DE1598886A1 - Mittel fuer immunserologische Reaktionen - Google Patents

Description

Dr. A. ULLRICH · Dr. T. UH.

PATENTANWÄLTE , I 598885

6? HEIDELBERG, Poststraße 30 Fernsprecher: 25335 - Telegrammadresse: ULLPATENT

Unser .Zeichen:

7545

Mittel für immunserologigohe Reaktionen

Si· Erfindung betrifft ein MIttel sur Durchführung immunserologlaoher Reaktionen, insbesondere ein Verdünnungsmittel für Antisera und «in Zusatsiaittel für ein· weohselseitlge Blutgruppenbestimmung.

Bei Bluttranefueionen let es allgemein üblich» iu •mitteln, ob das Blut des Spenders eich mit dem Blut de· Empfänger· verträgt. Wenn da· Blut des Spenders und das Blut de· Sapfänger· sich nicht vertragen» ist es möglloh, daß eine hämolytlsohe Transfuaionereaktion eintritt, wa· sur Folge hat, daß bein lebenden Menschen eine Zersturung der roten Blutkörperchen im Blut des Empfänger· eintritt.

Si· Verträglichkeit wird durch wechselseitige Blutgruppentestimmmg geprüft. Gewöhnlich wird ein· Suspeneion der Ζ·11·η d·· Blutes des Spender· mit demselben Tolu»*n de· Blutaerues d·· Empfängers vermischt und im Brutofen bei Körpertemperatur verschiedene Zeitabschnitt· aufbewahrt» Während der Xnkubationsieit wirken Schuteetoff·, dl· im Seru» de· Empfänger· anwesend sind, den Antigenen, dl· auf der Oberfl»oh· der roten Blutiellen vorhanden aind, entgegen und binden die··. Die Anwesenheit solcher entg*eenwirktnd«r 3ohut«etoffe wird durch die Agglutination ά·τ roten Iluteellen des Spender· und der Mangel an solohen ttntgegeBwlrktmlen Sohutietoffen durch da· Auebleibea der Agglatination der rotem Blutsellen dee Opender· bestimmt·

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Das bekannteste Mittel Bur Suspendierung der roten Blutxellan dee Spenders 1st eine Salalöeiing. Sb wurde jedoch erkannt, daß »anoht Arten von Antikörpermolekülen bei meneohliohen Erythrojsyten-Antigenen Bioh in Salalöeungen nioht genügend agglutinieieren und eo falsche Resultate der Verträgliohkeit geben. Die zuletzt genannten Arten τοη Antikör- * pern sind, wie gefunden wurde, nur fähig iur Agglutination, wenn die roten Blutiellen der beBtlamten kolloidalen Medien, insbesondere in rom Bind oder Menschen stammendem Biweiß suspendiert sind. Synthetische Kolloide wie Polyvinylpyrrolidon,, Dextran und MethylBellulose, werden ebenfalls verwendet, obgleioh diese auoh nioht vollständig zufriedenstellend wirken, da diese kolloidalen Lösungen sehr oft die roten Blutseilen in Klumpen anhäufen, in einer sogenannten "eeldrollenanordnung" der Brythrosyten. Dieselbe Art von Sohut»körpern kann bei der Agglutination in 8al«lösung festgestellt werden, wenn die roten Blutiellen suerot auf bestiamte proteolytisoh· Ensyme einwirken« Die proteolytisohen Baiyae reduaieren die Aniahl ionisierter Oberfläohengruppen auf den roten Bluteellen und set gen so ihre OberfltVohenladung herab. Sine andere Verwendung ala die von Sniysen ist der Antiglobulinteet.

aueätslioh aur weohs*la«itig*a BlutgruppenbeetiM-■ußg wird routineaieig eine Blutfrupptnbiatieiunf aur Ermittlung speiifieoher Antikörper und AAtigtnei» Blut in Salaneaiuft,in hochaolekulmr·» Protein wi» RinderalbuMin, unter Yerwtnaang τοη mensohlicheii Antiglobulia und duroh Behandlung der roten 51utsell*n »it proteolytiiohtn lniy»*n durohgeführ*.

