KR20140022694A - 생물학적 방법으로 파라-히드록시벤조산을 제조하는 방법 - Google Patents

생물학적 방법으로 파라-히드록시벤조산을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학적 및 생물학적 전환을 이용해 리그닌을 원료로 사용하여 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 재생가능한 리그린으로부터 액정고분자의 핵심원료 및 식품 또는 화장품 부패방지목적의 보존제로 널리 사용될 수 있는 p-히드록시벤조산을 친환경적이고, 높은 특이성을 가지며 경제적으로 생산할 수 있다.

Description

생물학적 방법으로 파라-히드록시벤조산을 제조하는 방법{PROCESS OF BIOLOGICALLY PRODUCING A p-HYDROXYBENZOIC ACID}
본 발명은 생물학적 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리그닌을 원료로 사용하여 화학적 및/또는 생물학적 전환을 이용해 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 전세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 국제원유 가격이 지속적으로 상승하는 상황과 더불어 원유에 의존하여 생산되는 납사등의 기초 유분의 가격상승은 2차 석유화합물의 제조비용을 급격히 상승시켜 석유화학 산업의 제품가격을 빠르게 상승시키고 있다. 이러한 원유에 의존하는 석유화학산업에 대한 대안으로 최근에 산업바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화 되고 있다.
바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 카길-다우사에 의해 상업화된 폴리유산 (polylactic acid, PLA)이 기존의 polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS) 등을 대체하면서 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. 또한, 그 이전에 개발되어 Metabolix사에 의해 상업화된 polyhydroxyalkanoate (PHA) 계 바이오 플라스틱도 기존의 고가 의료용 고분자 시장에서 벗어나 범용 고분자 시장으로의 진출을 위한 공장건설이 진행 중에 있다. 이외에도 숙신산 (succinic acid)을 활용한 polybutylene succinate (PBS) 등도 광범위하게 상업화되어 사용되고 있다. 바이오 화학제품 시장의 경우 듀폰사가 2006년말 상업화한 1,3-프로판디올이 기존의 석유화학공정을 바이오매스 기반의 산업바이오 공법으로 대체한 성공적인 예이다. 향후 다양한 화학제품들이 기존의 석유화학 공법에서 재생 가능한 산업바이오 공법으로 대체되리라 예측된다.
방향족 히드록시카르복시산, 특히 p-히드록시벤조산, 살리실산, 2-히드록시-3-나프토에산 등은 방부방미제, 의약품, 염료, 안료 등의 원료로서 그의 유용도가 오래전부터 공지되어 왔으며, 또한 최근에는 농약, 감열기록지용 발색제 등의 합성원료뿐만 아니라 방향족 폴리에스테르용 단량체로서의 유용성이 보다 증대되어 왔다. p-히드록시벤조산은 Ticona사의 액정고분자인 ZeniteTM의 65%를 이루는 주요 단량체로, 상기 액정고분자는 기존의 범용 수지에 비해 높은 강도/경직도, 열안정성, 저용융점도, 유기용매내성, 낮은 기체투과성의 특징을 가지고 있어 자동차부품, 전기전자 부품 등의 산업에 보다 광범위하게 응용되고 있다. 또한 p-히드록시벤조산은 에스테르화 반응을 거쳐 파라벤(paraben)으로 전환되는데, 이러한 파라벤은 화장품, 위생 및 생활용품, 식품 등에 보존제로 광범위하게 사용되고 있는 화학물질이다.
p-히드록시벤조산의 화학합성법으로는 페놀과 이산화탄소를 원료로 콜베-슈미트 공정에 의한 제조법 (JP05-009154)과 그 대체 방법이 보고되었다(US5,399,178, US4,740,614, US3,985,797 등). 그러나, p-히드록시벤조산의 화학적 합성 방법은 생산 비용이 높을 뿐만 아니라 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부산물의 생성으로 인한 복잡한 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.
p-히드록시벤조산의 생물학적 생산방법으로, 미생물에서 벤조산, p-크레솔, 톨루엔 등으로부터 p-히드록시벤조산이 생성되는 경로도 알려져 있다 (JP平06-078780, Whited and Gibson, J. Bacteriol. 173:3010-3020 (1991), US20060246559, WO2005/103273). 그러나, 출발물질이 미생물에 대해 독성을 나타내므로 대량 생산이 어려운 문제가 있다.
1998년 미국 듀폰사는 Pseudomonas mendocina 미생물을 이용하여 glucose (글루코스)를 원료로 하여 p-히드록시벤조산을 생산하는 기술을 개발하였다 (WO1998/056920). 이후 2000년 미국 GE사가 재조합 대장균을 이용하여 포도당으로부터 p-히드록시벤조산을 합성하는 기술을 개발하였다 (US6,030,819). 이후 2008년 미국 노스캐롤라이나 주립대학(North Carolina State university)의 라모스 등은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 tonB 유전자를 미생물에 도입하여 p-히드록시벤조산 내성을 증가시키는 생산기술을 개발하였다 (US7,348,412). 이후 2001년 미시간 주립대학의 Frost등은 대장균에서 글루코스를 원료로 이용하여 12g/L 농도의 p-히드록시벤조산 생산하는 기술을 개발하였다.
