DE1492202A1

DE1492202A1 - Konservierendes einfrierbares Verduennungsmittel fuer lebende Zellen und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1492202A1
Application number: DE19651492202
Authority: DE
Inventors: Rajamannan Ambrose Harry
Original assignee: TWYFORD LAB Ltd
Current assignee: TWYFORD LAB Ltd
Priority date: 1964-12-14
Filing date: 1965-12-14
Publication date: 1969-11-20
Also published as: BR6575665D0; FR1459554A; US3444039A; ES320736A1; DK115866B; GB1063148A

Description

TWYPORD LABORATORIES LIMITED Twyford Abbey Road, London N.W.10 /England

Konservierende8 einfrierbare8 Verdünnungsmittel für lebende Zellen und Verfahren zu. seiner Herstellung

Die Erfindung besieht sich allgemein auf das Konservieren und Einfrieren von lebenden tierischen Zellen mit Kolehydrat-Polysaoohariden und auf die dabei erhaltenen Produkte.

Insbesondere besieht sich die Erfindung auf ein konservierendes einfrierbares Verdünnungsmittel für nichtwaohsende lebende Zellen auf ein Verfahren sur Herstellung dieses Kittels und auf die Anwendung dieses Mittels für lebende Zellen. Das konservierende Verdünnungs mittel gemKA der Erfindungkann ».B. für lebende Zellen und Zellgewebe, wie Samen, K»im$lasma_t Knoohenmaxk-

zellen, Muskel- oder Aeteriengewebezellen und anderes benutzt werden; diese Zellstoffe werden normalerweise getötet oder zerstört, wenn sie in Gegenwart von teilweise hydrolisierter Pflanzenstärke in form von Polysacchariden hoher Ordnung praktisch verwendet werden.

Bei der Konservierung und beim Einfrieren in Zucker, Alkohol und anderen Konservierungsmitteln hat man sich bisher dem Problem der Zellanzerstörung gegenübergeeehen. Das Problem der Stoffumwandlung hat zur Verwendung von teuren Stoffen geführt, welche in erster linie mehrfach gesättigte Alkohol· mit 4-7 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Erythrit, Adonit, Sorbit, Mannit oder Inosit enthalten· Weiterhin wurden Stoffe, wie beispielsweise Traubenzucker oder Fruchtzucker verwendet· Jedoch tritt auch bei diesen teuren -β Stoffen zusätzlich das Problem auf, daß die Zahl der gesunden zellen nach dem Einfrieren gering ist· Auch bei den teuersten Stoffen sind viele Zellen nach dem Einfrieren zerstört. Es ist daher von großer Bedeutung, «in konservierendes Verdünnungsmittel su sohaffen, das billig ist und die Möglichkeit bietet, viele Zellen beim Einfrieren gesund su erhalten.

Es ist Aufgab· der Erfindung, ein konservierendes, einfrierbar·· Verdünnungsmittel xu schaffen, daß wirtschaftlich herstellbar ist und ein· Verbesserung ia de* *ieder-

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gewinnung von dem Verdünnungsmittel beigemischten gesunden Zellen nach dem Einfrieren ermöglicht. Es ist weiterhin Aufgabe derErfindung, ein Verfahren zur Herstellung von konservierenden Verdünnungsmitteln anzugeben, wobei das Verdünnungsmittel aus einer Mischung von Kohlehydrat-Po Iy sacchariden hergestellt werden soll, welche Teilhydrolyse von natürlicher pflanzlicher Stärke gewonnen werden,

Bas einfrierbare konservierende Verdünnungsmittel für I

lebende tierische Zellen gemäß der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Mischung eines Proteins, eines Puffermittele und einer Kombination von Kohlehydrat-Sacchariden, welche in Wasser gelöst ist, wobei die Btsung einen pH-Wert von 6-7,5 und einen osmotischen Druck von 225 bis 350 Milliosmolen besitzt.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist die Anwendung des konservierenden Verdünnungsmittels für lebende -Zellen sum Zwecke des Einfrierens vorgesehen.

Schließlich ist gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines konservierenden Verdünnungsmittels vorgesehen, bei dem eine wässrige Lösung eines Proteins, eines Puff ermittele und einer Kombination von Kohlehydrat-Polysacchariden bereitet wird, welche einen pH-Wert von 6-7,5 und einen osmotisch en Druck von 225 - 350 Milli-

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osmolen besitzt.

Als bevorzugtes Protein kommt ein flüssiger Extrakt von getrocknetem Eigelb in Betracht. Das Eigelb ist vorzugsweise sprühgetrocknet.

