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Verfahren zur fermentativen Herstellung von Itaconsäure durch submers-aerobe
Schimmelpilzgärung Für die Gewinnung von Itaconsäure, die zunehmendes Interesse
für die Erzeugung polymerer Massen, Kunstharzprodukten, Anstrichen, Weichmachern
usw. findet, wurden bereits verschiedene Gärverfahren mit Hilfe von Schimmelpilzen
der Gruppe Aspergillus vorgeschlagen. Insbesondere ausgewählte Stämme von A. terreus
und A. itaconicus erwiesen sich als geeignet für diese Gärung. Als Rohmaterial für
die industrielle Gärung wurden der Reihe nach Glucose, Stärkezucker, Rohrzucker
und schließlich VMelassen vorgeschlagen. Zudem ist man von der Oberflächentechnik
auf die submerse Gärungsform übergegangen.
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Die Wahl der Rohmaterialien richtet sich nach wirtschaftlichen Erwägungen.
Die bisher bekanntgewordenen Verfahren waren auf die Eigenheiten der einen oder
anderen Rohstoffquelle abgestellt, so daß ein Wechsel nur auf Grund neuer Forschungen
und Umstellungen möglich war. Die bisher vorgeschlagenen Submersmethoden verwenden
überwiegend getrennt vorgezüchtetes Mycel, das nach genügender Entwicklung mit der
Hauptmenge der Kohlehydratlösung, der eigentlichen Gärmaische, vereinigt wird. Hierbei
wurden jeweils die optimalen Gärbedingungen, die vom verwendeten Organismus und
von der eingesetzten Kohlehydratquelle abhängen und das pH, die Temperatur, die
Konzentration, die Nährsalze, die Rührgeschwindigkeit usw. betreffen, von Fall zu
Fall festgelegt. Aus diesen Gründen zeigen diese Bedingungen starke Abweichungen
voneinander. Zur Sauerstoffversorgung dieser stark aeroben Gärungsform bediente
man sich getrennter Rühr- und Belüftungseinrichtungen unter atmosphärischem oder
erhöhtem Druck, was kostspielige und infektionsanfällige Apparaturen erfordert.
Die portionsweise Arbeit in der Art sogenannter »Abstellgärungen« bringt alle, aus
anderen Gärungszweigen bekannten Schwierigkeiten mit sich und liefert geringere
und unsichere Ausbeuten. So z. B. bedeutet eine steckenbleibende Gärung wegen Stromausfall
oder aus anderen Gründen der Verlust der gesamten Kohlehydratmenge, da sie von Anfang
an zugegeben wurde.
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In der USA: Patentschrift 2 385 283 beschreiben J. H. Kane, A. C.
Finlayund P. F. Amann ein Verfahren zur Gewinnung von Itaconsäure durch submerse
Vergärung von »high test« Melasse- und Zuckerlösungen unter Zugabe von Salzen mit
Hilfe ausgewählter, aber nicht näher definierter Stämme von Myxomyceten, Schizomyceten
und Eumyceten, insbesondere von Aspergillus terreus. Es werden in 1 bis 2 Wochen
dauernden Gärungen, die .direkt mit Sporen beimpft werden, Ausbeuten von 24,5 bis
27,7 % Itaconsäure, bezogen auf eingesetzten Zukker, erhalten.
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Die USA.-Patentschrift 2462981 von L. B. Lockwood und A. J.
M o y e r schützt ein Verfahren zur Itaconsäureerzeugung aus Glucoselösungen, die
mit ungiftigen Mineralsäuren angesäuert und mit Ammonsalzen in derartigen Mengen
versetzt wurden, daß während der Gärung ein pH von 1,4 bis 2,4 erhalten bleibt.
Die Gärungen werden mit Hilfe der Organismen A. terreus NRRL 265 und 1960 durchgeführt,
und es wird unter anderem Schutz für die Belüftung unter überdruck begehrt. Auch
hier werden die Gärungen direkt mit Sporen beimpft. Es werden in 8 bis 11tägigen
Gärungen Ausbeuten von 20,5 bis 32,5 % erhalten und zwar: in 11tägiger Oberflächenkultur
32,5 %, in 8tägiger Submerskultur 21,0 %, in 8tägiger Schüttelkultur 20,50/0.
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Die USA: Patentschrift 2 657173 von V. F. P f e i -fer, G. E. N: Nelson,
Ch. Vojnovich und L. B. Lockwood beinhaltet ein submerses Gärverfahren unter Verwendung
nicht näher definierter Stämme von A. terreus und A. itaconicus: Es werden mit Hilfe
von in 2 Tagen vorgezüchtetem Mycel Stärkezuckerlösungen, die nicht mehr als 7 %
vergärbare Kohlehydrate enthalten dürfen und mit Säuren, vorzugsweise Itaconsäure,
angesäuert wurden, submers unter überdruck in 3 bis 6 Tagen (samt Vorzüchtung in
5 bis 8 Tagen) vergoren. Es werden Ausbeuten von 61 bis 65 % Itaconsäure erhalten.
