DE1268569B

DE1268569B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Asparaginsaeure

Info

Publication number: DE1268569B
Application number: DEP1268A
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Hino; Moriyoshi Ishida; Yasoji Miura; Shinji Okumura; Masahiro Takahashi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1962-05-26
Filing date: 1963-05-17
Publication date: 1968-05-22

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

C07b

6b-16/02

12 q-6/01

P 12 68 569.7-41 17. Mai 1963 22. Mai 1968

Die Erfindung betrifft ein im großtechnischen Maßstab durchführbares Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Asparaginsäure, das hohe Ausbeuten liefert.

L-Asparaginsäure ist eine der wichtigen Aminosäuren und wird auf vielen Gebieten verwendet.

Es sind schon verschiedene Methoden zur Herstellung von L-Asparaginsäure bekanntgeworden, ζ. Β.

die chemische Synthese von DL-Asparaginsäure auf chemischem Weg und die Spaltung der erhaltenen racemischen Asparaginsäure in die optisch aktiven Isomere,

die Isolierung der L-Asparaginsäure aus Proteinhydrolysat und

die biotechnische oder fermentative Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure und einigen geeigneten Aminodonatoren (vgl. französische Patentschrift 1 248 130).

Dieses dritte Verfahren wird für das günstigste und zweckmäßigste gehalten. Trotzdem ist es bislang nicht gelungen, L-Asparaginsäure in industriellem Maßstab herzustellen.

Nach dem Verfahren der französischen Patentschrift 1 248 130 werden zur Herstellung von L-Asparaginsäure Mikroorganismen der Species Pseudomonas fiuorescens und aeruginosa, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Proteus vulgaris sowie Bacillus megatherium bei nahezu neutralem pH-Wert auf Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Asparaginsäure

Anmelder:

Ajinomoto Kabushiki Kaisha, Tokio Vertreter:

Dr. G. Lotterhos und Dr.-Ing. H. Lotterhos, Patentanwälte, 6000 Frankfurt, Annastr. 19

Als Erfinder benannt:

Masahiro Takahashi,

Tetsuo Hino,

Yasoji Miura, Tokio;

Shinji Okumura,

Moriyoshi Ishida, Kanagawa-ken (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 26. Mai 1962 (21524)

Fumarsäure und/oder Fumarat in Gegenwart von Ammoniumverbindungen einwirken gelassen. Die nach 4 bis 8 Tagen erhaltenen Ausbeuten schwanken zwischen 52 und 87%. Sie sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I Beispiel

Mikroorganismen

L-Asparaginsäure-	Ausbeute	Für die L-Asparagin
konzentration in der		säurebildung
Reaktionsmischung	(°/o)	benötigte Zeit
(g/100 ecm)	61,0	(Tage)
3,6	64,8	8
4,2	87,0	8
5,0	55,7	1 + 3
3,2	81,8	9
4,7	83,5	1 + 3
4,8	57,0	1 + 3
3,7	78,3	5
4,5	60,9	1 + 3
3,5	52,2	1 + 3
3,0	1 + 3

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Escherichia coli

Aerobacter aerogenes

Ps. fiuorescens

Ps.aeruginosa

Proteus vulgaris ....
Bacillus megatherium

Es wurde gefunden, daß man diese Ausbeuten bei Organismen bei nahezu neutralem pH-Wert in Gegenkürzeren Fermentationszeiten wesentlich erhöhen 50 wart von Ammoniumverbindungen auf Fumarsäure kann, wenn man bei der biotechnischen Herstellung und/oder Fumarat gemäß Erfindung als Mikroorgavon L-Asparaginsäure durch Einwirkung von Mikro- nismen Pseudomonas trifolii ATCC 12287, ATCC

809 550/336

14537 oder B 26-9-PY-5 (hinterlegt beim Institut für angewandte Mikrobiologie der Universität Tokio) in Form einer Kulturflüssigkeit einsetzt.