본 발명은 생물학적 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산을 포함하는 기질과, 상기 b)의 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 제거하여 p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는, 생물학적인 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 리그닌을 원료로 사용하여 화학적 및/또는 생물학적 전환을 이용해 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 일예에서, 리그닌을 분해하여 a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산을 포함하는 리그닌 분해산물을 제공하는 단계; 및 상기 리그닌 분해산물과, 상기 b)의 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 제거하여 p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는, p-히드록시벤조산을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 리그닌을 분해하여 p-히드록시벤즈알데히드를 포함하는 리그닌 분해산물을 제공하는 단계; 및 상기 리그닌 분해산물을 산화시켜 p-히드록시벤즈알데히드를 p-히드록시벤조산으로 전환하는 단계를 포함하는 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 방향족 고리에 a) p-히드록시기와 b) 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 함유하는 방향족 카르복시산을 포함하는 기질에 p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는, 생물학적인 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 리그닌 분해산물을 원료로 사용하여 화학적 및/또는 생물학적 전환방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방향족 카르복시산은 방향족 환에 카르복시산을 포함하는 물질을 의미하며, 환의 하나 이상의 위치가 치환기로 치환된다.
본 발명의 일예에서, a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산은 하기 화학식1로 표시될 수 있으며, 그 바람직한 예로는 바닐산 (vanillic acid) 또는 시린지산 (syringic acid)을 들 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이다 (단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님). 상기 C1-C4 알콕시기는 알킬기가 산소에 결합된 형태로, 알킬기는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 바람직하게는 메톡시 또는 에톡시이다.
화학식 1의 화합물은 p-히드록시벤조산 생산을 위한 생물학적 반응 기질로 사용된다. 본 발명의 생물학적 반응 또는 전환이란 생촉매로서 효소, 상기 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물을 이용한 생물학적 방법을 포함한다.
상기 기질과 생촉매를 접촉시키는 단계는 p-히드록시벤조산을 제조가능한 충분한 조건하에서, 상기 효소, 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물을, 상기 기질과 접촉하거나 상기 기질을 포함하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 방법으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 생촉매는 p-히드록시벤조산을 제조가능한 활성을 갖는 것으로서, 더욱 구체적으로는 화학식 1의 벤젠환의 3' 및/또는 5'위치에 있는 치환기를 제거(remove)할 수 있는 활성을 갖는 생촉매일 수 있다. 본 발명의 생촉매는 화학식 1로부터 3'및/또는 5'위치의 치환기를 제거하여 p-히드록시벤조산를 제조할 수 있는 활성을 가진 효소라면 어떠한 효소라도 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나 안트라닐산 생성효소(anthranilate synthase (EC 4.1.3.27)), 5-O-(1-카르복시비닐)-3-포스포시키메이트 포스페이트-리아제(5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimate phosphate-lyase (EC 4.2.3.5)), 코리스메이트 리아제(chorismate lyase (EC 4.1.3.40)), 3-데히드로시키메이트 히드로-리아제(3-dehydroshikimate hydro-lyase (EC 4.2.1.118)), 이소코리스메이트 리아제(isochorismate lyase (EC 4.2.99.21)), 아미노데옥시코리스메이트 리아제(aminodeoxychorismate lyase (EC 4.1.3.38)), 3-데히드로퀴네이트 히드로-리아제(3-dehydroquinate hydro-lyase (EC 4.2.1.10)), 프레페네이트 히드로-리아제(prephenate hydro-lyase (EC 4.2.1.51)) 및 히드록시페닐피루베이트 생성효소(hydroxyphenylpyruvate synthase (EC 5.4.99.5)) 로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 효소일 수 있다.
일례로, 아미노데옥시코리스메이트 리아제(aminodeoxychorismate lyase, ADC lyase)는 본 발명의 바닐산 또는 시린지산으로부터 3' 및/또는 5'위치의 메톡시를 제거하여 p-히드록시벤조산을 생성할 수 있다.
구체적으로 본 발명 효소의 일예로, GenBank No. AAA35175.1, AA35176.1, AAA23487, CAA47181.1, AAC37159, AAK46749, CAA96313, CAA42091, CAA86380, AAB59309 등이 포함된다.
일반적으로 효소는 여러 기질에 대해 활성을 나타낼 수 있으며 알려진 기질이 아닌 기질에 대해서도 활성을 나타낼 수 있다. 또한 효소는 기질마다 활성에 있어 차이를 보이는데, 효소의 변이, 방향진화(directed evolution) 등을 유도하여 효소의 기질에 대한 활성을 증가시키거나 기질 특이성을 변경할 수도 있다. 예를 들어, Ito 등은, 대장균 유래의 azoreductase에 대하여 실험적으로 3차원 구조를 밝히고, 구조 분석 후 단일 아미노산 변이를 통해 기질특이성을 바꾼 예를 보고하고 있다 (Ito et al., Expansion of Substrate Specificity and Catalytic Mechanism of Azoreductase by X-ray Crystallography and Site-directed Mutagenesis, Journal of Biological Chemistry, 283(20), 13889-13896, 2008) 또한, Wang 등은 대장균 유래 aspartase에 대해서 error-prone PCR 및 DNA shuffling을 통해 돌연변이 라이브러리를 만들고, 이로부터 고활성 돌연변이 효소를 찾아냄으로써, 활성이 28배 증가한 aspartase를 만들어 낼 수 있었다 (Wang et al., Enhancement of the activity of l-aspartase from Escherichia coli W by directed evolution, Biochemical and biophysical research communications, 276(1), 346-349, 2000). 이와 같이, 공지의 단백질 진화 방법 등의 기술을 통하여 기질특이성을 변환하거나 활성을 증가시키는 것이 알려져 있다. 실제 반응공학에 적용한 예들도 보고되고 있으며 (Williams et al., Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences, Cellular and Molecular Life Sciences, 61, 3034-3046, 2004), 다양한 단백질 진화 실험법 또한 알려져 있다. (Yuan et al., Laboratory-Directed Protein Evolution, Microbiology and Molecular Biology Review, 69(3), 373-392, 2005).