Die KohlehydratTPolysaccharide können dem Eigelb vor dem Sprühtrocknen zugefügt werden. Das Puffermittel ist vorzugsweise ein lösliches säureneutralisierendes Salz, ein alkalischer Stoff oder eine Mischung dieser Stoffe.

Die Kohlehydrat-Polysaccharide sind vorzugsweise Trisaccharide, Tetrasaccharide, Pentasaccharide, Hexasacoharide, Heptasaccharide oder höhere Saccharide. Sie können aus den teilweise hydrolysierten Endprodukten natürlicher pflanzlicher Stärken, wie beispielsweise das hydrolysierte Endprodukt von Getreidestärke, bestehen. Als geeignetes

Ausgangsmaterial für Kohlehydrat-Saccharide hat sich Getreidesirup erwiesen. Speziell enthalten die Kohlehydrat-Saccharide mehr als 80 i» Polysaccharide ausschließlich der Mono- und Disaccharide und einschließlich wenigstens 30 i> einer Mischung von Tri- bis Heptasacchariden.

Ein bevorzugtes einfrierbaree Verdünnungsmittel enthält eine Kombination eines Wasserextrakt β von 25 bis 100 Teilen festen getrockneten Eigelbs, 0,5 bis 15 Teilen Kohlehydratsacohariden und eine ausreichende Menge Puffermittel,

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so daß die fertige Mischung einen pH-Wert von 6-7,5 • und einen osmotischen Druck von 225, bis 350 Milliosmolen in wässriger Lösung besitzt. Die Kohlehydratsaccharide können zusammen mit bis zu zwei Teilen Komplementär-Zucker verwendet werden.

Speziell ist gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines einfrierbaren Verdünnungsmittels vorgesehen, bei dem eine wässrige Lösung von getrockneten Eigelb und eines Puffermittels hergestellt, die Flüssigkeit von den i festen Stoffen abgeschieden und der Flüssigkeit 0,5 - 15 Teile von über 80 tigern Kohlehydrat-PoIysaccharidetoff pro 1000 cbcm Wasser hinzugeführt wird, wobei die Menge des Puffermittels so groß ist, daß sich ein pH-Wert der Lösung von 6-7,5 und ein osmotisoher Druck von 225 bis 350 Milliosmolen einstellt.

Das einfrierbare konservierende Verdünnungsmittel wird für lebende Zellmaterialien in bekannter Weise verwendet. Vorzugsweise wird das Verdünnungsmittel in frisch hergestellter flüssiger Form benutzt. Allerdings kann der flüssige feil auch durch Sprühtrocknung oder Kältetrocknung verdampft und das feste Verdünnungsmittel später für Konservierungssweeke in Wasser gelöst werden·

Im folgenden wird das Verdünnungsmittel und das Verfahren gemäß *er Erfindung im Zua«useafa*ag mit seiner Anwendung

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für die Konservierung von tierischen Samen für eine künstliche Besamung beispielhaft erläutert.

Beispiel 1

ITatriumzitrat 54 Gramm

Wasser 2000 cbcm

Sprühgetrocknetes Eigelb 100 Gramm

Teilweise hydrolysierte feste

Getreidestärke 5 Gramm pro 1000 cbcm Flüssig-

keiteextrakt

Die Pufferlösung von Natriumzitrat und Wasser wird etwas unterhalb von Zimmertemperatur hergestellt, darauf wird da· Eigelb in der Pufferlösung verteilt» Durch Mischung bildet sich ein Koagulat, das durch Zentrifugieren, Filtern oder Abgießen von der klaren Flüssigkeit getrennt werden kann. Die Mischung wird stehengelassen, bis sie sich in zwei Teile, und zwar ein sich oben befindendes Koagulat und eine sich unten befindende klare Flüssigkeit getrennt hat. Die klare Flüssigkeit wird darauf abgezogen und pro 1000 cbom klaren Extrakts 5 Gramm teilweise hydrolysierter fester Getreidesirup mit über 80 £ Polysacchariden hinzugefügt. Damit wird ein flüssiges Verdünnungsmittel für das Einfrieren von Iahenden Zellen erhalten. Soll die Lösung von konservierendem Verdünnungsmittel und lebenden Zellen eingefroren «erden, so werden 5-10 Yolueen-jt Glyzerin hinzugefügt. Da« Glyaerin kann sowohl vor als auch nach der Mischung

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des konservierenden Lösungsmittels mit lebenden Zellen beigemengt werden.