Die unter denselben Fermentationsbedingungen wie zu Tabelle I mit den gemäß Erfindung verwendeten Pseudomonas-trifolii-Stämmen durchgeführten Versuche der Tabelle II zeigen die gegenüber dem vorbekannten Verfahren erzielte Ausbeutesteigerung an L-Asparaginsäure und Erhöhung der L-Asparaginsäurekonzentration im Kulturmedium auf etwa das Zwei- bis Dreifache der des Verfahrens der französischen Patentschrift. Hierdurch wird die Aufarbeitung erleichtert.

Tabelle II

Beispiel	Mikroorganismen	L-Asparaginsäure- konzentration in der Reaktionsmischung (g/100 ecm)	Ausbeute (%)	Für die L-Asparagin- säurebildung benötigte Zeit (Stunden)
1 2 3 4 5 6	Ps.trifolii ATCC 14537 Ps.trif olii ATCC 14537 Ps.trifolii ATCC 14537 Ps.trifolii ATCC 14537 Ps.trifolii ATCC 12287 Ps.trifolii B 26-9-PY-5	8,6 5,7 10,0 13,5 4,8 8,3	100,3 100,4 87,4 98,0 55,8 99,0	18 + 24 18 + 25 18 + 45 18 +48 18 + 23 18 + 23

Zur Verfahrensdurchführung wird ein Kulturmedium üblicher Zusammensetzung des jeweils eingesetzten Pseudomonas-trifolii-Stammes mit Fumarsäure und Ammoniak gemischt, sodann unter etwa neutralen Bedingungen stehengelassen und nach Beendigung der Fermentation die gebildete L-Asparaginsäure isoliert.

Eine gute Kultur der gemäß Erfindung eingesetzten Pseudomonas-trifolii-Stämme läßt sich in einfacher Weise aus einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung (mit Lieferanten für Kohlen- und Stickstoff, den wesentlichen Mineralien und einigen Wachstumsfaktoren) im pH-Bereich von 6 bis 8 bei 15 bis 40⁰C unter aeroben Bedingungen herstellen.

Bei der eigentlichen biotechnischen L-Asparaginsäureherstellung handelt es sich um eine Enzymreaktion.

In Tabelle III ist die Fähigkeit der gemäß Erfindung eingesetzten Pseudomonas-trifolii-Stämme ATCC 12287, ATCC 14537 und B 26-9-PY-5, aus Fumarsäure L-Asparaginsäure zu bilden, mit der anderer Mikroorganismen verglichen.

Die Versuche wurden in folgender Weise durchgeführt: 5 ecm Kulturmedium des jeweiligen Bakteriums wurden 5 ecm Diammoniumfumaratlösung zugegeben, die 5 g/100 ecm Fumarsäure enthielt, der pH-Wert der Mischung auf 7 eingestellt und die Fermentation 48 Stunden bei 37° C durchgeführt. Zur Bestimmung des Bakterienwachstums wurde das Absorptionsvermögen des Kulturmediums bei einer Wellenlänge von 562 ηιμ gemessen.

Tabelle III

Bakterien

akterien- achstum	Restliche Fumarsäure	%	Menge gebildeter L-Asparaginsäure	Molprozent
CL\^11O LUJIlX	g/100 ecm	28	g/100 ecm	1,9
0,449	1,4	68	O₃H	2,2
0,361	3,4	68'	0,13	20,0
0,127—		'- -70	1,15	9,2
0,449	3,5 " "	20	0,53	7,8
0,650	1,0	10	0,45	54,0
0,418	0,5	10	3,09	39,7
0,283	0,5	34	2,28	3,3
0,388	1,7	34	0,19	0,7
0,310	1,7	18	0,04	5,7
0,545	0,9	24	0,33	8,7
0,648	1,2	20	0,50	0,3
0,409	1,0	70	0,02	7,3
0,183	3,5	66	0,42	1,1
0,591	3,3	36	0,06	0,2
0,309	1,8	28	0,01	1,9
0,562	1,4	4	0,11	100,8
0,458	0,2	4	5,74	97,9
0,412	0,2	4	5,56	101,2
0,401	0,2	5,76

Bacillus megatherium B-9-1

Escherichia coli K-12

Aeromonas hydrophila NRRL B-909 ...