본 발명의 일예로, 바닐산 또는 시린지산에 대한 기질 특이성이나 효소활성을 증가시키는 방향으로 본 발명의 효소를 변이 또는 진화시켜 p-히드록시벤조산의 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 구현 예에 있어서, 상기의 효소들은 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula,　Debaryomyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloekera, Pichia, Trigonopsis, Brettianomyces, Aspergillus, Yarrowia, Cryptococcus, Aureobasidium, Rhizopus, Monascus, Leucosporidium 및 Issatchenkia으로 구성되는 군에서 선택되는 진핵세포 또는 Streptococcus, Escherichia, Bacillus, Brucella, Mycobacterium, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aquifex, Helicobacter, Staphylococcus, Thermotoga, Pseudomonas, Sinorhizobium, Vibrio, Schizosaccharomyces, Clostridium, Lactobacillus, Klebsiella, Citrobacter 및 Streptomyces으로 구성되는 군에서 선택되는 원핵세포 유래일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 구체적으로는 Escherichia.coli, Streptococcus pneumonia, Bacillus subtilis, Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella enteric, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Pseudomonas putida, Vibrio harveyi, Clostridium beijerinckii, Lactobacillus rhamnosus, Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella pneumonia 등이다.
본 발명의 구현 예에 있어서, 화학식 1의 물질을 p-히드록시벤조산으로 전환하는 미생물은 재조합 또는 천연형(wild-type)일 수 있으며, 재조합 미생물은 상기 효소를 암호화하는 유전자가 재조합 방법으로 숙주세포에 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 구체적 일례에서, 재조합 효소를 사용하는 경우는 1) 상기 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 과정; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환하고 배양하는 과정; 3) 상기 숙주세포로부터 효소를 생산하는 과정; 및 4) 상기 효소와 기질을 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 기질과 반응하는 효소는 정제 또는 비정제된 것일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터의 제조시 p-히드록시벤조산의 생산에 사용될 수 있는 발현벡터로는 유전자 재조합 방법에 이용되는 어떠한 벡터라도 사용될 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포로는 대장균을 사용하는 것이 바람직하나, 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 목적하는 유전자를 발현하고 활성이 있는 효소 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 박테리아, 곰팡이, 또는 효모 등 어느 것이라도 사용될 수 있다.
p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매가 효소인 경우, 상기 효소 반응은 pH 5.5 내지 pH 9.5 범위에서 이루어질 수 있으며, 최적 pH 는 상기 범위 내에서 각 효소의 특성에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일예에서는 pH 7.0 내지 7.6 범위에서 전환시킬 수 있다. 또한 상기 효소 반응은 온도 25℃ 내지 50℃ 범위에서 이루어질 수 있으며, 최적 온도는 각 효소의 특성에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일예에서는 전환온도는 30℃ 내지 37℃범위에서 이루어지는 것이 바람직하나, 상기 효소 반응 시간도 통상적인 방법에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 상기 기질과 생촉매의 접촉 계전에, 화학식 2로 표시되는 방향족 알데히드를 화학식 1로 표시되는 방향족 카르복시산으로 산화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것으로서, 상기 화학식 2로 표시되는 방향족 알데히드의 예로는 바닐린(vanillin), 또는 시린알데히드(syringaldehyde)일 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이다(단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님). 상기 C1-C4 알콕시기는 알킬기가 산소에 결합된 형태로, 알킬기는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 바람직하게는 상기 C1-C4 알콕시기는 메톡시 또는 에톡시이다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 리그닌 분해산물을 원료로 화학적 및/또는 생물학적 반응을 통해 p-히드록시벤조산을 합성하는 방법을 제공한다.
상기 a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산을 포함하는 기질, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 리그닌을 분해함으로써 제공할 수 있다.
