob Mn⁺⁺ vorliegt oder nicht.

Fig. 8 bis 14 erläutern eine weitere Ausführungsform der Erfindung, wobei die Replicasepräparate, die verwendet werden, im wesentlichen frei von nachweisbarer Virus-Infektionsfähigkeit sind,und es werden Werte für die Replicasepräparate aufgezeigt, die nur den Verfahrensschritten der CsCl-- und Sucrosezentrifugierung unterworfen waren: Fig. B zeigt die Ergebnisse •der Bandenfraktionierung (banding) des Enzymproteins in einem CsCl-Gradienten; Fig. 9 zeigt den Vergleich · des Substrat (primer)-Ansprechens durch die Replicase vor und nach der CsCl-Reinigung; Fig. 10 zeigt einen Vergleich der autokatalytischen Synthese durch die Replicase vor und nach der CsCl-Reinigung; Fig. 11 zeigt.das,Verhalten der Replicase während der Sedimentation im Sucrosegradientenj Fig. 12 zeigt die Wiederauflösung der Replicase und Transcriptase in Sucrosegradienten; Fig. 15 zeigtdie Sedimentationsanalyse

"■--■ -■"."-,' ,der ■ .

909887/1891 -^-

der sehr erheblichen Synthese mittels der Replicase, die durch CsCl und Sucrose gereinigt worden war; Fig. 14 zeigt die Synthese von RNS und infektiösen Einheiten durch Enzyme, die durch CsCl- und Sucrosezentrifugieren gereinigt worden sind.

Bezüglich der folgenden Ausführüngsbeispiele umfasst Beispiel I zwei RNS-Replicasen, welche in dem gleichen Gast durch nicht verwandte RNS-Bakteriophagen hervorgerufen wurden. Beide Replicasen sind gereinigt worden, und ihr Ansprechen auf verschiedene RNS-Moleküle wurde geprüft. Unter optimalen Ionenbedingungen sind beide völlig inaktiv gegenüber heterologen RNS, einschliesslieh der Ribosomen- und s-RNS des Gastes. Keine der Replicasen kann mit der RNS der anderen arbeiten. Jede erkennt das RNS-Genom ihres Ursprungs und benötigt dieses als eine Schablone für die synthetische Aktivität. Diese scharf unterscheidende Auswahlfähigkeit seiner Replicase ist ein offensichtlicher Vorteil eines Virus, das versucht, seine eigene Duplikation in einer cellülaren Umgebung, die mit anderen RNS-Molekülen vollgefüllt ist, auszurichten.

In den nachfolgenden Beispielen II und III sind Versuche mit einer gereinigten Replicase beschrieben, welche in E. coli durch den RNS-Bakteriophagen QS induziert worden ist. Die Daten zeigen, dass das Enzym

- - identische

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- identische Kopien der hinzugefügten, Virus-RNS erzeugen kann. Ein serienmässiges Verdünnungsexperiment hat belegt, dass die neu synthetisierte RNS genauso wie die ursprüngliche Virus-RNS geeignet ist, um die Synthese von Virusteilchen zu programmieren und als Schablonen für die Erzeugung weiterer Kopien zu dienen. Da die Daten erkennen lassen, dass das Enzym tatsächlich •Vervielfältigungen erzeugt, ist nunmehr eine zweifeisfreie Analyse des RNS-Veryielfältigurigsmechanismus möglich, und zwar in einem einfachen System, welches aus gereinigter Replicase der Schablone-RNS, Ribσsidtriphosphaten und Mg besteht.

Gemäss dem nachfolgenden Beispiel IV wurde gefunden, dass in Bruchstücke zerbrochene Virus-RNS aussergewöhnlich unwirksam sind zur Anregung der Replicase bezüglich synthetischer Aktivität,. Die Replicase ist offensichtlich befähigt, die Vervielfachung von Fragmenten ihres eigenen Genoms zu vermelden. Obwohl die Synthese von Virus-RNS während längerer Zeiträume in Gegenwart

..-■:. - f ■ : und Mg+⁺

von Sättigungsmengen der intakten Schablone/linear Verläuft, hört die Reaktion nach einer verhältnisfflässig kurzen Zeitspanne aUf_# wenn dem Reaktionsgemisöh Mn⁺"¹* zugeführt

Das nachfolgende Beispiel V erläutert ein Verfahren zur Erzielung intakter Virus-RNS>■ wie z.B. 4ß-

■ ".-"".." '■■ zur

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zur Verwendung als Schablone. Das gleiche allgemeine Verfahren kann verwendet werden sowohl zur Herstellung MS-2-Phagen als auch anderer Phagen.

Das nachfolgende Beispiel VI beschreibt im einzelnen ein Verfahren zur Reinigung von RNS-abhängiger RNS-Polymerase (Replicase), die gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung aus infizierten Bakteriophagenzellen gewonnen wurde.

Beispiel I
1. Bakterien und Viren

Die verwendeten Bakterienviren sind MS-2 (ursprünglich erhalten von Dr.A.J.Clark vom department of microbiology, University of California, Berkeley, California) und Qß (erhalten von Professor Watanabe). Wenn"man mit den beiden Viren MS-2 und Qß arbeitet, muss dauernd darauf geachtet werden, dass keine Verunreinigung des einen mit dem anderen eintritt. Glücklicherweise liegt keine

serologische .Überkreuzungsreaktion zwischen den beiden ■■ .

. vor (Nihon Rinsho, 22, 243 (1964)), so dass die geeigneten Antiseren zur Identifizierung und Reinheitsprüfung verwendet werden können.

Die beiden RNS-Goliphagen, MS,2 und Qß, wurden physikalisch Und 'Serologisch charakterisiert: Ms-2 hat einen S₂Q, -Wert von 79* ein Molekulargewicht von 3,6 X IG ,eine Dichte von 1,422 und einen pH-Wert am isöelektrisehen Punkt von 3*9* Q.ß hat einen S„_n .

, von 84_# ein Molekulargewicht von 4,2 χ IQ , eine

'.-909887/1691

• Dichte

Dichte von 1,429>und einen -pH-Wert am isoelektrischen Punkt von 5,j5. Ein Gastorganismus . (E. coil A-I9) erlaubt eine Unterscheidung zwischen den beiden auf Grund eines ausgeprägten Unterschieds in der Grosse der Plaque, Sie unterscheiden sich immunchemisch, da keine~ serologische Überkreuzungsreaktion entdeckt vrerden kann.

Der Gast- und Prüforganismus 1st ein mutanter Hfr-Stamm von E. coil· (Q-l», der im Laboratorium von W. Gilbert (department of biology, Harvard University,Cambridge, Massachusetts) durch Diane Vargo, früher Assistent bei Dr. Gilbert, nunmehr Mitarbeiter im department of microbiology; Univerity of Illinois, Urbana, Illinois, isoliert wurde. Der Stamm hat die günstige Eigenschaft, dass ihm Ribonucleasen und RNS-Phsphorylase fehlt; (Fed. Proc, 24, 295-(1-965) >.£-Q-l> ist ein Abkömmling von A-19, einer RNS-ase negativen Mutanteri, die hier erörtert wird. Die Herstellung der Virusausgangsmaterialien und der gereinigten RNS erfolgte gemäss der Arbeitsweise von*Doi und Spiegelman (vgl. Proc., Nat ¹I, Acad. Sei., U.S., 49, 355-360 (1963)).

2. Herstellung von infizierten Zellen

Das Grundmedium, das für das Wachstum der infizierten

\ ■ ■■-■■'

Zellen und zur Herstellung des Virus verwendet wurde, enthielt die folgenden Bestandteile in g pro Liter: NH^CIi Ij MgSO^.T H₂Q, 0;06; Gelatine 1 x,10"⁵; ',

■-■■■-■■ -.' -Casamino-,

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Casaminosäuren (vatiminfrei), 15; Glycerin, JQ; hierzu werden nach getrenntem Autoklavieren 7 ml 0,1 m CaCl₂ und 10 ml, enthaltend 4 g Na₂HPO₂^ H₂O und 0,9 g KHpPOh, hinzugefügt. Zunächst werden Lysate in Liter-Mengen hergestellt, die verwendet werden zur Infektion grösserer Volumina von Zellsuspensionen. Diese werden erhalten durch Infizierung· von Kulturen (QDßgQ von 0,25) in der log-Phase mit-einem gereinigten Präparat von Phagen bei einer Multiplizität von etwa ™ -5« Diese werden unter Schütteln bei-37⁰C inkubiert,

bis die Lysis vollständig ist, undftann wird hinsichtlich des Gehalts und der Reinheit der Phagei geprüft. Derartige Lysate können bei -17°C in gefrorenem Zustand unbegrenzt gelagert werden und lassen sich direkt vor der Verwendung auftauen. Im allgemeinen werden Mengen von 35 Litern an Zellen in Glasballons bis zu einem ^0D660 ^{zwischen e}twa 0,275 und 0,290 herangezüchtet. Die Temperatur' in den Ballons beträgt 3^⁰C, während Λ die Temperatur des Wasserbades, in das sie eintauchen, bei 37⁰C gehalten wird. Wenn die Zellen einen ODg^₀ von 0,275 erreicht haben, werden sie mit dem Virus bei einer Multiplizität zwischen 10 und 50 infiziert und 1 Minute lang zur Vermischung belüftet..Die Belüftung wird 10 Minuten vor der Absorption unterbrochen, wieder aufgenommen und die Inkubierung fortgesetzt. Nach 25 Minuten werden soviel Sucrose und Magnesium

hinzugefügt, 909887/1691

162Q64S

hinzugefügt, dass sich eine Endkonzentration von 1.8$ bzw. 0,01 m ergibt; Nach weiteren 5 Minuten wird das Verfahren durch Zusatz von zersto'ssenem Eis beendet Die Zellen werden in.einer Sharples-Zentrifuge geerntet und bei -l4°C gelagert, bei welcher Temperatur die Enzymaktivität während einer Zeiti die 6 Monate überschreitet, erhalten bleibt. Nicht-infizierte Zeilen,

werden in der gleichen V/eise hergestellt und gelagert. Um einheitliche Präparate zur Enzymisolierung zu schaffen, werden die Zellen irgendwann vor der Verwendung aufgetaut und in einer Lösung wieder suspendiert .--... ■ "- -fSö g gepackter Zellen in 100 ml), weiche 0,01 $l· frispuffer pM-Wert 7,4, O,OQl m MgCl^ und 0,0005 "jn^: -..-.. Mercaptöäthanöl sowie 5 IJ-g/ml DNS-ase (Ribonucleäse) enthalt« Mäch .gründlicher Suspension mit einem Magnetrührej? bei %°0 wird die Öüsperis i oh in ge eignet e" Anteile in i»lästikrc5hren aufgeteilt, eingefroren und "bei -il^e gelagert. -

3- i

£■ -maskierte Ribonußlebisidffionbphosphate werden^ wie in Sroc. Mät'i. Acad.^ Sci.^VIJ.S. _t §0j -905-911; (19^3) be schrieben^ hergesteiit. Die' iiiäi»kie*rten iiononucieotide werden" enzymatis<;ft. in die ehfcs-pi^eGhehdeh Mbbriücleösidtriphosphate uinge$mndeit iniit iiiifs^ eines Isolierten KinasePräparates aus E. coil (Biööhiin. "Biophys; 61, 29-35 (1962)5. ':

9ö0ö8J/1Eft _BA0

4. Chemische und biologische Reagenzien Die nicht markierten Ribasidtriph.ospha.te stammen von P-L Biochemicals, Inc.^ Milwaukee, V/isconsin. DHS-ase von V/orthington Biochemical Company, Freehold/ Hew Jersey wurde zweimal urnkristallisiert, weiterhin an DEAE-Zellulosesäulen gereinigt, um verunreinigende Ribonuclease zu entfernen, Phosphoir.ol^/ruvat (?3?) und die entsprechende Kinase (PEP-Kinase) v/urde bezogen von Calblochem, Inc., Los Angeles, California; Lysozym von Armour and Company, Kankakee, Illinois und Protamlnsülfat von SIi Lilly, Indianapolis, Indiana. Der gelbe Rübenmosaikvirus (TYIiV-RNS) und der "Satellitvirus" des Tabaknekrosevirus (STtIV-RNS) wurden beide von Dr.B..Reichmaftn (Botany Department, University of Illinois) geliefert.

5. Snzyrnhersteilung

Die folgende, Arbeitsweise wird für 20 g gepackter Zellen beschrieben. Die eingefrorene Zellsuspension (120 ml) wird aufgetaut, und zu derselben werden 0,5 mg/mi Lysözym hinzugefügtj danach wird das Gemisch eingefroren lind zweimal aufgetaut unter Vervendung von Methanol und Trockeneis als Kältegemisch. Zu deni Lysat werden 0,9 ml 1 m*MgCl₂ und 2^5 μg/ml DMS-ase (Desoxyribonuclease) hinzugefügt, und das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten lang in einem Eisbad inkubiert. Der Extrakt wird dann 20 Minuten lang bei 30.000 χ g •zentrifugiert und der Überstand entfernt. Der plüttchenförmige Zentrlfugierrückständ wird in einen vor- g_AD ORIGINAL

8688HBSi

gekühlten

: T62064S

gekühlten Mörser gebracht, 5 Minuten vermählen;und. dann in JO ml des gleichen Puffers suspendiert, der auch für die "Zellsuspensiön verwendet wurde, mit der , Abwandlung., dass die Magnesiumkonzentration auf 0,01 m erhöht wurde, um die Wirksamkeit der DNS-ase-Wirkung zu erhöhen. Der Extrakt wird dann bei '',_■/ 30.000 χ g 20 Minuten lang zentrifugiert, und die beiden Überstände werden vereint auf eine Molaritat von 0,01 EKDA (Kthylehdiamintetraessigsäure, die vorher auf einen pH-Wert von 7,^ gebracht worden.war) eingestellt und bei Ö°C 5 Minuten lang inkubiert. Es traten

- - stoffe .■"-."■

unlösliche Eiv/eiss/ auf, die durch Zentrifugieren bei

3O.OOO x g während 20 Minuten entfernt vmrden. An diesef· Stelle besass ein typischer aktiver infizierter Ex- ' trakt ein QD₂^₀ zwischen 150 und 180. Niedrigere Werte zeigen im allgemeinen eine schlechte Infektion an, die eine geringe Ausbeute ah Enzym liefert. Zu der geklärten Überstandflüssigkeit werden Q,01 rr.£ Protaminsulfat für Jede ODpgQ-Einheit hinzugefügt. liach 10 Minuten wird der gebildete Niederschlag, der praktisch die gesamte Enzymaktivität enthält, durch 10 minütiges Zentrifugieren bei 12.000 χ g gesammelt. Er wird in 12 ml eines Standardpuffers aufgelöst (0,01 m Trispuffer, pH-Wert 7,^j 0,005 m MgCl₂; 0,0005 m MercaptOäthanol), auf eine ■(NHj.JgSQ^-Koiarität von 0,4 eingestellt und bei 0°C über Kacht stehen gelassen. >.