Serratia marcesens B 181/1

Pseudomonas aeruginosa IFO 3455

Aerobacter aerogenes ATCC 7256

Proteus vulgaris HX-19

Bacillus subtilis NRRL B-558

Micrococcus flavus ATCC 400

Alcaligenes faecalis ATCC 101

Pseudomonas olevorans ATCC 8062

Staphylococcus aureus 209

Erwinia carotovora IFO 3308

Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 ...

Corynebacterium equi B-271-1

Brevibacterium helvolum ATCC 11822..

Pseudomonas trifolii ATCC 14537

Pseudomonas trifolii ATCC 12287

Pseudomonas trifolii ATCC B 26-9-PY-5

5 6

Tabelle III ist zu entnehmen, daß die gemäß Erfin- Glucose 20 g

dung eingesetzten Pseudomonas-trifolii-Stämme in Mieki* 10 ecm

hervorragendem Maße die Fähigkeit haben, auf j^tt dq ι

Grund des von den eingesetzten Pseudomonas-trifolii- * ⁴ ' ""' ^

Stämmen entwickelten Aspartaseaktivität Fumar- 5 MgbU₄-7H₂U ü,l g

säure in !--Asparaginsäure überzuführen. Mit Wasser aufgefüllt auf 11

Die enzymatische Reaktion, d. h. die Stufe, die aus *> _{Mieki ist die} Handelsbezeichnung für Sojabohnenhydrolydem Kulturmedium der eingesetzten Pseudomonas- sat und enthält 2,4 g Gesamtstickstoff in 100 ecm.
trifolii-Stämme, Fumarsäure und Ammoniak bestehende Mischung stehenzulassen, wird im pH-Bereich io ein Kulturmedium hergestellt und nach Einstellung von 7 bis 9 und im Temperaturbereich von 25 bis des pH-Wertes auf 7,0 bei 110⁰C sterilisiert.
50⁰C durchgeführt. Das Reaktionssystem besteht aus Danach wurde das Medium mit dem Stamm Fumarsäure oder deren Salzen, Ammoniak oder Pseudomonas trifolii ATCC 14537 beimpft, der Ammoniumsalz und dem Kulturmedium der Pseudo- 24 Stunden in einem Bouillon-Agar-Medium kultimonas-trifolii-Stämme. Schütteln oder Belüftung ist 15 viert worden war, sodann die Kultivierung 18 Stunden nicht notwendig. bei 3O⁰C durchgeführt, wobei der pH-Wert durch

Bei der enzymatischen Reaktion beträgt die opti- automatische Zufuhr von Ammoniakgas auf 7,0

male Fumarsäurekonzentration etwa 4 bis 40 g/ gehalten wurde. Nach 18 Stunden erreichte das Bak-

100 ecm der gesamten Reaktionsmischung. Zugabe terienwachstum seinen Höhepunkt. Die im Medium

von Fumarsäure im Überschuß verlängert die Reak- 20 enthaltene Glucose wurde vollständig verbraucht,

tionsdauer. Wird die Fumarsäure dem Kulturmedium Auf die Herstellung des Kulturmediums folgte die

der gemäß Erfindung eingesetzten Pseudomonas- enzymatische Reaktion zur Bildung der L-Asparagin-

trifolii-Stämme zugesetzt, geht die Enzymaktivität säure. Eine wäßrige Lösung von Diammonium-

wegen der Erniedrigung des pH-Wertes verloren. fumarat, hergestellt aus 150 g Fumarsäure und

Daher sollte die Fumarsäure vorsichtig und zusammen 25 175 ecm 28%ige^r wäßriger Ammoniaklösung, die

mit basischen Reagenzien, wie Ammoniak oder Alkali, auf 11 verdünnt worden war, wurde mit 1 1 des

zugegeben werden, um den geeigneten pH-Wert des Kulturmediums von Pseudomonas trifolii ATCC