상기 리그린을 분해하여 얻어지는 분해산물이 화학식 2로 표시되는 방향족 알데히드 화합물을 포함하는 경우, 상기 리그닌 분해산물과 생촉매의 접촉단계 전에, 리그닌 분해산물을 산화시켜 화학식 2로 표시되는 방향족 알데히드를 화학식 1로 표시되는 방향족 카르복시산으로 전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 리그닌을 분해하여 p-히드록시벤즈알데히드를 포함하는 리그닌 분해산물을 제공하는 단계; 및 상기 리그닌 분해산물을 산화시켜 p-히드록시벤조산으로 전환하는 단계를 포함하는 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 석유화학 원료 의존도를 완전히 탈피할 수 있는 바이오매스를 이용한 p-히드록시벤조산 합성에 초점을 맞추어, 저가의 리그닌을 원료로 하여 화학적 또는 생물학적 분해단계 공정을 거쳐 생산된 방향족 단량체들을 기질로 화학적 및/또는 생물학적 공정에 의해 p-히드록시벤조산을 제조하게 되었다.
본 발명의 리그닌에는 리그닌, 리그닌 유도체, 리그닌 단편 및 리그린-함유 물질이 포함된다. 리그닌 유도체는 페놀레이션(phenolation), 아세틸레이션(acetylation) 등의 화학반응으로 리그닌이 수식된 것을 의미하며, 리그닌 단편은 리그닌이 화학적 또는 생물학적으로 분해된 것을 의미한다.
리그닌은 바이오리파이너리 또는 펄프 공정에서 셀룰로스와 헤미셀룰로소를 분리하여 얻을 수 있으며, 생산 방법에 따라 kraft lignin (alkaline lignin), dealkaline lignin, hydrolytic lignin, organosolv lignin, sodium lignin sulfonate 등을 예로 들 수 있고, 리그노셀룰로오스 바이오에탄올 공정의 부산물인 리그닌 또한 적용 가능하다. 리그닌은 미세섬유를 둘러싸고 있는 방향족 중합체로서, 쿠머릴 알코올(coumaryl alcohol), 코니퍼릴 알코올(coniferyl alcohol), 시나필 알코올(sinapyl alcohol) 등의 페닐프로파노이드 (phenylpropanoid) 를 구성단위로 하여 탄소-탄소 결합 또는 탄소-산소 결합으로 복잡하게 중합된 수지상 구조로 이루는 물질이다
상기 리그닌 분해단계는 생물학적 또는 물리화학적 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 분해 반응 속도가 빠른 물리화학적인 방법을 사용할 수 있다.
리그닌을 분해하는 생물학적 방법으로는 퍼옥시다제(Peroxidase)와 라카제(laccase) 등의 효소를 처리하여 분해시킬 수 있다.
생물학적인 분해 방법 외에도 상기 리그닌의 분해는 고온열분해 (pyrolysis), 가스화 (gasification), 수소화분해 (hydrogenolysis), 산분해 (acidolysis), 염기분해, 화학적 산화분해 (chemical oxidation) 및 임계상분해 (hydrolysis under supercritical condition)로 이루어지는 군에서 선택되는 물리화학적 방법을 수행할 수 있다.
본 발명의 일예에서, 리그닌을 산분해 또는 염기분해하는 경우, 고농도 (0.5 내지 2.0 mol/L)의 NaOH 또는 KOH 수용액이 바람직하고, 산 처리용으로 H2SO4, HCl, 또는HNO3 등을 0.1 내지 5 %(w/v) 의 농도로 처리하는 것이 바람직하다. 산 처리와 염기 처리는 약 80 내지 350 ℃에서 5 내지 120 분의 조건이 바람직하다.
열분해법에 의한 리그닌 분해는, 고압반응기를 이용하여 350 - 650 ℃의 고온에서 열분해 (Pyrolysis)를 통해 리그닌을 분해할 수 있고, Nitrobenzene, KMnO4, H2O2, Zeolite 등 분해 작용을 돕는 촉매들을 사용하여 분해 효율을 높일 수 있어 바람직하다. 또한 수소화 분해법 (hydrogenolysis) 및 임계상 분해법 (hydrolysis under supercritical condition) 등의 여러 물리화학적 분해 방법을 이용 할 수 있다.
상기 리그닌 분해 반응은 분해반응을 최적화하기 위해서 2 - 20 bar의 산소 압력 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 또한 상기 분해 방법들의 반응시간은 200 분 이하가 바람직하지만 적절히 조절할 수 있다.
상기 리그닌 분해산물은 바닐린, 시린알데히드(syringaldehyde), p-hydroxybenzaldehyde, 바닐산, 시린지산 등의 방향족 단량체 혼합물이 포함되어 있으며, 본 발명의 화학식 1의 화합물 및/또는 화학식 2의 화합물 물질을 포함한다.
일례로 화학식 2의 방향족 알데히드를 화학식 1의 방향족 카르복시산으로 전환하는 반응은 화학적 또는 생물학적 반응을 이용할 수 있다.
화학적 방법으로는 silver oxide method법 또는 caustic fusion 방법을 이용할 수 있다. 먼저 알데히드 작용기를 가지고 있는 방향족 단량체들을 1M의 Ag2O존재 하에 1M NaOH, 55 내지 60 ℃에서 약 10분간 반응시킨 후, 다시 침전물을 같은 양의 1M HCl에 첨가하여 흔들어 반응시켜 산화된 방향족 카르복시산을 얻을 수 있다.
