DE1617612A1 - Medium fuer die Replikation von Mycoplasma pneumonise - Google Patents

Description

Medium für die Repllkation von Kyooplaasa pnetmonise

Die Erfindung betrifft neue Medien für die Replication von Mycoplaema pneumoniae, die zusätzlich Kulturfliissigkeiten liefert, die eich zur Herstellung von Vaccinen verwenden lassen, die von sensibilisierenden Stoffen im wesentlichen frei sind»

Als primäre, atypische Pneumonle (PAP) werden bestimmtet niohtbalcterielle Formen der Pneumonie bezeichnet, die den Anzeichen nach auf Mycoplasmapneumoniae beruhen, da eich gezeigt hat, dass ein serologisches Ansprechen auf das Eaton-Agens, einen Stamm dee Myooplaeaa pneumoniae, la ungefähr 90 Jt derjenigen PAP-Päll· erhalten wird, in denen eich während der Rekonvaleszenz Kälteagglutinlne ausbilden. Ein eerologiachee Anapreohen auf da· Eaton-Agena ergibt aloh ebeneo bei einer weeentllohen Anzahl agglutinln-negativer Pneumonlen und let auch bei etwa 10 ^ aller untersuchten Infektionen der unteren Atmungaorgane erhalten worden. Daa Eaton-Agens 1st der Eaton-Stamm dee Myoo-

BAD ORIGfNAL

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plasma pneumoniae und wird gewöhnlich als eaton-pleuropneumoniaeartiger Organismus oder abgekürzt Eaton-PPLO bezeichnet.

Die Erkrankung ist bei Baumwollratten und Hamstern durch intranasale Einträufelung des M» -pneumoniae-Organiemus hervorgerüfen und durch Neutralisation der Organismen mit RekonvaleBzenz-Seren von Patienten mit klinisch diagnostizierter PAP verhütet worden«

Ein wesentlicher Portschritt in der Untersuchung des Eaton-Agens wurde 1961 erzielt, als der Organismus isoliert und in einem künstlichen Medium identifiziert wurde, das Pferdeserum enthält, welches als wesentlicher Bestandteil für das Wachstum angesehen wurde.

Dieseβ Medium enthielt relativ grosee Mengen an Komponenten, durch die es für eine Vermehrung der Organismen zur Vaocine-Erzeugung unbefriedigend wurde, insbesondere 5 1* Rinderherz zur Infusion, 1,0 # Pepton, 10 # Hefevollextrakt und 20 $> Pferdesar uü. Die störenden Stoffe, insbesondere das Pferdeserum und der Hefeextrakt, wurden in hohen Konzentrationen benötigt <md ergaben zwei Risiken, nämlich einmal Sedimente, deren Entfernung von konzentrierten Organismen schwierig, wenn nicht unmöglich war, und andererseits die Gefahr der Seneibilisierung

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von Vaccineempfängern mit den verunreinigenden Komponenten*,

Es wurde gefunden» dass die Vermehrung von M.-pneumoniae in neuen» eine Ausführungsform der Erfindung darstellenden Medien"^s möglich ist, die von* Pferdeserum frei sind und hohe Ausbeuten ^/J* an Organismen liefern, die sich für die Zwecke der Vaccine- ****" Erzeugung in einem von potentiellen, sensibilisierenden lien im wesentlichen freien Zustand JsoXie5W|n lassen,. Es ^ sich gezeigt, dass man anstatt mit der hoÄ^^Konzetit'rti^ion des Pferdeaerums, die bisher als fur die Replication von* %-pneumoK· liiae wesentlich gegolten hat, unter VerwenduW«vi»JStöffen arbeiten kann, die nachfolgend als Gruppe -A-Stoffe bezei"3Hfet sind - Hierzu gehört die Verwendung der Allantois-Pllissigkeit des Eis ("Egg Allantoic Fluid") oder einer Kombination von Albumin, Traubenzucker und Arginin oder einer Kombination der Allantois-Flüasigkeit des Eis mit einem oder mehreren der Stoffe aus der Gruppe Albumin, Traubenzucker und Arginin, wobei die Gesamtmenge dieser Stoffe bei alleiniger oder bei korn« binier.ter Anwendung etwa 0,1 bis 20 #, vorzugsweise 0,5 bis 10 <jo, des Gesamtmediums beträgt» Dabei kann jedes für den Einsatz in injizierbaren Präparaten geeignete Albumin Verwendung finden, z. B. Human-Albumin, Ovalbumin, Laotalbuminhydrolysat oder Mischungen derselben»

Es hat sich weiter gezeigt, dass auch der Hefeextrakt, der in

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10194 κ

dem Medium dee Standes der Technik verwendet wird, durch bestimmte, kombinierte chemische Stoffe (nachfolgend als Gruppe-B-Stoffe bezeichnet) ersetzt oder aber als solcher in viel kleineren Mengen eingesetzt werden kann, so dass die Entfernung während der Arbeitsgänge bei der Vaccine-Erzeugung leichter ist. Chemische Stoffe, die sich bei kombinierter Anwendung als geeignete Austauschstoffe für Hefeextrakt erwiesen haben (d. ho die Gruppe-B-Stoffe), sind Cholesterin, Lecithin und Piphosphopyridlnnucleotid (DPNH, reduziert), wobei die Gesamtmenge von jeglichen zwei oder mehreren dieser Stoffe nicht mehr als Ο?025 fit bezogen auf die Gesamtmedien, beträgt ο Beim Arbeiten mit Hefeextrakt wird dieser ebenfalls tn einer Menge von nicht mehr als 0,025 $> der Geeamtmedien verwendet.

