DE1598886B2 - Verfahren zur Durchführung immunserologischer Reaktionen - Google Patents

Description

ί 598 886

tial eine Wirkung auf die Agglutination der roten Blutzellen.

Es gibt drei Grundmethoden zur Durchführung des Verträglichkeitstests vor einer Bluttransfusion. Die erste besteht darin, das Serum des Empfängers und eine Salzsuspension der roten Blutzellen des Spenders zusammenzumischen, diese Mischung bei 37° C im Brutofen zu halten, gefolgt von einer kritischen Prüfung der Zellen vor und nach dem Zentrifugieren zur Beobachtung des Auftretens einer Agglutination. Die zweite Methode wird in ähnlicher Weise durchgeführt, aber mit dem Zusatz von Rinderalbumin oder menschlichem Albumin zur Erhöhung der Proteinkonzentration. Die dritte Methode besteht darin, daß man die roten Blutzellen des Spenders mit dem Serum des Empfängers im Brutofen behandelt, anschließend die Zellen wäscht und menschliches Antiglobulinserum zusetzt.

Die bei den verschiedenen Methoden der wechselseitigen Blutgruppenbestimmung zur Ermittlung der Verträglichkeit vor der Bluttransfusion auftretenden Schwierigkeiten zeigen sich auch bei den Tests zur Blutgruppenbestimmung.

Es stellte sich daher die Aufgabe, durch Auswahl eines bestimmten Reaktionsmediums die obengenannten, bei immunserologischen Untersuchungen allgemein auftretenden Schwierigkeiten zu beseitigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß als Reaktionsmedium eine wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Polymers von Rohrzucker mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2000 bis 2 000 000, welche auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 gepuffert ist und eine Ionenstärke zwischen 0,05 und 0,18 Gramm Ionen pro Liter aufweist, verwendet wird.

Vorzugsweise wird derart verfahren, daß das synthetische Rohrzucker-Polymer ein Molekulargewicht zwischen etwa 100 000 bis 800 000 und die wäßrige Lösung eine Ionenstärke von 0,16 Gramm Ionen pro Liter aufweisen.

Ein Entsprechendes Polysaccharose-Präparat ist bekannt und im Handel erhältlich.

Dieses enthält ein sphärisches Molekül ohne ionisierbare Gruppen, wodurch es im pHrBereich von 4 bis 10 inert ist. Es enthält etwa 23 % freie Hydroxylgruppen, die ihm eine große Affinität für Wasser geben. Der Salzgehalt des Präparats als NaCl beträgt weniger als 1%

Im Gegensatz zu anderen synthetischen Kolloiden, wie Dextran und Polyvinylpyrrolidon, haben geringe Veränderungen im Molekulargewicht des synthetischen Rohrzucker-Polymers nur eine geringe Wirkung auf seine Dielektrizitätskonstante. Bestimmungen der Dielektrizitätskonstanten wäßriger Lösungen des synthetischen Rohrzucker-Polymers mit einem Molgewicht von 300 000 und 400 000 zeigen, daß eine 1 %ige Lösung (Gewichtsprozent bezogen auf das Volumen) die Dielektrizitätskonstante von 35 auf 38 erhöht, während eine Änderung im Molekulargewicht-einer

ίο ähnlichen Lösung von Dextran die Dielektrizitätskonstante von 38 auf 58 und eine Änderung im Molekulargewicht einer ähnlichen Lösung von Polyvinylpyrrolidon die Dielektrizitätskonstante von 30 auf 40 erhöht. Da der die Agglutination vergrößernde Effekt der Polymeren abhängig ist von dem dem Wasser gegebenen Zuwachs der Dielektrizitätskonstanten, ist der Grad der Agglutination von der Konzentration der Lösung abhängig. Geringe Abweichungen im Molekulargewicht synthetischer Kolloide, wie Dextran und

ao Polyvinylpyrrolidon, verursachen große Abweichungen bezüglich der Dielektrizitätskonstanten und geben so Anlaß zur Bildung von »Geldrollenanordnungen«. Es wurde festgestellt, daß das kritische Zeta-Potential, bei dem die Geldrollenanordnung beginnt, bei 4,2 (± 0,2) Millivolt (mV) liegt.