생물학적 반응은 효소, 미생물 전세포, 세포 파쇄액 또는 세포 추출물을 생촉매로 이용하는 방법이다. 상기 효소에는 알데히드 데히드로게나제 (aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1,2,1,5)), 바닐린 데히드로게나제(vanillin dehydrogenase (EC 1.2.1.67)) 또는 이와 상응하는 기능을 가지는 효소가 포함된다. 이러한 효소의 비제한적 예로는 GenGank ID CAD60262.1 또는 ABK09332.1, Uniprot ID P47771 또는 P54114 등을 들 수 있다. 이러한 효소반응은 정제된 효소를 사용하는 반응 뿐만 아니라, 해당 효소 혹은 상응하는 기능을 하는 효소를 포함하는 Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Sphingomonas paucimobilis, Streptomyces viridosporus, Desulfovibrio vulgaris, Burkholderia cepacia 등과 같은 미생물 전세포, 그 파쇄액 또는 그 추출물을 사용하는 반응도 포함된다.
상기 생물학적 반응은 화학식 2의 방향족 알데히드를 효소 또는 효소를 포함하는 미생물 등과 접촉하거나 상기 기질을 포함하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 것인 방법일 수 있다. 상기 효소 반응은 pH 5.5 내지 pH 9.5 범위에서 이루어질 수 있으며, 최적 pH 는 상기 범위 내에서 각 효소의 특성에 따라 달라질 수 있다. 또한 상기 효소 반응은 온도 25℃ 내지 50℃ 범위에서 이루어질 수 있으며, 최적 온도는 각 효소의 특성에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일예에서는 전환온도는 30℃ 내지 37℃일 수 있다.
본 발명은 기질과, p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는, 생물학적으로 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법을 제공하여, 친환경적인 생물학적 방법으로 산물을 제조할 수 있으며, 화학 공정에 비하여 p-히드록시벤조산 생산에 대한 높은 특이성을 가진다.
또한, 본 발명은 재생 가능한 바이오매스(biomass) 유래 리그닌을 원료로 한 p-히드록시벤조산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 리그닌을 화학적 방법에 의해 분해하여 방향족 단량체를 포함하는 리그닌 분해산물을 얻고 그것을 기질로 생물학적 방법에 의해 p-히드록시벤조산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명 일례의 리그닌을 원료로 한 p-히드록시벤조산의 생산경로를 도시한 개략도이다.
도 2는 리그닌 유래 방향족 단량체 표준물질들의 HPLC 분석 크로마토그램이다.
도 3은 실시예에서 사용한, 리그린 열분해 반응기의 일예인 고압반응기 (450 mL, Parr 4562)을 보여주는 개략도이다.
도 4a 내지 4c는 HPLC-ESI-MS/MS를 이용한 반응 후의 산물을 분석한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<리그닌 유래 방향족 단량체의 분석>
리그닌 유래 방향족 단량체들의 정량분석을 위하여 바닐린 및 p-히드록시벤조산을 비롯한 13종류를 포함하는 표준용액을 제조하고, Waters e2695 HPLC와 Waters 2489 UV/VIS (254 nm, 280 nm) 검출기를 이용하여 분석하였다 (도 2). 분석시 칼럼은 XBridge C18 (4.6 x 150 mm, 5 μm)을 사용하였고, 칼럼 온도는 35 ℃, 이동상의 흐름속도는 1 mL/min로 하였다. 이동상으로는 A) 0.1% 포름산이 첨가된 5% 아세토니트릴 수용액, B) 0.1% 포름산이 첨가된 50% 아세토니트릴 수용액을 사용하였고, 기울기조건으로 1.5 min (0% B), 9.5 min (90% B), 16.5 min (40% B), 21.5 min (24% B), 24.5 min (0% B)를 사용하였고, 다음 샘플의 분석전에 평형화 시간으로 초기 조건에서 6분간 유지하였다.
도 2에서 나타난 각 피크의 화합물은 다음과 같다:
1. 3,4-di히드록시벤조산
2. p-히드록시벤조산
3. 바닐산
4. p-히드록시벤즈알데히드
5. 시린지산
6. 바닐린
7. 코니페릴알코올(Coniferyl alcohol)
8. 시린알데히드(syringaldehyde)
9. 구아이아콜(Guaiacol)
10. 2,6-디메톡시페놀
11. 벤조산
12. 2,6-디메톡시 -4-메틸페놀(2,6-dimethoxy-4-methylphenol)
13. 2-메톡시-4-메틸알콜(2-methoxy-4-methylphenol)
p-히드록시벤조산의 생성은 HPLC와 ESI-MS/MS (Waters TQD)를 이용하여 확인하였다. HPLC의 조건은 상기 HPLC 조건과 동일하게 사용하였고, Mass spectrometry의 조건은 p-히드록시벤조산 표준용액을 이용하여 최적화하였다. 이온화 방법은 음이온화 방법을 사용하였고, capillary voltage (3 kV), cone voltage (25 V), source temperature (120 ℃), desolvation temperature (300 ℃), desolvation gas flow (600 L/hr, N2), cone gas flow (60 L/hr, N2)의 최적화된 조건을 사용하였다. 표준용액의 결과와 비교함으로써, HPLC-ESI-MS/MS에서 p-히드록시벤조산 생성 피크를 스캔모드 (50~200, m/z)에서 분자이온과 collision energy가 주어졌을 때의 특이적인 조각 이온의 생성으로 확인하였다.