Der Rest der Medien (die Gruppe-C-Stoffe) wird von der ablichen, wässrigen Phase gebildet, die Salze, Puffer und dergleichen enthält, die herkömmlicherweise bei der Herstellung von fHessfähigen Kulturmedien Verwendung finden. Das pH der Medien wird auf. 6,6 bis 8,0, vorzugsweise etwa 1,2 bis 7_t4_f eingestellt -

Die beiden Nedien der folgenden Zusammensetzung haben sich als für das Wachsen von M_a pneumoniae besonders geeignet erwiesen:

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Zusammensetzung. #

Medium I
Gruppe-A-Stoff Lactalbuminhydrolysat

(Edarain-Typ S, Sheffielt Chemical»

Korwich, N.Y.) . 0,5

Allantois-Flflaeigkeit des EIb 10,0

Gruppe-B-Stoff

Hefeextrakt 0,025

Gruppe-C-Stoff Hanksche Salzlösung» ausgeglichen

(1Ox)("Hanks¹ Balanced Salt Solution") 10,0

Natriumbicarbonat (2,8 1>) 2,0

destilliertes Wasser, qe 100,0

Medium II
Gruppe-A-Stoffe Lactalbuminhydrolysat (Edamin-Tyρ S) Human-Alburain Traubenzucker (U.S.P.) L-Arginin, HCl (1,5-millimolar) Gruppe-B-Stoffe Cholesterin (U.S.P.) Lecithin (L,α, synthetisch) Diphosphopyridinnucleotid (DPNH, reduziert)

Zusammenaotzung,

0,75 0,625 1,0
0,0316

0,0005 0,001

Gruppe-C-S toffβ Natriumbicarbonat Hanksche Salzlösung, auegegllohtn (1Ox) dtfetilliertee Waietr, q§

0,0004

0,0028 10,0
100,0 BADORIGfNAL

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10194 ί

Zur Herstellung von Medium X löst man den Hefeextrakt und das Laetalbuminhydrolysät in einem Teil des destillierten Wassere. Die Ei-Allantois-Fliissigkeit wird aseptisch aus 10- bis 12-Tage· Embryo-Hühnereiern entnommen und unter Hindurebleiten durch ein entsprechendes Filter, wie eine filterkerie, keimfrei gemacht. Die Komponenten von Medium I werden dann in den obigen Anteilen gewöhnlich in der folgenden Reihenfolge vereinigt ι Hankeche Lb'eang, Natrlumbicarbonat (zur Ph-E ins te llung auf 7,2 bis 794)., Hefe~Laotalbumin-Löeung, Allantoie-Flüeeigkeit und restliches Wasser· Dieses Genieoh wird denn durch Bewegung oder auf anderen eeohanieohea Wege durehgemisoht und durch Hindurchleiten durch ein entsprechendes filter keimfrei gemacht. . . ' ' ' .

Ein ähnliches Medium kann hergestellt werden, indem man das

LQCtalbuminhydrolyaat mit einer entsprechenden Menge eines anderen geeigneten Albumine oder einer Albumin-Mischung der obengenannten Art ersetst.

Zur Herstellung von Medium II wird das Lecithin und Cholesterin unter raschem Rühren in einer kleinen Menge absolutem Äthylalkohol gelöst und das Produkt dann langsam unter kräftiger Bewegung zu einem Anteil des destillierten Wassers zugesetzt. Diese Lösung wird unter fortgesetztem Rühren mit dem Arginin» dem Traubenzucker und dem Diphosphopyridlnnuoleotid versetst.

' BADO

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t: · « β Ί t

Han gibt dann das Lactalbumin hinzu und schüttelt das Gemisch kraft ig _P um die Auflösung zu bewirken«. Man erhält auf diese Weise eine Vorratslösung, die mit dem Human-Albumin, der H*nk~ schen Lösung, dem Hatriumbioarhonat (bot pH-Einetellung auf 7,2 bis 7,4) und dem restlichen destillierten tamtr vereinigt wirdo .

Die im Medium II verwendeten Grupp©-A-Stoff6 können durch jeden der obengenannten Grapp©~B-Stof£e ersetzt werden.

Die Zusammensetzung der oben beschriebenen Medien entspricht optimalen Konzentrationswerten. Innerhalb der genannten, bevorzugten Bereiche ist eine beträchtliche Yariatien dsi" Konsentrationen jedes Bestandteile siSglicfe^ B@id© M@ii®a hstea aiß© solche Zusammensetaaiig, dass g©gQfe@airBf©lls snwa©@aä©, p©tentteile Sensibilisierungsetoffe, wie l@f©_@ zu Antrag i», g@?ing@n Konr.e«trationen vorliegen aad auf Grund äse spät©? b^eeteiebenen ν^jcine-Verfahrens ©uf vernachlässigbar© Wert® verringert werden. Das mit dem Einsatz von fferdeserum zwangsläufig verbundene Risiko wird naturgemäss durch die Verwendung der neuen ■ Medien gemäss der Erfindung wesentlich verkleinert.

Eine andere AaafiihrungsfoOT der Erfindung ist auf afin Verfahren zur Herstellung einer Vaocine des inaktivierten Eaton-PPLO gerichtete Man beimpft mit wachs turas fähigem Eaton-PPLO <§igies der oben beschriebenen, s@rumfrei®ia Medien in Ferrn eia@s 5-

BAD ORIGINAL

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bis 1Q-#-Inokulums mit einem Gehalt von ungefähr 10' bis 10 Organiemen/ml. (Zur Inokulum-Herstellung kann man zunächst den Organismus in dem Medium I oder II wachsen lassen oder ■das FPLO auf irgendeinem hierzu geeigneten Kulturmedium vermehren _o) Die beimpften Medium-I- oder Medium-II-KuItürβa werden in einer aeroben Atmosphäre bei etwa 37 C eine genügende Zeit, gewöhnlich 7 bis 14 Tage» bebrütet, um die Gesamtbevo'lkerung an Organismen in dem Wachstumsmedium auf ungefähr 10⁶ bis 1Q¹%il zu erhöhen»

Am Ende der Inkubationszelt werden die Kulturbehälter kräftig bewegt, um jegliche Organismen wieder fm suspendieren, die an den Flächen des Kulturbehälters haften könntenc Pie die Organismen enthaltende Suspension wird dann bei 20 000 bis 30 000 U/Min, geschleudert, vorzugsweise in einem gekühlten Sohleudersystem mit kontinuierlicher Gutströmung, in dem die Strömungsgeschwindigkeit etwa 1200 bis 3000 ml/Std. beträgt» Nachdem die gesamte PPLO-Suspension die Zentrifuge passiert hat, leitet man durch das Schleudersystem gepufferte Kochsalzlösung (0,006-molar an Natrium phosphat, 0,7 56 Natriumchlorid, pH 7?2) oder ein anderes, zweckentsprechendes Verdünnungsmittel in einem Verhältnis von etwa 1 1 auf 5 1 gewonnene Flüssigkeit, um die sedimentierten Organismen zu waschen und restliches Wachetumsmedium zu entfernen«

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Die sedimentlerten Organismen (Produkt A) «erden aus dem Zentrifugen-Rotor auf entsprechendem Wege (Abkratzen, Bewegen usw.) entfernt, und die BehälterflUeeigkeit (Boul Fluid) kann verworfen oder gewonnen und in der später beschriebenen Weise eingesetzt «erden. Sie auf diese Wels· erhaltenen Organismen liegen in hochreiner Form vor, man kann sie «ur Herstellung eines Yacolna-Konzentratee duroh Wiedersuspendleren | ▼on Produkt A in gepufferter Kochsalzlösung und Inaktivieren der Organismen verwenden oder das Produkt A in der später beschriebenen Weise vor oder nach der Inaktivierung «eiter reinigen. .