-■"·.-_"■ " ^: Diese ^: ;

SOa087/T69i —

Diese Wartezeit ist wichtig für die nachfolgende Fraktionierung, da gefunden wurde, dass die vollständige Trennung, wesentlich ist für eine annehmbare Abtrennung der Replicase von der Transcriptase (Transcriptase ist das Übermittl"ungsenzym, das DNS als Schablone benutzt zur Synthese komplementärer RNS, und es ist weiterhin bekannt.« als DNS-abhängige RNS-Polymerase). Der Extrakt wird verdünnt mit 24 ml eines Standardpuffers und bei JO.000 χ g nach 20 Minuten 20 Minuten lang zentrifugiert,, und zu jeweils 40 ml des Überstandes werden 12 ml einer 0,5$igen Lösung von Protaminsulfat zugegeben. Der sich bildende Niederschlag enthält im wesentlichen die gesamte DNS-abhängige RNS-Polymerase zusammen mit einer RNS-unabhängigen RNS-polymerisierenden Aktivität*,, Die RNS-Replicase verbleibt im Überstand und beginnt gute Abhängigkeit von hinzugefügter RNS zu zeigen. (Dies ist einer der kritischen Schritte bei der Fraktionierung, und jede Veränderung bezüglich ^ des Gastorganismus, des Mediums, der Zeit oder Tempe- ' · ratur der Infektion verändert die Menge an Protamin, die notwendig ist zur Erreichung der Trennung. Es ist oftmals sicherer, geringe Anteile zu titrieren und die Menge an Protamin , welche benötigt wird, durch geeignete Prüfmethoden zu bestimmen.)Nach IO Minuten wird der Niederschlag durch 10 minütiges Zentrifugieren bei 12.000 χ g entfernt. Zu dem sich ergebenden Überstand wird das gleiche Volumen an konzentrierter Ammo-

nium-909887/1691

BAD OHlGiNAL

162064S

niümsulfatlösung hinzugefügt (gesättigt bei Ö^DG und mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7.,O eingestellt)* Nach 10 Minuten bei O⁰S wird dear· Nieder-; schlag durch Zentrifugieren bei 10'.-00O- -x g während _ 10 Minuten gesammelt· und ;in ²J- ml eines Standard- -/ puffers aufgelöst, der 0,4 m Ämmöniumsüifat enthalt» Die erhalten^; Lösung wird dann gsgen 1 'tdpm? einss ^: Standärdpuffers während■" 1,§ Stunden dialysieft» Die dialysisrte Fraktion wird mit dem Standardpüffer auf tine AmffiöMuffiSülfateBolarifeäii von 0^05 eingegtsllt Ufld äüröh eine ■ßlÄM-Oellultaseisä'üle (1,2·- 3c IO ö») ge^ kbi die direkt >or der Verwendurig mit 100 ml r Stäftdärdpuffers ausgewaschen wurde»Nash Aufgabe d#§ Fföteins .wird d-ife. Säule, mit 4© ml ©Anis Standard* puffSi⁴S.: ausgewasöhen^ -'&&$> Q₃IM: m MaOl^ welshes das -

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e entfernt,,^: ©nthllfe* Sa-S Eagyffi wiru ■ daa-n fflife 33 Ml dss Sfeandardpuff^PSr₄J ü©r 0*SO ffi Mäöl eiüitrt * !«. dia^ ft»akti€vnea_s uie

^ . wirä gesafetigte/ -Afflmenlufflsuif ätlösM&g- Ma zugöf tigü, Uffi der, Endlösting öint lO^ige; gä geben» Aß di&gejft JPunkfe _:hk%^; tlat lniyffipr" ■■Ößgjgö/pÖggO*^*¹^!^^ Vöii-' Iv^.tiflä enthlit^: lieh M mg PröHfi-n pr©.-ffil.». Unter .ü§& änf tgtbi lönenbedingüngen' isfe Mi -eiaef» tägtKliife ;¥-©|5. l-_-Möaa%" Q⁰O kein' Aiifeiv-itltgrerlutt 2u fe;e#'Me&teft.*: -.■■■"'.

6 ♦ Stanclar-clunter suchun.nesy erfahr en - untersuchung? der* Enzymaktivität durch Binver^- lelbung -von radioaktiven nucleotiden

Das Stahdardurnsetzungsvolumen beträgt 0,25' ml,. und es

enthälts wenn nicht anders" angegeben, die folgenden Bestandteile in μ-Molen: Tris-HCl pH-Wert 7,^, 21j Magnesiumchlorid", 5*2 (Manganchlorid, wenn es verwendet wird> 0,2); CT¹B, ΑΪ?, U^P und GTP, o'ev/eils 0,2* Das Enzym wird gewöhnlich geprüft bei einer Menge von 4O₁Ug Protein in Gegenwart von 1 μ«; der RifS-Scha.-blone«.-Man lässt die Reaktion 20 Minuten lang bei 35°C ablaufen_ und beendet sie in einem. Sisbad durch Zusats von O* 15 Ml -neutralisisrteni gesättigtem Pyrophosphat, 0,15 ml neutralisiertem gesättigtem Orthophosphat und.OjI ml SO^xger Trichloressigsäure. Der niederschlag ■wird auf ein Membranfilter überführt und siebenmal mit 5 ml kalter.lö^iger ^richloressigsäurs ausgewaschen. Die Membran wird dann getrocknet und in einem Flüssigkeitsscintilationszahler gezahlt, wie es in Pröc, -Nat ¹I₁, Acad* Sei*, U.S.,. 50,-905-9H-.(1963) beschrieben Viird» Bisses . Auswaschv^rf ahren ergibt Mulltei t"Zahlungen viehiger als öQ cprn mit Eingabe-Zählungen, von 1 ic 10 cpsi₄ Die spezifischen Aktivitäten des hinzugefügten markiertan triphosphats wurden so e Inges teilt >■ dass mit der angewenaeten '.'i-rksaakeit 1 & 10 ops 0^2 μΚοΙβή des entsprsGhenden ^riphosphats

Uli

BADORtGlNAL

7. Ergebnisse .

(A) EiRenscfag.ften der vereinigten Qß-Repliease _:

Pig. 1 betrifft; die Chromatographie des zweiten Protaminüberstandes an PEAE-Gellulose und vergleicht die SIutionsdiägramme von Protein und der Enzyrr.aktivita;t;von Präparaten (vgl, nachfolgenden Teil 5), die äus.infizierten und nicht-infizierten Zellen

Für die Werte nach Fig. 1 .'wurde .die-folgende. Arbeitsweise angewendet: 35 .sü·. von 0,2 in NaCl in dem Standardpuff er v/urden auf die Säule gegeben, kurz bevor Fraktion Nr. laufgefangen wurde. Vorher wurde die Säule, wie in Teil 5 vorstehend beschrieben, mit 0^12 m HaCl ausgewaschen. Es ist zu beachten, dass

;der Peak der Snzymaktivität sich in-...der-.abfallenden Schulter des 0. D.-Diagrarnmes findet, ilochmalige

'Chromatographie ergibt ein Zusammenfallen der beiden.

Infizierte Präparate zeigen, eine Pölyneraseakti'vität," die mit 0,2 m KaCl eluiert v/ird, ausgezeichnet auf zugefügte Q3-HNS anspricht und frei ist von DHS-abhängiger RNS-Polymerase. Die vollständige Abhängigkeit von Qa-HWS lässt erkennen, dass das Enzym kerne Nucleinsäure enthält, die zur Anregung des Srizyns hinsichtlich seiner Aktivität innerhalb der "Versuchs -.. zeit dienen kann. Eine entsprechende Fraktion, von nicht-infizierteri Zellen zeigt ähnliche Elutionseigenschaften, besitzt aber keine.nachweisbare

RriS-synthetisierende Fähigkeit. "

909887/16191 ^_€

162064S

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt, dass nach der DEAE-Behandlung das Enzym völlig frei ist von Ribonuclease I Phosphorylase und der durch K⁺ angeregten Ribonuclease. - Die Gegenwart des Energie liefernden Systems (PEP + ΡΞΡ-Kinase) hat nur geringe Wirkung" auf die Reaktion (vergl. Tabelle 2 unten) und zeigt, dass sie frei ist von störenden Enzymen, die die Ribosidtriphosphate zerstören können. Schliesslich hat DNS-ase keinen Ein- £ fluss auf die Reaktion, wohingegen, das Vorliegen selbst geringer Mengen von Pancreas-Ribonuclease die gesamte Synthese des.Polyribonucleotids völlig ausschaltet.

Das Enzymsystem benötigt nicht nur die Schablone, sondern ausserdem alle vier Ribosidtriphosphate (vergl. Tabelle 3 unten). Die Replicase hat ein obligates Bedürfnis für zweiwertige Ionen',wobei Magnesium das bevorzugte Ion bei homologer RHS ist.

_ Mangan' kann, dieses teilweise (10$) ersetzen und ruft

interessante Veränderungen in der Art der Reaktion hervor, deren Einzelheiten im nachfolgenden Beispiel 4 beschrieben werden.

Tabelle

90988 771691

BAD ORIGi[SJAL

'Tabelle 1

Untersuchungsverfahren für Ribonuclease^;und Phosphorylase +/ .--'-' /-'" - .·

14 ' ■ , 3

C-ADP. ; - : : ■:% H^-RNS, hydrolysiert

:".-.. '- ■; Incorporation (gO Min.) \ in 30 Min./

■-·■-"'-■-_ . ' cpm .-."■■■ 0,25 „0,25 keines von ;. ■■--■::-■ ·. '. V - -;. , -'-' M Κ-κ · . M NA+ ■ . beiden

Vor DEAE -^v . .40 ⁺⁺λ ' nach- DEAE 32 -^

"*".' Das Prüfverfahren für die -Phosphorylase vmrde ausgeführt - ·. nach J,Mol.Biöl,, U,..257-271- (1965). -Jede Reaktion. tO,25 ml)

enthielt 40^g Protein und 1 μΜοΙ G -ADP bei 6 χ 10^ cpm,

■ ■■""-"■■""■ 4 ■■-

"*. Für_: die Ribonuclease wurden-10 \xg bei 1 χ 10 /cpm . pro Reak'-

tionsgemisch hinzugefügt. -

Ähiiiiche Präparate vom "wilden Typ".".incorporieren.30«Ö'ÖÖ^: öpm (äquivalent'480 μΜοΙ) vor dem: DEAE Schritt, und .etwa .die Hälfte davon nach der Elution aus'der Säule» . . - .-.. ..-..:

tabelle 2

909887/1691

Tabelle 2 Wirkung von Nucleasen und dem Energie liefernden System auf

+) ■■-.■

Zusatz

Q,i3-Re?licase

Schablone

com ineorporiert

PEP (1,0 μίίοΐ)

+ PEP-Kinase (10μg)

4,803 9β

DNS-ase (5

RNS-ase (1 ug)

19 37

Keine

75

. Äusser den angegebenen Zusätzen wurden die Untersuchungen ausgeführt,unter den im obigen Teil β beschriebenen Standardbedingungen,

Tabelle 3

Bedürfnisse der QjB-He pll case "** *- ' Untersuchungsgemisch UMP (oder AM?)-Incorporation

CD O (O OO GO -»J

Vollständig.

- Qß-RNS

- GTP

- Mg, - Mn

390

Die ÜntersuGhungsbedingungen entsprechen denen, die vorstehend in Teil β beschrieben/wurden mit der Abv/andlung, . dass Mn mit 0,2 μΜοΙεη pro 0,25 ml eingeführt wurde»

BAD

■■-"■■■ - 43 -- ■·-,■-■■ "-... _ . -. ■

FiS. 2 betrifft das ;kinetiseheVerhalten derReolleäse-.aktivität und zeigt die Kinetik, die in einem ileak-. tionsgemisch beobachtet wird, das Sättigun-smengen der Schablone (1 μ^ RNS pro 40 μβ"Protein}enthält. Für die Werte von Fig. 2 gelten folgende Bedingungen: Jeweils 0,25 n*l enthielten 40 g.g Protein und 1 μ£ QiO-HKS'; alle anderen Bedingungen entsprächen den in . Teil 6 angegebenen; die spezifische Aktivität des

"SO

■ UTP war derart, dass die Incorporation von H-.QQO μρτ. der Synthese von 1 ^g _;RNS entsprach. Während eines Zeitraumes über 5 Stunden wurde-eine kontinuierlicne Synthese bei 35°C beobachtet* Ss ist festzustellen^ dass in 2 Stunden die Men^e der synthetisierten HNS dem 5-fachender Einführungsschablone entsprach. Durch .Variierung der Kenge der zugesetzteri HNS und der Syn-■chesezeit kann .tatsächlich jeder erwünschte !•Mehrfachsuviachs des Ausgangsnraterials erzielt* i-.*erdsr,:. Die Seendigung der Synthese innernaib von 5 bis IC Xir.uten, vfie sie von anderen Verfassern für wahrscheinlich ähnliche Präparate berichtet worden ist,, iss bei der vorliegeriGen Erfindung nur in den. ersten Stufen der Reinigung beobachtet worden«"Fig. 3 besieht sich auf

das Ansprechen gegenüber zugesetzter. Protein und

\ :." ■■'-.-.. .;.-.·"■- - .-_"■ .-;■-.■-.-■. prüft die Wirkung von augesetzten Proteimr.engen bei

'», einer festgelegten Kehge der SchaOlone (5 ^g B213/ö_x25 "I). ■"" Für die^:" in Fig. y aufgezeigter;. >.'erte"viurden/Versuchsansätze durchgeführt, und zwar während 20 Minuten.tei

909887/1091 ^Q.

55°C unter den In Teil β angegebene-. 2~dir";"ungen, und. wiederum entsprach die Ineorocraiiub v:n ^£.&0O^;cpa-der. Synthese von 1 ug.. ?~>73:.. Hc is:; c.;_"cr:c;.c.-.jli;l, cacs die Reaktion linear verläuft, v.-oduro.;. cie /-...jweccnhiit von störenden Verunreinigungen in άΰ::. görel-ilgv..:··" lin-zyr.' angezeigt wird.

(B) Spezifische S-chabloneh"-Bedürfnisse ^tr r^olicase

Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt die Fähigkeit verschiedener RN-S-Kqleküle-, die QiI-Repli case zu synthetischer Aktivität cei der Säüti^un^skonzentration (;1 ^i_\ der homolorer. R2^3 und dera Lz zollten dieser Menge anzuregen. Das Ansprechen der Qii-P.eplicase ist für c.x& MS-2-Rep.licase, v;ob&i die Bevorzugung klar auf ilt:·-· eigene Schablone ausgerichtet 1st. -Die ein-zige heterloge RNS, di«3 nachv.'eisbare Aktivität zeigt, ist TY.·.V, und bei einer F.c-nge von 2 ,^.unterstützt sie eine 07η-thesre', die 6y!> der^enige-n entspricht., ^T-;ie sie bei "dar horüologen· Z.2,-Rl':3 c^obachtet x-rarde. Beide heterologsn Virus-HK3, Mi~£ unc STHV sind völlig inaktiv und das trifft Such für die rliboso^en- und Übertragungs"-Rl\3-Arten der'Gastzelle (3V ebli £,-13) - zu. iüe zu erwarten, zeig-t die RK3-Masse aus infizierten Zellen-eine gewisse'·· Sehablono-n^irksamkeit·^ z.L^:~ i^it d$n: - Fortschreiten der Infektion ansteigt. Es fi:.-et sich -<eine hachv/eis- bare DNS-abhängige HNS-Poly^eraseaktlvität.

■'-■"' " ■""■ ' ' ' Tabelle K

•-,.-V./9 0 9 8 8 7/1691 Si '^ \> X > ϊ ' "

BAD ORIGINAL Tabelle 4

1 ii. &	4,9^5
.. --.Λ,929	312
146 -	:;.. -26^
35 -	." . 9:
.;_. . 45 _ .	.57 ,-.
- . . 15 '··	•263
- ' 146 ;
Sl ■■·■

"..-- Ansprechen der Qß-Replicase auf verschiedene Schablonen ^'

" · . ■■ -.Elnführun,£!:smeng;en der "■■]

Schablone

TYMV

; MS-2 . - ■■'■■ '"'.'. ■-'. . ■".'-Ribosomen-RNS .
S-RNS";' ":.';

RHS-Masse aus infizierten Zellen Satellit-Virus .

. DNS (10 μ-g) - ■■ ■ 36 ' -

-^' Die Untersuchungsbedingungen entsprechen denen,->v/ie sie im -vorstehenden Teil 6 beschrieben sind. Via in allen Fällen jedoch- wird die -Prüfung- für^ die. DNS-abhang!ge Aktivität .-mit 10\μ£ DNS pro .0,25 mi des .Reaktionsgemiscaes ausgeführt, Keine Schablone enthaltende Kontrollreaktiönen ergaben einen .· Durchschnittswert; von-JO eprs. - .

" " --- Um einen eindeutigen Vergleich der beiden Replicasen. zu erhalten,- die von demselben Gastorganismus stammen,. . wurde das MS-2-.Enzym aus'entsprechend infizierteKi Q-I3 : isolierjt. Die Reinigμng der MS-2-Replicase geschah ge-

.nau ;nach derselben Vorschrift wie für das. Q,B-Enzym "...- (vergl. vorstehend Teil. 5)mit der Ausnahme, dass . . --."■'. 0,22 m MaCl fun?; die Slution^gLUs der DEAE-Saule verwendet worden ist, . j;l ..:.-.- ■■'.-- "' ■;.