[ 실시예 1]: 리그닌의 알칼리 산화 분해
도 3에 나타낸 실험실용 고압반응기 (450 mL, Parr 4562)를 이용하여 리그닌 분해 반응을 실시하였다. 크라프트 리그닌 10.0 g을 미리 준비된 200 mL 1M NaOH 수용액에 첨가하여 반응초기 리그닌 함유량을 5.0 %(w/v)으로 하여 반응물을 준비하였다. 촉매로 KMnO4 10 g을 첨가하였다. 반응물을 내부 부피가 450 mL인 스테인리스스틸 재질의 고압반응기에 충진 후 밀봉하고 500 rpm 속도로 교반을 시작하였다. 반응기 내부로 연결된 샘플링 라인을 통해 반응물에 약 5 bar의 산소가스로 2분간 충진시킨 후 반응기의 가열을 시작하고, 반응기 내부 온도가 140 ℃에 도달했을 때부터 60분간 반응을 지속하였다. 반응 온도는 냉각수관을 통해 PID 콘트롤러로 조절하였다. 본 반응 시작으로부터 60분 경과 후 샘플링 라인을 통해 시료 채취 후 반응을 종결시켰다.
상기 채취한 리그닌의 알칼리 분해산물 시료 2mL에 증류수 4mL을 첨가하여 3배 희석한 후, 리그닌을 필터(10 kDa MWCO)로 제거하였다. 상기 리그린이 제거된 시료 1mL에 9배 부피의 메탄올을 첨가하여 추출한 후, 주사기 필터 (0.22 μm)를 이용하여 불순물을 제거하여 리그닌 분해산물을 정제하였다. 이후 HPLC로 분석하여 표 1과 같은 조성을 얻었다.
조성 농도 (mM)
p-히드록시벤조산 0.00
p-히드록시벤즈알데히드 0.66
바닐산 1.90
바닐린 5.32
시린지산 0.20
시린알데히드 0.11
[ 실시예 2]: 효소반응에 의한 p- 히드록시벤조산 생산
< 단계1 > 아미노데옥시코리스메이트 리아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡 터 및 형질전환 미생물 제조
아미노데옥시코리스메이트 리아제(aminodeoxychorismate lyase, ADC lyase)를 제조하기 위하여, S. cerevisiae 균주로부터 유래한 ADC lyase유전자를 클로닝하였다. 우선 S. cerevisiae KCCM 50712로부터 게놈 DNA를 추출하였다. S. cerevisiae KCCM 50712의 ADC lyase를 코딩하는 염기서열(Genbank Accession Number; DAA10190.1)을 기초로 하여 각각 다음의 프라이머를 고안하였다.
(정방향 프라이머1): 5'-AAACATATGTCACTAATGGACAATTGGAA -3'(서열번호 1)
(역방향 프라이머1): 5'-AAACTCGAGATATTTTGTCTTCACTGTTC -3'(서열번호 2)
상기 프라이머를 이용하여 S. cerevisiae KCCM 50712게놈에 대해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 ADC lyase 유전자의 염기서열을 증폭하였다.
PCR 조성은 주형 100 ng, 프라이머 각각 10 pmol, 2.5 mM dNTPs, 1X PCR 버퍼, 2.5U Taq 폴리머라아제를사용하였으며 반응액의 총 부피는 50 ㎕로 하였다. PCR의 DNA 증폭 반응 조건은 94℃, 5분의 프리-디네이쳐레이션(pre-denaturation)에 이어 94℃, 디네이쳐레이션 1분; 55℃ 어닐링(annealing) 30초; 72℃ 엘롱게이션(elongation) 3분를 30 사이클로 하였으며, 최종 신장을 위하여 72℃에서 5분간 포스트-폴리머라이제이션(post-polymerization)을 하였다.
증폭된 유전자는 각각 NdeI /XhoI 제한효소로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 같은 제한효소로 절단된 플라스미드 벡터 pET28a(Novagen 사)에 삽입하여 pET28a/ADCL 벡터를 제작하였다. PCR및 클로닝 결과는 1.2% 아가로오즈 전기영동으로 판정하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다. 또한, 상기 형질전환된 미생물은 15% 글리세롤 용액을 첨가하여 냉동 보관하여 추후 효소 생산을 위한 배양을 실시할 수 있도록 하였다.
<단계 2> ADC lyase 의 제조
ADC lyase를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 재조합 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB 배지 5 ㎖이 들어있는 시험관(test tube)에 접종하고 600 ㎚에서 흡광도가 2.5이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 LB 배지 100 ㎖이 들어있는 300 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.5 mM IPTG를 첨가하여 효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반속도는 250 rpm, 배양 온도는 33℃가 유지하도록 조절하고, IPTG를 첨가한 후에 같은 조건으로 6시간 동안 배양하였다.