Die obigen Organismen (Produkt A) können in gepufferter Kochsalzlösung, pH 7»0 bis 7,2, oder einem anderen, für injizierbare Präparate geeigneten Verdünnungsmittel auf jede gewlinechte Konzentration wiedereuspendiert «erden. Das PPLO «ird danach duroh libliohe Methoden inaktiviert, «ie duroh Zusatz von formalin (USP) auf eine Endkonzentration von 1 ι 400 bis 1 ι 4000, und dann etwa 24 Std. bei etwa 37° 0 bebrütet. Auoh andere, zweckentsprechende Inaktlvlerungsmittel oder -verfahren können Anwendung finden, «ie 7- bis lOtHglgee Erhitzen auf etwa 37° C oder ein Zusatz von Phenol auf eine Endkonzentration von etwa 0,5 % und dergleichen. Das ungebundene fiestforma,lin kann mit flatriumbisulfit neutralisiert und 48 Std. gegen Kochsalzlösung dialyslert oder einfach belassen

werden.

BAD ORIGINAL

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16t7612 Μ

DIe βο erhaltene Suspension inaktivierter Organismen (sur Vereinfachung nachfolgend auch ala Produkt B bezeichnet) eignet aIch für den Einsatz sur Heratellung einer Vaccine in der nachfolgend beschriebenen Weise» man kann aber auch» wenn gewünscht, restliche Proteinverunreinigungen aua dem Produkt B in der folgenden Weise entfernen.

Zur Entfernung von Restproteinen wird das Produkt B einer Schleuderung bei hoher Geschwindigkeit unterworfen, bei welcher man die Organismen.etwa 45 bis 60 Min« bei etwa 16 000 U/Min, sedimentiert. Das Überstehende, fliesefähige Gut wird verworfen, und die Organismen werden wieder auf das ursprüngliche Volumen oder eine andere gewünschte Konxentration in phoephat-gepufferter Koohsalslösung oder einem anderen zweckentsprechenden Verdünnungsmittel suspendiert, wo-. duroh man das Produkt C-1 erhält. Hit dieser Behandlung wird im wesentlichen das gesamte messbare Fremdprotein entfernt.

Andererseits kann man Beatprotein von den sedimentlerten Organismen (Produkt A) entfernen und die Ausbeute an Organismen erhöhen, indem man die sedimentierten Organismen mit der BehälterflUssigkeit der ersten Sohleuderung vereinigt und dann, wenn gewünscht, gepufferte Kooheal«lösung auf die jeweils gewUneohte Konsentration susetst. Diese Suspension wird dann einer Sohleuderung bei hoher Oeaohwlndigkeit

. ₁₀ 1 BAD

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10194 ■ .'

(etwa 45 Mj,n» bei 16 000 U/Min·) unterworfen» um die Organismen zu sedimentieren. Das überstehende, fllesefähige Out wird verworfen, und die Organismen werden geerntet und wieder in der jeweils gewünschten Konzentration in gepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Die Organismen werden in der oben für die Herstellung von Produkt B beschriebenen Weise inaktiviert; das so erhaltene Konzentrat ist nachfolgend als Produkt C-2 I bezeichnet»

Unmittelbar nach der Herstellung der Suspensionen B, 0-1 und C-=2 wird ein Konservierungsmittel zugesetzt _t zweckmäesig Formalinlösung mit 20 γ/ml und Merthiolat (Thiraerogal) auf 1:10 000.

Biese Vacoine-Konzentrate können ä©as auf Jeda Antigen-Konzentration verdünnt und kb*nn@a allein für sieh oder in Kombination mit anderen Vaccinen eingesetzt oder'zur Herstellung einer Vielfalt von Vaoeinen, wie wässrigen Vaeeinen,

• *

an Aluminiumkaliumsulfat (Alum) adsorbierten Vaccinsn, Vaceinen mit emulgiertem, pflanzlichem öl ale Adjuvane oder Vaeoiaen mit Freundachem Adjuvane und dergleichen verwendet werden·

Jede Vaoeine-Zubereitung wird angemessenen Gütekontrollen unterworfen, um ihre Brauchbarkelt als Injektionsmittel für den Menschen sicherzustellen. Zu den Prüfungen gehören die Sicherheitsbewertung bei Mäusen und Meerschweinchen und in

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BAD

Thioglykolat und Sabouraud-BrUhe durchgeführte Sterilitätsprüfungen, und darüber hinaus werden Prüf auge η durchgeführt, um die Inaktivierung der Organismen» einen pH-Wert von etwa 6,5 bis 7»2 (wenngleich der pH-Wert diesen Bereich auch etwas Über- oder unterschreiten darf), einen Aluminiuakaliumsulfat-Gehalt von nicht mehr als 15 mg/Dosis (optimal 8 mg/Dosis), eine Formaldehyd-Restkonzentration von nicht mehr als 90 γ/ml, gewöhnlich etwa 20 γ/ml, die Wirksamkeit bei Tieren und die Identifizierung des Endproduktes sicherzustellen.

Die Wirksamkeit der Vaccine wird durch intramuskuläre Injektion bei einer Gruppe von Hamstern (gewöhnlich 10 Hamster/ Gruppe) mit 0,5 ml der inaktivierten Vaccine bei 0, 7 und 14 Tagen bestimmt ο Man entnimmt allen Tieren vor der Vaccination und 21 Tage nach der Anfangeinjektion Blut oder man entzieht einer Reihe von Tieren der gleichen Gruppe zu Beginn der Prüfung das Blut und führt nur bei den injizierten Tieren 21 Tage nach Prüfungsbeginn eine Blutentnahme durch, wobei gewöhnlich gleichzeitig einer anderen Gruppe von Hamstern aus dem gleichen Tierbestand das Blut entzogen wird, um festzustellen, ob sich in dem Prüfzeitraum eine spontane Erkrankung ergeben hat, die direkt oder indirekt auf das Eaton-PPLO zurückzuführen ist. Nach Komplementbindungs- und bzwo oder Serumneutralisationstechniken werden die Seren auf ihre Antikörper-Werte in Bezug auf Eaton-PPLO geprüft.

