DE1617390A1 - Herstellungsart der Vorbereitung der Kultur zur Erzeugung eines neuen antifungalen Antibiotikums - Google Patents

Description

Ceskoslovenska akademie ved-, Praha Λ , Narodni

Herstellungsart der Vorbereitung der Kultur zur Erzeugung eines neuen antifungalen Antibiotikums

der Erfindung ist ein Verfahren £ur Vorbereitung der XuItür zur Erzeugung eines neuen, antl£ungc3j.£/i Antibiotikums.

ILs Jg^-DZt werdea von den antifungalen Antibiotika vcr allem 4v;ei durch Permentationsverfahren erzeugte Präparats benützt. Das eine von diesen - Fungizidin - wird durch die Aktinomyzete Streptromyces ncwrS^jL "(U.S. Pat. 2 797 183) produziert, und das andere - Griseofulvin - wird mittels des Pilzes Penicil-7 i.uin griseofulvum produziert (Brit. Pat. 784· 61Γ5) ι Die beiden Präparate trerden vorwiegend peroral applizifij-t,, für eine oberflächige Anv/eriiing in der Form einer Salbe oder- eines Streupulvers wurden die zugehörigen Applikationen von Fu/vgL-zidin erzeugt. Unter Berücksichtigung dieser Sittafeion,

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.19671

:;ge : iar bekannten Gefahr der Bildung von resisten^en „ti .anen Mikroorganismen, is'o die Frage der Gewinnung

3uer antifungaler Antibiotika immer außerordentlich .■'".fuell. Eine solche neue Gewinnungsmöglichkeit eir^s ^tz-fur-galen Antibiotikums gibu das V er fahrer, nach der f an.

_e Vorbereitung einer submersen Kultur für die Herstelung 3ines neuen antifungalen Antibiotikums wird nach . sr -—'■findung im wesentlichen so durchgeführt, daß eine air... Kultur von der Basidiomyzete Oudemansiella mucida .t^vjls der Methode der Tiefkultivierung bei der i'ezipeatur von 15 - 50⁰C 6 bis 8 Tage lang im flüssiger. Tährbode.i kultiviert wird, der als assimilierbare Kohle:_- zozl..-· und Stickstoff-Quelle Glyzide, Lipide, JLxino.--äu-3n, Amoniumsalze, Kitrate, beziehungsweise sclcLa l'iommt.Lüen enthaltende Rohstoffe, und als Nahrs^c^e ^ineil....Ize, Sulphate, Chloride, Phosphate, Iodide, oder _.arLonate von Kalzium, Na"criun, Kalium, Magnesium., Zink, Kupi'ar, Kobalt, leisen (II) oder Eisen (III) enthält, Die ...ssimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoff -Quell -^n. wer den mit Vorteil in der Konzentration bis 15 %·> nnd die ITährquellen bis 5 % benützt, wobei die Konzentra"cionsangabe auf das Gewicht des Nährbodens bezogen ist.

her durch die angeführte Basidiomyzete produzierte antiviotische Stoff wurde bisher im reinen chemischer. Zustand nicht isoliert. Zur oberflächigen Applikation gegen Hautmykosan kann aber ein Konzentrat von diesem J-ntibiotikum angewandt werden, wobei 1 ^g die Aktivität von ca. 30 bis 50 Ei.J:3iten von Fungizidin enthält. Eine zweckmäßig

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konzentrierte Lösung von diesem Extrakt in einem esjzsprechenden organischen Lösungsmittel kann direkt zur oberflächigen Applikation gegen verschiedene Hautmy-.•:osen gebraucht werden. Bei dieser Applikations art . ii-Z^ C-as Präparat keine toxische Wirkung oder Nebenv.irk^ij. Das ölartige Konzentrat ist beträchtlich thermostabil und seine antibiotische Aktivität wird auch nach 50 Minuten langer Behandlung bei einer Temperatur von 10O⁰C nicht vermindert. Seine Lösung ir. Aetliyläther oder in einem anderen ge eignem en organischen Lösungsmittel zeigt spezifische Absorbtion i_ ;.T-C-ebiet bei 205, 211, 223, 229, 237, 264, 292, 2^9 ■i_id 3'. 2 m /t(— 1 Ely«·), die nach unserer Bestimmung die anwesenheit eines aktiven Stoffes bedingt.

Das ermittelte Spektrum v.^Teist darauf hin, daß der gewonnene Stoff mit keinem der bisher beschriebenen -In^-Ci- -otl.:a identisch ist.