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Die Menschlichen roten Zellen tragen bei phyeiologieohen pH-fferten «Ine negative elektroetatieohe La« dung. Biese Ledung; erhtfht ei oh hauptsächlich duroh Ionisation ionogener Gruppen auf der Oberfläche der Erythrozyten, variiert aber ale Ergebnis der Abeorption ionogener Substansen wie Antikörper« polyvalent· Metall* kationen» Polyelektrolyten, Fettsäuren usw. in Seiug auf dae uHgebende Medius. Ba jede rote Seile negativ geladen let, besteht «ine abstoßend· Kraft «wieoben ihnen. Sie Blutgruppen-Antikörper, die in Salzlösung eine Blutkörperohenagglutination hervorbringen, sind haupteäohlich ganaa-globulin-MolekUlc Mit Molekulargewichten von etwa 9 x 10 , d.h. »ie haben einen Sediaentationekoeffisienten von 19 x to"¹' Sekunden (19s)_t während die Antikörper, die in Salclttsung nicht agglutiniaieren, Sediaentations-' koeffieienten von 7S entsprechend ihren Molekulargewicht von 1_V6 x 10⁵ haben. Beim Auftreten einer besonderen IaBunagglutination süssen sieh die roten Blutsellen •inander nahe genug konin, daait Brücken aus Antikörperprotein swisehen den Seilen gebildet werden* Bei Antikörpern A9T 78-Hass* MUß dies weniger als 200 JtngstroM-Einheiteft betragen. Wenn die roten Blutsellen in nioht •lektrolytischen Medien alt Bielektrisitätskonstanten» die dem destillierten Wasser gleioh sind» suspendiert werden» so genügt die abstoßende Kraft swisohen den roten Bluteeilen sur Überwindung der Anhäufungekräfte des MediuMs und Aw Antriebekraft der roten Blutsellen» die duroh thereisohe uni kinetieoh· Energien verliehen wird. Mit anderen Worten» iie Kollieionefrequena swieehen den roten fellen ist auf ils lullwahreoheinliohkeit herabge« eetst. Ia öegenwart As* Elektrolyten wird viel von der •lektreetatieehe« Abstefungekraft durch die Ansiehung Aer

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Kationen an die Oberfläche der roten Blutsellen herabgeeetat und dort wird ale Ergebnie davon eine diffuse elektrieohe Ionenwolke oder eine Doppeleohioht um jedee der Erythroeyten gebildet. Auf dieser Doppeleohioht existiert ein elektrisches Potential, das fflit dem Abet and der Trennung awischen den Teilohen und dem Gegenion abnimmt. Das Potential ist bekannt als das Zeta-Potential oder das elektrokinetisch^ Potential. Auf diese Weise gestattet die Reduktion des Zeta-Potentlals das Eintreten der Agglutination. Das Zeta-Potential nimmt ab, wenn die Ionenstärke oder die Dielektrizitätskonstante des Mediums vergrößert wird. Infolge der umgekehrten Beziehung des Zeta-Potentlals zur Ionenstärke oder aur Dielcktrisitäts· konstanten haben auf diese Welse Veränderungen in der Ionenstärke oder der DlslektriBltätskonstanten des Mediums mit der darauffolgenden Änderung auf das Seta-Potential eine Wirkung auf die Agglutination der roten Elutseilen.

Is gibt drei Grundmethoden sur Durchführung des Yerträglichkeitsteete vor der Blutübertragung. Die erste besteht darin, das Serum des Empfängers und eine SaIxauspeneion der roten Blutreilen des Spenders susammeaiumifohen, diese Miβοhung bei 37° 0 im Brutofen iu halten gefolgt von einer krltisohen Prüfung dtr Seilen vor und naoh dem Zentrifugleren «ur Beobaehtung des Auftretens einer Agglutination. Die «weite Methode wird in ähnlicher Weise durchgeführt, aber mit dem Zusat« von Rinderalbumin oder menschlichem Albumin sur Erhöhung dtr Proteinkon- «entration. Die dritte Methode besteht darin, daS man dl· roten Blutsellen des Spenders mit dem Serum dt« SmpfKngers Im Brutofen behandelt, anschließend die fellen wischt und menschliches Antiglobullnserum susetst.