BAD

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Sie Identifizierung des Endproduktes erfolgt durch Komplementbindung.

Die Serumneutralieations-Untereuohungen «erden nach herktiemli~ chen Methoden durchgeführt» und auch die Abwesenheit τon sensibilisierenden Stoffen wird nach dtn bekannten Meereohweinchen-Sensibilisierungsprttfungen ermitteltο "

Die in den folgenden Beispielen verwendeten M.-pneumoniae-Organiemen wurden auf Agar aue einem Raohenabstrioh eines an primärer, atypischer Pneumonie erkrankten Patienten isoliert·

BAD ORiGIfMAL 15 -

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Beispiel

Stufe A: Anfangevermehrung von EatQn-PPLO in Rinderherz-InfüaJonabrühe

Der Inhalt einer 5,0-ml-Arapulle von Eaton-PPLO-Impfgut nit einen liter von ungefähr '10 koloniebildenden Einheiten/ml (CFU/ral) wivd in Rinderherü-InfueioiiebrUh· (enthaltend 5 ^ Rinderherz zur Infusion, 1 £ Popton» 0,5 J* Natriumchlorid, 10 i> Hefevollextrakt und 20 i> Pferdeeerum) eingeimpft, wobei man in 5 Röhrchen mit 1O₉O ml Medium jeweils 1,0 ml ein« bringt. Nach 7- bis 9tägiger, stationärer Inkubation bei 36 bis 37° C wird jede Kultur in 500 ml des gleichen Rinderhers InfuoionsbrUhe-Mediuras eingeimpft und etutionrtr einer weiteren 7- bia 9tägigen Inkubation bei 37° C unterworfene Di· gewünschte Konzentration der Organismen lHset sich unter ' Durchfuhrung weiterer Passagen erreichen, wobei bei der vorliegenden Darstellung 10 Passagen durchgeführt werden«

Stufe B₁s Endpassage des PPLO im Median I ·

50 ml des in der Rinderherz-InfusionebrUhe vermehrten PPLO (10a Paa aage) werden in 950 ml dee neuen Medium· I eingeimpft. Man utellt insgesamt 19 1 beimpftes Bledium her und bebrütet in stationärer Lage 7 bis 12 Tage bei 37° C*

Stufe B₂I Konzentration der PPLO-Organisnen aus ModIum-I-FlUsetiketten

Man vereinigt aseptisch alle ProduktionsflUesigkeiten und

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BAD

/fs-

führ.t das vereinigte Gut zur Gewinnung dee PPLO aus den Medium

direkt in eine gekühltβ Zentrifuge mit kontinuierlicher Gut« strömung? die mit 27 000 V/Min₀ umläuft und mit einer St.rümungageschwindigkeit von etwa 1500 ral/Std. arbeitet· Die sedimentierten Organisnen werden mit 4 1 phoaphat-gepuffertej· Kochsalzlösung (pH 7,2) gewaschen, aus dem Eotor der Zentrifuge entnommen und mit 317 nl phoaphat-gepufferter Kochsalz«-' lösung (pH 7,2) wieder auf die 6Ofache Konzentration gebracht ο

Man stellt eine 1:40-Verdünnung von Formalin (U.SoPo) in phosphat gepuffert er Kochsalzlösung (pH 7*2) mit einem Gehalt an 1 s 10 000 Merthiolat her und gibt dann zu j^eile 1OQ₉O ml der PPLO-Suapension unter etfindiger Bewegung 1₉0 ml de® 1 's verdünnten Formaline binsu₉ isobei ®in®. Enakonmntrmtlon roti 1 : 4000 erhalten wird«, Bi© £8eiuie wird. 24 Stä· fe@i 31° O brUtet und darauf mit weiterem

mittel auf eine Bndkonzentration v®a 1 §10 000 auf man die Yaocine bei 4° G aufbewahrt, ohm® das Formalin eh neutralisiorenο

Bestimmung des Grades der Inaktivierung der Organiemen

Man entnimmt aus der inaktivierten Masse des PPLO mit einer Konzentration von 6Ox 5 ml des Gutes und beimpft 10 Rinderherz-InfuBionabrilhe-Kulturen, die 7 Tage bebrütet werden» Danach werden mit 10 aliquoten 0,01HaI-AgIt©ilen des Materials auo den Rinderhers-Infusionsbrühe-Kulturen 10 Rinderhera-Infusions-Agarplatten beimpft und 7 iage bei 37° C bebrütet_n Lebensfähiges

_ir 109813/1591

PPLO. ist nicht festzustellen« Bekanntes, lebensfähiges Baton-PFLO wird in ähnlicher Weise geprüft, tot die wachstumefordernden Eigenschaften der Riiiderheri-Xnfusionsbrlihe- und Rinderhers-Infueiono-Agar-Medien zu zeigen«

Das Rinderhers-InfueionB-Kulturmediun enthält 7 Seile Difco-PPLO-Agar, 2 Teile inaktiviertes Pferdeβerun und 1.Teil 25£igen Hefeextrakt (erhalten aus aktiver Backhefe durch Kochen mit deotilliertem Waoser und darauf Klärung durch Filtrierpapier)« Per Agar wird durch Autoklavbehandlung keimfrei gemachte Nach Abkühlung auf etwa 45° C wird der Agar nit dem Hefeextrakt und Pferdeserum zuzüglich 500.Einheiten Penicillin, 5 ng Amphotericin/ul und Thalliumacetat auf eine Endkonzentration von 1 : 2000 ergänzt»

Stufe C; Vacoine-Herntellung

Ee werden drei Vaooine-Zubereitungen, eine wässrige Vaccine, eine an Aluminiumkaliumeulfat adsorbierte Vaccine und eine Vaccine mit emulgierten, pflanzlichem Öl als Hilfestoff, hergestellte Jede Vacciae-Zubereitung wird unter Verwendung der in Stufe B« erhaltenen Vorratelöeung mit einer Konzentration Ύοη 6θχτ3ίΐ!"verschiedenen Antigenkonzentrationen und in Form von mcnovalenten Vaccinen oder unter Einsatz in multivalenten AttiungQorgan-Behandlungsmitteln hergentellt. Alle Vaocinen Vierdeii bei 4 C aufbewahrt«

