DE1593917B1

DE1593917B1 - Verfahren zur biochemischen Entmethoxylierung

Info

Publication number: DE1593917B1
Application number: DE19671593917
Authority: DE
Inventors: Yamamoto Atsushi; Omori Tairiku; Hiroshi Yasui
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-02-21
Filing date: 1967-02-15
Publication date: 1971-10-28
Also published as: SE323359B; NO123393B; FR1512001A; GB1117498A

Description

io Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in der R₁ -CHO oder COOH und R₂ Wasserstoff, Vanillin eingesetzt.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von durchgeführten Versuchen zusammengefaßt.

Verbindung

Verwendeter Mikroorganismus

Fermentationsprodukte

H,CO

H,C0

HO

OH

CHO

OCH,

OH

OCH,

1. Saccharomyces sake ATCC 20018

2. Saccharomyces sp. ATCC 20017

3. Torula utilis ATCC 15239

4. Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248

1. Saccharomyces sake ATCC 20018

2. Torula utilis ATCC 15239

1. Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 (Oberflächenfermentation)

1. Saccharomyces sake ATCC 20018

2. Torula utilis ATCC 15239

1. Saccharomyces sake ATCC 20018

1. p-Hydroxybenzoesäure

2. p-Hydroxybenzaldehyd

3. p-Hydroxybenzylalkohol

4. Vanillylalkohol

5. Vanillinsäure

1. p-Hydroxybenzoesäure

2. unbestimmte Substanz

1. p-Hydroxybenzoesäure

2. p-Hydroxybenzaldehyd

3. 3,5-Dimethoxy-4-oxybenzylalkohol

4. 3,5-Dimethoxy-4-oxybenzoesäure

1. p-Hydroxybenzoesäure

2. unbestimmte Substanz

1. 3,4-Dihydroxybenzoesäure

2. 3,4-Dihydroxybenzaldehyd

3. 3,4-Dihydroxybenzylalkohol

4. 3-Methoxy-4,5-dioxybenzylalkohol

5. 3-Methoxy-4,5-dioxybenzoesäure

1. 3,4-Dihydroxybenzoesäure

2. unbestimmte Substanz

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die aerobe Kultur eines der genannten Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium, welches die durch die obige allgemeine Formel wiedergegebenen Verbindungen enthält, eine Entmethoxylierung der Verbindung in Stellung 3 oder den Stellungen 3 und 5 zur Folge hat. Das gebildete Produkt wird dann im Kulturmedium angehäuft.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Einem Kulturmedium aus 100 g Glucose, 2,5 g L-Asparagin, 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0 g Magnesiumsulfatheptahydrat und 11 Leitungswasser werden 0,1 g Vanillin zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums wird auf 4 bis 5 eingestellt. Dann werden 100 ml einer sporenhaltigen Lösung von Saccharomyces sake ATCC 20018, der getrennt im gleichen Kulturmedium wie oben beschrieben, aber in Ab-Wesenheit von Vanillin gezüchtet wurde, dem Medium zugesetzt.

Das erhaltene Gemisch wird unter aerobem Schütteln 5 Tage bei einer Temperatur zwischen 28 und 30⁰C gehalten. Dann wird zentrifugiert. Die so erhaltene obere klare Lösungsschicht wird mit 1 g Kaliumhydroxyd gemischt und dann unter vermindertem Druck auf etwa 200 ml eingeengt. Der Rückstand wird mit Schwefelsäure angesäuert und mit Äther kontinuierlich 2 Tage lang extrahiert, um die Fermentationsprodukte zu sammeln. Der Hauptteil des Lösungsmittels wird abdestilliert, und die konzentrierte Ätherlösung wird mit einer kleinen Menge einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung geschüttelt, um die sauren und die neutralen Komponenten zu trennen. Die in der gesättigten Natriumbicarbonatlösung gelöste saure Phase wird mit Schwefelsäure etwas stärker angesäuert und dann mit Äther extrahiert. Man erhält so ungefähr 0,08 g Extrakt.

Die extrahierten Produkte werden papierchromatographisch untersucht. Hierbei werden die extrahierten Produkte auf der Breitseite eines Filterpapiers aufgetragen, und die aufsteigende Entwicklung des Chromatogramms wird mit 1,5 n-Ammoniak-gesättigtem n-Butanol dreimal wiederholt. Durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht von 2536 Ä können zwei getrennte Absorptionsbanden, eine obere und eine untere, unterschieden werden. Aus diesen beiden Banden lassen sich zwei verschiedene Arten von sauren Pro- _λ dukten isolieren.