Reaktionssystems aufrechtzuerhalten. Diammonium- 14537 vermischt, das in der weiter oben angegebenen

fumarat ist für die Reaktion der Vorzug zu geben. Weise gewonnen worden war. Der pH-Wert der

Als Aminodonatoren werden bei der enzymatischen 30 erhaltenen Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und die Reaktion Ammoniak oder Ammoniumverbindungen, Lösung ohne Schütteln oder Belüftung 24 Stunden wie wäßrige Ammoniaklösung, Ammoniumchlorid, inkubiert. Die während der Inkubation angereicherte Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, verwendet, L-Asparaginsäure betrug zum Schluß 8,6 g/100 ecm. von denen Ammoniakgas oder wäßrige Ammoniak- Die gebildete L-Asparaginsäure war — wie mikrolösungen bevorzugt werden, da sie keine Anionen 35 biologische Untersuchungen ergaben — 100,3 Molhaben, die die Isolierung der gebildeten Asparagin- prozent des zugeführten Diammoniumfumarats äquisäure hindern. Wäßrige Ammoniaklösungen sowie valent.

Ammoniakgas können sowohl als Neutralisations- Die Reaktionslösung wurde mit Salzsäure auf pH 4

mittel als auch als vorteilhafter Aminodonator ver- angesäuert, mit Aktivkohle entfärbt, das dabei erhal-

wendet werden. 40 tene klare Filtrat im Vakuum konzentriert, auf pH 2,8

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die enzy- eingestellt und über Nacht im Eis stehengelassen,

matische Reaktion unter anaeroben Bedingungen wobei sich Kristalle abschieden, die abfiltriert und

durchzuführen, da Schütteln und Belüften die getrocknet wurden. Sie betrugen 126 g (73,4% der

L-Asparaginsäureausbeute vermindern. Theorie). Die Elementaranalyse und Bestimmung der

Die enzymatische Reaktion dauert etwa 20 bis 45 optischen Drehung ergab, daß es sich um L-Asparagin-

100 Stunden. Die Reaktionslösung enthält die L-Aspa- säure handelte,

raginsäure in einer Konzentration von 5 bis 40 g/

100 ecm.

Die Isolierung der L-Asparaginsäure aus der Reak-

tionsmischung kann nach bekannten Methoden erfol- 50 stickstoff nach
gen. So wird z. B. die Lösung zur Abtrennung der Kjedahl.

Bakterienzellen zentrifugiert und die erhaltene klare,

Gefunden 10,51%

24,5°

Berechnet

10,53% 24,6°

überstehende Flüssigkeit konzentriert.

Dann wird das Konzentrat bis zum isoelektrischen . .

Punkt der L-Asparaginsäure angesäuert (auf einen 55 eispielz

pH-Wert von etwa 2,5 bis 3,5) und die ausgefallene 660 ecm eines Kulturmediums von Pseudomonas

kristalline L-Asparaginsäure gesammelt. Mehr als trifolii ATCC 14537, das in der im Beispiel 1 ange-

85% der gesamten in der Reaktionsmischung erhal- gebenen Weise hergestellt worden war, mischte man

tenen L-Asparaginsäure können in erster Fällung mit 1340 ecm wäßriger Diammoniumfumaratlösung,

isoliert werden. Die restliche L-Asparaginsäure kann 60 die 100 g Fumarsäure enthielt, stellte die Mischung

aus der Mutterlauge durch Konzentration und Küh- auf pH 7,4 ein und führte bei 37⁰C 25 Stunden die

lung gewonnen werden. Inkubation durch. Die bei Reaktionsende angereicherte L-Asparaginsäure war 100,4 Molprozent der

Beispiel 1 zugesetzten Fumarsäure äquivalent.

Zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Pseudo- Beispiel 3

monas-trifolii-Stämme wurde aus den folgenden Sub- 11 eines Kulturmediums von Pseudomonas trifolii

stanzen: ATCC 14537, hergestellt in der im Beispiel 1 ange-

gebenen Weise, mischte man mit 11 wäßriger Diammoniumfumaratlösung, die 200 g Fumarsäure enthielt, stellte die Mischung auf pH 7,4 ein und führte bei 37 ⁰C 45 Stunden die Inkubation durch. Die L-Asparaginsäureausbeute war 87,4 Molprozent der zugesetzten Fumarsäure äquivalent.

Beispiel 4

120 g Fumarsäure wurden in 400 ecm Wasser suspendiert und mit 140 ecm 28%ig^er wäßriger Ammoniaklösung in Lösung gebracht. Sodann fügte man 350 ecm eines Kulturmediums von Pseudomonas trifolii ATCC 14537, das in der im Beispiel 1 angegebenen Weise hergestellt worden war, der Diammoniumfumaratlösung zu, führte die Inkubation der Mischung 16 Stunden bei 37°C durch, stellte die Mischung auf pH 7,5 ein, verdünnte mit Wasser auf 11 und setzte die Inkubation 48 Stunden bei 37 ⁰C fort. Die gesamte Fumarsäure wurde in L-Asparagin- a° säure übergeführt, und die Reaktionslösung enthielt die L-Asparaginsäure in einer Menge, die 98 Molprozent — auf die eingesetzte Fumarsäure bezogen — entsprach. Die Mischung wurde auf 0,51 konzentriert und mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2,8 angesäuert, wobei 150 g rohe, kristalline Asparaginsäure erhalten wurde, die 83% ^-Asparaginsäure enthielt und deren Hauptverunreinigungen Ammoniumchlorid, Bakterienzellen und deren Bruchstücke waren. Andere Aminosäuren als L-Asparaginsäure wurden jedoch nicht gefunden. Durch Umkristallisation wurden aus den Rohkristallen 115 g reine L-Asparaginsäure gewonnen, was 84 Molprozent — auf die zugesetzte Fumarsäure bezogen — äquivalent war. Die Analysendaten und der Wert der optischen Drehung der erhaltenen Kristalle stimmten befriedigend mit denen der L-Asparaginsäure überein.

Beispiel 5

11 eines Kulturmediums von Pseudomonas trif olii ATCC 12287 wurde in der im Beispiel 1 beschnebenen Weise hergestellt, 150 g Fumarsäure und 175 ecm 28%ige Ammoniumhydroxydlösung wurden gemischt und mit Wasser auf 11 aufgefüllt. Das Kulturmedium wurde der Mischung zugegeben, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und die Reaktion 23 Stunden bei 37⁰C durchgeführt. Der Gehalt an L-Asparaginsäure in der Reaktionslösung betrug 4,8 g/100 ecm, wie die biologische Bestimmung ergab.

Beispiel 6

Nach der im Beispiel 1 angegebenen Weise wurde ein Kulturmedium von Pseudomonas trifolii, Stamm No. B 26-9-PY-5, hergestellt, 11 des Mediums mit 11 Diammoniumfumaratlösung gemischt, die wie im Beispiel 1 angegeben hergestellt worden war, der pH-Wert der Mischung auf 7,0 eingestellt und die Inkubation 23 Stunden bei 37° C durchgeführt. Man erhielt 8,3 g/100 ecm L-Asparaginsäure.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Asparaginsäure, bei dem man Mikroorganismen bei nahezu neutralem pH-Wert in Gegenwart von Ammoniumverbindungen auf Fumarsäure und/ oder Fumarat einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas trifolii ATCC 12287, ATCC 14537 oder Pseudomonas trifolii B 26-9-PY-5, bei dem Institut für angewandte Mikrobiologie der Universität Tokio hinterlegt, in Form einer Kulturfiüssigkeit einsetzt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Französische Patentschrift Nr. 1 248 130.

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