- 16 - ^bA°

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10,94 ^

Wässrige PPLO-Vaocine C-I Das in der in Stufe Bg beschriebenen Weise erhaltene Vseoine- Konzentrat wird mit pyrogenfreier, phoephatgepuf forte? Kooh-

salslueung (pH 7,2), die 1 ι 10 000 Merthlolat als

Konservierungsmittel enthält, auf Konzentrationen won 5x# 1Ox

und 2Ox verdünnt. Die Verdünnungen «erden in Bit UUBaistopfsn und Aluminiuokappen versehene aineaapullen abgefüllt» deren

Jede 5,2 el Vaoolne enthält« Prüfnethoden und Ergebnisse

Die Prüfungen der wässrigen Pl'LC-Vacelrte auf Sicherheit, Formaldehydgeholt, pH~W@2*t_f Keimfreiheit land Wirksamkeit wurden nach den oben beeohriebenen Methoden durohgefUhrt, wobei man befriedigende Ergebnisse erhältο

Wirkeankeit bei Hanotern

Fünf Hamster (BO bis 120 g) wurden jeweils intiaauekulUr bei O₉ 7 und H Tagen mit 0,5 ml der jeweiligen Yaooinen injiziert, Allen Tieren wurde am 21. Tag Blut entnommen, um Seren für die Bestimmung der

zu gewinnen» Unmittelbar vor Beginn dar Injektion wurde 10 Hamstern Blut entsogen» um Seren für Kontr@ll-. proben zu erhalten.. Mit d@n S®r@n wurden Komplem@sitbindunge-Unternuchun^en durchgeführt (Ergebnisse siehe Tubella I), wobei alle Antikörpor-Titer alß Kehrwert der Änfanges®rumverdünnung vor'4^a Zuaiit% jaglichsr anderer Hesgentien aungedrückt werden 109813/1

1019«

Tabelle I

Konplementbindungs-Untersuohung von Hamstereeren

WUeerige Vaccine Konzentration	, Geometrisches Mittel des plamentbindun«e-Titere	Korn-	Menochen	2,5
	50 i> End« 100 *EKnd- punkt punkt	30,0
5x.	2,5	52,0
1Ox	34,0
2Ox	69,0
Wirkuankeit beim

Dae Antikörper-Ansprechen beim Menschen wurde wie folgt bestimmt ι Weiblichen Untersuchungspersonen verschiedenen Alters wurden bei 0, 20 und 180 Sagen 5 ul der wässrigen Vaccine-Zubereitungen injiziert, wobei jede Konzentration bei jeweils 30 Personen Anwendung fand. Bei 0, 28, 56, 112, 180, 201 und 365 Sagen wurden Blutproben genommene Das Antikörper-Aneprechen wurde eerolotfiach durch Serumneutralieations- und Komplementbindungetechniken bestimmt ο Ergebnisses

Tabelle II

	Serumneutralisations-Untersuohung von Human-Seren	180 201 365
Yfiiearige Konzen	Geometrisches Mittel des Serusmeutralieations-· Antikörper-Titers (Kehrwert der Anfangsserura- voräünnun«) bei Ta^:	16,0 13,0 32,0
tration	O 28 56 t12	20,0 13,0 16,0
5x	0,0 10,0 14,0 13,0	21,0 14,0 20,0
1Ox	5,3 9,8 12t0 9,2	109813/1591
2Ox	4,6 10,6 13,0 14,Q	»AD O0&WM*
	18 -

10194

Wässrige Vaccine, Konzentration

5x ' 1Ox 2Ox

Tabelle III

Komplementbindunge-Untersuchung von Human-Seren

Geometrisches Mittel See Komplementbindunge-Antikörper-Titerβ (Kehrwert derAnfangseerutt- verdünnung) an den folgenden Tag

28

112

180

201

4,9 4,3 2,1

14,0

8,6

10,6

9· 2 9,8

13,0

14,0 6,1 9,8

9,2

9»8

10,6

10,6 18,0 12,0

Jede der wässrigen Vaooine-Zubereltungen ist in Versuch bein Menschen in der obigen Weise angewand^ worden, ohne dass . irgendwelche ungünstigen klinischen Reaktionen aufgetreten

aindo

An Aluminiumkaliumsulfat adsorbierte PPIiO-Vaooine C-2

In der oben beschriebenen Welse werden alt phosphatgepufferter KochöulzlÖQung (pH 7,2), die 1 : 10 000 Herthiolat enthalt» Verdünnungen des Eaton-PPLO-Vacclne-Konzentrates von Stufe Bg ait Konzentrationen von Sx, 1Ox und 2Ox hergestellt= Sas Antigen wird dann mit Aluminiumkaliumsulfat gefällt und wieder auf

ieToIumen suspendiert, wobei man zur FälXui je ml PPLO-KonEentrat 8,0 mg Aluminiumkaliumsulfat (KAlSOj₁.12H₂O) einsetzt und die Fällung bei pH 5,5 durchführte Pas am Kaliumalaun adsorbierte PPLO wird sedlmentlert, indem man 15 Hin» bei 1700 U/bin« schleudert, das überstehende Out dekantiert und das Präzipitat mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung

„ ₁₉ „ 109813/1591

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to

(pH 7,2), die 1 : 10 000 Merthiolat und 20 jr/ml Poraalin enthält, wieder auf das ursprüngliche Volumen suspendiert und uuf pH 6,5 eingestellt<> Die Vacoine wird in verschlossen« Ampullen eingebracht und bei 4° C aufbewahrt; nenn man QUteprUfungen bei Mäusen und Meerschweinchen in der oben für die wässrigen Vucoinen beschriebenen Weise durchfuhrt» sind ungünstige Reaktionen weder bei den Mäusen noch bei den Meerschweinchen feotausteilen_a