또한, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 4,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, PBS완충용액으로 두 번 세척한 다음 50 mM 트리스-염화수소 완충용액 (pH7.5)을 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 세포 상등액만을 얻어 Ni-NTA His-Tag 크로마토그래피로 효소를 정제하였다. 정제한 효소는 원심분리필터(10 kDa)를 사용하여 50 mM 트리스-염화수소 완충용액 (pH7.5)으로 교환한 후 농축하여 단백질 정량법 (Bradford 분석법)을 통해 농도를 측정한 후, 최종적으로 5mg/mL 농도로 제조하였고, 이를 p-히드록시벤조산 생산에 사용하였다.
<단계 3> p- 히드록시벤조산의 생산
5mg/L 농도의 정제한 ADC lyase와 500mg/L 농도의 바닐산(Sigma사)을 4:1의 부피비로 혼합하여 37℃ 항온조에서 3시간 반응시킨다. 반응 종료 후 시료에 9배 부피의 메탄올을 첨가하여 추출한 후 주사기 필터 (0.22 μm)를 이용하여 불순물을 제거하여 분석샘플을 준비한 후 p-히드록시벤조산의 생성과 농도는 HPLC로 확인하여 분석하였다 (표 2).
또한, 시린지산(Sigma사)에 대해서도 상기와 같이 동일한 방법으로 효소반응을 수행하고 분석결과를 표3에 제시하였다.
효소반응 전 (mM) 효소반응 후 (mM)
바닐산 0.583 0.460
p-히드록시벤조산 0.000 0.112
효소반응 전 (mM) 효소반응 후 (mM)
시린지산 0.595 0.490
p-히드록시벤조산 0.000 0.068
상기에서 보는 바와 같이, ADC lyase에 의하여 바닐산 또는 시린지산이 p-히드록시벤조산으로 전환됨을 알 수 있다.
[실시예 3]: 전세포를 이용한 p-히드록시벤조산 제조
정제된 효소를 이용한 반응 이외, 전세포(whole cell) 를 사용하여 바닐린으로부터 p-히드록시벤조산을 생산하였다.
구체적으로, 글루코스가 포함된 YPD 배지에서 37℃, 250rpm 조건에서 S. cerevisiae KCCM 50712를 24시간 배양한 후, 4,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 세포 펠렛은 트리스-염화수소 완충용액으로 2회 세척하였다. 이렇게 획득한 세포를 500mg/L농도의 바닐린을 기질로 하여 37℃ 항온조에서 24시간 정치 배양하였다. 반응 종료 후 시료에 9배 부피의 메탄올을 첨가하여 추출한 후 주사기 필터 (0.22 μm)를 이용하여 불순물을 제거하여 분석샘플을 준비한 후 p-히드록시벤조산의 생성과 농도를 HPLC로 확인 및 분석하였다 (표4).
효소반응 전 (mM) 효소반응 후 (mM)
p-히드록시벤조산 0.000 0.018
바닐산 0.000 0.257
바닐린 0.650 0.133
전세포 내 알데히드 데히드게나제에 의해 바닐린이 바닐산으로 전환되고, 전환된 바닐산이 p-히드록시벤조산으로 전환됨을 알 수 있다.
[실시예 4]: 리그닌으로부터 p-히드록시벤조산 생산
상기 실시예 1에서 얻은 리그닌 분해 산물에 대해 효소반응을 진행하여 p-히드록시벤조산을 생산하였다. 리그닌 분해 산물에 10M HCl를 소량 첨가하여 pH7.5로 적정 한 후 10kDa MWCO 필터로 여과하여 그 여과액을 반응물로 준비하였다. 상기 실시예3 의 ADC lyase 및 알데히드 데히드로게나제를 포함하는 야생형 S. cerevisiae KCCM 50712 전세포 용액과 실시예 2의 효소용액을 1:1의 부피비로 혼합하여 반응에 사용하였다. 이 용액과 리그닌 분해물질을 4:1의 부피 비율로 혼합하여 37℃ 항온조에서 3시간 반응시켰다. 반응 종료 후 반응액을 13,000×g로 4 oC에서 20분 동안 원심분리하고 상등액을 획득한 후 시료에 9배 부피의 메탄올을 첨가하여 추출한 후 주사기 필터 (0.22 μm)를 이용하여 불순물을 제거하여 분석샘플을 준비하여 p-히드록시벤조산의 생성과 농도는 HPLC를 수행하여 분석하였다 (도 4). 반응 전후의 시료 분석 결과를 [표 5]로 정리하였다.
도 4a는 효소반응 결과를 나타내는 크로마토그램이고, 도 4b는 효소반응 후 p-히드록시벤조산 피크의 스캔모드에서 질량스펙트럼 (M: 분자량)이며, 도 4c는 효소반응 후 p-히드록시벤조산의 분자이온의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
물질 반응 전 (mM) 반응 후 (mM)
p-히드록시벤조산 0.00 1.16
p-히드록시벤즈알데히드 0.66 0.00
바닐산 1.90 4.28
바닐린 5.32 1.58
시린지산 0.20 0.00
시린알데히드 0.11 0.00
상기에서 보는 바와 같이, 바닐린, 시린알데히드, p-히드록시벤즈알데히드는 산화되어 함량이 감소하고, 생성된 또는 리그닌 분해산물에 존재하던 바닐산, 시린지산은 p-히드록시벤조산으로 전환됨을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SAMSUNG PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> PROCESS OF BIOLOGICALLY PRODUCING A p-HYDROXYBENZOIC ACID <130> DPP20124630KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ADC lyase <400> 1 aaacatatgt cactaatgga caattggaa 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ADC lyase <400> 2 aaactcgaga tattttgtct tcactgttc 29

Claims (20)

  1. a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산을 포함하는 기질과, 상기 b)의 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 제거하여 p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는,
    생물학적인 방법으로 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이며, 단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님.