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Die bei den Tereohledenen Maßnahmen auftretenden Schwierigkeiten bei der wechselseitigen-Blutßruppenbestlmmung aur Ermittlung der Verträglichkeit tot der Bluttransfusion sind auoh bei den Teats Torhanden, die sur Blutgruppenbeetlmmung angewendet werden.

Gegenstand der Torliegenden Erfindung let es, ein Mittel flir Immunserologlsohe Reaktionen heraus teil en.

Dl· Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines Suspensionsmittels für rote Blutaellen, dme für die Ermittlung τοη Antikörpern Terwendet werden kann.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verdünnungsmittel für Anti-Seren.

Schließlich betrifft die Erfindung «in Keagen«, das sieh den physikalischen Eigenschaften τοη normalem Blutserum nähert.

Andere Merkmal· und Vorteil· der rorliegenden Erfindung werden aus der Beschreibung offenbar·

Eb wurde gefunden, daß ein waeaerlÖBlichee Polymer τοη Rohrzucker mit einem durchsohnittliehen Molekulargewicht Bwlsohen etwa 2 000 bie etwa 2 000 000, zweckmäßig aber töh etwa 100 000 bie etwa 400 000 zur Verwendung in einem Mittel nur Durchführung immunserolegisoher Reaktionen geeignet 1st. Ein unter dem Wareneeiohennamen "Fioöil" bekanntes Polyaaooharoseprttparat der Firma Pharmaela Company, Uppsala, Schweden ist tür diesen 2weck besonders geeignet. Das Polysaooharosepräparat "Jiooll" ist «in eynthttieohes Hoehpolymer τοη Rohrzucker mit einem Molekulargewicht τοη «twn 300 000 bie βΟΟ 000. Dae Präparat "Hooll" hat eic sphärisches Molekül ohne ionisierbare Gruppen und maoht es auf dl··· Weite un-

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βapfindIioh in pH-Bereichen von 4 bis 10. Sa 8HlIaIf' etwa 23 ⁰S freie Hydroxylgruppen, die ihm eia« großeAffinität für Waoser geben. Par Salzgehalt dea Präparats als MaOl beträgt weniger, als 1 #. , ·'

Andere synthetische Kolloid· wie Daxtran und Polyvinylpyrrolidon und geringe Veränderungen im Molekulargewicht dee Polyeaooharosepräparate "Fiooll" haben geringe Wirkung auf seine Dielektrlsltätakonatante. Bestimmungen der Dielektrizitätskonstanten wässriger Lösungen τοη ^HPiooll··?; ml* eine» Molgewicht von 300 000 und 400 000 ■eigen, daß eine 1 #ige (w/V) Lösung dia Dielektriiitätekonstante um 35 auf 38 erhöht, während eine änderung im Molekulargewioht einer ähnlichen löaung τοη Dextran die Dielektrisitätskonatante um 38 auf 58 und eine Änderung im Molekulargewicht einer ähnliohen Lösung ron Polyrinylpyrrolidon die Dielektriaitätskonetante um 30 »uf 40 erhöht . Da die Agglutinatione-SrhöhungBwirkung τοη Polymeren abhängig ist vom dielektrlsohen Suwaohe dar dem Weeeer gegeben wird, lat der Grad der Agglutination τοη der Son» ientration abhängig. Geringe Abweichungen in Beiug auf das Oewioht synthetischer Kolloida wia Dextran und PolyTinylpyrrolidon Terursaohen große Abweichungen beiüglloh der Dielektrialtätekonstanten und geben ao AnIaS nur Bildung Ton ^HGoldrollananordnungen". Ea wurde teatgeateilt, daß daa kritische Zeta-Fotentlal bei dam die öeldrolltnanordnung beginnt, bei 4,2 (+ 0,2) MilliTolt (äT) liegt.