I" er Organismus, der das neue Antibiotikum nacli der Srindung produziert, is"ü die Basidiomyzete Oudemansieila -icida (Scirrci. ex Fr.) I-Iöhn, deren Synonyme nach Singer _νϊ1. Singer: 2he Agaricales in modem .taxonomy.Ed.J.Cramer, Weinheim, 1962) Armillaria nucida Kummer, Collybia mucida Quel., Lepiota mucida Schröter und Muciduia mucida Pat* sind. Sie gehören in die Ordnung Agcricales, Familie Tricholomataceae, Gattung Marasmieae, i-abgatüung Cudemansiellineae. Das Vorkommen und Ausselion ihres 2TaturI:örpers wird zum Beispiel von Singer oder Cartwright und Ξ,-ndlay beschrieben (X.SiC. Cartwright, V.P.l·:. Findlay: Decay of timber and its prevention. His Majesty's

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-jationary Office, .London, 1964). Die reine Laborkultur .νaim durcli Explantation des Naturkörpers und durch die .'nkuoation des Explantates auf Ag ar-Nährt» ο den gev/oiiiien -'orden. Die reine Kultur wächst auf dem Malz-A:; sr in der Form von eineis, weißen, watteartigen Myzel, asporogen, Spangen "bildend, mit verzweigten' oder s ekti erteil I-Iyf en von der Dicke von 2 "bis 5 /^· In. einigen S¹ all en l:omnt es in der reinen Kultur zu einer spontanen Bildung das '-..rcurkörpers, der meistens kleinere Dimensional als :.η der Natur erreicht.

3as ---tibiotikum wird wie folgt, hergestellt: Bei der. V erfahr oiii nach der Erfindung ist "bei der Vorbereitung des .'.auen Antibiotikums der Ausgangspunkt die Kultur auf -gar-Nährboden, die auf einem Nährboden in Kolben auf dem Schüttelapparat geimpft wird. Mit dies-en flüssigen llulzuren wird der Nährboden in dem Inokulationstanl-: ge- :apft, und von dort aus wird der Fermentations "cc. ~θπ in -etriebsfermentoren wieder geimpft. Andererseits 1-Lunn die Fermentation mit der Basidiomycete Oudemansiella durch Oberflächenkultivierung durchgeführt werden. Theoretisch wäre es auch möglich, das Antibiotikum aus der. Pilz zu erzeugen, der durch Natursammlung der wildwacii^enden Natur-.körper geworden wird, was natürlich für die Ausnutzung in der Industrie nicht in Frage komut. Hehr vorteilhaft erscheint di^ Anwendung der Tiefkulüivierung nach dem obenerwähj*ten Schema.

Der I „hrboden enthält eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und organischem oder anorganischem Stickstoff, Mneralnährsalze und Spuren von verschiedenen MetäLlen,

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cie -piLTcentreils aus Verunreinigungen in den anderen Komponenten des Nährbodens anwesend sind, Als Quelle von assimilierbaremKohlenstoff können Lipide (vegetabilischö oder tierische OeIe) benutzt werden, verschiedene Polyole (z.3. Glyzerol), assimilierbare Kohlenhydrate, z.3. G-lucose, Saccharose, ifruktose, Maltose, Dextrin, Stärke _vnormale oder lösliche), lösbare Derivate der Zellulose und andere in Wasser völlig oder zum Teil lösbare Kohlenhydrate oder Kohlenhydrate enthaltende Stoffe (z.B. Melasse, Malz, Hydro! usw.). Als Quelle von assimilierbarem Stickig -so ff können verschiedene Stoffe, wie z. B. Aminosäuren oder Aminosäuren enthaltende Stoffe, Kasein, auch hydrolysiert, 5'ischmehl, Sojabohnenmehl, ¥1 eischextrakte, P ep ton, Destil-.. at ions schlempe, Hefe (auch Extrakte oder Autolysate), ,.äis-Weichwasser . (corn-steep: liquor) und verschiedezie andere stoffe von pflanzlicher oder tierischer Abstammung, angewandt werden. Außerdem können als Kohlenstoff-Quelle auch verschiedene chemische Verbindungen angewandt werden, die amoniakalen, aminartigen, amidisehen, Nitrat- oder STitrit-Stickstoff enthalten. Vorteilhaft erweist sich auch die Zugabe von verschiedenen Mineralnähr sal ζ en, wie z. B. H"atriumüalz (z.3. Chlorid), Kalziumsalz (z.B. Karbonat), MagneoiuEisalz (z. B. Sulfat), Phosphat usw. Der pH-Wert des JTähr-"',odens wird vor der Sterilisation auf 3-7 eingestellt, am resten auf den pH-Wert von 5»5 bis 6. Die Permentauion kann ■^oi der Temperatur von 15 - 30⁰G, am besten von 18 - 25°C -erlaufen. -_; ■;"■

^ie Entwicklung der submersen Kultur verläuft langsamer als :·;.Β. bei den Aktinomyzeten oder P.enicillien. Das Maximum ihres Wachstums wirdgewöhnlich nach 5 - 6 Tagen erreicht_;