Die.Ergebnisse des Vergleichs zwischen den beiden Re-"" plicasen gehen aus der nachfolgender. Tabelleb

909887/ tS91 ^:- und

BAD OR(GiNAL

und sie sind hinreichend eindeutig. Die. r-:3-2-Replica; lässt keinen Ilinv-rsis'darauf erkennen, dass sie die Qß-RNS als Schablone bei irgend einer Menge der 3273-Zuführung annimmt, ϊη ähnlicher V.^:eise ignoriert die Qß-Repiieasa die IiS-2-RNS, während sie gut mit ihrer eigenen Schablone arbeitet. Aus diesen VJerten dürfte sich ergeben, dass die Schablonenspezifitäu hinreichend gesichert ist.

i-.Vio v-■.

—pr-> i'"

■:>_o:_'QV--

Snzym · 1 ug 2 μg 1 ~g

τνϊ q ο L· -"7 - - ■ ~a £ £· C\

i. ill—' ™" £· ·" * *"i "V "T ». ^/ O V^ . T«>

Teil β genannten, wobei Kn'' in einer Ksngo von G,2 μΜ pro 0,2p ml vorliegt.

s ^nzyiss und de-s riaini

gungsverfahrens ist as möglich, ν Replicase aus geeignet infizierten vrildenHfr-i^^^^en zu isolieren (Proc. Nat'1...Acad. Sei., U.S. ^G, 9C^-JIl (1963)). Die Verwendung der Muuanten Z-Ip c_.v.:-.?._;iir-c-r. offensichtlichen Vorteil für die Reinigung dar- Aeplicas;,

909887/Ί691

c.a

BAD

da. der Rohextrakt bereits frei von Ribonuclease-χ -und Phosphorylase war. Die beiden zurüekbieibenden störende: Aktivitäten waren auf die DNS-abhängise* RNS-PoiyrneraGe (Transcriptase) und eine durch Kalium anregbare Ribonuclease zurückzuführen. . ;_;

Ss ist "-wichtig zu betonen, dass die vollständige-Entfernung' der Transcriptase wesentlich ist, wenn Fragen bezüglich des Mechanismus und der Replicasespezifität zweifeisfrei beantwortet werden sollen. Die Sranscriptase kann jede RMS als Schablone für die RXS-Synthese verwenden und bildet bei "diesem Prozess eine r'ibonueleasebeständi^-e Struktur. Dementsprechend schützt die Verwendung von DJüS-ase oder Actinoniycin-D nicht gegen eine Vermischung mit Transcriptaseaktivitar. Eel dorr, in Beispiel I, Teil 5, beschriebener. Arceitssan^ wird der Hauptanteil der Transeriptase ir. aer i\^Tiederschiagsfraktion der zv;eiten Prctaminscufe. entfernt. - Dsr Rest wird als spät auftretender Bestandteil.in dar ΒΞΛΞ-Säule zurück-elassen; Die kaiiur^-abhäh^ige Ituclease ist fest an Zellmescranfrainier.ten gebunden, die in der mit niedriger Geschwindirkeit erhaltenem Praictichdurch die vorliegende -varhältnisfciissir nriide'Sinfriar- '

•Die geringe .Miri5e ^an .RiscnucleS-ss, .die- den- 2;^trakt

mit C, 12-in ITaCl·entfernt, -welches-: gleichsreitif-' •^^^-=-- -

909887/1691 '^ ; :>

BAD

1620845

■ - 48 - . ■

und ein PoIy-A synthetisierendes Enzym (J. 3iol, Chen.,' '" 237, 3786-3793 (1962)) ausschaltet. Die Tatsache, dass< die sich ergebende Replicase frei von störenden und unerwünscht einwirkenden Aktivitäten ist., macht es möglich, diese in einem einfachen Gemisch zu untersucr.Gr;, v/el-. ehes nur die erforderlichen Ionen·, Substrate und Schablone! enthält. - .

Die Unterscheidungsmerkmale der gereinigten Replicasen, die oben beschrieben wurden, können wie folgt zusammengefasst werden: (a)'vollkommene Abhängigkeit von hinzugesetzter RNSi (b) Fähigkeit für längere Synthese -(mehr als'5 Stunden) von BHS; (c) Fähigkeit zur vielmaligen Synthese der Sinführungs-Schablone; (4) Satti--' gung bei niedrigem Niveau von RNS (1 μg RNS pro 40 μg Protein); (e) tatsächlich ausschliessliches Bedürfnis für die homologe Schablone unter optimalen lonenbedingungen.

' Angesichts der .sehr unterschiedlichen Reinheitsgrade ' ^: ist es schwierig, die Unterschiede bezüglich der Eigenschaf ten der erfindungsgernäss beobachteten Enzyme, -verglichen mit denjenigen,· die von anderen Verfassern ent- -

deckt oder isoliert wurden* zu beschreiben. Die.von ...... ■',.". . . - ■■*-■-- '

' hinzugesetzter RNS- unabhängige Aktivität legt die Tatsache nahe, dass die Reinigungen keine Entfernung.der

■--■■,-;-.-■ ι- -.-■ -, ■■ ..--.-, .-■■ '---:■ jedem

verunreinigenäen Rlv^TS bewirkt, haben, χιηά verhindert iny

90988 7/1691

BAD ORIGINAL

I- fall. die Prüfung der Schablonensp_NezifitMt . -■;■;"

Der Vergleich der beiden berichteten Replicasen zeigt, dass jede' ihre, homologe Schablone benötigt. Der Versuch■

'"■■; mit der Satellit-RNS (STNV) war einebesonders inter- ; essante; Prüfung. Reichmann zeigte (Proe. Nat'l. Äcad. < Sei., U.S. 52, 1009-lOlT (1964)), dass der Satellit , Virus nur soviel RNS enthält, um einen Gode·" für seihen \ eigenen Proteinüberzug zu liefern, was vermuten lasst, dass er.die Replicase seines Begleitvirus (TNV) für . seine Vervielfältigung anwenden muss. Das bedeutet entweder, dass der Satellit bezüglich der Sequenz dem Λ TNV-Virus verwandt ist, oder dass er eine- Eigensenafi; besitEt, welche ihm erlaubt, jede beliebige yirus-RiTS- Replicase zu verwenden^ Die Tatsache, dass STNV-RNS; .·' für keine: der beiden gereinigteji Replicasen als -Scha- .

."■ blone dienen kann, lässt erkennen, dass die" Antwort = in einer zumindest teilweisen Sequenz-Gleichartigkeit; zwischen den STNV- und TNV-Genomen zu-finden "ist; dies Γ ist noch durch das Experiment nachzuprüfen. - ·

Die gezeigten Spezifitätsbeziehungen führen zur Frage ι -:"' des von der Replicase benutzten Mechanismus zur Untere [ scheidung ihrer Schablone von anderen RNS-Molekülen. Die Einbeziehung einer beginnenden Sequenz ist'eine · . offensichtliche Möglichkeit, Der Erkennungsmechanismus: j jedoch ist wesentlich komplizierter/ da er sb_; abgestellt j

- : - ;■■":.- - ^:-' -■ s^:ein

909887/1601 : ^

BAD

sein muss, dass eine Vervielfältigung Von Fragmenten des eigenen Genoms vermieden wird, selbst wenn sie die Anfangssequenz enthalten.

Es dürfte klar sein, dass die Replicasen auf einen Reinheitsgrad gebracht worden sind, der die Durchführung zweifelsfreier Versuche erlaubt und zu der Hoffnung Anlass gibt, den Mechanismus des RNS-Vervielfältigungsprozesses aufzuklären.

■ Beispiel II 1. Biologisches System und Enzympräparat Der verwendete Bakterienvirus ist Qß und wurde von Watanabe (Nihon Rinsho, 22, 24j (1964)) isoliert. Der Gast- und Versuchsorga-nismus ist ein mutanter Hfr-Stamm von E. coil (Q13), der im Laboratorium von W. Gilbert durch Diane Vargo isoliert worden ist. Dieser Bakterienstamm hat die günstige Eigenschaft (Fed. Proc. 24, 293 (1965)), dass ihm Ribonuclease-I und RNS- · Phosphorylase fehlt.. Die Herstellung von infizierten Zellen sowie die nachfolgende Isolierung und Reinigung der Replicase entspricht in den Einzelheiten den Angaben des vorstehenden Beispiels I. Die Herstellung von Virus-Ausgangsmaterial und die Reinigung von RNS aus diesem erfolgte -gemäss dem Verfahren in Proc. Nat ¹I. Acad, Sei., U.S., 49, 353-360 (1963)).

909887/1691

BAD ORIGfNAl

2. Prüfung der Enzymaktivität durch Incorporierung von radioaktiven Nucleotiden ·

Das Standardreaktionsgemisch von 0,25 ml enthielt ausser 40 γ des Enzyms die folgenden Bestandteile in μΜοΙ: Tris-HCl, pH-Wert ?**#' 21; MgCl₂, 5,2; CTP, ATP, UTP und GTP jeweils 0,2. Die Umsetzung wird durch Zusatz von 0,15 ml neutralisiertem geÄättigtemPyrophosphat, 0,1-5 ml neutralisiertem gesättigtem Orthophosphat und 0,1 ml 8Oj6lger Trichloressigsäure in einem Eisbad beendet. Der Niederschlag wird auf ein Membranfilter übergeführt und 7-mal mit'3 ml kalter 10#iger Trlchloressigsäure ausgewaschen. Die Membran wird dann getrocknet und in einem Flüssigkeitsscintillationszähler wie vorher beschrieben gemessen. UTP^ wurde gemäss Proc. Nat Acad. Sei», U.S., 50, 905-911 (1963) synthetisiert. Es wurde bei einer solchen spezifischen Aktivität verwendet, dass die Incorporation ven 20.000 epm der Synthese von 1γ RNS entsprach, was die Verwendung von 20 λ -Proben zur Verfolgung der Bildung" markierter RNS erlaut»te> -

3. Isolierung des synthetisierten Produktes

Die von dem Reaktionsgemischλ abgenommenen Proben werden sofort in eiri Eisbad gebracht, und es werden 20/\ entfernt zur sofortigen Untersuchung der radioaktiven RNS, wie in Teil 2 vorstehend, beschrieben· Das Volumen wird dann mit TM-Puffer (IO"² m Tris, 5 x 10"^ m MgCl₀ pH-Wert 7*5) auf 1 ml eingestellt* Dann wird 1 ml,

909887Λ169Τ

: von

BADOBIQiNAU

von wassergesättigtem Phenol hinzugefügt und das Gemisch bei 5⁰C während 1 Stunde in starkwandigen Zentrifugenbechern aus Glas (Sorvall, 18 χ 102 mm) geschüttelt. Nach Abtrennung der wässrigen Phase vom Phenol durch Zentrifugieren bei 11,000 rpm während 10 Minuten wird nochmals 1· ml des TM-Puffers zu dem Phenol hinzugefügt, der dann durch I5 minütiges Umschütteln bei 5°C vermischt· wird. Dann werden wiederum die Phenol- und die wässrige Schicht voneinander getrennt und die beiden wässrigen Schichten vereint. Das Phenol wird durch zweimalige Ätherextrakt'ion entfernt, wobei dafür Sorge getragen wird, das Phenol von den Wänden der Zentrifugenröhren durch vollständige Füllung derselben mit Äther nach jeder Extraktion zu entfernen. Der in der wässrigen Phase gelöste Äther wird dann mittels eines StickstoffStroms enffernt. Die RNS wird ausgefällt durch Zusatz von 1/10 Volumen Kaliumacetat (2m) und 2 Volumina von kaltem abs. φ Äthanol. Die Proben werden 2 Stunden lang bei -20⁰C gehalten, bevor sie während 1 Stunde bei 14.000 rpm in einem Sorvall SS J4-Rotor zentrifugiert werden. Die Rückstandsplättehen werden abgetrocknet, und-der restliche Alkohol wird durch Aufbewahrung in einem Vakuumexsikkator unter vermindertem Druck während 6 bis 8 Stunden bei 5⁰C entfernt. Die RNS wird dann in 1 ml Puffer (1O~² m Tris, 10~² m MgCl₀, pH-Wert 7*5) aufgelöst^ und die Proben werden sofort für die

909887/169 1 Infektions-

BAD ORIGINAL

untersuchung
Infektionsfähigkeils entfernt. Die durch Trlchloressig- *säure ausfällbare Radioaktivität wird gemessen an 20y\ -Anteilen des Endproduktes, aus denf dieJirOzentuale Gewinnung* der synthetisierten. RNS bestimmt werden kann. Im Bereich von 1 bis 8 /γ wurde gefunden, dass im allgemeinen 65$ der synthetisierten RNS gewonnenwurden. Alle gereinigten Produkte wurden hinsichtlich deö Vorliegens intakter Virusteilchen durch Untersuchung- an ganzen Zellen geprüft; es wurden keine gefunden.

4. Prüfung hinsichtlich Infektionsfähigkeit der synthetisierten RNS · ^v-

Das verwendete Verfahren ist eine Modifikation der Sphäroplastenarbeitsweise -von Guthrie und Sinshelmer gemäss J. Mol. Bio!,,. 2, 297 (196Q), Die notwendigen Bestandteile waren folgende:

; (A) Medium l· ' :__:'-~^:~ : / Das verwendete Medium ist eine Modifikation des 3XD*-Mediums von Fräser and Jerrel (J.-Biol, Chem., 205, 291-295 (1953)) und enthält in g/l die folgenden Bestandteile: Na₂HPO₄, 2 g; KH₂PO₄, 0,9 g; NH₄Cl, 1 g; -Glycerin (Pisher-Reagenz), JO gji Difco-Hefeextrakt, " 5Q mg; Qasaminosäureh (Difco, vitamihfi*e£), 15 g; L-Methionin," ICL^mg; D, L-Leucin, IO wg; MgSO₄^TH₂O, 0,5 g. Diese Bestandteiie werden vermischt in der angegebenen Reihenfolge in 5OO ml glasdestilliertem Wasser. Hierzu werden schliessiich weitere 500 ml, die 0,3 ml m GaOl₂ enthalten, hinzugefügt. ^^

(B) Sucrose-Nährlösung (SNB) '

Die SNB enthält in g/l folgende Bestandteile: Casaminosäuren (Difco), 10 g; Nährlösung (Difco), 10 g; Glucose, 1 g; Sucrose, 100 g., Nach Autoklavieren wer-.derr folgende Stoffe unter aseptischen Bedingungen hinzugefügt: 10 ml 10# MgSO₂^ und 3,3 ml 30#iges Rinderserumalbumin (BSA) von Armour Laboratories.

(C) Für die Herstellung der Sphäroplasten erforder-

liehe Reagenzien

Die folgenden Lösungen sind notwendig zur Herstellung von Sphäroplasten: Lysozym ,(Sigma) 2 mg/ml in 0,25 m Tris-Puffer, pH-Wert 8,0; Protamlnsulfat von Eli Lilly and Co., 0,1$; und sterile Lösungen von JO^igem BSA; 0,25 m Tris (Trizma), pH-Wert 8,0; 0,01 m TriSr Puffer, pH-Wert 7,5 und 8,0; 0,5 m Sucrose; EDTA in 0,01 m Trispuffer, pH-Wert 7,5.

Zur Herstellung der Sphäroplasten wurde eine über Nacht gewachsene Kultur von Q13 in dem JXD-Medium zuerst mit einem frischen Medium bis zu einem ^0D660 ^von °'°6 verdünnt. Die Kultur wird bei 30°C bis zu einem OD^g₀ zwischen 0,2 und 0,22 weiter gezüchtet und die^-ZeIlen bei Raumtemperatur abzentri-•fugiert,(spun down). Das Rückstandsplättehen von 25 ml der Zellen wird zuerst in 35 ml 0,5 m" Sucrose" plus 0,1 ml 0,25 m Tris-Puffer, pH-Wert 8,0> sus^

pendiert. 90988 7/1691 :

BAD ORSGÜSäAL

pendiert. Dann werden 0/01 ml Lysozym hinzugefügt und danach 0.,OjJ ml EDTA. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur, wenn die Umwandlung zu Sphäroplasten 99,9% beträgt, werden 0,2 ml dieses Ansatzes mit >,8 ml SNB verdünnt, und es werden 0,025 ml Protaminsulfat zugefügt. Die Sphäroplastenmasse wird mikroskopisch vor der Weiterverarbeitung geprüft. Das Vorliegen von nur 5$ Bruchstückender Sphäroplasten zeigt ein Präparat an, das beim Agarplattenversuch nur eine geringe Wirksamkeit ergibt. In Übereinstimmung mit Paränchych (Biochem. Biophys.. Res. Commun.,* 11, 28 (1963)) wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass Protamin die Wirksamkeit der Entdeckung infektiöser RNS erhöht. Die optimale Protaminkonzentration im vorliegenden System ist jedoch bedeutend niedriger als die von Paränchych verwendete.