Beispiel 2

Alkalisches Zitratsalz 27 Gramm

Wasser 1000 cbcm

festes Eigelb 50 Gramm

fester Getreidesirup 5 Gramm

Diese Komponenten können lediglieb/zusammengebracht und i gemischt werden. Es ist jedoch günstig, zunächst die Pufferlösung durch Mischen des alkalischen Zitratsalzes, beispielsweise Natrium- oder Kaliumzitrat, mit Waseer herzustellen und dann den Getriedesirup und das sprühgetrocknete Eigelb hinzuzufügen und durchzumischen. Durch Abstehen der Lösung wird die oben genannte Trennung erhalten. Sie unten befindliche klare flüssigkeit wird abgezogen, womit sie für den Gebrauch fertig ist. Es kann die gewünschte Menge lebender Zellen hinzugefügt werden. Bas Eingeben von beliebigen Mengen lebender Zellen in ein Verdünnungsmittel ist an sich bekannt. Zum Einfrieren der Mischung aus Verdünnungsmittel und lebenden Zellen werden 5-10 Volumen-ji Glyzerin hinzugefügt.

Das folgende Beispiel zeigt, wie die festen Bestandteile des VerdünnungsmitteIe geändert werden können.

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Beispiel 3

Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6-7,5

und einem osmotisch en Druck von 250 - 500 Millioemolen

Wasser - 1000 eben

festes Eigelb 20 bis 100 Gramm

Kohlehydrat-Polysaccharide 0,5 - 15 Graara (vorzugsweise 2 bis 15 g,
wenn kein komplementärer
Zucker oder Alkohol hinzugefügt wird)

Fruchtzucker und/oder Traubenzucker 0-2 Gramm.

Diese Komponenten werden wie in Beispiel ü gemischt, wobei eine Trennung des gewünschten flüssigen Extraktes erfolgt. Der Extrakt kann auch, wie in Beispiel 1, hergestellt werden. Die verwendete Pufferlösung kann aus irgendeinem geeigneten Salz oder alkalischen Stoff bzw. aus Mischungen dieser Stoffe bestehen. Beispielsweise sind Zltrate, Acetate, Phosphate oder Karbonate geeignet, um den Spermertötenden sauren Charakter der Polysaccharide zu neutralisieren und den pH-Wert, wie beschrieben, zu kontrollieren. w Die Kohlyhdrat-Saccharide bestehen auseiner Mischung von geringen Mengen Mono- und Disacchariden mit großen Mengen Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-, Hepta- und höheren Polysacchariden. Diese Polysaccharide können durch teilweisesaure und/oder enzymische Hydrolyse von natürlich vorkommender Getreide-, Mais-, Kartoffel-, Weizen-, Heiß-, Hafer- und anderen Pflanzenstärken bestehen. Bei den Hydrolyseprodukten handelt es sich um eine Teilumwandlung zwischen 10 - 50 £ Traubenzuckeräquivalent (Dextrose equivalent)

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Diese Mischung von Kohlehydrat-Polysacchariden kann nicht ohne lösliche Neutralisierungs- oder Puffermittel wie alakalische Metailzitrate, -Phosephate, -Azetate oder -Karbonate sowie Mischungen dieser Stoffe verwendet werden. Die Kohlehydrat-Polysacoharide werden vorzugsweise durch Teilhydrolyse von natürlicher Stärke, wie sie in Mais oder Getreide vorkommt, gewonnen. Zur Vervollständigung der Saccharide kann konventioneller Zucker benutzt werden. Allerdings werden bisher in diesem Zusammenhang benutzte Zucker und Alkohole vorzugsweise nicht verwendet .

Beispiel 4 Das Verfahren nach Beispiel 1 wird mit Zuckerhirsesirup

in dtr in Beispiel 2 angegebenen Menge durchgeführt.

Dabei wird «ine schnellere Benetzung der Mischungen mit getrocknetem Eigelb beobachtet, wenn die teilweise hydrolysiert β Stärke bein Herausziehen des festen Eigelbs hinzugefügt» wird. Damit wird Mischungszeit meßbar verkürzt. Wegen der Gleichartigkeit der Teilhydrolyse der Getreide stärke Boheint es nicht erforderlich, andere gleichwertige Stärken und ihre Umwandlung durch Teilhydrolyse in Polysaccharide au beschreiben.

In den beschriebenen Beispielen betragen die relativen Prozentsatz· der festen Stoffe 33 Jf Puffermittel, 60 Jt

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getrocknetes Eigelb und 6 j£ Saccharide.