Etwa 0,06 g des aus der oberen Bande erhaltenen Rohproduktes werden durch Sublimation unter vermindertem Druck gereinigt. Dann werden Elementaranalyse, Schmelzpunktmessung, Mischverbindungsuntersuchungen und Messungen der UV- und Infrarotspektren durchgeführt. Die Ergebnisse sind wie folgt: Schmelzpunkt 211°C. Der Mischschmelzpunkt mit einer reinen Probe von p-Hydroxybenzoesäure ergibt keine Schmelzpunkterniedrigung. Die durch Elementaranalyse und Infrarotanalyse erhaltenen Werte stimmen gut überein. Außerdem stimmen die Infrarot- und Ultraviolettspektren vollständig überein, auch in den Einzelheiten. Auf diese Weise wurde das eine der isolierten Produkte als p-Hydroxybenzoesäure identifiziert. Das andere isolierte Produkt erwies sich als Vanillinsäure.

Der nach der Entfernung der sauren Komponenten mit der gesättigten Natriumbicarbonatlösung verbliebene Ätherextrakt wird ebenfalls papierchromatographisch unter Verwendung von Filterpapier untersucht. Nach aufsteigender Entwicklung mit 1,5 n-Ammoniak-gesättigtem n-Butanol über Nacht wurden p-Nitroanilindiazoniumchlorid und 2,4-Dinitrophenylhydrazin aufgesprüht. Hierbei wurde die Bildung von p-Hydroxybenzylalkohol, p-Oxybenzaldehyd und Vanillylalkohol nachgewiesen. Von Vanillin konnten keine Spuren mehr gefunden werden.

Beispiel 2

1 kg Glucose, 25 g L-Asparagin, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 30 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 g Vanillin und 101 Leitungswasser wurden gemischt und auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt. Dieses Kulturmedium wurde in eine 201 fassende, gläserne.

Fermentierungsflasche gebracht. Dann wurde 11 einer sporenhaltigen Lösung von Saccharomyces sake ATCC 20018 zugesetzt, welcher als getrennte Reinkultur im oben beschriebenen Medium, jedoch in Abwesenheit von Vanillin, gezüchtet worden war.

Das erhaltene Gemisch wird 5 Tage lang unter Durchleiten von sterilisierter Luft mit einer Geschwindigkeit von 10 l/min kultiviert. Die so erhaltene Fermentationslösung wird wie im Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet, wobei 0,55 g p-Hydroxybenzoesäurekristalle erhalten werden.

Beispiel 3

100 g Glucose, 2,5 g L-Asparagin, 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,1 g Vanillin und 11 Leitungswasser werden gemischt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4 bis 5 eingestellt. Dem Kulturmedium werden dann 100 ml einer sporenhaltigen Lösung von Torula utilis ATCC 15239 zugesetzt, welcher im gleichen Medium wie oben beschrieben, aber in Abwesenheit von Vanillin als Reinkultur gezüchtet wurde. Das erhaltene Gemisch wird unter aerobem Schütteln 5 Tage bei einer Temperatur zwischen 28 und 30° C gehalten.

Nach Behandlung der erhaltenen Fermentationslösung, wie im Beispiel 1 beschrieben, werden 0,04 g p-Hydroxybenzoesäure erhalten.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführte Kultivierung erfolgt in an sich bekannter Weise.

Das heißt, sie wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise aerobem Schütteln der Kultur oder Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 28 bis 35°C und einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 6,0 durchgeführt. Als Nährmedium eignet sich sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches, solange es die essentiellen Nährstoffe für das Wachstum des speziell verwendeten Stammes enthält. Diese Nährstoffe sind bekannt und umfassen solche Stoffe wie einen Kohlenstofflieferanten, einen Stickstofflieferanten und anorganische Verbindungen, die von dem verwendeten Mikroorganismus in entsprechenden Mengen benötigt werden. Als Kohlenstofflieferanten können beispielsweise Kohlehydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse oder andere geeignete Kohlenstoffquellen wie Glycerin und organische Säuren angeführt werden. Diese Substanzen können entweder einzeln oder als Gemische von zwei oder mehreren davon verwendet

werden. Als Stiekstofflieferanten können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und- Ammoniumphosphat oder eine oder mehrere Aminosäuren als Gemisch oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maiswasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydrolysat und Fischsolubles (Konzentrat von wasserlöslichen Komponenten von Fisch- ro fleisch, das organischen Stickstoff enthält) verwendet werden. Der Stickstofflieferant kann aus einer einzigen Substanz oder einem Gemisch von zwei oder mehreren bestehen. Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Mangansalze, Manganchlorid und Calciumchlorid. Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu entmethoxylierende Verbindung wird vorteilhaft dem Kulturmedium in einer Menge zwischen 0,0001 und 1 Gewichtsprozent zugesetzt.

Claims

,Patentansprüche:

1. Verfahren zur biochemischen Entmethoxylierung von Verbindungen der allgemeinen Formel

OCH₃

in der R₁ -CHO oder COOH und R₂ Wasserstoff, — OH oder -OCH₃ bedeutendadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart dieser Verbindungen Saccharomyces sake ATCC 20018, Saccharomyces sp. ATCC 20017, Torula utilis ATCC 15239 oder Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 28 bis 35° C und einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 6,0 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Vanillin einsetzt.