Die RNS-Infektion wird üblicher Welse ausgeführt bei Raumtemperatur mit Lösungen, die 0,5 Y von RNS/ml enthalten, eine Konzentration, bei der das Untersuchungs-· verfahren nicht durch die Anzahl des Sphäroplasten pro infektiöser Einheit beschränkt ist.'Es werden zu 0,2 ral/ RNS 0,2·ml des Sphäroplastenmaterials hinzuge-

fügt,, das etwa 3 x. 10 Sphäroplasten enthält. Die Proben werden vermischt, und es wird sofort eine anteilmassige Menge entfernt und in geeigneter Weise mit_; SNB verdünnt, ehe der Plattenversuch mit L-Agar unter Verwendung von QlJ als Indikator vorgenommen wird.

, 90 9887/169 1 Die

Die verwendete weiche Agar-Schicht (0,7$), die 2,5 ml ausmacht, enthält 10$ Sucrose, 0,1$ MgSO^ und 0,01 ml 30$ige BSA pro Glas" plus 0,2 ml einer über Nacht gewachsenen Kultur von QlJ. Um Reproduzierbarkeit zu erhalten, wird die Späroplastenmasse 15 bis 45 Minuten nach der Verdünnung mit SNB verwendet. Die Wirksamkeit des Plattenversuches (e.o.p.) liegt gewöhnlich zwischen 2 - 8 χ ΙΟ"⁷. Höhere Wirksamkeiten ( > 1 χ 10"⁶) können eher erzielt werden, wenn die Sphäroplastenmässe

sofort nach der Verdünnung verwendet und eine Stabi-

■ .Chen

lisierungszeit bei den SNB-Verdünnungsröhr^/ . einbezogen wird, als durch eine sofortige Agar-Plattenuntersuchung. Diese höhere Agar-Plattenwirksamkeit fällt jedoch schnell ab und macht es schwierig, reproduzierbare Duplikate bei wiederholten Ansätzen zu erhalten. Da die Reproduzierbarkeit wichtiger war als die Wirksamkeit, wurde das oben im einzelnen aufgeführte Prüfverfahren verwendet.

5. Ergebnisse

Bei "Muster"versuchen., die Infektionsfahigkeitsuntersuchungen von enzymatisch synthetisierter RNS ein-, schliessen, ist es wichtig zu erfahren, dass selbst hochgereinigte Enzyme aus infizierten Zellen, obwohl sie nachweisbar keine intakten Zellen enthalten, wahrscheinlich einige Virusteilchen enthalten. Vom chemischen

909887/1691

. 162QS4S

■- - - 57 ,.- ■ . ■ .. . ■/-■■■-..■ "■■" ;;"■

sehen Standpunkt aus ist die Verunreinigung belanglös, da sie sich auf 0,l6 γ Nucleinsäure und 0,8 γ Protein für jeweils 1*000 γ Enzymprotein, das bei den vorliegendenVersuchen verwendet wurde, beläuft. Da 40 y an Protein für jeweils 0,25 ml der Reaktion verwendet Werden, ist der Beitrag der Teilchen zu den gesamten ; RNS nur 0,006 γ, was in Vergleich zu setzen ist mit den 0,2 γ der Einführun&s-iiiiSunä den·5-20 γ; die bei der üblichen Arbeitsweise ■- synthetisiert werden. Es konnte in Kontroll versuchen gezeigt werden, dass RTTS, die aus Teilchen in dem Heaktionsgemisch frisch extrahiert

nicht ■■'-, , "'- in

wurden/infektiöser sind als diejenigen, welche aus dem / üblicher Weise gereinigten Viruspräparat gewonnen wurden*, Weiterhin beweist das obligate Bedürfnis für zugesetzte · RNS, dass innerhalb der verwendeten Inkubationszeiten diese kleine Menge an RNS entweder zur Einleitung der Reaktion nicht angemessen ist oder nicht zur Verfügung steht. Diese Teilchen beeinflussen also !unwesentlichen ,weder die chemischen noch die enzymatischen Gesichts- " punkte des Versuches. Wegen Ihrer höheren infektiösen Wirksamkeit Jedoch können selbst massige Mengen ah intaktem Virus bei den Prüfungen hinsichtlich der synthetisierten RNS auf Infektionsfähigkeit. nicht* geduldef werden» Demzufolge wurdai sämtliche RNS-Präparate vor dem Versuch mit Phenol behandelt (vergl, die Arbeitsweise in Beispiel TI, Teil >)*,, Weiterhin wurden -

.... ^{; :} ' . ; /"■ ' die '■■■■. 90988 7/1691

die phenolgerelnigten RNS routinemässlg auf vollständige ,Virusteilchen geprüft, und bei den hier erörterten Versuchen wurden keine gefunden,

Beispiel III

Es wurden Experimente durchgeführt, bei denen das* kine-■ tische Verhalten beim Auftreten von neuer RNS und infektiösen Einheiten auf zwei unterschiedliche Arten geprüft wurde. Die erste zeigte, dass die Anreicherung an radioaktiver RNS begleitet wird von einem propor-. tionalen Anstieg der infektiösen Einheiten. Die zweite bewies anhand eines serienmässigen Verdünnungsversuches, dass die neu synthetisierte RNS infektiös ist.

1. Prüfung der Infektionsfähigkeit des gereinigten

Produktes

Um das.Auftreten der neuen RNS und infektiösen Einheiten bei einer ausgedehnten Synthese zu vergleichen, wurden 8 ml eines Reaktionsgemisches angesetzt, das die notwendigen Komponenten in den in Beispiel II, Teil 2, angegebenen Konzentrationen enthielt. Es wurden nach den'für die Bestimmung von radioaktiver RNS angegebenen Zeiten und Reinigung des Produktes für die Infektlonsfähigkeitprüfung Anteile abgenommen. Die Er-

co ^

_o gebnisse, die die Kinetik der RNS-Synthese und die

cx> Bildung von infektiösen Einheiten betreffen, werden oo -° in FIg. 4 zusammengefasst, und zwar in Form einer

ο, halblogarlthmischen Aufzeichnung gegen die Zeit des

co .

-». beobachteten Anstiegs sowohl bei den RNS als auch

den Infektlösen Einheiten.

BAD ORIGINAL

Für die Werte gemäss Fig. 4 wurde ein 8 ml-Reäktionsgemisch angesetzt, das die Bestandteile in den in Beispiel II, Teil 2, angegebenen Konzentrationen enthielt. Proben wurden wie/folgt abgenommen: 1 ml zur Zeit O und nach 30 Minuten, 0,5 ml nach 60 Minuten, 0,3 ml nach 90 Minuten und 0,2 ml nachfolgend in entsprechenden Zeitabständen. Es wurden 2Q")\ zur Untersuchung auf incorporierte Radioaktivität, wie in Beispiel II, Teil 2, beschrieben, entfernt,Die RNS aus dem Rest wurdegereinigt (Beispiel II, Teil 3), wobei die Radioaktivität in dem Endprodukt zur Prüfung der erhaltenen Ausbeute bestimmt wurde. Infektionsfähig- . keitsprüfungen wurden gemäss Beispiel II, Teil 4, durchgeführt. . .

Die Menge an RNS (0,8 γ/ml), die zur Zeit 0 eingegeben wurde, liegt wesentlich unter dem Sattigungsniveau des vorliegenden Enzyms.. Dementsprechend nimmt die RIiS autokatalytisch während etwa der ersten 90 Minuten zu, und zwar mit nachfolgender Synthese, die linear mit der Zeit verläuft, ein Merkmal-, das schon vorher beobachtet worden war. Es ist festzustellen, dass der Anstieg der RNS-Menge parallel läuft mit einer Zunahme der Zah> der infektiösen Einheiten. Während der 240 minütigen inkubation fand eine 75-fache Vermehrung der RNS und eine 35-i"^ache ^Termehrung der

■..■■"'" . .infektiösen

909887/169 1

BAD

infektiösen Einheiten über diejenige Menge hinaus statt, die zur Zeit O vorlag. Diese Zahlen stimmen überein mit den Genauigkeitsgrenzen des InfektlonsfähigkeitsprüfVerfahrens. Mit einem anderen Enzympräparat durchgeführte Experimente brachten Ergebnisse, die mit den oben beschriebenen völlig übereinstimmen.

Es ist offensichtlich, dass man den Nachweis für eine Zunahme der Zahl der infektiösen Einheiten erbringen kann, die parallel läuft mit dem Auftreten neu synthetisierter RNS. -."■■.;. .

2. Beweis, dass die neu synthetisierten RNS-Moleküle infektionsfähig sind

Die Art der oben beschriebenen Versuche zeigt deutlichdie Infektionsfähigkeit der radioaktiven RNS auf. Sie sind jedoch nicht beweiskräftig, weil sie nicht die Möglichkeit ausschliessen , dass die beobachtete Übereinstimmung zufällig ist. Man könnte argumentieren, dass das Enzym die Infektionsfähigkeit der Ein-_: führungs-RNS "aktiviert", während es neue nicht-infektiöse RNS. synthetisiert,und dass das ziemlich komplizierte, Gemisch der exponentieIlen und linearen'Kinetik der beiden Prozesse zufälligerxweise übereinstimmt.

Ein direkter Beweis, dass die neu synthetisierte RNS infektiös ist, kann prinzipiell erbracht werden durch Versuche," die N * -. $ - markierte Anfangsschablonen unter Erzeugung eines N - P^ - markierten Produktes

9 0 9 8 8 7/1691

verwenden.

BAD ORIGINAL

verwenden. Die beiden lassen sich dann trennen (Proc. Nat.¹I* Acad. Sei,/· U-.S., 49, 355-360 (1963)) in Gleichgewichts -Dichtegradienten -von Cs₂SO₁,. Derartige Versuche sind für andere Zwecke bereits durchgeführt worden. Die Steilheit der Cs₂SO^ Dichtegradienten macht es jedoch schwierig, eine Trennung herbeizuführen, die eine genügende Reinheit bietet, um vollständig zufriedenstellend zu sein.

Es besteht jedoch noch eine weitere ÄnnäherungsmÖglichkeit, die diese technischen Schwierigkelten umgeht und aus der Tatsache Vorteil zieht, dass es sich im vorliegenden Falle um eine sich selbst vermehrende Einhext handelt. Es möge eine Reihe von Reagenzglas " sern vorliegen, von denen jedes 0,25 ml des Standardumsetzungsgemisches, aber keine hinzugefügte Schablone enthält. Das erste Glas wird mit 0,2 γ Qß-RNS beimpft und solange irikubiert, bis eine Synthese verschiedener γ radioaktiver RNS eingetreten ist'. Eine anteilige Menge (50 X) wird dann "auf das zweite Glas übertragen, worin man die Synthese etwa der gleichen Menge ah RNS ablaufen lasst, davon wird wiederum -ein Anteil' auf ein drittes Glas übertragen usw. Wenn jede aufeinanderfolgende Synthese RNS produziert, die dazu dienen kann, die nächste einzuleiten, kann der Versuch solange fortgesetzt werden, bis ein Punkt erreicht ist, an dem die anfängliche RNS des Glases 1

909087/1691 " bis-

bis zu einer unbedeutenden Menge verdünnt ist. Tat~ sächlich können genügend Übertragungen durchgeführt· werden um sicherzustellen, dass das letzte Glas weniger als einen Strang des Einführungssubstrates (primer) enthält. Wenn in allen Gläsern einsehliesslich des letzten die Zahl der infektiösen Einheiten der Menge der radioaktiven RNS,die gefunden wurde, entspricht, dann ist der überzeugende Nachweis erbracht, dass die neu synthetisierte FINS infektiös ist.

Tabelle 6 zeigt nachfolgend einen vollständigen Ablauf eines derartigen serienmässigen Übertragungsversuches, und die entsprechende Legende liefert die notwendigen Einzelheiten der Versuche und Berechnungen. Es wurden 16 Gläser benutzt. Das erste (Glas 0) stellt eine nicht-inkub'ierte Kontrolle beim Zeitpunkt 0 dar. Es ist darauf hinzuweisen, dass die aufeinanderfolgende Verdünnung derart war (1 zu 6), dass bis zum B.Glas weniger als eineinfektiöse Einheit den einleitenden 0,2 y der RNS zuzuschreiben war. Nichtsdestoweniger zeigte das gleiche Glas 8,8 χ 10-³ neu synthetisierte infektiöse Einheiten während der 30 Minuten seiner Inkubation. Schliesslich produzierte das Glas 15, welches weniger^ als einen Strang der ursprünglichen

12

Einführungsmenge enthielt, 1,4 χ 10 neue Stränge und 5,2 χ 105 infektiöse Einheiten in 20 Minuten.

Es

909 88 7/169 1

'■■■■■.-. BAD ORIGIfSJAL

Es ist zu beachten., dass das Kontrollglas, dem keine RNS, hinzugefügt worden war, 60 Minuten lang inkubiert worden ist. Verglichen mit Glas 1, in dem 4.800 cpm für jeweils 20 in 40 Minuten ineorporiert wurden,, zeigte die Kontrolle keinen Anstieg über das Niveau von 80 cpm bei der Zeit 0. Weiterhin konnte' kein Anstieg bezüglich der infektiösen Einheiten in diesen Kontrollen beobachtet werden.

. Tabelle 6

909887/169 1

BAD ORIGINAL

ο:	O U5	—^	O	O	O	KN	CJ	LP1ONlTiH	HHHHHHH
6 ί	H M	H	.Ή	H		O	LfN ·.
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r-i r-¹. r-t r-'. r-i i->.

909887/1691

BAD ORiGiNAt

Tabelle 6 (Fortsetzung)

	Bildung	Il Serien^tJbertragungs-Versuch	13	14
	11	von IU	Beobachtete	·%■
' ι. ' ■■''■	χ 10-5	12	e.o.p X 10^7	Ausbeute an p32-RNS
Übertragung Nr.	1,0 -	χ 10~5	•5,5	« · O
O	5,2	1,0	3,2	54,2
1	2,2	5,2	2,0	88,3 .
2	11,3	6,5 -	5,3'	59,9
3	5,7	17,4	3,0 ;	42,5
4	; 7,4	21,2	. · 3,0	65,4
■ ■ 5 ■ ' · ■ '	15,0	27,6 :· .	3,7	82>4
>: ■ β ■ , : ■·■■	13,4	'56,4 ■■·■·:	5,0	52,9
■■■■■■■ ■ ι .■·.,.'	8,8	48,1 ;	5,2	. :..■ -51,4
. . 8 /	: 5,6'	54,7	■2,0	92,6 -
■.■;.-· · 9	9,3	58,4 ■·.	4,0	54,2 . .
■ 10	6,5 ί	66,8	3;7	•74,3
11 "	' 6,9	73,7	7>0 ,	46,8
12	3,6	84,3 .	4,0	49,2
13	10,8·	89,4-	5,7	. 79,7
14 .■ ·	3,2	102,0	5,5	65 4
;, ' 15' ' Λ	105,0

m > α

30

fs)

Serienübertragungsversuch (zu Tabelle 6 gehörig)

Es wurden ΐβ Umsetzungsgemische.von 0,25 ^l angesetzt, ■ ■ von denen jedes 40 γ Protein und die anderen Komponenten, die für den Standardversuch gemäss obigem Beispiel II aufgeführt wurden, enthielt, 0,2 γ der Schablone RNS wurden zu den Gläsern Ound 1 hinzugefügt; RNS wurde aus ersterem sofort extrahiert, und das letztere wurde 40 Minuten lang inkubiert. Dann wurden 50 λ von Glas 1 in das Glas 2 übertragen, das 40 Minuten lang inkubiert wurde, und 50 Λ von Glas 2 wurden dann in Glas 3 übertragen usw., wobei jeder Schritt nach dem ersten eine 1-6-Verdünnung des Einführungsmaterials umschloss. Jedes Glas wurde aus einem Eisbad lh ein Wasserbad von 35°C wenige Minuten vor der Verwendung übertragen, um einen Temperaturausgleich herbeizuführen. Nach der Übertragung aus einem gegebenen Glas wurden 20 Λ entfernt, um die Menge an synthetisierter P^-RNS zu bestimmen, und das Produkt wurde von dem' Rest, wie im obigen Beispiel II besehrieben, gereinigt. Kontrollgläser, die 60 Minuten lang ohne Zusatz der 0,2 γ RNS inkubiert worden waren, zeigten weder eine nachweisbare RNS-Synthese noch irgend eine Bildung infektiöser Einheiten.