Die Herstellung von konservierenden Verdünnungsmitteln im Zusammenhang mit lebenden Zellmaterialien ist bekannt. Die Einzelheiten der Bildung von Mischungen des beschriebenen Verdünnungsmittels mit lebenden Zellen können c&e in Bezug auf die Konzentrationen wie bekannt wahlweise vorgenommen werden. Pur die obigen Versuche betrug die Verdünnung 1 Teil Samen in 100 Teilen Verdünnungsmittel, wie allgemein bei Bulleneamen für eine künstliche Besamung gebräuchlich ist. Die Anwendung für eine künstliche Besamung ist sonst wie bei bekannten Verfahren gleichartig.

Bei Versuchen mit dem beschriebenen Verdünnungsmittel für Bullensamen in Vergleich mit bekanntem Elgelbzitrat und anderen Mitteln, wie "Minnesota GR>^N, einem bekannten Zukker-Alkohol-Verdünnungsmittel, wurden folgende Ergebnisse erhalteni

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1. Samen niederer Qualität

Standard Eigelbzitrat "Minnesota Go" Verdünnungemittel

nach Beispiel 1

lagern b. Umgebungstemp.

+ 5°C

1 Tag Lebens fähigkeit

3 Tage "

2 Tage Lebensfähigkeit

5 Tage "

2 Tage Lebens fähigkeit

7 Tage »

2. Samen hoher Qualität

Lagern b. 1 bis 2 Tage 3 Tage Lebens- 3 Tage Lebens-Umgebungstemp· Lebensfähigkeit fähigkeit fähigkeit

+ 5°C

5 Tage " 7 Tage ^w 7 Tage

Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren

3. Samen hoher Qualität

Vor Einfrieren 60 £ Beweglichkeit 40 5* Beweglichk. 60 % Beweglichkeit

" 40 + " 55⁺* "

Lebensfähig- 30 * ice it nach Einfrieren auf Temperatur flüssigen Stickstoffs

4. Samen geringer Qualität Vor Einfrieren 40 £ Beweglichk. 40 £ Beweglichk. 40 > Bewegl

Lebensfähigkeit 5 1» " 20^M* " 35⁺?6 " nach Einfrieren

⁺) Der höhere Prozentsatz der Beweglichkeit zeigt, daß keine bpermazellen zerstört sind und daß ein erstaunliches Anwachsen der Lebensfähigkeit eintritt.

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Die Vorteile des beschriebenen konservierenden Verdünnungsmittels zeigen sich beim Hegenerieren von eingefrorenem Samen geringer Qualität. Der Samen oft deckender Bullen (deren Samen geringe Qualität besitzt) kann daher in größerem Ausmaß verwendet werden, da die Zellenzerstörung und -tötung durch Einfrieren vermindert wird. Eb werden mit anderen Worten mehr leben* Zellen beim Regenerieren gewonnen. Daher können .Bullen mit Samen hoher Qualität öfter zum Decken zugelassen werden. Bei künstlicher Besamung müßten ansonsten wertvolle Bullen mit Samen geringer Qualität trotz hohen Zuchtwertes ausgeschieden werden, wenn bisher bekannte Samenkonservierungsmittel benutzt werden. Bei Verwendung des konservierenden Verdünnungsmittels gemäß der Erfindung können solche Bullen zur Zucht verwendet werden, da ihr Samen wirksam verwendbar ist.

Bei gleichartigen Versuchen mit eingefrorenen Mischungen des erfindungsgemäßen Verdünnungsmittels und Samen von Hähnen, Pferden, Kanichen, Schweinen, Hunden, Schafen und Ziegen zeigten die regenerierten aufgetauten Mischungen unter dem Mikroskop vergleichbar gute Beweglichkeiten und kaum nennenswerte Zellenzerstörung.

Ein weiteres Anwendungsgebiet besteht in der Konservierung von Blut. Dabei wird eine Blutprobe mit der Kohlehydrat-

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Polysaccharid-Zusammensetzung ohne Eigelbextrakt im Verhältnis von 1 Teil Blut und 2 Teilen terdünnungsmitteln gemischt. Biese Mischung wird bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs eingefroren. Ein Vergleich von aufgetauten Blutzellen mit frischen Blutzellen der gleichen Probe zeigte keine sichtbare Zellenzerstörung. Insoweit, als die Kohlehydrat-Polysaccharide ein menschliches Nahrungsmittel darstellen, können sie in flüssiger form unter hygienischen Bedingungen und mit oder ohne einem geeigneten Antibiotikum als Konservierungsmittel für gefrorenes Blut zu Blutübertragungen sowie Muskel- und Gewebezellen in an sich bekannter Weise verwendet werden. In an sich bekannter Weise kann das konservierende Verdünnungsmittel auch für menschliche Zellen verwendet werden.