Die Moleküle des synthetischen Rohrzucker-Polymers sind verhältnismäßig inert und elektrisch neutral. Daher dimerisieren sie nicht beim Stehen in wäßriger Lösung. Dieser Widerstand gegen die Dimerisation ist bedeutsam, da die Dimerisierung eine nicht Spezifische Agglutination von Molekülen verursacht, was eine gleichzeitige Zunahme in bezug auf die Dielektrizitätskonstante und eine Abnahme des Zeta-Potentials mit sich bringt. Beide Substanzen Dextran und Polyvinylpyrrolidon dimerisieren und bilden beim Aufbewaren wäßriger Lösungen einen Niederschlag, siehe »Artificial Colloids für Intravenous Use«, National Academy of Sciences, National Research Council, September 1962, J.T.Trupp, S. 93.

Die kritische Beziehung von Zeta-Potential zur Agglutination der Erythrozyten kann aus den Tabellen I und II ersehen werden. Die Tabelle I vergleicht das Zeta-Potential mit der Agglutination, die mit drei salinen Antikörpern-D-Seren, dialysiert und verdünnt mit den selben Puffern, erhalten wurde, und Tabelle II vergleicht das Zeta-Potential mit der Agglutination, die mit drei Albumin-Antikörper-D-(Rh„)-Seren, dialysiert und verdünnt mit den selben Puffern, erhalten wurde. In jedem Fall wurde die Tonizität mit Rohrzucker auf 300 Millimol eingestellt.

Tabelle I

Zeta-Potential

Serum Nr.155

160

0

320

Reziproke Werte der Verdünnung von Anti-D

Serum Nr. 243

160

0

320

0

Serum Nr. 233

160

0

320

0

0

0

0

0

mV

W

±

0

0

-26,0

++

0

+ +

±

0

— 23,4

+++

0

-\—r·+

H—l·

-J-

W

-23,3

++H—l·

0

-J--J I—J-

-j- -j-

H—1"

±

-21,1

++++

±

++++

—I—]—j—

-j--j--j-

-J-

-19,6

_|—I—J--J-

+ +

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H—l·++

—I—I—f-a. —J—

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++■

-18,8

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+

-j J—I—J-

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+++

-J--J-

-18,2

++++

+++

+

+++ +

+ + + +

+++

-}--}-

-17,1

+ +

·+

-16,6

+

-15,8

+

Tabelle II

Reziproke Werte der Verdünnung von Anti-D

Serum Nr. 186

320

0

160

0

Serum Nr. 228

160

+

320

0

Serum Nr. 222

320

W

640

0

eta- otentia

-J-

0

4-

0

±

0

mV

+

0

-}-

W

-J-

-J-

-13,0

-J-

W

-f- -f.

+

-J-

-J-

-11,4

-j-

-j- -j-

+±

-J—I—J-

-J--J-

— 10,8

H—I—l·

-J-

H—l· +

H—h

-J—I—J-

-J—J-

— 10,3·

+++

++

—i—ι—{—j—

-J- -J- -J-

—I—I—ι—ι—

-J--J--J-

-9,6

++++

+++

++++ ■

++++

—I—ι—ι—ι—

-J--J--f-J-

-9,1

-Jj -J—J—J-

H—I—h

-|—I—I—|-

-j—]—I—J-

—I—ι—ι—J^

■++++

-8,8

++ + +

++ +

++++

++++

++++

+ +++

-8,4

-8,1

-7,7

Die Tabellen I und II zeigen, daß das kritische Zeta-Potential, oberhalb dessen eine Agglutination nicht eintreten kann, bei — 23 und — 13 mV für saline Antikörper und Albuminantikörper liegt. Für eine optimale Agglutination und einen Titer sollen diese maximalen Zeta-Potentiale bei — 18 bzw. — 8 mV liegen.

Normales menschliches Blutserum hat folgende Eigenschaften:

pH: 7,5;

Dielektrizitätskonstante: 160 bis 190;

Ionenstärke: 0,16 Gramm Ionen pro Liter.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reaktionsmedium besitzt somit serologische Eigenschaften; die stark denjenigen des normalen Blutserums ähneln.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiele

1. Es wird ein Zusatzmittel für die wechselseitige Blutgruppenbestimmung mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Imidazol 3,404 g

Destilliertes Wasser 800 ml

InHCl 9,30 ml

NaCl 4,67 g

Synthetisches Polysaccharid

Molgewicht 4 · 10⁵ .. 263,4 g

Wasser ad 1 Liter

Diese Zubereitung gibt eine Lösung mit einem pH 7,5 und einer Ionenstärke von 0,16 Gramm Ionen pro Liter.

Einem Volumen einer 3 %igen Salzlösungssuspension der Erythrozyten des Spenders wird ein Volumen Serum des Empfängers und ein Volumen der vorbeschriebenen Zubereitung zugesetzt. Die Mischung wird 15 Minuten bei 37° C im Brutofen gehalten, und anschließend an diese Behandlung wird das die Mischung enthaltende Röhrchen 2 Minuten bei 500 bis ao 1000 · g zentrifugiert und auf Agglutination untersucht.