Alle numerierten Ansätze wurden auf ein Normalvolumen von 0,25 flil gebracht. Die Spalten.1, 2 und 3 beziehen sich auf die Übertragungsnummer, das für die Synthese gegebenen Zeit-' interval! bzw. die verflossene Zeit vom Zeitpunkt. 0 aus. Spalte 4 zeigt die Menge an radioaktiver RNS, die in jedem Glas nach Beendigung der Inkubation gefunden wurde,und Spalte 5 die Gesamtmenge an RNS in jedem Glas; Spalte 6

gibt die Gesamtsynthese während des Zeitintervalls an.

die

Spalte 7 führt/gesteigerte Synthese der RNS auf. Die abfallenden Konzentrationen der Einführungs-RNS, die sich aus den serienmässigen Verdünnungen ergeben-, werden in y in Spalte 8, die Zahl der Stränge in Spalte 9 und die infektiösen Einheiten :(IU). pro-Glas in Spalte 10 wiedergegeben. Die letztere; ist aus Spalte 9 und aus der

909887/1691 ... - Wirksamkeit

BAD ORIGINAL

Wirksamkeit der Agar-Platten-Ergebnisse (e.o.p.) von 5 χ IO - berechnet worden. Spalte 11 zeigt die Zunahme an infektiösen Einheiten, die während jeder Syntheseperiode beobachtet worden ist und die hinsichtlich der Wirksamkeit der Ausbeute (Spalte 14) korrigiert wurde. Spalte 12 gibt, die entsprechende Summe wieder. Spalte 1J> zeigt die Agar-Platten-Wirksamkeit (e.o.p. )* die aus der beobachteten Anzahl von Plaquen (Spalte 11) bestimmt wurde, sowie die tatsächliche Menge an RNS, die untersucht und aus den Spalten 6 und 14 bestimmt wurde. Spalte 14 beruht auf Untersuchungsergebnissen von säuregefällter Radioaktivität an 20 Λ -Anteilen des Endproduktes im'Vergleich zu Spalte 5· . ■ -

9098877169Ί

■■'■-. BAD ORIGINAL

-DO-

Pig. 5 betrifft die RNS-Synthese- und die Bildung von infektiösen Einheiten bei einem serienmässigen Übertragungsversuch und vergleicht die mit der Zeit angehäuften Zunahmen der neu synthetisierten RNS (Spalte 7> Tabelle 6) und infektiösen Einheiten (Spalte 12, Tabelle 6). Alle Einzelheiten von Fig. 5 sind in der obigen Tabelle 6 beschrieben, und die Daten aus Spalten 7 und 11 der Tabelle 6 entnommen und gegen die verflossene Zeit (Spalte 3) und die entsprechende Übertragungsnummer (Spalte 1) aufgetragen. Beide Ordinaten von Fig. 5 beziehen sich auf die Mengen, die in den 0,25 ml-Anteilen gefunden wurden.

Die Übereinstimmung zwischen dem Zuwachs der synthetisierten RNS und₍der neu auftretenden infektiösen Einheiten ist in jeder'Stufe der Serienübertragung ausgezeichnet - undgeht kontinuierlich bis zum letzten Glas. Lange nach Verdünnung der Einleitungs-RNS auf unbedeutende Mengen dient die RNS, von einem Glas zur Initiierung der Synthese in dem nächsten. Weiterhin, wie sich ergibt aus der verhältnismässigen Konstanz der Infektionswirksamkeit (Fig. 5 und Spalte IJ von Tabelle 6), ist die neue RNS genau so wie die ursprüngliche Virus-RNS geeignet, die Synthese von Virusteilchen in Sphäroplastenzu synthetisieren.

Um den Beweis zu vervollständigen war es notwendig zu zeigen, dass die durch die synthetisierte RNS produzierten Viren tatsächlich Qß waren, d.h. die ursprüngliche Quelle

der

909887/1691 - :

BAD ORiGiNAL

_._:69 ■;. . ; 162084S

der RNS,. die zur Einleitung des ÜbertragungsVersuchs als Einsaat in Glas 1 verwendet wurde.. Da Qß ein ein-, maliger serologischer Typ ist (Nihon Rihsho, 22, 24>_y (1964)), wurde diese's Merkmal als bequemer diagnostischer Test Verwendet, Pläquen, die durch die in Glas 15 synthetisierte RNS induziert wurden, wurden zur Herstellung der Lysate verwendet, und die sich ergebenden Teilchen AntiserexL gegen MS-2 und Qß ausgesetzt. Die in Tabelle kurz zusammengefassten Ergebnisse zeigen deutlich, dass' die synthetische RNS Virusteilchen des·gleichen serologischen'Typs wie die authentische Qß'hervorruft, ^:

. ^: ," ; ; -,.."= Tabelle 7

909887/1691 ^;> \ '^ ^; " ^;

■■■■■-■■- BAU

"synthetische" RNS⁺' gebildet worden sind.

O CO CD OO

1,

Zeit

O ■

1,

Anti-Q,ß

überlebende

Zeit

Anti

O

-MS-2

io8

überlebende

Viren ■ ^^\^

1,

9 x

108^

8,

10 Min.

0,052

1,1

χ ΙΟ8

10 Min.

108

■ 96

Authentische Qß

5 x

ίο?;.

Ox 10-3

0,053

1,5

χ ΙΟ8

1,06 χ

93

Virus aussynthe-' tischer RNS

8 χ 104

1,40 x

In allen Fällen wurden Lysate aus E. coli Q13 hergestellt, das auch als .Untersuchungsorganismus verwendet wurde. Die Antiseren wurden mit l/lüO Verdünnung verwendet., und die Inkubationstemperatur betruß 35 C. Die Nummern geben die Plaqueh-Bildner pro ml wieder.

TO CD cn

cn

Es ist vielleicht verstellbar, dass ein einen komplexen Kopierprozess ausführendes Enzym eine hohe Fehlerfrequenz zeigt, wenn es in einer unnatürlichen Umgebung arbeitet, wie sie bei enzymologischen Versuchen vorliegt. Wenn dieses eine quantitative und ins Gewicht fallende Komplizierung \väre, müssten'sich biologisch inaktive _- Stränge entsprechend dem Portschreiten der Synthese, angereichert haben. Dass dieses nicht der Fall ist, wird eindeutig erläutert durch den Serienubertragungsversuch (Tabelle 6, Fig. 5). Die nach der 15. Übertragung synthetisierte RNS ist biologisch in-gleicher Weise geeignet wie initiierendes "Natur"material, das . von Virusteilchen stammt.

Die erfolgreiche Synthese einer biologisch aktiven Nucleinsäure mit einem gereinigten Enzym"ist selbst von offensichtlichem Interesse. Ein fruchtbarer Aspekt hinsichtlich einer möglichen Anwendbarkeit beruht jedoch auf dem Nachweis, dass die Replicase tatsächlich identische Kopien der Virus--RNS' erzeugt. Es ist zum ersten Kai ein System verfügbar gemacht Korden, das es er- laubt, die molekulare Grundlage, die der Vervielfäl-..: tigung einer sich selbst vermehrender, ^cleinsäure/ zu Grunde liegt ^analytisch zu erfassen; Jeder notwendige Schritt und Bestandteil für die vollständige Vervielfachung muss bei.dem beschriebenen Reaktionsgenisch gegeben sein. Wenn zwei Enzyme benötigt werden

. ■ ' ■ - " ■ - ■ (Fed.

909887/1691 —

BAD ORIGINAL

(Fed. Proc., 23, I285-I296 (1964)), müssen beide vor-

c te
liegerij und es soll/ möglich sein, ■'entweder ihr Vorliegen festzustellen oder zu beweisen, dass nur eins erforderlich ist. Wenn ein dazwischenliegender "vervielfältigender" Schritt zwischen der Schablone und der endgültigen identischen Kopie liegt (Fed. Proc, 2j5j 1285-1296 (1964)), dann müsste eine "replikative Form" in dem Umsetzungsgemisch nachweisbar sein. Falls der Kopievorgang direkt verläuft, dürfte kein derartiges Zwischenprodukt gefunden werden.

Beispiel IV 1. Verfahren

Der Gast- und Untersuchungsorganismüs ist E. coli QlJ* eine Hfr-Mutante, der Ribonuclease-I und Phosphorylase (Fed. Proc, 24, 293 (1965)) fehlt. Das Virus ist Qß und wurde von Watanabe (Nition Rinsho, 22, 24^ (1964)) isoliert. Alle Verfahren zur Herstellung infektiöser Zellen, zur Reinigung der Replicase, zur Synthese radioaktiver Substrate und zur Prüfung und Bestimmung der Enzymaktivität sind oben im einzelnen beschrieben worden.

. " *■■'■'

Zerlegung

Die RNS des QS-Virus ist einer enzymatischen/offensichtlich mehr zugänglich als die von MS-2, und daher muss bei der Herstellung der RNS aus diesem Virus Sorgfalt und Schnelligkeit angewendet werden.

Die Verfahren waren wie folgt: E. coli (Ql>)-Kulturen 909887/1691 _mraea '

• BAD ORIGINAL

wurden, bis zu einejix QBgg₀ zwischen 0,2 und .Q, j in . . ■-■ '-. Gegenwart von MS-2-Antise:p,uni bei' eine-r Verdünnung. V-QR 1 :;: 10,000 ■gezüchtet« Die gf^Phägen werden^hinzugesetzt-.b@i einer jCnfektionspiulfeiplizifeät von 10> und die Kultur wird 50 Minuten lang bei -37⁹S ohne SQntlttsln"inkU:öie.rt, Die· Kulturen werden dann duröh Scnütteln-Idielüftitj. naoli etwa:2 itundgri Lysis auftritt. Das SeMtteln weitere 4 Stunden fortgesetzt, und clann werden; äie türen abgekühlt. Das. Lysat wird 10 ;Minuten l4ng -bei 3,OQO % g gentrifugiert:, und e^:§. werden 311 g. gulfat tß- tite^ des abgekühltin^-über§tand.§§ ^in gefügt» Niaoh 3 bis 4 atunägn bei 5^öö weräen di© fe tit durah fgntrifugiQrifi bei 15,000.3ξ g

, Si© w^rd.en godanji in §inga 3?M*Pufftp - · ■ g se iq^ä^-m Mgeig> pH-Wept TiS^witäiP und zweimalVwßhrend. .g itund.§Pi gaitn . - . ■ ' fM^:-Pufi?ra äial^Bier^/.;.. Sie ihagefe-Süspsäwird dann _iq Minuten lang'bei- lO.ÖOO χ g

fugierfe und öle. üb§rst§h&nö@ ι Stund© bei 3Q°a mit ppena&e (1 mg/ml)

ybig um und" die- MS- (

2· Ergebnisse

(A) Absprechen auf bruchstückarti^e 0,9,-RMS

Zn Bruchstücke zerlegte RNS-Moleküle v/erden leicht erhalten au§ Qß,. indem man die 4 Stunden dauernde/ Perioce der AmmoniumguifafcausfaHung auf 10 Stunden^ und aar-üoerhinaus verlängert, pig erhaltene HKS zsi^t rait-DeutXichlceit tine geordnete Zerlegung in BruchstÜQke, die durch 'das Auftreten von reprodugiertiaren Peaks" be st St igt v;ird, welehe niedrigers SedimentatiQnswerte aui'v/eiserj als die a8s dir intakten Vi^ug-RNS. Diese werden hinsiohtlich mit e4nsm SuQrdsegr&d.ienter, frsktiöraert, gg und dureh Alkoholausfällung konzentriert, I¹Ig, β geigt das Ansprechen der Repl'ioase auf intakte und bruQhgtÜOkartige 0,B-RIvS/ Die Sedinien gramrot ä@p drei Präparate werden in der Zeichnung von Fig.. β gezeigt. Dag erste' entspricht d@r intakten. Virus-RNS ,(SSS), di§, v/ie in Teil 1 besahriebiri, hergisttllt wurde. Dag zweite entspricht einem

·....■■■-■ ha.lbiertss i©il rait einem Mittelwert von etwa. 17S und das dritte beiitgt eine Seäirnentations-KQeffizienteh von 78, Das Ansp.r-esheii; der Repliaase auf. die drei HN3«

e "wii'd in FIg, 6 gegeigt, S-s ist ergiohtlich, § äa§ bruchstUakartig© Material nicht irnstande ist/ , die Rgplicasi auf einen Wert, d©r auch nur annähernd ihrer völlitindigen Aktivität entspricht;, anzu.regan»

.. Insbesondere ,

.'- 9-09-887/1681

BAD GRIGiNAL

Insbesondere stellt die eingefügte Zeichnung in Fig. 6 ' die Verteilung eines linearen Sucrosegradienten (2,5 ~-, Vj%) von RIiS dar, die, wie in Teil 1 oben beschrieben, hergestellt und fraktioniert wurde. ■ Jedes Präparat lief in einem getrennten Behälter 12 Stunden lang bei 25.000 rpm und 4⁰C in einem SW-^S-Spinco-Rotqr mit Markierüngssubstanzen (Mb ο some-RNS),, um die Bestimmung der S-Werte durchzuführen. Die Sehablonenfunktion jeder Grö'ssenklasse der RNS wurde bestimmt gemäss dem im obigen Beispiel I beschriebenen Versuch. Ausser 40 {ig Protein enthielt jedes Standard-Reaktionsvolumen von 0,25 ml die folgenden Bestandteile in μ Mol; Tris-HCl, pH-Wert T,^, 21; MgCl^y 3,2; MnClg, 0,2) CTP, ATP, UTP und GTP, jedes G,2. Die Reaktion wird bei 35°C 20 Minuten lang ablaufen gelassen und in einem Eisbad beendet, wonach Ausfällung mit Trichloressigsäure und Auswaschen auf einer Membran erfolgty^Weeks FlüssigkeitsscintillationsZahlurigi -wie in Beispiel I oben beschrieben. "UTP- , das nach Haruna et äl (Proc. Mat-'l^ Acad. Sei., U.S. 50, 905 (1963)) -synthetisiert ivorden war, wurde in einer Menge von 1 χ IG cpm/0,2 μ KoI. verwendet, "

.'-.. (B) Die Hirkun?~ von Kangan auf .die Grosse
■ und das Sequenzbedürfnis der Repileäse

Im Verlauf der Prüfung der Schablonenspezifität und <ies GrÖssenbedürfnisses der Qß-Replicase vmrde ein eindeutiger Effekt von Mangan aufgedeckt..Eine typische

■■■;.■■■. - . '■ . ;: Reihe -.'. 909β87/1691 "" ™-'

-, 76 -

1620845

ist die Pähig-

i :

Reihe von Ergebnissen ist in der nachfolgenden Tabelle 8

zusammengestellt. In Gegenwart von Mg

keit.sowohl des 17S*-Pragments als auch der das Enzym anzuregen, fast zu vernachlässigen entspre*- ^; chend den 2 bzw. 4$ von derjenigen;, die bei intakten ■ , ' RNS beobachtet wurde. Falls andererseits Mg⁺* durch Mn⁺⁴" ersetzt wird, ist eine wesentliche Änderung zu beobachten.

Die normale Synthese mit 28S-RNS"wird, stark gehemmt, -. _; wohingegen: die anomalen Aktivitäten 'angeregt werden** (lie bei 17S- und RYMV-RNS beobachtet werden. Wenn man tat- ' > sächlich die optimalen Bedingungen für die Funktion dieses Enzyms nicht keimen würde, könnte man versucht?

sein, aus den mit Mn erhaltenen Ergebnissen zu folgern; -.

dass.die Q;ß-Replicase TYMV-RNS als Schablone bevorzugt / und dass sie verhältnismässig indifferent ist gegenübei? · * der Grosse der RNSj mit der zusammen sie arbeitet-*

Tabelle 8

909887/1601

BAD ORIGINAL

• '/'■ .-'
Wirkungen' von Mg und Mn auf die Schablonenspezrfität der Replicase

,, ·..·. Incorp.