• !Ansprüche .

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Claims

Ansprüche :

1. Einfrierbares konservierendes Verdünnungsmittel für lebende tierische Zellen, gekennzeichnet durch eine Mischung eines Proteins, eines Puffermittels und einer Kombination von Kohlehydrat-Polysacchariden, welche einen pH-^fert von 6-7,5 und einen osmotisch en Druck von 225 - 350 Milliosmolen besitzt.

2. Verdünnungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus einem flüssigen Extrakt von getrocknetem Eigeelb besteht.

3. Verdünnungsmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Eigelb sprühgetrocknet ist.

4. Verdünnung smittel nach den Töibergehenden gekennzeichnet durch eine Kombination ei near Waeggrfckt s von 25 bis 100 Teilen getfoekneten festen BigteüB, 0,5 -15 feilen Kohlehydrat-Polysacchariden ®ad^l Puffexmitteln.

* Verdünnungemit tel nach einem der Aaspjrüehe 1 eis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohleüyäjpat-Polyaaci ■mit bia zu 2 Teilen kompieaeatärem Zucdcer verwendet

6. Verdünnungemittel nach den vorhergehendenAnsprüchen, dadurch gekennzeichnet, dau das Puffermittel aus einem löslichen säureneutralisierenden Salz, einem alkalischen Stoff oder Mischungen fe-dieser Stoffe besteht.

7. Verdünnungsmittel nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydrat-Polysaecharide in Form von Tri-Saccharid en, Tetra-Sacchariden, Penta-Sacchariden, Hexa-^acchariden, Hepta-Sacchariden oder höheren Saccharide« Verwendung finden.

8. Verdünnungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daü die Kohlehydrat-Polysaecharide aus teilweise hydrolysierten Endprodukten von natürlichen pflanzlichen Stärken bestehen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydrat-Polysaecharide aus teilweise hydrolysieren Endprodukten von Getreidestärke be-

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10. Verdünnungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydrat-Polyeaccharide aus Getreidesirup bestehen.

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11. Verfahren zur Herstellung eines einfrierbaren, konservierenden Verdünnungmittels für lebende tierische Zellen,

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dadurch gekennzeichnet, dau eine wässrige Lösung eines Proteins, eines Puffermittels und einer Kombination von Kohlehydrat-Polysacchariden bereitet wird und daß die wässrige Lösung einen pH-Wert von 6 - 7_t5 und einen oßmotischen Durck von 225 - 350 Milllosmolen besitzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein ein flüssiger Extrakt von getrocknetem Eigelb verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch H oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Eigelb sprühgetrocknet; wird.

H. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13_t dadurch gekennzeichnet, daß in der wässrigen Lösung von Puffermittel getrocknetem festem Eigelb und Kohlehydrat-Polysacchariden die festen Stoffe von der Flüssigkeit getrennt werden und die separierte Flüssigkeit als Konservierungsmittel benutzt wird.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis H, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung von getrocknetem festem Eigelb und Puffermittel hergestellt wird, dab die Flüssigkeit von den festen Stoffen getrennt wird, daß der ?ltissigkeit 0,5 - 15 Teile Kohlehydrat-Polysaccharide mit über 80 io Polysacchariden pro 1000 cbcm Wasser hinzugefügt wird und daß das Puffermittel in einer derartigen Menge beigemengt wird, daß der pH-Wert der Lösung 6-7,5 und der osmotische Durck 225 - 350 Milliosmole beträgt.

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16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydrat-Polysaccharide in Kombination mit Komplementär-Zucker verwendet werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dab das Protein in Form von Eigelb und die Kohlehydrat-PoIysaccharide vor dem Trocicnen des Eigelbs zusammengemischt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dab eine wässrige Lösung eines alaklischen Puffermittels bereitet wird, daß der Lösung getrocknetes festes Eigelb beigemengt wird, daß eine trennung der festen Bestandteile und der klaren flüssigen Lösung der Mischung herbeigeführt wird, daß die klare flüssige Lösung von den festen Bestandteilen getrenntwird und daß der klaren flüssigen Lösung die teilweise hydrolysiert en -dridprodukte von natürlichen Stärken in Form von über 80 ^eß> Polysacchariden ausschließlich der Mono- und Disaccharide, jedoch mit über 30 i> an Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa- und Heptasaccharide beigemengt werden.

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