Die Molekül· dea Präparat« "Iloell" ii&d τ·railtniemäSig inert und elaktriaoh neutral· Daher dimorleieren ate nicht beim Stehen in wäaariger Lttaung. Dieser Widaratand gegen die Dimerisation iet bedeutsam, da die Dimarialarumg aina nioht-eptiifisohe Agglutlnatlom τοη Mdlekülen Ttrur-

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sacht, was «in· gleichseitige Zunahme in Beeug auf die Die.lektritl tat ekone tent β und eine Abnahmt dc« Ζβΐβ-Potentials nit βloh bringt. Beide Substanzen Dextran und Polyvinylpyrrolidon dimerisieren und schlagen sich bein Aufbewahren wässriger Lösungen nieder* siehe "Artificial Colloids for Intravenous Uere", Rational Acadeey of Science β, Fational Eeseareh Council, September 1962, J.T. Trupp, Seite . 93.

Die kritische Eeriehung νου Zeta-iotential but Agglutination der Erythrozyten kann aus den Tabellen I und ZI ersehen werden. Sie Tabelle J vergleicht das Zeta-Potential nit der Agglutination, die «it drei Salsiesiing-Anti-D-Seren, dialyslert und verdünnt Bit denselben Puffern, erhalten wurde und Tabelle II vergleicht das Zete-Potential nit der Agglutination, Ute mit drei Albumin-Agglutinieierunge-Anti-D-(Eh_Q)-Seren, dialyslert und verdünnt nit denselben Puffern, erhalten wurde. In jedem Falle wurde die Tönung alt Rohrsuoker bei 300 000 000 Mol konstant gemaoht.

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Zeta-	Keaiproke	Werte	der Verdünnung	243	von Anti-D	233
Potential	Serum No.	155	Serum No.	320	Serum No»	320
aY	160	320	160	0	160	0
-26,0	0	0	0	0	0	0
-23,4	0	0	0	+	0	0
-23,3	W	0	+	+	0	W
-21,1	++	+	++	4-4-	+	+
-19,6	4-4·+	+	+++	++	+	+
-18,8	++++	+++	++++	++♦	++	++
-18,2	++++	+++	+4-++	++++	+++	++
-17,1	++++ ■	+++	++++	++++	+++	++
-16,6	++++ 4	■+++	++++	++++	+++	++
-15,8	+++4-	4-++	++++	+++

Zt ta-

Potential

Tabelle II '

Reziproke Vierte der Verdünnung von Anti-B

Serum No, 186 Serum No. 228 Serum No.

320 320 640

160

320 160

-13,0 -11,4 -10,8 -10,3

- 9,6

- 9,1 -8,8 -8,4 -8,1 -7,7

0 0 0 w

4-

+4-

0 0

+4 +

♦■l·++

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BAD

IW, A L

Dl· Tabellen I und II «eigen, daS das kritische Zeta-Potential, oberhalb dessen eine Agglutination nioht eintreten kann, bei -23 mV und -13 mV für Koohsal« und Albuminkörper liegt. 7Ur eine optimale Agglutination und einen liter sollen diese maximalen Zeta-Potentiale bei «18 mV b«w. -8 mV liegen.

Normales menschliches Blutserum hat folgende Eigenschaften» pH - 7,51 Oielektrisitätskonatante - 160 - 190 und Ionenstftrke 0,16 öraram Ionen pro Liter. Es 1st aweokmäßig, ein Mittel zur Durchführung immunserologleoher Reaktionen heraustellen, daa ■erologlsahe Eigenschaften besltst, die stark denjenigen des normalen Blutserums ähneln. Dementsprechend hat das Mittel gemäß Erfindung folgende Eigenschaften: pH - 7-8, awaokm&öig 7#5? Dlelektrisiitätskonertante - 170 - 190, zweckmäßig 180; Ionenstärke 0,05 - 0,18 (Jranuft Ionen pro Liter, aweökmftßig 0,16 Öramm Ionen pro Liter.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern bis Ins Einsein· die Herstellung und die Verwendung dor Reagensien und umfassen die Lehren sur Durchführung der !Erfindung.