Wirksamkeit bei Haastern

Gruppen von 10 Hutastern (Gewicht jeweils 90 bis 100 c) wurden bei O₉ 7 und 14 lugen intramuskulär 5/10 ml jeder Konsentration der an Kaliumalaun adsorbierten Yaooine injisiert» Vor und 21 Tage nach der Injektion wurde den Sieren Blut abgenommene Die Seren wurden serologisch nach den Serumneutralisatione- und Komplementbindungsteohniken untersucht, die oben für die Saton-FPLO-AntikBrper-Siter beschrieben sinA. Ergebnisses

Tabelle IT Komplenentbindunge- -und Serumneutralisatione-üntereuohung Ton Hamster-Seren

Vaccine*), Komplement- Serum- Sero-Konsen- bindung neutrali- · Umwandlung» trat ion sation 56

5x 42 26 100

1Ox 169 24 100

2Ox 640 45 100

) Buton-PPLö, an nluminiumkaliumsulfat adsorbiert

.20- 109813/1591

10194

Wirkaaukeit beita Manschen

Zwei Gruppen von 10 weiblichen Unterauchungapersonen verschiedenen Alters wurden bei O und 23 Tagen intraauakulür Q₉5 ml der jeweiligen Vaoeine-Zubereitungen injiziert* V©v iraä I₉ 14» 28» 42 und 56 Tage nach der Injektion wurde ©lsi© Blutabnahme durchgeführtο Die Seren wurden serologisch aach dasn Kooplenentblndungs- und Serumneutralieationeteohnikegi wie oben auf die Antikörper-Titer in Bezug auf dne Eaton-BHiO untersucht Ergebniaaej

TaIeIl e V

Komplomentbindungs- und ü®ruaneutralioationg<»l7nter©uohung

von HuBian-Seren

Geonetrieches Mit»
tel des Antikörper-Titere am toi*
genden Tag

an

adeor«

1Ox

O	CF*)
	neut»*)
7	CF
	Neut
14	CP
	Neut
23	CP
	Neut
42	GP
	Neut
56	CP
	Neut
70	C?
	Neut
•J ÜJf ••hum	* KoMpIahaa^SineRii *tvf*,.- 3§r man® ii tral if

fung (9 K@n~

tr@llB

οβηβιι)

12,0

13,0

mo

54,0

4,9

7,0 It₉O

24,0 15,0

3,7 15,0

2,3

52,0 13

15,0

4,9-

2O₉ 0

4,0

BAD ORIGINAL

Vaoolnen nit emulgiertem, pf lanalioham Öl ala Adjuvana - C-3

Die Vaocinen mit emulgiertem Adjuvana in For» von pflanzlichem Ol worden bei Antlgen-Konsentratlonen von IQx und 2Ox hergestellt* Die Konsentrate «erden in der oben beschriebenen WeI-ae auf entsprechende Werte verdünnt und don emuigierten, pflanzlichem öladjuvans nuoh der Arbeitsweise dar USA-Patentaehrift 3 149 036 einverleibt. Allgemein wird daa Adjumna fe hergestellt, indem nan unter Bewegung und gleichseitige* Brhitisen Aluminiunmonoatearat in einen vorher gebildeten Gemisch einea pflunelichen öle, wie Erdnussöl, nit liannidnonooleat diaperglert, die anfallende Diaparaion abkühlt und in der entsprechenden Verdünnung daa wäaarige Baton-FPüO-Vucolnekonsentrat von Stufe B₂ sunetzt, wobei eino ent spreche »de Scherkraft zur Einwirkung gebracht wird, um die Adjuvanaemulalon su bilden«, Die fertigen Adjuvanavaocinan werden zur Aufbewahrung in 5-nl-InJektioneapriteen abgefüllt·

Die auteprtlfung der Taooinan nach der oben beechriebenen Arbeit aweiee bei Meeraobwelnohen und Uäueen hat befriedigende Brgebniaae erbraoht» Auch die Keimfralhaltaprtifungan In ThIo-. glykolat- und Sabouraud-BrUha in der obigen Weise haben au befriedigenden Ergebnissen geführt_o WirkeankeitβPrüfungen des wäeerigen Vorratekonsentratea uit einer Konzentration von 6Ox in der Adjuvansenuleion naoh der oben beaohriebenen Methode bei Hanotern haben ein geonetrlsohea Mittel des Komplementbinciuriga-Aiitikörper-Titere von 1 t 20 ergeben«

- 22 -

_BAD

Wirksamkeit bei Hamstern

Drei Gruppen von je sehn HaQBt er η wurden bei Ö und 12 Tagen intramuskulär mit 0,5 al der Adjuvuneraooine ganäos Tabelle TI injiziert_o Vor und 21 Tage nach der Injektion wurden Blutübhahmen durchgeführtο Ergebnisset .

T a be I^ e YI

Komplementbindunßs-Untersuehung ▼on ieatvev-Seren

Adjuvanο- Geoaetriachee Mittel dee Koeplement-

vaccine blndunf^a-Antikürper-Titere

1Ox 20

2Ox 20

6Ox 20

Wirkaankeit beim Menechen

Weiblichen Untereuchungspersonen verechiedenen Alters wurden bei 0 und 28 Tagen O₉5 ml der jeweiligen Adjuvansvaocine injizierte Vor und 0, 28 und 36 Tage nach der Injektion wurden Blutabnahmen durchgeführt; die Untersuchung erfolgte serologisch nach den oben beschriebenen Konplementbindungs» und Serumneutralieations-Techniken» Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt«

BAD ORIGINAL

- 23 -

109813/U91

10194

Vt

T a b eile

YII

Konplenentbindunge- und Serunneutrali aations-Untersuchung

von Huuan-Seren

Adjuvans- vaccine,	Geometrisches Mittel an dem folgenden Tag	2	2	•	Neut	-	28	4,3	der	Antikörper-Titer	,0	Heut .
Konzentration	0	1		,6	7	CP	6,5		?6	,3	21
	CP	2	,6	6,1	1	Heut	CP	,5	45
1Ox (25 Personen)	,3	14		56	7		10
2Ox (22 Pereonen)		49	4
Kontrolle (6 Personen)		17	1
Beispiel

Zur Bewertung des Wachstumspotentials von Eaton-PPLO in dem neuen Medium I wird die in diesem Medium erhaltene Waohetumskurve mit der Wachstumskurve beim Wachsen in dem Rinderherz-Infusioasaedium verglichen, welches das bisher als zur Replikati on dieses Organismus wesentlich erachtete Pferdeserum enthält» Man gibt su der Rlnderherz-InfusionsbrUhe (beschrieben in Beispiel 1, Stufe A) und zum Medium I ein Inokulum von 500 000 koloniebildenden Einheiten Saton-PPLO/ml hinzu, bebrütet jeweils bei 37° C und entnimmt bei den nachfolgend genannten Zeitintervallen Proben und untersucht sie auf ihren Titer_a Sie Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellte