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die Fermentation' wird nach. 6-8 Tagen eingestellt;, wobei die Produktion des Antibiotikums maximal is~c. Die pH-Werte ändern sich, während der Fermentation in Abhängigkeit vom Alter der Kultur und von der angewandten Konzentration der Kohlenstoff-Quelle. Bei eineii Ausgangspunkt eines pH-Wertes von 5»5 erscheint in den ersten Tagen der Kultivierung eine Erniedrigung auf 5>O -r,7, dannfolgt eine allmähliche Erhöhung bis auf den 3ndwert, ca. 6 - 7»5· Die antibiotische Aktivität erhöiit sich in den ersten J - 4- Tagen allmählich, dann folgt είη heftiges Anwachsen bis auf den Endwert von 1OOOO bis ^:0000 Fungizidin-Einheiten/ml, bei dem das Fermenta-"aionsverfahren beendigt wird. Die Intensität der Belüftung kann sich im Bereich von 0,5 bis 8 Liter Lufu/I Liter Fährboden/Min, bewegen, ohne einen größeren Sinflu£ auf das Niveau der Produktion des Antibiotikums zu bewirken .

Pralcjisch kann die Erfindung nach den folgenden Beispielen durchgeführt werden, wird aber auf diese nicht ausschließlich beschränkt. Die Aktivität des produzierten Antibiotikums wurde durch diffuse mikrobiologische Plattentitration mit dem Stamm Candida albicans SZU unter Anwendung von !Fungizidin als Vergleichsstandard bestimmt, und wird in. den Einheiten von Pungizidin/1 ml Fermentationsflüssigkeit ausgedrückt.

Beis-piel 1 .

Aus der. Naturkörper der Basidiomyzete Oudemansiella mucida wird mit sterilem Skalpell ein Stück vom Myzelgewebe

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o:cpIar,T7iert, in das Probierglas mit schrägen'A-gar-Kal z übertragen und Dei 20 - 25°C inkubiert. Die aufgewachsene i^vlyzelkult.ur wird weiter in Probiergläser mit schrägem Ägar-Kalz geimpft. Kadi 10 'Tagen Wachstum-wer-den JLie Kulturen χει Eulilschrai-ik bei +4- C aufbewahrt -und im Bedarfsfälle für die Impfung des Inokulationskolbens oder für weitere Ήachimpfung auf festen Agar-Ifährboden "benü^st;. .

In einen ?erm.entati ons tank mit 50 Lit er*-Vo lumen werden 18 Liter j?emientationsboden von folgender Zusammensetzung gefüllt:

C-luccse . .■·.'. ' 3 %

Iais-Weichwasser (corn-steep liquor, -•ro cl-ronsub stanz 50-%)" . 1,5 %

Kagnesiumsulphaü, kristallin 0,15 %

Der pE-Wert tvird auf 5,5 eingestellt, und dieser Nährboden wird 60 Minuten lang im strömenden Dampf und 60 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. 2\"ach der Abkühlung auf 23°C v;ird der i^ermenta'cioiistank nit ca. 1200 ml submerser Kultur ^: Oudeiiansiella nucida aus 5 Srienmayer-Kolben mit einem Vu- 1 um en von 2000 ml mit ^i-OG nl 3oden von derselben Zusaminen-„etzung geinpxt, der vorher wäjirend 120 Stunden auf dem -'•eziproken Schutt el apparat inkubiert vnir de. Die Kulöur im Impfungstank wird mit 0,7 Lufv-Volumen/ L Volumen 2-ermen-"cationsboden "belüftet und während 96 Stunden durohgemischt.

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Dann wird mit dieser Kultur der Produkt ions f ermentor mit einem Volumen von 1000 Litern, gefüllt mit 700 Lit;er 3oden folgender Zusammensetzung geimpft:

Glucose 5 %

xiais-Weichwasser (corn-steep liquor),

Trockenmasse 50 % . 2,0 %

?Iagnesiumsulphat, kristallin 0,15 °/°

Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 5?5 eingestellt. Die Fermentation verläuft 168 Stunden "oei einer 'Temperatur von 23 — 1 G, bei einer Belüftungs-In^ensität; /on 0,7 Luft-Volunien/Volumen Boden, und bei 4-00 Umdrehun-3en des Rührers / 1 Minute.

-Tacii der Anfangs Senkung des pH-Wertes auf 4,7 steigt der pH-Wert am Ende der Fermentation auf 6,4-. Die antibiotische .-.ktivität der Fermentationsflüssigkeit beträgt 58000 Fungizidin-Sinheiten/ 1 ml.