  3. 제 1 항에 있어서, a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시기 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산은 바닐산(vanillic acid) 또는 시린지산(syringic acid)인 것인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 생촉매는 효소, 상기 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 생촉매는 안트라닐산 생성효소, 5-O-(1-카르복시비닐)-3-포스포시키메이트 포스페이트-리아제, 코리스메이트 리아제, 3-데히드로시키메이트 히드로-리아제, 이소코리스메이트 리아제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제, 3-데히드로퀴네이트 히드로-리아제, 프레페네이트 히드로-리아제 및 히드록시페닐피루베이트 생성효소로 이루어지는 군에서 선택된 효소, 상기 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 효소는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula,　Debaryomyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloekera, Pichia, Trigonopsis, Brettianomyces, Aspergillus, Yarrowia, Cryptococcus, Aureobasidium, Rhizopus, Monascus, Leucosporidium, Issatchenkia, Streptococcus, Escherichia, Bacillus, Brucella suis, Mycobacterium, Salmonella, Shigella, Yersinia, Aquifex, Helicobacter, Staphylococcus, Thermotoga, Pseudomonas, Sinorhizobium, Vibrio, Schizosaccharomyces, Clostridium, Lactobacillus, Klebsiella, Citrobacter 및 Streptomyces로 이루어지는 군에서 선택된 균주로부터 유래된 것인 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 생촉매는 천연형(wild-type) 또는 재조합 미생물인 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 기질과 생촉매를 접촉시키는 단계는 p-히드록시벤조산을 제조가능한 충분한 조건하에서, 상기 효소, 효소를 포함하는 미생물, 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물을, 상기 기질과 접촉하거나 상기 기질을 포함하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 것인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은, 상기 기질과 생촉매의 접촉단계전에, 화학식 2으로 표시되는 방향족 알데히드를 화학식 1로 표시되는 방향족 카르복시산으로 산화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00004

    상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이며, 단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 방향족 알데히드는 바닐린(vanillin) 또는 시린알데히드 (syringaldehyde)인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 방향족 알데히드는 화학적 또는 생촉매를 사용하여 화학식 1의 방향족 카르복시산으로 산화시키는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제9항에 있어서, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 리그닌 유래인 것인 방법
  13. 리그닌을 분해하여 a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산을 포함하는 리그닌 분해산물을 제공하는 단계; 및
    상기 리그닌 분해산물과, 상기 b) 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 제거하여 p-히드록시벤조산을 제조가능한 생촉매를 접촉하는 단계를 포함하는,
    p-히드록시벤조산을 제조하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 a) p-히드록시기와 b) 방향족 고리의 적어도 하나 이상에 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기를 포함하는 방향족 카르복시산은 하기 화학식 1로 표시되는 것인 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이며, 단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님.
  15. 제13항에 있어서, 상기 리그닌 분해산물과 생촉매의 접촉단계전에, 리그닌 분해산물 내 포함된 화학식 2으로 표시되는 방향족 알데히드를 화학식 1로 표시되는 방향족 카르복시산으로 산화시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
    [화학식 2]
    Figure pat00006

    상기 식에서, X 및 Y는 같거나 다를 수 있으며, 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C1-C4 알콕시기이며, 단 X 및 Y는 동시에 수소는 아님.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 생촉매는 효소, 상기 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물인 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 생촉매는 안트라닐산 생성효소, 5-O-(1-카르복시비닐)-3-포스포시키메이트 포스페이트-리아제, 코리스메이트 리아제, 3-데히드로시키메이트 히드로-리아제, 이소코리스메이트 리아제, 아미노데옥시코리스메이트 리아제, 3-데히드로퀴네이트 히드로-리아제, 프레페네이트 히드로-리아제 및 히드록시페닐피루베이트 생성효소로 이루어지는 군에서 선택된 효소, 상기 효소를 생산하는 미생물, 그 미생물 파쇄물 또는 미생물 파쇄물의 추출물인 방법.
  18. 리그닌을 분해하여 p-히드록시벤즈알데히드를 포함하는 리그닌 분해산물을 제공하는 단계; 및
    상기 리그닌 분해산물을 산화시켜 p-히드록시벤즈알데히드를 p-히드록시벤조산으로 전환하는 단계를 포함하는
    p-히드록시벤조산을 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 산화는 화학적 또는 생촉매를 사용하는 것인 p-히드록시벤조산을 제조하는 방법.
  20. 제 13 항 또는 제18항에 있어서, 상기 리그닌의 분해는 고온열분해 (pyrolysis), 가스화 (gasification), 수소화분해 (hydrogenolysis), 산분해 (acidolysis), 염기분해, 화학적 산화분해 (chemical oxidation) 및 임계상분해 (hydrolysis under supercritical condition)로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 수행하는 것인 방법.
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