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109813/ISfti

10194 %f

Stunden nach der Beimpfung	Titer, koloniebildende Einheiten/ml	Medium Z
	Rinderherz- Infua ionamedium	106·5
20	1os;25	107,25
42	107P2	10© »2
96	1p8» ^	1O9,25
136	109	1O9,25
172	to9

Dieae Werte seigen^ «aase die Replikatio» dee in Bled ium I ebenso gut wie beia Vermehren des Organismus in der Pferdeeerom und eine grosee Menge an enthaltenden Ririderhes*a«-Infuaions%rtife@ ist»

Der Inhalt (5 al) einer Asspull© laton-PPIsO-Iapfgut »iyd in Hinderhers-X&iiESioaabFüfeo (g^saißEtöiigefsssisg geraisg B@i apiel 1, Stuf® A) ©ing@iispf % _ö -wobei m®a S.^ § Hahrsten^" die 9 ml Medium enthalten* J9&®il® 1 Kl eingibti etutionfirer Inkubation %®i 36 fei® 31^& G lapft..BOB der Kultur in 500 ml Rinderbrühe-Xnfteaionutos^he^ü und bebrütet 10 Tag© in ©tsitioiite·®^ 'feg®« Bsuss ^©^©fi 25 der PPLO-'Buspeneion. in 50© öl flUeei|gea. Ri medium eingeimpft und in etationfiresr- Lag® 16 Sage b®i 36 bia 3(° G bebrütet.'.'Hierauf werden 100 ral d®r PPL0~8u'8peneion in 900 ial Medium II ainn©impft., Inagewmtä w<&rü®m 18 beimpfte® U&üium hergestellt., Di® Kultsirsre nttrer tage 7 Tag« bei 37° C bebrütet - 1 ₀iS 1 3 / Ut

10194

Man vereinigt aseptisch alle ProduktionaflUssiglceiten, wobei 18 000 al erhalten werden» und gewinnt dann da· PFIO aus den Kulturmedium wie in Beispiel 1 durch Hindurchleiten durch eine Zentrifuge» Nach dem Schleudern (30 000 U/fein.., Strtt-v mungsgesohwindigkeit 3000 nl/Std.) werden die sedimentierten Organismen mit 2 1 phosphat gepufferter KoohaalMlösung» pH 7,2» gewuschen und unmittelbar ansohlleseend aus den Zentrifu<;en~ Rotor entnommen.und mit 3CO nl phosphatgepufferter Kochsalz-Lösung, pll 1_:,2, wieder auf eine Konsentration von 6Ox suspendiert O

In phosphatgepufferter Kocheale-Löaung (pH 7»2) wird eine 1 s 40 Verdünnung von Formalin (USP) hergestellt <> Man gibt dann 3 ml dee t s 40 Formalins unter ständiger Bewegung «u 295 ul des PPLO-Konsentrates hiniu, wobei eine Endkoneentration von 1 s 4000 Formalin erhalten wird, bebrütet die Suspeo-. sion 24 Std. bei 37° O und versetst si· unmittelbar unschliessend mit 3 ml tilgen Merthiolat, wobei ein· Sndkonsentration des Konservierungsmittel· von 1 ι 10 000 erhalten wird, uöd bebriltet die PPLO-Suepeneion bei 4° C» ohne dna formalin au neutralisieren.

An AluminiumkaXtumsiilfat adsorbierte

Vacoina --~~-^

Diy Eatori~PPLO»Suepension mit einer Konaentration von 6Ox wird wie in Beispiel 1 auf Kaliunalaun (KAlSO,.12H₂OT adsorbiert, wobei die Füllung bei pH 5,5 unter Verwendung von

•²⁶" 109813/1S91

■■■■■-..·": "ν " ·? BAD

10194

8_e0 ng AluminluBkaliuos ulfat/ml PP£O-Konsentr«t erfolgt * Das an Kaliumalaun adsorbierte FPIO wird wieder in phosphat· gepufferter Kochsalz-Lösung (pH 7t2) suspendiert, die

1 t 10 000 Merthiolat und 2OjVmI Formalin enthält» und auf pH 6,5 eingestellt«

^asikörper-Anaprechen der an Kaliuaaltum Eaton-PPLO-Vacoino wurde, bei Hamstern ^estimate Fünf Sieren wurden bei O, 7 und 14 Sagen intramuskulär jeweils 0,5 el der Vaccine injisiert«. Bei 21 Tagen wurde den Sieren Blut entnommene Desgleichen wurde sehn nicht geimpften fieren Blut entnontiien, um den Antikörper-Status vor der Vaccination zu bestimmen* Die Seren wurden nach den oben beschriebenen Methoden auf die Kbnplementbindungs- und SeruBneutralia&tiöne·· Antikerper-Siter untersucht; firgebnieeei

g a b e 1 1 e

Kompleraentbindungs» und Serunneutralisatione-Untersuohung

▼on Harnster~Seren

An Kaliumalaun adsorbierte Vaccine» Konzentration

6Ox

Geometrische» Mittel des Antikörperit

Kpmplementbindume

Serufaneutra-Iioation

BeJBpiel

Man stellt aseptiooh eine FroduktioneflUeeigkeite^Vorraterauaoe (erhalten wie in Beispiel 1, Stufen A und B₁) her

- 27 -

109813/1534

BAD ORIGINAL

un3 gewinnt dae Pt¹LO aus dem Medium durch direktes Einleiten in eine gekühlte Zentrifuge mit kontinuierlichen Strömungssystem, die mit 27 000 U/Hin» umlauft und nit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1500 nl/Std. arbeitet _o Die sedimentierten Organismen werden nit 4 1 phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7»2) gewaschen, aus dem Zentrifugen-Rotor mit der restlichen Behftlterflüssigkeit entnommen_e um einen Verlust an Organismen auf Grund mechanischer Faktoren auszuschliessen, und mit 317 ml phosphatgepufferter Kochsalz-Lösung (pH 7,2) wieder auf eine Konzentration von 6Ox gebrachte