2. Es wird ein Verdünnungsmittel für das Anti-D-Objektträger-Testserum mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Imidazol 0,1 M

1 η HCl 22,8 ml

NaCl 8,03 g

Synthetisches Polysaccharid

Molgewicht 4 · 10⁵ 260 g

Wasser ad 1 Liter

Dieses Verdünnungsmittel hat ein pH von 7,4; eine Ionenstärke von 0,16 Gramm Ionen pro Liter und ein Zeta-Potential von 7,2 mV.

3. Es wird ein Medium zur Bestimmung von Antikörpern, das 22% Rinderalbumin ersetzt, mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Imidazol 0,1 M

1 η HCl 22,8 ml

NaCl 2,77 g

Synthetisches Polysaccharid

Molgewicht 4 · 10⁵ 200 g

Wasser ad 1 Liter

Das Medium hat ein pH von 7,5; eine Ionenstärke von 0,07 Gramm Ionen pro Liter und eine Dielektrizitätskonstante von 716.

4. Es wird ein Verdünnungsmittel für saline Antikörper mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Imidazol 0,1 M

1 η HCl 22,8 ml

NaCl 20 g

Synthetisches Polysaccharid

Molgewicht 4 · 10^s 30 g

Wasser ad 1 Liter

Dieses Verdünnungsmittel hat ein pH von 7,5 und eine Dielektrizitätskonstante von 180.

Claims (2)

anhäufen, in einer sogenannten »Geldrollenanordnung« Patentansprüche: der Erythozyten. Dieselbe Art von Antikörpern kann durch Agglutination in Salzlösung nachgewiesen wer-

1. Verfahren zur Durchführung immunserolo- den, wenn die roten Blutzellen vorher mitbestimmten gischer Reaktionen in einem aus einer kolloidalen 5 proteolytischen Enzymen zur Reaktion gebracht wur-Lösung eines synthetischen Kolloids bestehendem den. Die proteolytischen Enzyme reduzieren die An-Reaktionsmedium, dadurch gekenn- zahl ionisierter Oberflächengruppen auf den roten zeichnet, daß als Reaktionsmedium eine Blutzellen und setzen so ihre Oberflächenladung herab, wäßrige Lösung eines wasserlöslichen Polymers Eine Alternative zur Verwendung von Enzymen stellt von Rohrzucker mit einem mittleren Molekularge- io der Antiglobulintest dar.

wicht von etwa" 2000 bis 2 000 000, welche auf Neben der wechselseitigen Blutgruppenbestimmung

einen pH-Wert zwischen 7 und 8 gepuffert ist und werden auch Blutuntersuchungen zur Ermittlung

eine Ionenstärke zwischen 0,05 und 0,18 Gramm spezieller Antikörper und Antigene im Blut routine-

Ionen pro Liter aufweist, verwendet wird. mäßig in Salzmedium, in hochmolekularem Protein,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 15 wie Rinderalbumin, unter Verwendung von menschlizeichnet, daß das Rohrzucker-Polymer ein Mole- chem Antiglobulin und durch Behandlung der roten kulargewicht zwischen etwa 100 000 und 800 000 Blutzellen mit proteolytischen Enzymen durchgeführt, und die wäßrige. Lösung eine Ionenstärke von Die menschlichen roten Zellen tragen bei physiologi-0,16 Gramm Ionen pro Liter aufweisen. sehen pH-Werten eine negative elektrostatische La-

20 dung. Diese Ladung erhöht sich hauptsächlich durch Ionisation ionogener Gruppen auf der Oberfläche der Erythrozyten, variiert aber als Ergebnis der Absorption