. Schablone Mg (μΜοί) Mn (μΜοί) · cpm

146 63

TYMV - - 0

Qß-28S ' 4 - '·' 4655

Qß-17S -4 - ' 109

TYM 4 . - 218

_t — - ■ 4 ' - ' 1

Qß-28S ' - . 0,12 · 474

Qß-I7S - 0^12 222

TYMV , - 0,12 766

103

	12
O^	12
o,	12
0,	12
o,	2
°*	2
o,	2.
o,	2

Qß-28S 3 0,2 2804

Qß-17S 3 . '0,2 240

TYMV - 3 0,2. 1037

—τ 3 . . 0,2 103

■ ⁺^Die Reaktionen (0,25 ml), enthielten 1 μ£ der angegebenen RNS

und 40 μ£ Protein ausser dort anderen Bestandteilen, die im co einzelnen in der Beschreibung von Pig. 6 vorstehend angegeben ■ ^ .werden, und zwar mit den am Ende der Tabelle aufgezeigten Abwand- ^s

o° lüngen. Die Inkubationen wurden durchgeführt bei 35°C währendop " ' »

■<i 20 Minuten; das Auswaschen und Zählen geschah, in der gleichen Weise Ij ' wie in Fig. 6 beschrieben..TYMV bezieht sich auf intakte RNS/. die ; ^ aus dem gelben Rubenmosaikvirus isoliert wurde. Qß-28S ist die —» intakte RNS des Qß-Bakteriophagen und 17S ist das Fragment von

der halben Grosse. - _. _{ßAD O}R1G«NAL _Γ

Die anomalenAbweichungen,, die in der Reaktion entweder, durch, bruchstückartige RMS oder das Vorliegen von Mangan hervorgerufen- werden, gehen noch besser aus dem kinetischen Verhalten der Reaktion (vergl. Pig. T) hervor.

Die Reaktionen wurden gemäss den in Fig. 6/aufgezeigten. Einzelheiten "angesetzt mit der -Abwandlung/ dass Mn**., wie angegeben, ausgelassen oder hinzugefügt wurde .--Es wurden Proben von 0,25 nil abgenommen und zur Zahlung entsprechend Fig. β behandelt. Die Schablonenkonzentrationen waren in allen Fällen 1 μ§-RNS. auf jeweils 40 μζ Enzym in 0,25 ml* Es ist zu beachten, dass die Ordinate der rechten Hälfte von Fig. 7 nur 1/iO derjenigen der linken Hälfte der FIg, 7 ausmacht.

Wie bereits beobachtet worden ist, verläuft die Synthese während ausgedehnter Zeiträume in Gegenwart von Sättigungsmengen" der intakten Schablone und von Mg linear. Wenn man jedoch Mn dem Reaktionsgemisch zufügt, bricht die Reaktion in etwa. .60· Minuten ab, selbst wenn die 28s-RNS als Schablone verwendet wird. Wenn nunmehr- das Ansprechen des Enzyms auf die bruchstückartig zerlegte Schablone (Fig. 7) geprüft wird> wird ersichtlich, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit geringer 1st als 10$ der normalen und dass sie in JO Minuten völlig ; _}

aufhört, ob Mn⁺* zugegen ist oder nicht.

..Beispiel·

f 9 09887/1 691 \_;

. : BAD

: ' - Beispiel V

Intakte Vifus -ItNS zur Verwendung als Schablone können . .· ■'. · getnäßs dem nachstehend beschriebenen Verf-ahrenherge-. stellt werdenί

Der GastOrganismus ist ein Hfr-Stamm von E. coli (Q-I^). • Er würde gezüchtet bei 37⁰C unter kräftiger Belüftung in einem JXD-Medium (j; Biol. Chem., 205, 291 (1953)) bis zu einer optischen Dichte bei 66Ο πιμ von 0,15 ent-

sprechend 5 χ 10 Zellen pro ml. Um jede Möglichkeit von Überkreuzüngs-Verunreinigungen auszuschliessen, z.B. "j mit 8!S~2, wurde eine. 10 -Verdünnung .von MS-2-Antiserum der Kultur zugesetzt. Wenn MS-2 herangezüchtet wird, dann wird das Atttiserum gegen Qß in die Kultur einbe- !- zogen. Die Kultur wird dann infiziert bei einer Infektions-MultipUzität von 5 oder darüber von Virusteilclien zu Zellen, ßs wird eine Ruhezeit von 5 Minuten zur ^Absorption ,erlaubt und dann wird belüftet', bis in etwa : 2 bis 3 Stunden Lysis auftritt.

„Bas Iflrsat wird dann untersucht« um die Anzahl von Virus-

* . · ■ ■ i

,. teilchen pro ml zu bestimmen, die sich gewöhnlich auf ^!

■ einen t/ert zwischen 3 und 8x10 Plaquen-bildenden

-.""' Einheiten pro ml belauft. An dieser Stelle-wird das

%, Vorliegen anderefNnöglichen verunreinigenden Teilchen

' ■ weiterhin geprüft unter Verwendung anderer Gastorganis-

. ■ . men, z.B. E. coli B. Ausserdem werden die Phagenteil-

' ' chen gegenüber dß-Antiserum geprüft, um sicherzugehen,

V 909887/1691

- 8ο -

1820645

dass es sich auch tatsächlich um Qß-Phagenteilchen handelt, ■ ■ .",·»■

Das Lysat wird dann bei 9.000 rpm. 45 bis 60 Minuten . lang zentrifugiert. Der tiberstand wird in 3 bis 4 Liter-Bechergläser gegossen, und 311 g Amrnoniumsulfat pro Liter des Überstandes werden sodann hinzugefügt. Diese Mischung wird-dann 2 1/2 bis 3 1/2 Stunden bei 4⁰C. stehengelassen und wiederum 45 bis 6o Minuten lang bei 9.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Die abzentrifugierten zurückbleibenden Plättchen werden in 20 bis 30 ml 0,01 m Trispuffer mit einem pH-V/ert von 1,3 und einer Magnesiurnkonzentration von '10"^ m wiedersuspendiert. Dann wird gegen 200 ml des gleichen Puffers bei 4⁰C mindestens 4 Stunden lang dialysiert. Nach der Dialyse wird die Phagensuspension 20 bis 30 Minuten lang bei 15.ΟΟΟ rpm zentrifugiert und die abzentrifugierten Plättchen verworfen. Der so erhaltene Überstand wird in Gegenwart von 1 mg pro ml Pronase 60 Minuten lang bei 35°C inkubiert ; und dann auf 0,2^ in Bezug auf IJätriumdodecylsulfat gebracht. Die erhaltene Suspension v/ird mit wass.ergesättigtem Phenol geschüttelt* Das Protein wird in der Zvrischenschicht zwischen Phenol. und Wasser gehalten, und die proteinfreie- RInTS verbleibt in der wässrigen- Phase. Die RIJS kann sodann mit zwei Volumina in der Kälte ausgefällt v/erden, und die intakte Virus RNS wird durch Zentrifugieren gewonnen und in

einem

909887/1691

BAD

einem geeigneten Puffer zur Weiterverwendung wiedersuspendiert. . .-- ; > '

Versuche zur Analyse des Vervielfältigungsmechanismus müssen der Tatsache Rechnung tragen, dass die hier einbezogenen Enzyme wahrscheinlich sehr kompliziert zusammengesetzte Moleküle sind. Ein hoher Grad komplexer¹ Zusammensetzung ergibt eine Flexibilität,· die das Auftreten anomaler Aktivitäten erlaubt, einer Möglichkeit, die hervorgehoben werden kann durch entweder fremde Umgebung oder durch ungewöhnliche Bestandteile. In Ab-Wesenheit des Substrats (primer) leitet die DNS-abhängige DNS-Poiymerase eventuell die Synthese eines A-T-Mischpolymerisates (J. Bio!» Chem. '■ 235, 2242 (I96Ö)) ein. ; · In Gegenwart von Mn⁺* führt das gleiche Enzym Ribosidtriphösphate in ein gemischtes Polymerisat ein (Berg, P., H, Pancher, und M. Chamberlin, in Informational Macromoleculesj herausgegeben v. H.J.Vogel, V.Brysoii und J.0.Lampen (New York· Äöademic Press, (1963))♦ In analoger Weise synthetisiert die DNS-abhängige RNS-Polymerase (Transcriptase) Poly-Ä, wenn ihr nur ATP zugeführt wird, eine Reaktion, die gehemmt wird, wenn die anderen Ribosidtriphosphate zugefügt .werden (Symposia, gehalten auf dem VII.,Internationalen Kongress für Mikrobiologie, S₀ Sl-iOJ (1958);. Proc, Nat'l, Acad." Sol., U.S. 48, 81 (1962)>v Wenn ihr eine einzelsträngige DNS zugegeben wird> synthetisiert die Transoriptase ein DNS-RNS-Hybrid (J. Mol. Biol,, 8, 29T (1964ΪΧ ·

9Ö9887/1&91

,■ ■■;.".. / - ■■"■■- .-." ;J,MoX, ·

' BAD

J..MoX. Biol.; 8, 289 (1964); Proc.Nat^rl. Aead. Sei., U.S. 52, 796 (1964); Biophys. J., 5, 231 (19β5)), und falls die Schablone RNS ist, ergibt sich eine doppelte RNS (,duplex) (Proc, Nat ¹I. Acad. Sei., U.S., 49, 88 (1965); Proc. Nat ¹X.' Acad* Sei., 48, 88O (1962); J.Mol. Biol., 9, 193 (I964)). Die Tatsache, dass derartige Kunstprodukte auftreten können, macht es schwierig, unwiderlegbare Schlussfolgerungen aus dem Auftreten eines

* ■■ " Produktes bei einer Umsetzung-zu ziehen. Ein Nachweis,

A ■■·.■■ ■·■■-..■■■..

^w der nicht nur einfach auf seinem blossen Vorliegen beruht, muss geschaffen werden, ehe der Bestandteil als
obligatorisches normales Zwischenprodukt bei dem Polymerisationsprozess angenommen werden kann.

Die aufgeführten Versuche zeigen, dass das Ansprechen der Replicase auf fragmentartige Qß und heterologe RNS sehr verschieden in Bezug darauf ist, was zusammen mit der intakten Qß-RNS beobachtet wird. Im vorliegenden Falle muss betont werden, dass die Untersuchung der normalen Funktionen der Replicase intakte homologe " RNS und die Vermeidung des Vorliegens von Mn⁺⁺ erfordert. Das frühzeitige Aufhören der Reaktion mit Fragmenten (vergl. Fig. 7) kann die beschränkte Synthese erklären, die von anderen Verfassern mit teilweise gereinigten Enzympräparaten festgestellt wurde, aus denen Nucleasen nicht vollständig ausgeschaltet worden sind. .^

Die Unfähigkeit der Replicase, Bruchstücke ihres

9 0*98 8-7/16 9.1 . , eigenen

BAD ORIG¹NAC

eigenen Genoms als Schablonen in geeigneter Weise zu verwenden, stellt ein Argument gegen einenErkennungsmechanismus dar, in welchen nur eine beginnende Sequenz einbezogen sein soll. Offensichtlich "merkt" es das Enzym, wenn es einem intakten RNS-Molekül gegenübersteht, ein Hinweis, dass gewisse Elemente der Sekundär-Struktur hier eine Rolle spielen. Man kann eine plausible formelle Erklärung vorschlagen im Sinne einer "funktionellen Kreisanordnung¹¹ * Man kann auf diese Weise hinsichtlich der Unversehrtheit eines linearen Heteropolymerisates leicht entscheiden durch Prüfung beider Enden in Bezug auf die geeigneten Sequenzen. Eine derartige Prüfung kann physikalisch unterstützt werden durch Bildung feiner Kreisstruktur unter Verwendung der Endsequenzen von sich überlappenden Ergänzungseigenschaften. Das Enzym kann dann den entstandenen Bereich der Doppel-Stranganordnungen erkennen. Dieser spezielle

Mechanismus wird nur als theoretisches Beispiel (nicht

- - ■"'■." .■■'■■ ■■■ ■ ■- . ^: - - - ■■.-■■::■■-■ zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung) dafür

vorgebracht, wie ein Enzym gleichzeitig sowohl die Sequenz als auch die Unversehrtheit unterscheiden könnte* Welche Einzelheiten hier auch vorliegen mögen, so hat es den Anschein, dass die HMS-Replicasen imstande sind, die Zwecklosigkeit zu vermeiden, entweder fremde Sequenzen oder unvollständige Kopien ihres eigenen Genoms zu,vervielfältigen.-

909887/1691 '

Beispiel VI (A-) Verfahren und Materialien

Katalase (2 χ umkristallisiert) wurde von der Firma Sigma Chemical Co..bezogen und wie in J. Biol. Chem., 236, 1372 (1964) beschrieben geprüft..Als CsCl wurde das 99i7# reine Material von Penn Rare Metals, Inc., Reverse, Pennsylvania, verwendet. Ein nicht zufriedenstellender hoher- 0.D. -Wert konnte leicht korrigiert werden durch Filtration durch ein Cellulosenitratmembranfilter (Schleicher und Sohttll, B-6, 27 mm).

Als Gast- .und Untersuohungsorganismus wurde wie in Beispiel I ein mutanter Hfr-Stamm von E. CoIi (Q-I]J)

verwendet.

(B) Prüfung der Enzymaktivität durch Incorporation radioaktiver Nucleotide

Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel I verwendet.

(C) Herstellung infizierter Zellen

Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel I verwendet.

(D) Enzymherstellung

Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel I verwendet.

(E) Zentrifugieren in CsCl

Ein ml von 10#igerä Ammohiumsulfat im Standardpuffer (0,01 m Tris, pH-Wert .7,4j 0,005 m MgCl₂; 0,0005 m 2-Mercaptoäthanoi) enthaltend 10 bis 15 mg eines Enzymproteins, das nach der DEAE-Behandlung erhalten wurde, 90 98 8 7/16 91

wird

wird über 4 ml einer CsOl-Lösung geschichtet, die auf eine Dichte von 1^40 gm/cm< eingestellt war» Das Röhrchen wird bei Ö°C 24 Stunden läng in einem Spincö-SW-39-Rotor bei 39.000 rpm zentrifugiert. " Nach dem Zentrifuglei'en wird das ZentrifugenrÖhrchen ' .·.".-an der Seite unmittelbar unterhalb des sichtbaren Proteinbandes durchbohrt und die Fraktionen durch eine Nadel von 0,5 mm einer Injektionsspritze aufgefangeri. Die Nadel wird im rechten Winkel gebogen, um eine Ein- ;führung mit dem langen Ende der Nadel nach oben zu ge- £ statten, danach wird..4as lange Ende um 180° gedreht, damit der Inhalt des Röhrchens auslaufen kann. -Der untere Teil im Röhrchen wird dann entfernt,- indem man . den Boden durchbohrt und Fraktionen auffängt. Auf dieseWeise ist die Verunreinigung des Proteinbarides durch das "Virusband minimal auf Grund der wesentlichen .

Unterschiede der Dichten der.beiden Stoffe. Die Frak-

-V" 10j6igem; ■""■■': - : '-■.""■_ tiönen werden dann auf 1 ml mit/Ammoniumsulfat im Standardpuffer verdünnt, um optische Dichtenmessungen ■ .j

■-■ ^; ■ ^; *■'■ - ^; ' €5

und EngymprÜfungen durchzuführen. . . .:- ^!

(F) Sedimentation mittels Suorosegradienten. ■ '--". Die Peaks enthaltenden Röhrchen aus den Enzymbereicheri

der CsCl-Grädien^en werden gesammelt und mit SO^igem ^;

gesättigtem Ammonsulfat ausgefällt. Der Niederschlag :

wird im Standardpuffer bis zu einer Proteinkonzdntra- ' _e-■

tion von 25 bis ?O mg/ml dispergiert und die Suspension 9 Q 988 7/1 69 1 2 Stunden

2 Stunden lang bei O⁰C gegen 250 ml Stanäardpuffer dialysiert. Zwischen 0*2 und 0,3 ml der dialysierten Proteinlösung werden auf 5,4 ml eines 5 bis 20Jiigen linearen "Gradienten von Sucrose aufgeschichtet, die im Standardpuffer gelöst ist. Wenn ein Bezugsprotein erwünscht ist, werden ΧΟΟγ Katalase zu Jeweils 0,2 ml

. der Proteinlösung hinzugesetzt. Die Gradienten werden bei Q⁰C 12 bis 15 Stunden lang in einem SpinGo-SW-39-Rotor bei 39.000 rpm zentrifugiert. Wiederum wird, um eine Verunreinigung mit abgeschiedenen Virusteilchen und anderen Materialien zu vermeiden* der Enzymbereich seitlich abgenommen, wie das bei dem CsCl-Zentrifugieren beschrieben worden ist. Aliquote Anteile werden von jeder Probe für die 0»D.-Messungen und Enzymbestimmungen abgenommen. Um eine Verdünnungsinaktivierung zu vermeiden, werden diejenigen Röhrchen, die Replicaseaktivität enthalten, nicht verdünnt,; aliquote Anteile werden entfernt zur Verdünnung und 0.D.-Bestimmung. Röhrchen mit Aktivitäts-Peaks werden vereinigt und ohne weitere Behandlung verwendet. Um einen hohen Aktivitätsverlust zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass die Reinigung mittels Suerosegradienten durchgeführt werden' muss bei angemessenen Proteinmengen, nicht weniger als 4 mg pro Röhrehen.