Beispiel 3

Der Produktionsfernentor mit einem Volumen von 1000 ml wird mit 700 ml Nährboden von folgender Zusammensetzung gefüllt:

Glucose . 2,0.^

SoQabohnenmehl 3.,0 %

belasse · 0,6 %

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ι»ei» pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 5,5 eingestellt. Zl& Sterilisation, Impfung und !Cultivation, verläuft wie im "Beispiel 2. Nach 144Stunden -.,erreicht der TIt er vom Antibiotikum den Wert von 65000 ITungizidin-Einheiten/ 1 ml.

Beispiel 4

Der Produkt!onsfermentor mit 1000 Liter Volumen wird mit 700 Liter Boden folgender Zusammensetzung gefüllt:

Glucose ' 6,0 %

?IaIs-Weichwasser (corn-steep liquor,

Trockensubstanz 50 %) , 1,0 %

Amoniumnitrat * . ' 0,2 %

-'lagnesiumsulphat, kristallin 0,15 %

Der pH-¥ert wird auf 5?5 eingestellt. Die Sterilisation, Impfung und !Cultivation verläuft wie im Beispiel 2. Nach 144 Stunden erreicht der Titer des Antibiotikums gewöhnlich 70000 Fungizidin-Einhelten/ 1 ml.

Beispiel 5 " ~

Der Produktionsfermentor mit 1000 Liter Volumen wird mit 700 Liter Boden folgender Zusammensetzung gefüllt:

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. 2,0 %

lösliche Stärke 1,0 %

Daxtrin 1,0%

Destinations schlempe 0,5 %-

.'-"oniuziphosphat (sekundär) 0,2 %

Acgnesiumsulphat, kristallin 0,15 % '

Natriumchlorid 0,2 %

Zaliumkarbonat 0,2 %

Der pH-V/ert wird vor der Sterilisation auf 5,5 eingestellt. Die Sterilisation, Impfung und Kultivation verläuft wie im Beispiel 2. Nach 168 Stunden erreicht der Titer vom Antibiotikum 60000 i¹ungizidin-3inheiter_J./l ml.

I-eisOiel 6

Lie Fermentation vjird -wie im Beispiel 5 durchgeführt, die Saccharose wird aber durch 2 % Glyzerol ersetzt. Unter diesen Bedingungen wird nach 168 Stunden der Titer des Antibiotikums au 56000 Pungizidin-Einheiten/ 1 ml erreicht.

Beispiel 7

Der Fermentaijionstank mit 1000 Liter Volumen wird mit "liter Boden folgender Zusammensetzung gefüllt:

-•lucose Asparagin Alanin
Amoniumtartrat

0	,.25
0	,01
O	,05
0	,1
0	,05
MÜ QRiQINAL

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-,^O:U anil. ' 0,025 ^c/j

-iaCI 0,001 %

Spuren von Zn⁺⁺, Kn⁺⁺, Fe⁺⁺⁺ oder ?e⁺⁺, ou⁺⁺, co⁺⁺, ηJbO₅, ex,

Vitamin B_-1, Bp, 3g, iiikotinaiiiid
ΰ a-P antiio then afc

Der pll-V/ert vn.rd auf 5,8 zubereitet. Die Sterilisation, Impfung und Cultivation verläuft v;ie im Beispiel 2. Kach 144 S"3uiiden erweist- die Fernien-üationsflüssigk-eit- die an"üibiotisciae Aktivität von 15OOO Pungizidin-Einheiten/ 1 el.

3eisOJel 8

Die Fermentation wird wie in Beispiel 7 durcngefünrt, aber --.sparegirj. wird durch Glutaminsäure und Alanin durch Glyzin ώΓβετζτ. unter diesen Bedingungen beträgt die an^ibiotische -lctivität der Fermentationsflüssigkeit nach 144 Stunden Fungiaidin-Einheiten/ 1 nl.

- Patentanspriiehe -

Claims (1)

1. P a t' e η t an sprue he

   Verfahren zur .Vorbereitung der Kultur zur Erzeugung eines neuen antifungalen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur Basidiomyzete Oudenansiella mueida (Schrad. ex Fr.) Höhn auf flüssigen iiährboden kultiviert wird, welche als Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff Glyzide, Lipide, Polyole, Aminosäuren, Amoniumsalze oder Extrate, bzw. diese Komponenten enthaltende Stoffe enthält, und als Mineralnährsalze Chloride, Sulphate, Phosphate, Iodide, Borate oder/und Karbonate von Kalzium, Katriun, Kalium.» Magnesium, Zink, Kupfer, Kobalt, Eisen (H) oder Eisen

   (in). . ■

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle in einer auf das Trockengewicht des Nährbodens bezogenen Konzentration von bis 15 %» die Mineralnährsalζe bis 5 % angewendet werden.

   12. März 1970/525

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