ionogener Substanzen, wie Antikörper, polyvalenter

Metallkationen, Polyelektrolyten, Fettsäuren usw. in

35 bezug auf das umgebende Medium. Da jede rote Zelle

negativ geladen ist, besteht eine abstoßende Kraft zwi-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchfüh- sehen ihnen. Die Blutgruppen-Antikörper, die in SaIzrung immunserologischer Reaktionen in einem aus lösung eine Hämagglutination hervorrufen, sind einer kolloidalen Lösung eines synthetischen Kolloids hauptsächlich gamma-Globulin-Moleküle mit Molebestehendem Reaktionsmedium. 30 kulargewichten von etwa 9 · 10^s, d. h., sie haben einen Bei Bluttransfusionen ist es allgemein üblich, zu er- Sedimentationskoeffizienten von 19 · 10~¹³ Sekunden mitteln, ob das Blut des Spenders sich mit dem Blut des (19 S), während die Antikörper, die in Salzlösung nicht Empfängers verträgt. Wenn das Blut des Spenders und agglutinieren Sementationskoeffizienten von 7 S entdas Blut des Empfängers sich nicht vertragen, ist es sprechend ihrem Molekulargewicht von 1,6 · 10⁵ möglich, daß eine hämolytische Transfusionsreaktion 35 haben. Zum Auftreten einer spezifischen Immunagglueintritt, was zur Folge hat, daß beim lebenden Men- tination müssen sich die roten Blutzellen einander sehen eine Zerstörung der roten Blutkörperchen im nahe genug kommen, damit Brücken aus Antikörper-Blut des Empfängers eintritt. protein zwischen den Zellen gebildet werden. Bei Anti-Die Verträglichkeit wird durch wechselseitigeBlut- körpern der 7-S-Klasse muß dies weniger als 200 Änggruppenbestimmung geprüft. Gewöhnlich wird eine 40 ström-Einheiten betragen. Wenn die roten Blutzellen in Suspension der Zellen des Blutes des Spenders mit nicht elektrolytischen Medien mit Dielektrizitätskondemselben Volumen des Blutserums des Empfängers stanten, die dem destillierten -Wasser gleich sind, vermischt und im Brutofen bei Körpertemperatur ver- suspendiert werden, so genügt die abstoßende Kraft schiedene Zeitabschnitte aufbewahrt. Während der zwischen den roten Blutzellen zur Überwindung der Inkubationszeit wirken Schutzstoffe, die im Serum des 45 Anhäufungskräfte des Mediums und der Antriebs-Empfängers anwesend sind, den Antigenen, die auf der kraft der roten Blutzellen, die durch thermische und Oberfläche der roten Blutzellen vorhanden sind, ent- kinetische Energien verliehen wird. Mit anderen Worgegen und binden diese. Die Anwesenheit solcherent- ten, die Kollisionsfrequenz zwischen den roten Zellen gegenwirkender Schutzstoffe wird durch die Agglutina- ist auf die Nullwahrscheinlichkeit herabgesetzt. In tion der roten Blutzellen des Spenders und der Mangel 50 Gegenwart eines Elektrolyten wird viel von der elekan solchen entgegenwirkenden Schutzstoffen durch trostatischen Abstoßungskraft durch die Anziehung der das Ausbleiben der Agglutination der roten Blutzellen Kationen an die Oberfläche der roten Blutzellen herabdes Spenders bestimmt. gesetzt; und als Ergebnis davon wird eine diffuse elek-Das bekannteste Mittel zur Suspendierung der roten trische Ionenwolke oder eine Doppelschicht um jeden Blutzellen des Spenders ist eine Salzlösung. Es wurde 55 Erythrozyten gebildet. Auf dieser Doppelschicht jedoch erkannt, daß manche Arten von Antikörper- existiert ein elektrisches Potential, das mit dem Abmolekülen bei menschlichen Erythrozyten-Antigenen stand der Trennung zwischen dem Teilchen und dem in Salzlösungen nicht genügend agglutinieren und so Gegenion abnimmt. Das Potential ist bekannt als das falsche Resultate der Verträglichkeit geben. Die zuletzt Zeta-Potential oder das elektrokinetische Potential, genannten Arten von Antikörpern sind, wie gefunden 60 Auf diese Weise gestattet die Reduktion des Zeta-Powurde, nur fähig zur Agglutination, wenn die roten tentials das Eintreten der Agglutination. Das Zeta-Po-Blutzellen in bestimmten kolloidalen Medien, insbe- tential nimmt ab, wenn die Ionenstärke oder die Disondere in vom Rind oder Menschen stammendem elektrizitätskonstante des Mediums vergrößert wird. Eiweiß suspendiert sind. Synthetische Kolloide, wie Infolge der umgekehrten Beziehung des Zeta-Poten-Polyvinylpyrrolidon, Dextran und Methylzellulose, 65 tials zur Ionenstärke oder zur Dielektrizitätskonstanten werden ebenfalls verwendet, obgleich diese auch nicht haben auf diese Weise Veränderungen in der Ionenvollständig zufriedenstellend wirken, da diese kolloida- stärke oder der Dielektrizitätskonstanten des Mediums len Lösungen sehr oft die roten Blutzellen in Klumpen mit der darauffolgenden Änderung auf das Zeta-Poten-

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