Es wurden vor der Zentrifugierreinigung andere Rei- ' · nigungsarbeitsweisen benutzt. Zu diesen Arbeitsweisen

&09887/Ί691 gehören

BAD

gehören folgende Methodenϊ Ammoniumsulfatfraktionierung, Adsorption und Elution an Ογ-Aluminiumoxyd und an DEAE-Cellulose, Chromatographie mit Hydroxylapatit-GeI, isoelektrische Ausfällung und Elektrophorese.

(G) Prüfung.auf infektiöse RNS

Es wurden Protoplasten hergestellt durch eine Modifi- - " ■ ■-' - "■ "-■'.: ■ weise ■' -. - ""--,. .[■'.-■'. _' "_. zierung der Arbeits vonGuthrie und Sinsheimer

(Bioahem. Blophys. Aota,, 72» 290 (1963)) und Strauss (J* Med. Bio!,, lQ_t 442 (1965)). E*·ooli K12-W6-Kulturen, die Von Dr. R.L.Sinsheimer (Galifornia Institute of Technology) zur Verfügung gestellt worden waren/ wurden

in 50 ml -5XD-Medium (J. Biol, Cheou, 205, 291 (1955))

bis zu einer 2Selldichte von 5 χ 10 /ml gezüchtet und

durch Zentrifugieren bei >. 000 rpro und Raumtemperatur während'.'-10 Minuten,geerntet. Der Zellrückstand wird gründliche getrocknet und dann in 0>35 ml 1,5m Sucrose, 0,17 ml Rinderserumalbumin (Armour, 3Oj6).und 0^04 ml 2 mg/ml Lysozym (Armour), gelöst in 0,25 m Tris, pH-Weife 8,1, dispergiert. Die erhaltene Suspension wird 2 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, währenddessen der gesamte zurückgebliebene Rückstand völlig wiedersuspendiert wurde, dann werden ,0,05 ml von. 4$6igera EDTAOnit^aOH bis zu einem pH-Wert von 7*\ neutralisiert) hinzugefügt. Nach..30 weiteren Sekunden . werden 10 ml PAM {1% Casaminosäure, Difco; I^ Nährlösung, Difco; Iji Glucose; 10^ Sucrose; 0,2J

009887/1891 wobei

INSPECTED

wobei das letztere nach dem Autoklavieren zugefügt wurde).hinzugesetzt. _f

Die Protoplastenpraparate werden bei 2⁰C gelagert und innerhalb von 5 Tagen nach der Herstellung aufgebraucht. Die Wirksamkeit der Infektion durch Virus-RNS erreicht ein Maximum in 2 oder 3 Tagen nach Herstellung der Protoplasten und bleibt mindestens -5 Tage lang stabil. Die erhaltenen routinemässigen Agarplatten-Wirksamkeiten liegen im Bereidi von 1O~' bis 10" infektiösen Einheiten pro Strang der Einführungs-Virus-RNS. Bei der Untersuchung vervielfältigter Produkte hinsichtlich der Infektionsfähigkeit wurden aliquote Mengen aus Reaktionsgemischen mit 0,01 m Tris, pH-Wert 7,4; 0,005 m MgCIp bis zu einer RNS-Konzentration von 0,2 bis 0,8 γ/ml verdünnt (wie durch Zählungen incorporierter Radioaktivität während der Synthese festgestellt wurde). 0,2 ml des verdünnten Reaktionsgemisches werden auf 35°C gebracht, und 0,2 ml der Protoplastensuspension werden bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach 30 Sekunden bei 35⁰C wird das Gemisch um das 5-fache mit PAM-Nährlösung verdünnt, weitere 10 Mi-

nuten lang bei 35°^c Inkubiert und dann die Agarplatten-Untersuchüng durchgeführt. Als Indikatororganismus dient E. coli K 38, erhalten von Dr. N. Zinder (Rockerfeiler University). Die Plattenpräparate wurden bei 34⁰C inkubiert.

Nach

909887/1691

Nach der zunächst durchgeführten Fraktionierung an DEAE-Oellulose (S. 58I von Proc. Nat'l. Acad, Sei,, U.S., 54 579 (1965)) enthalten. Replicasepräparate IQ? bis IQ¹² Plaquen-bildende Teilchen pro mg Protein. Zur direkten Prüfung der Umsetzungsgemische auf infektiöse: RNSist die Herabsetzung des Gehalts an Virusteilchen um einen Faktor von 10 erforderlich. Die anfängliche Abtrennung von^cPratein und'Virus auf Grund der Dichte: wird erreicht durch Gleichgewichfcs-Zentrifugieren ijä CsCl-Dichte-Gradienten» Die restlichen Virusteilchen werden durch Sedimentation in Sucroge^Gradienten entfernt»

Pycnographisehe Heiniffun^ ι Die Ergebnisse der^ bandenmJEssigen Trennung (banding) des En^mprotein-fraparafce das nach dem ersten DEÄB^hj?ömatographie§ehritt in . ,einem ösßl-Srädientep erhalfee|i wurde* sind in Big* 8 wisäe^gegthen.. Um diese Ergebnis se, zu: erhal^eiijt wurden die Brec.hungsindiaes gemes^en^und d^nn wurd.e?i die Pro^ ben auf 1 ml verdünnt^:i von denen jeweils eine 20 % <■-■ Iraktion zur Prüfung der En^piaktivität im Standard-- · Reaktiqnsgemls,eh. benutzt wurde \ die Inkubationsbedingungen Tiaren 3Q^QQ während |Q Jfinuten.

fanden sip.J% bel^e.iner pishte enfcsprgahend 4 Die Beplipase zeigte Sänger^ (bands) bei 1^b

dis,

und kann daher leieht wn iem

Etwa IQ der m
909887/1891

werden* Etwa IQ der ugsprünglichen

gung

BAD

gung wird im·Peak der Proteinmasse zurückgehalten, und wiederholte. Band-Trennungsversuche des Proteins in CsCl konnten die Verunreinigung nicht wesentlich herabsetzen. Wahrscheinlich wirkt der in den hohen

Konzentrationen von CsCl gebildete Proteinniederschiag als Ionenaustauscher-Oberfläche, wobei die restliche Virus-Verunreinigung die Adsorptionskapazität des Niederschlages darstellt. '

Nach der Reinigung in CsGl bleibt das Bedürfnis und da,s Ansprechen hinsichtlieh hinzugefügter Qß-rRNS erhalten. Wie jedoch in den Sättigungskurven von Fig. 9 gezeigt wird, tritt eine wesentliche.Zunahme in der beobachteten Aktivät des Enzyms nach der Pycnographie auf. Um dies,e. Kurven zu erhalten, wurden Standard-Reaktionsgernische verwendet, die 50 μg Enzymprotein enthielten* Und zwar mit einer spezifischen Aktivität von *Priphosphat von 2 χ 1CP cpm/0,2 μ Mol/ wobei die Inkubationfesbedingungen 30^C während 30 Minuten waren. Da äquivalente Konzentrationen von RNS zur Sättigung des Enzyms benötigt' werden^ scheint die nach der psGl^Behandlung beobaeht^te Anregung zu einer sehnelleren "Afelesun^' (read-pqut) der Schablone zu fiihren. Bies ergibt iicl| duj^feh Prüfuiig der Synthese im Exponential-^ be.reien während einer Besehrankung in Bezug auf die Schablone..

: - . : Fig. ίο

9Di8 8 7/1601 ■ - ■ ■':. "~ ■ -

ψ -

SADORfGiNAL

Pig, 10 ist ein Vergleich der autokatalytischen Synthese der Repliease vor und nach der CsCl-Reinigung; die Verdopplungszelt der RNS beträgt das 3-fache desjenigen, was durch ein Enzym katalysiert wird, welches nicht weiterhin gereinigt worden war. Um diesen Vergleich zu erhalten, wurden Reaktionen, die 50 ^g Protein und 0,15 gg Q-RNS in jedem Standard-Reäktionsgemisch erhielten, bei 30^GC durchgeführt, und es wurden aliquote Anteilenach den angegebenen Zeitintervallen abgenommeni die spezifische Aktivität

des iriphosphats war derart, dass jS.3°° ^cP^m

des RNS-Prodüktes "ixi; jeweils 0,25 ml entsprachen.»

Sedimentationsreinigung: Proteinpräparate, die nach der Bandauf-trennung (banding) in CsCl erhalten wurden,." erhalten noch zuviel Virusteilchen, um direkte Prüfungen des Reaktionsproduktes hinsichtlich Infektionsfähigkeit zu erlauben. Die restliche Verunreinigung wird auf eine annehmbare Höhe herabgesetzt durch Sedimentierung des mit CsCl gereinigten Enzymproteins mittels linearer Gradienten von Sucrose. Fig. 11 zeigt die Sedimentatiönsdiägramme der Replicaseaktiyitat, wobei Katalase als Bezugssubstanz einbezogen worden war. Nach 12-stündigemZentrifugierenwurden die infektiösen Virusteilchen als Rückstand im Zentrifugenröhrchen gefunden. Es ist zu beachten,

009887/1691

dass die Replicaseaktivitat eine Sedimentieruiig entsprechend einem einzelnen Peak zeigt. Unter Anwendung von Katalase (Molekulargewicht 2,5 x 1O-³) als Standardsubstanz lässt sich das Molekulargewicht der Replicase zu 1,1 χ 1O^ festsetzen).

Tabelle 9 fasst die wichtigen Eigenschaften des Replicasepräparates bei jeder Reinigungsstufe zusammen. Im einzelnen zeigt Tabelle 9 die Ausbeute an Replicase aktivität, Virusverunreinigung und relativen optischen Dichtemessungen während einer Reinigung. Sehr oft sind die 0.D.²⁶⁰/0*D. -Verhältnisse der Enzympräparate nach der DEAE-Behandlung von einer Höhe entsprechend

einem Wert von 1,0. Nach der CsCl- und Sucrose-Behandlung jedoch wird dieser unveränderlich auf 0,60 herabgesetzt, was die Wirksamkeit der Arbeitsweise anzeigt. Auch übersteigen die Aktivitätsausbeuten aus der CsCl-Behandlung oftmals 100$.

Tabelle 9 ■

	Eigenschaften gungsstufen	der Repliease bei verschiedenen Reini-	0'.D.	260ZO-D.280
Stufe	Ausbeute an Replicase aktivitat	Plaquen-bildende Einheiten pro mg Protein	o,	660
Nach DEAE-Bhdlg,	. (100$)	6,5 x J-O11	0,	602
Nach DEAE- und CsCl-Bhdlg.	' 82<£ ^	4,6 xlO5	0,	604
Nach DSAE-, CsCl- und Sucrose- Bhdlg. . 69%	/^50

90 9887/1691 ^Der

BAD ORfGiNAL

. 95 . 1620545

Der endgültige 'Rest der Phagen-Veruhreiniguhg: .Ist derart,, dass nur I bis 10 Piaquenrhildende Einheiten in ein Standard-Reaktionsgemlseh eingeführt werden, eine Menge, die durch die vorliegende übliche Proben-Arbeltsweise nicht entdeckt werdeit würde. "'] '"■ - V ·;

Die Synthese ergibt gewöhnlich' das Auftreten von. 0,2 bis 20 γ neuer RNS entsprechehd 10 bis 10 infektiösen Einheiten pro ReaktionsgefflischvUnter den angegebenen Versuchsbedingungen, Die Mengen reifer Phagenverunreinigungen liegen eindeutig unterhalb der Naehwelsbarkeits-' grenze. --".."" . ' _ \ ~ ■-_■ ; ' ._-. ■ -.; ;

Gelegentlich verunreinigt etwas iranscriptase (DNS-abhängige RNS-Polymerase) den Repl i case-Pe afc, der aus ■· der DEAE-Säule eluiert worden ist.Nochmalige Chromatographie ist zu empfehlen, wenn das eintritt.-. Wie jedoch In FIg. 12 gezeigt wird, kann Sedimentation-mittels Sucrose-Grädiehten verwendet werden zur Trennung der Replicase von Transeriptase. Diese Arbeitawelse ist^;', auch äusserst wirksam zum Ausschalten irgendwelcher zurückgebliebenen Spuren an RNS-ase, die zu Anfang, des Gradienten zurückbleibt. Für die Werte gemäss FIg,· 12 wurden Zentrifugieren, Auffangen und Untersuchung·auf Re pll case, wie ob"en beschrieben, durchgeführt; bei der Prüfung auf DNS-abhängige-Aktivität^wurde Qß-RNS in : dem Standard-Reaktionsgemisch durch 10 pg Kalbsthymus« ^: .■:■ : ^: -■-" V : Λ-"-' DNS

909887/1691

DNS ersetzt, und aus den .relativen Sedimentationsgeschwindigkeiten der beiden Aktivitäten wurde das Molekulargewicht der Transcriptase berechnet zu 3 x 10^.

Synthese infektiöser Nucleinsäure. Es ist bereits

gezeigt worden, dass das Ansprechen der Repliease auf die Schablone während der Reinigung erhalten bleibt. Weiterhin zeigt Fig. 15, dass das gereinigte Enzyrnprodukt ein Sedimentationsrnuster ähnlich Q,ß-RNS besitzt. Zur Durchführung der Sedimentationsanalyse gemäss Pig. β enthält das Standard-Reaktionsgemisch 5Ομ£ äes "gereinigten" Enzymproteins und 0,2 μg Qß-RNS; die Reaktion wird weitere 4-0 Minuten bei 35°C durchgeführt, währenddessen eine 30-fache Synthese eintritt. Zu 0,1 mldes Reaktionsgemisches wurden hinzugefügt: 0,01 ml 20$iges Natriumdodecylsulfat, 0,005 ml Y? GJ3-RNS, 0,20 ml 0,01 m Tris, pH-Wert 7,Λ. und 0,00.5 m MgCl₂; dieses wurde dann auf einen linearen Gradienten von 2,5 bis 15% Sucrose in 0,01 rn Tris, pH-Wert 7,4; 0,005. in MgCl₂ und 0,1 m NaCl gebracht und bei 25.000 rpra und 10°C 12 Stunden lang zentrifugiert, und zwar in einem Spinco-SW-25-Rotor.