Man stellt weiter eine 1 s 40 Verdünnung von Formalin (UcSoPe in phoBphatgepufferter Kochsalz-Lösung (pH 7,2) nit einem Gehalt an 1 : 10 000 Merthiolat her« Dann wird 1,0 ml des 1 s 40 Formalina unter stündiger Bewegung zu jeweils 100,0 ml der PFLO-Suspenoion zugesetzt, um ein· Endkonzentration von 1 : 4000 zu erhalten, das Material 24 Std. bei 37° C bebrütet-,

Die inaktivierten Organismen werden dann auf einer Zentrifuge (Bauart Spinco, Modell L₉ Rotor Nr. 21, Kappen aus rostfreiem Stahl) 1 Std. bei 16 000 U/hinο geschleudert ο Die «edimentierten Organismen werden hierauf wieder mit phosphatgepufferter Kochsalz-Lösung auf das ursprüngliche oder ein anderes gewünschtes Volumen' suspendierte Man setzt dann alβ Konservierungsmittel weiteres Merthiolat auf eine End konzentratipn von 1 3 10 000 zu und „ewahrt die Vaccine

109813/1591

bei 4° C auf, ohne dae Formalin su neutralisieren.

Das in dieser Yaooine enthaltene Antigen wird dann alt Kaliumalaun gefallt und wieder auf dae ureprüngliohe YoIt** Ben suspendiert (Arbeitsweise von Beispiel 1, Stufe C-2)« Pas Produkt ist nachfolgend als A-4 bezeichnet«

Man stellt weitere fünf Poeten Vaoolne-Konsentrat her und Überführt sie naoh der obigen Arbeitsweise in an Kaliumalaun adsorbierte Vacoine, Jede dieser Vaooinen (nachfolgend alt 4-B bis 4-P bezeichnet) wie auch die an Kaiiutsalaun adsorbiert e Vaccine 4-A wurden getrennt naoh der Methode von Beispiel 1, stufe C-1, auf ihre iTirkeaiüceit bei Hamstern geprüft und die Boren getrennt naoh der Konplementblnäungs-Technlk untersucht? Ergebnisse!

Tabelle IX

Vaccine	Oeonetrisches Mittel Titers (50 * Bindung)	dss	KoBpleaentbindungs
	Kontrollen		vacoinebehan-
	TaA O . Ta* 21		delte tiere
4-A	< 1 <	MMMI 1	126
4-B	< 1 <	1	128
4· C	< 1 «	1	80
4-D	< 1 <	1	111
4-B	< 1 «	1	111
4-P	< 1 <	1	157
Placebo	< 1 <	1	* 1

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109813/1591

so

Die 1olgende Tabelle nennt Werte fur die Heetproteinkonsentration in einen gemüse Belepiel 1, Stufen A bis ^* erhaltenen 6Ox-Konzentrat einer PPLO-Suopeneion und die Veminde^ rung des Reetprotelna bei erneuter Vaeohbehandlung de· 60faoh-Kontsentratea durch Schleudern der Organienen auf einer Zentri fuge der Bauart Spinco bei etwa 16 000 U/Hin.

T a bell e X

Auswirkung eine· Waschen·

von Baton-PPLO-Suepeneionen

mit einer !Concentration von 6Ox

60fach-Konsen~ niohtdialy« niohtdialy- nichtdialy-

trat sierbaree eierbarea» eierbaree»

Oeeuntpro- niehteedinen- eedieentiertein_B y/nl tierbare· bare·-Pro-Protein, teiri /l ^ r/1

vor den 374 146 270 Schleudern

nach den

Schleudern 222 <5 242

äquivalente Ergebnisse können erhalten werden» wenn nan in Beiepiel 1 und 3 die Zueaaneneetsung von lledlun I bsw· XI dahingehend verändert, das· nan die Oruppe-A-Stoffe durch etwa 0,1 bis 20 jC (1) Allantöle-Flüssigkeit de· Bl·, (2) eine Kombination von Albuain, Traubeaeuoker und Arginin und (5) eine Konbination von Blalbunin mit nlndeaten· eineM 3toff au· der Gruppe Albumin» Traubensuoker und Arginin und den »ruppe-B-Stoff durch (1) eine Konbination von Cholesterin, Lecithin, Biphoephopyrldlnnuoleotid oder (2) Hefeextrakt ereetet. ^^ 10 9813/1591

BAD

Claims (1)

1817612

P Ιέ 17 612.8-411 _{lt 9dtmmm 1β}._Λ

Mfck 1 Co.. mc. SVÜmS ί?ϊ°

Patentansprüche

Medium für die Replikation von Mycoplasma pneumoniae« bestehend aus, bezogen auf das Gesamtmediura,

a) etwa 0,1 bis 20 i» eines Gruppe -A- Stoff es aus der Gruppe α) Allantois-FlUsaigkeit dee Eis,

ß) Kombination von Albumin, Traubenzucker und \rginin und

γ) mindestens einem Stoff der Gruppe Albumin, TraubenajicieT und Arginin in Verbindung mit Allantois-Plüssigkeit des

Eis, .

b) maximal etwa O₉025 $> eines Gruppe-B-Stoffes aus der Gruppe α) Kombination von Cholesterin, Lecithin, Diphosphopyr !denude otid

und ' ■ - .."..

ß) Hefeextrakt,

c) Rest übliche, Salze und Puffersubstanzen enthaltende wässrige Phase β

wobei der pH-V/ert des Mediums zwischen 6,5 tznd 8,0 liegt«

2- Medium nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen pH-Wert von 7₅2 bis 7,4.

3- Medium nach Anspruch 1 oder 2, gekennaeichnet durch einen Gehalt an 0,5 bis 10 # eines Gruppe~A~3toffeso

" " ■■■-■'-■..* 'S-,' a

1 - 109813M591

Medium nach Anspruch 2, bestehend aus

a) etwa 0,1 bis 20 # einer Mischung von Albumin und Allantois-FlUssigkeit des Eis,

b) maximal 0,025 £ Hefeextrakt,

c) Rest wässriger Phasec

5. Medium nach Anspruch 2, bestehend aus

a) etwa 0,1 bis 20 £ einer Miβchung von Albumin, Traubenzucker und Arginin,

b) maximal 0,025 £ einer .Mischung von Cholesterin, Lecithin* und Diphoaphopyridinnucleotid,

c) Rest wässriger Phase ο

_ ₂. _ 10981371591