Beispiele

1. Es wird «in Zusatsmittel fllr die wechselseitige Blutgruppenbestimmung mit folgender Zusammensetzung hergestelltι

5,404 g

Destilliertes Wasser 800 ml 1 η UCl 9,30 »1

HaCl 4,67 g

»Ficell* !folge*. 4 x 10⁵ 263,4 « w«ei*r iid 1 Lit tr

Diese Zubersltung gibt eins Lbenng von tine« pH 7,5 undr/2 ▼on 0,16 Gramm Iontn pro Iilter»

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Einem Volumen einer 3 ^igen SalslUsungssuspension der Erythrozyten des Spenders wird ein Volumen Serum dea Empfängers und ein Volumen der vorbesehriebenen Zubereitung sugesetst. Die Mischung wird 15 Minuten bei 37° C la Brutofen gehalten und anschließend an diese Behandlung wird das die Mischung enthaltende Röhrchen 2 Minuten bei 500 ble 1 000 χ g aentrifugiert und auf Agglutination untersucht.

Ee wird ein Verdünnungnmlttel für daß Anti-Ii-Objektträgerteet-Serum mit folgender Zusammensetzung hergestellt 8

0,1 M

1 η HOl 22,8 ml

8,03 g

" Molgew. 4 χ 10⁵ 260 g Y/aoser ad 1 Lit er

Dieses Verdünnungsmittel hat ein pH τοη 7»4; ein r/2 von 0,16 Gramm Ionen pro Liter und ein Zsta-FotentIaI von 7»2 mV.

Es wird ein Antikörperermittlungemittel, das 22 $ Rinderalbumin ereetet, mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Imidasol 0,1 U

1 η HOl 22,8 Ml

NaOl 2,77 «

"fieoll" Molgew· 4 X 10⁵ 200 g Waeatr ad 1 Liter

Dae iralttlungDoiittel hat «in pH fo» 7»5{ tin Γ/2 τοη

0,07 ßr&mm Ionen pro Llttr und eint konstante von 716.

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BAD ORiGSNAL

4. Es wird «in VerdUnnungsBlttel für SbIbIGBungeagglutinine mit folgender Zueeameneeteung hergestelltt

lüidacol 0,1 M

1 η HCl 22,8 al

MaOl - 20 g

^MFlooll» Molgew. 4 χ 10⁵ 30 g Wasser ad 1 Liter

Dieses Terdtinnungsnittel hat oin pH Ton T,5 und eine Dielektrisitätekonetante von 180·

Ee lot selbstverständlich, daß die Erfindung nioht auf die erläuterten und beschriebenen Einzelheiten beßchrfinkt ist» da ee für den Faohmonn Belbstrerständlioh ist, daß änderungen Torgonommen werden können, die in den Sohutzbereich derselben fallen.

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BAD ORfGINAl

Claims (3)

Patentanspruch«

1. Mittel Bur Durchführung iramunserologischer Heaktionen, dadurch fiekennseichnet, daß ea aus einer Lösung eines wasserlöslichen Itlymers von. Rohrzucker bzw. Saccharose mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht ron etwa 2 000 bis 2 000 000, ssweokraäßig von etwa 100 000 Mb 800 000, gepuffert auf ein pH sünioohen etwa 7-8,

zweokmäöig 7,5, besteht und. die Lfteung eine Ionenstärke »wischen etwa 0,05 und 0,18, zweckmäßig 0,16 öremm Ionen pro Liter besitzt.

2. Mittel neon Anspruch 1, dadurch ^ekennzeioUnet, daß ee zur Ermittlung von Antikörpern bei 3alBltieunge-Agglutininen ein Eetn-Potential unterhalb etwa ~?3 »V bsw. -18 mV beeitfit.

3. Mittel nach Anspruch 1» dadurch ^ekenngoichnet, daß es Bur Eröittlunf, von Albuiain-Agglutininen «in Zeta-Potential unterh&lb etwa -13 mV baw. -8 mV

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BAD ORiGIMAt