VJie in Proc. Nat ¹I, Acad. Sei., U.S., 54, 919 (I965) gezeigt wird, liefert ein mittels der ersten DSAE-Stufe gereinigtes Enzym einen ausreichenden Beweis, dass die durch Replicase synthetisierte RNS die biologische

Informa-909 887/169 1 ~

SAD ORlGJNAL

Informationschar»akteristikvon Qß besitzt. Bei diesen Versuchen wird das Produkt einer Reaktion, die mittels Qß~RNS eingeleitet worden-ist; in aufeinanderfolgenden Reaktionen serienmässig verdünnt^ bis die ursprüngliche Qß-RNS zu einer nur noch -unbedeutenden Menge herabgesetzt wurde,, Das letzte Glas enthält neue radioaktive RNS, die im biologischen Sinne genauso voll wirksam ist. wie die Virus-RMS, welche verwendet wurde zum Start der Reaktion in dem ersten Glas»

Ein ähnlicher Nachweis zeigte dass weiter mittels CsCl und Sucrose-Gradiehten gereinigte Replicase unbeeinflusst die Fähigkeit beibehältj» biologisch aktive Kopien zu erzeugen. · ·

Die Reaktion wird eingeleitet bei einem Wert geringer als die Substratsattigung,und die Synthese wird dann ablaufen gelassen. Nach einem geeigneten Zeitintervall wird i/läjStel dieser Reaktion verwendete um eine..zweite einzuleiten, Nachdem die Synthese in angemessener Weise abgelaufen ist* wird üer gleiche aliquote Anteil aus dem zweiten Glas als die Schablone für eine dritte Reaktion verwendet^und dies wird für 10 Überträgungen durchgeführt» Fig. 1# zeigt die Synthese von RNS und infektiöse Einheiten durch gereinigte Enzyme. Da die Reaktion im ersten Glas mit 6 χ ΙΟ¹⁰ Strängen (O₅1γ) von Q3-RHS eingeleitet wird und jede Übertragung eine lil2₅5^raVerdünnung einschliesst^ ist der Beitrag der

009887/1691 . einleitenden

BAD ORJGiWAL

einleitenden RNS zu den infektiösen Zentren, die im vierten Glas gemessen werden, unterhalt) der Nachweisgrenze, und dieses Glas enthält 2,4 χ ICK infektiöse Einheiten. Schliesslich enthält die elfte Reaktion weniger als einen Strang des einleitenden Substrats (primer) und zeigt gleichzeitig 2,5 x ΙΟ-³ infektiöse Einheiten, wie durch die Plaquen bei dem Protoplasten-Untersuchungsverfahren bestimmt wurde. Die .durch Pycnographie und Sedimentation gereinigte Replicase

offensichtlich . .

hat/ihre Fähigkeit zur Produktion biologisch wirksamer Vervielfältigungen beibehalten.

Pur die Daten gemäss Fig. 14 wurden elf Reaktionsgemische von 0,125 ml hergestellt, von denen jedes 22 μg durch CsCl- und Sucrose-Zentrifugieren gereinigtes " Enzym -sowie die anderen Bestandteile des Standard-Reaktionsgemisches enthielten. Die spezifische Aktivität von P^²~UTP war derart, dass 8.000 cpm 1 μg des RNS-Produktes anzeigten. Zu dem ersten Glas wurden 0,1 μg : Qß-RNS hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 35⁰C 25 Minuten lang durchgeführt, worauf 0,02 ml für die Zählung und O₅Ol ml als Schablone für die zweite Reaktion abgenommen wurden. Das erste Glas wurde dann eingefroren und bei"--70⁰C gelagert. Das zweite Reaktionsprodukt wurde verwendet, um das dritte einzuleiten usw. Eine zweite Rlhe von Übertragungen wurde in derselben Weise durchgeführt wie beschrieben., wobei darauf geachtet' §09887/16-91 - —— · '

BAD ORIGINAL

■■"■ - ⁹⁷ -'-■"■'^;-:- ·■-■■.-■-

tet wurde,-dass keine einleitende RNS-Schablone zu dem ersten Umsetzungsgemisch hinzugesetzt wurde. Aliquote Anteile von allen diesen Reaktionsgemisctien' wurden direkt wie oben beschrieben auf'ihre infektionsfähigen Einhei- '-. . ten untersucht. Im Falle der Kontrollübertragungsreihe. -;.-. wurden die Proben 1,:10 inTMverdünnt und. dajih init" . Protoplasten vermischt. Alle anderen Proben-wurden auf 0,2 bis 0,8 ^g RMS-Produkt/ml vor dem Vermischenmit r den Protoplasten eingestellt. ; :' ; : ^- .

Diese oben im einzelnen auf:geführten Arbeitsweisen zur Reinigung von Q,ß«Replicase ergaben Präparate, die zufriedenstellend frei von Virusteilchen■warenund ; eine direkte Prüfung des RHS-Produktes -hinsiehtlich seiner biologischen Aktivität erlaubten. :; _v

Die vorliegende Erfindung ist geeignet für Untersuohungen und/oyder Präparate von Produkten mit Antivirus- _.-.., Wirksamkeit, Antikrebswirksamkeit und-Hormpn-r und/öder ; Enzymaktivität. Eine derartigeForschung könnte zu - ' wichtigen therapeutischen Fortschritten führen» ..

Es ist vorstellbar, dass eine veränderte Replicase unter gewissen Bedingungen eine .-veränderte RNS herstellen - ; könnte, die im vorliegenden System möglicherweise ITipus-Eigenschaften verändert -haben könnte oder unter iäealen Bedingungen vielleicht Anti-^Virus-Eigenschaften _:aufweisen

90988771091 ; 7

^ OBiGiHAL

würde. Es kann möglich sein, dieses System eventuell zu benutzen* indem man einen neuen Bestandteil zu dem. bakterienreinen (bacteria-pure) .RNS-Virus-System hinzufügt, das eine neue Replicase ergeben- " könnte, wobei das Rep^icase-Sys-tem auf die Herstellung von Anti-Virus-Molekülen gerichtet sein könnte."-"

Bei der Herstellung eines Impfstoffes gegen eine Virus-Krankheit mit Hilfe der vorliegenden iViassnahmen wird das.Virus in einem komplex zusammengesetzten Medium '

α herangezüchtet. Dann wird es durch chemische oder physikalische Mittel so verändert, dass seine kranheitserregenden Eigenschaften beschränkt vier den; das abgeschwächte Virus wird dann einem Tier injiziert, um Antikörper zu produzieren. Diese Antikörper sind wirksam zur Neutralisierung der Aktivität des abgeschwächten Virus und des ursprünglichen Virus selbst. Wenn man grosse und fast unbeschränkte Mengen an Replicase für .einen bestimmten Virus zur Verfügung hat, kann das die Herstellung von Impfstoffen gegen das Virus,

™ wie ζ.Β. im folgenden Absatz beschrieben wird, unterstützen.

; Es ist zu erwarten, dass die Replicase per se bei'In- : Rektion in einen^tierischen Organismus ein Virusteil-'■ chen vervielfältigt ,und den Krankheitszustand herbeiführt. Eine Replicase kann jedoch bei Injektion in

■ ■ *

einen

909887/1691

BAD ORIGINAL

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einen"-tierischen" Organismus Teilchen hervorrufen, die direkt eine Form einer Viruserkrankung prqäusiererkönnen und auf die der tierische Körper· niit der Herst ellung von Antikörpern reagieren kann. liY einem solchen System könnte das aus veränderter Hepiicase .αηά dem Tierkörper bestehende System Antikörper herstellen leny und zwar auf direktem Wege,unter Vermeidung des unviirtsehaftlichen und mühsamen Systems der-bisherigen Impfstoffherstellungο '.

Bei dem vorstehend erörterten Reaktionssystem wurde eine Replicase isoliert. Es ist bekannt, dass andere krankheitsverursaehende Viren ebenfalls BiJS-rioIeküle sind, z.B. sind die Viren, Vielehe die Tabak- und fforaateniftos aikkr ankhe it; Poliomyelitis, 'Influenza, liex\^rcastle-Krankheit bei Geflügel sowie Mumps verursachen, Mbonucleinsäure enthaltende Proteine. Die vorliegende Erfindung weist auf die Möglichkeit hin, dass Beplicasen für ^edes dieser RNS-Viren offensichtlich aus einem geeigneten System gevionnen viei*den können. Die in vitro-Synthese derartiger Eeplicasen in reiner Form stellt einen wesentlichen SOrtschritt bei der Untersuchung der Biochemie der Krankheiten und der Herstellung von

Impfstoffen dar_o

\ "' - ' ¥enrx man eine reine Replicase in der Hand hat^₁ ist

es möglich^ ihre spezielle Aminosäurestruktur zu

Ιΐβιΐη aüss^rdem die reine BHS verfügbar
diir-fte es laögüöii sein, sowohl die Hucleotidrin der RMS als attefo ihre Meiterert :.'"-"■-.-:

BAD OBiGiMAL

162Q64S

strukturellen Merkmale zu bestimmen. Die Bestimmung von AminosäureStrukturen und Codes, die die spezielle,

RNS-Nucleotidsequenz ergeben, sind wichtig bei der Aufklärung der Beziehung zwischen Aminosäure- und Nucleotidsequenz. .

Die biologisch aktive RNS-Polymerase (Replicase) und die infektiöse RNS, die mit Hilfe des Systems und des Verfahrens der Erfindung hergestellt werden, sind intakt und frei von denjenigen Verunreinigungen oder Begleitstoffen, mit denen zusammen sie sonst in der Natur vorkommen. Beispielsweise ist die synthetisierte Virus-RNS frei von ihrem normalerweise auftretenden Proteinüberzug. Das in geregelter V/eise hergestellte RNS-Produkt, wie es mit Hilfe des Systems und des Verfahrens der «Erfindung erzielt werden kann, bietet den Vorteil, dass es für experimentelle, läbormässige und kommerzielle Arbeitsweisen geeignet ist, wo es erwünscht is-t, eine biologisch aktive RNS zu verwenden, die frei ist von nachweisbaren störenden oder fremden Materialien. Das.geregelte System der Srfindung ist ebenfalls frei von nachweisbaren störenden oder fremden Stoffen und bietet so ein wichtiges Mittel zur Erforschung des Mechanismus-, durch den genetische Veränderungen und Reduplikationen bei Lebensprozessen hervorgerufen werden, sowie eine Möglichkeit, derartige Prozesse oder Mechanismen zu ver- ■■ stehen^ su modifizieren o.dsr su verändern.

f ^_m- - - Patentansprüche Γ""'

BAD

Claims (1)

1. - .101 i-

   1.) Verfahren, zur In vitro-Synthese blQioglseii; aktiver^ _:intakter Nucleinsäure, dadurch gekennzelchnetj, dass man ein aktiviertes System: erzeugt, das imstande-Ist,:, wäh--' rend längerer oder ausgedehnter Zeiträume ; biologisch aktive Hucleinsaure zu synthetislereiij, und äas-biologisch

   aktive^ intakte Kucleinsäurei die spezifische Se^lipase für die Hucleinsaure," die von nachweisbaren¹^chiädlichen Verunreinigungen frei Ist j und einen Nucleotidbasen- ' - ': *" bestandteil oder -Bestandteile^ enthält, und da$s: man die synthetisierte Nuclelnsäure aus dem System gewlrmt«

   2.) Verfahren nach

   dass man als Nucleinsäure;eine Bibonuclelnsäüre· YpV-_: : wendet» "/".:" ■ . ; \ ■'■''. '" : '-.- ■■■■■ ■""■" -- ■" ^ ;^: '■': '" ."-■"■'.-■

   j5.') Verfahren nach Anspruehi/i zur in vitro-Synthese; ; biologisch aktiver^ ansprechbarer> übersetzbarer>; In- takter Ribonucleinsäure durch.Kopie ihrer Basengeqüenz, dadurch gekennzeichnet,- dass man ein aktiviertes System verwendet, das biologisch aktive, homologe, intakte Ribonucleinsäure* eine spezifische Replicase für die ' Ribonucleinsäuren die frei vcjn nachweisbaren: ^bbaüe:näen-Enzymen sowie Hemmstoffen isti und; einen ^iucleo/tid». ; ' basenbestandteil oder -befstandteile enthält« \ ' ; _' ;^:■-:-.-■

   4.) Verfaliren nach Anspruch;! zur VeryieIfaltlgung blo-

   ""'■ . ·* ,: . ; '■-" logisch;

   BAD

   - -102 -

   logisch aktiver, intakter Ribonucleinsäure in vitro, dadurch gekennzeichnet, dass man ein enzymatiseiles, sich selbstverdoppelndes in vitro-System anwendet, aas (a) eine biologisch aktive, homologe intakte, sich selbstvermehrende Ribonucleinsäureschablone; (b·) die' spezifische, selektive, aktive, homologe Replicase ; für die Ribonucleinsäure, die eine selektive Bevorzugung für die homologe Schablone"zeigt und frei von * nachweisbarer Nucleaseaktivität und zerstörender Enzym-™ ' aktivität Ist; (c) den spezifischen Nucleotidbasenbestandteil oder -bestandteile für die Ribonucleinsäure und (d) aktivierende, zweiwertige Metall-Cofakfcoren aufweist; und dass man die hergestellte biologisch aktive Ribonucleinsäure aus dem System gewinnt.

   ί 5O Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Nucleinsäure eine Virus-Ribonu- ! ■ Oleinsäure verwendet.

   6ο) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5*'dadurch gekennzeichnet, dass man als Nucleinsäure Ribonucleinsäure des Bakteriophagen . Qß verwendet.

   .70 Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet!, dass man als Nucleinsäure Ribonucleinsäure ^ des Bakteriophagen MS-2 verwendet.

   8.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekenn-' '--"—._' zeichnet, dass man' ein System verwendet, das praktisch

   .-■■"-.■■■" ' ' frei

   909687/rial ——

   ■ ■

   . BAD

   ■" .· 1B2084S

   .*■' - 103* '-■'■■ ■ » -■ . --■-.-■ frei.von,Transcriptase.und pesoxyribonußlelnsäure .ist.

   $'.) .Verfahren nach, Anspruch 1 bis,77 dadurch gekennzeichnet, dass man ein System verwendet, In dem Transeriptase nicht zusammen mit DesoxyribOnuolein- ; säure vorliegt. '

   lÜ.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7,. dadurch gekenn- ί

   zeichnet,, dass man ein System '.verwendet, das Desoxy- i ribonucleinsätire enthält und wobei die Replicase

   Transcriptase enthält. · ■ _t ■ \

   11.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet*' dass· man den Nucleotidbasenbestandteil oder . -bestandteile im System in "der Triphosphätform verwen- ■"! det. ; "-.,ν;"" .--.■"".'. . "■_■ ■-"■■■

   12») Verfahren nach Anspruch U₄ dadurch gekennzeich- * ; net, dass man als, iJucleotiäbasenbestandteil oder -bestandteile Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat^ Qyfeiäintripßospiiat und/oder Uridintriphosphat; verwendet. *

   13») Verfahren nach Anspruch 1 bis 12 _s dadurch ,gekennzeichnetj, dass man einen isotopenmarkierten Hucleotld- _; basenbestandteü oder »isestandteile verwendet«

   I%_o) Verfahren nach Anspruch 1 bis 1% dadurch gekenn= dass aan eine jrucleinsäure-Sinführungs«

   - ■■ .-"-.-" -"-.',- .■'■.-- schablone

   BAD ORIGINAL

   1820645

   schablone bei dem System verwendet, ätt von einem Froteinüberzug frei ist, wobei ein Nualeinsäureprodukt erhalten wird., das von einem proteinartigen Überzug frei ist. \ '" ." * ^:'^u '■■ .. " *:

   15.) Verfäliren nach "Anspruch 1 bis" 14, dadurch gekennzeichnet, dass-man in dem System eine für die angewandte Nucleinsäu-re "spezifische Replica.se verwendet, die praktisch frei von Virus-Xnfektionsfähigkeit ist.

   16,)" Verfahren zur Herstellung einer "Replicase für

   Virus-RNSj, - öaclureli gekenn^siaSmisti dass man eine Replicase in. der· !©ist g-swiimt^ dass sie von nachweis-baren Mengen--abbauendes? Enzyme sowie Hemmstoffen frei". und .befähigt" ist^ sine" laagaadauernds oder ausgedehnte . ■ Yervielfältiguag.- feoisologer^ lasalcter 7irus-RMS zu

   17c) ferfahren aach/ünspr-uch. "iÖ;, ä&mzpoh,' gek:ennzeic£i-" tm%_a össs_ man -siae EepAiuass ^si-weiiäetj; ils ini-we- -' _: seatlieäsa - fr®i ^on "/i^us-^ifokt-ioasfahisicsit;-." ge- /

   Q.'3t₅ class άΐ&ιι clie Η^ϋΐ: : .ι is, der 'Äise

   -· "^x". . - " .. - - ■
   dass "sie:ästiges© Eigsja.^-cjäftsa "aufweist

   . V ^Badorig,_Nal

   19.) Verfahren nach Anspruch 17 oder 13 zur Herstellung von Replloasen für Virus-RHS aus Mikroorganismen, .'da- j durch gekennzeichnet* dass man folgende Reinigungs- I schritte anwendet: Lysis, Abbau durch DNS-ase, Protamin-j fraktionierung,, Ammoniumsulfatfraktionierung, Adsorp- I tion und Elution mit einer Diäthylaminoäthylcellulose-Säule, Bandenbildung in Cäsiumchloridlösung und Zoneiizentrifugieren in linearen Gradienten wässriger Sucroselösung. ' . · *'".·■'

   20.]) Verfahren nach Anspruch 19j dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus ein Virus, z.B. einen Bakteriophagen, verwendet-.

   909887/1691