Versuche
in halbindustriellem Maßstab nach dem gleichen Verfahren werden auch in lud. Eng..
Chem., 44 (1952), 2975 bis 2980, ausführlich beschrieben.
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Weiter ist aus der deutschen Auslegeschrift 1086 654 ein Verfahren
zur Herstellung von Itaconsäure bekannt, bei dem unter. Einsatz von A. itaconicus
unbehandelte Melasselösungen_ mit Konzentrationen von 15 bis 20 % und einem Stickstoffsubstanzgehalt
von 0,1 bis 0,5 % Ausbeuten -an Itaconsäure bis 60,5 %, bezogen auf eingesetzten.
Zucker, in 91/2 Tagen (21/z Tage Vorzüchtung -@ 7 Tage Gärung) erhalten werden.
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M. B u e n d i a und J. M. G a r r i d o berichten in Rev. cienc.
apl., 12 (1958), 481 bis 495 (referiert in Chem. Zentrbl., 132, 8867, und in Chem.
Abstr., 53, 19 290) ausführlich über die Versuche zur mikrobiologischen Herstellung
von Itaconsäure mit Hilfe von A. terreus NRRL 1960 und - ATCC 10020 in 13 Versuchsreihen
mit Oberflächentechnik auf gemischten Kulturmedien aus Jöhannisbrotextrakten und
ferrocyanidbehandelten Melassen (bis 10.% Melassezusatz), wobei in 8 bis 16 Tagen
Ausbeuten von 62,9 0/0 erhalten werden. Die gleichen Autoren veröffentlichten-in
Rev. cieric. apl., 13 (1959); 23 bis 33 (referiert in Chem. Zentrbl.,132, 8867,
und in Chem. Abstr., 54, 14569), eine Arbeit über -die Aussichten der industriellen
Herstellung von- Itaconsäüre mit Hilfe-von -A. terreus NRRL 1960 aus Invertzucker
und Glucose: Es-werden die Vorteile der-Submerstechnik betont und 11 Versuchsreihen
.in, Schüttelkultur mit verschiedenen Kohlehydratquellen `veröffentlicht. Es wurden
ih' 7 bis 10 Tagen mit vorgezüchtetem Mycel Ausbeuten bis 64;2 0/0, bezogen auf
verbrauchten - (nicht . eingesetzten), Zucker - .erhalten.
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Es wurde ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Itaconsäure
durch submers-aerobe Schimmelpilzgärung unter Zulauf von mit Ferrocyanid und/öder
--Kationenaustäuschern vorbehandelten- Köh1ehydratl'ösungen entwickelt; das dadurch
gekennzeichnet ist, .daß man in der Wachstumsphase einen Ferrocyanidgehalt von 5'bis-
50 mg/1 und in der Itaconsäurebildungsphase einen Ferrocyanidgehalt von weniger
als 5 mg/1 einhält und den Zulauf der Kohlehydratlösung auf einen Zuckergehaft von
10 bis 40 g/1; - vorzugsweise 15 bis - 20 g/1, in der Fermentationsflüssigkeit .einstellt.
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Dieses Verfahren bedeutet gegenüber den bisher bekanntgewordenen Methoden
einen technischen Fortschritt, da es unter anderem bei höchsten Ausbeuten eine wesentliche
Gärzeitverkürzung mit sich bringt: Die Gesamtgarzeit, einschließlich der Wachstumsphase,
beträgt nur 1 bis 71/2 Tage gegenüber den üblichen 2 -I= 7 =.9 Tagen, was eine Gärzeitverkürzung
um rund 30 °/0 bedeutet. Weiter ist dieses Verfahren generell auch 'für bekannt
schwer zu verarbeitende Rohmaterialien, wie z. B. Rohrmelassen, anwendbar und ist
nicht- auf einen streng definierten Aspergillusstamm beschränkt. Jeder zur Itaconsäurebildung
befähigter Aspergillusstamm kann Verwendung finden, sofern man die stamm eseigentümlichen
Erfordernisse hinsichtlich Nährsalze, pH, Temperatur usw. beachtet: Ein weiterer
Vorteil dieses Verfahrens liegt in dem Umstand, daß eine Mycelvorz_üchtung in einer
getrennten Gärung entfällt.
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Es wurde gefunden, daß für die Itaconsäuregärung nicht nur - wie bekannt
- schädliche Schwermetalle durch bewährte Methoden (Ferrocyanidbehandlung, Entkationisierung-
durch <Ionenaustäuscher) entfernt werden müssen, sondern däß zur Erzielung eines
geeigneten und gärkräftigen Mycels in der Wachstumsphase ein bestimmtei, vom Aspergillusstamm
abhängiger .Ferroeyanidgehalt in der Maische zweckdienlich ist.: Überraschenderweise
ist dieser Überschuß aber iii der Itacönsäürebildungsphase hinderlich, woraus sich
die technische Lehre ergibt,- daß der Ferrocyanidgehalt im richtigen Moment durch
geeignete Maßnahmen, vorzugsweise durch Zugabe berechneter Mengen löslicher, ionisierter
Zink- oder Kupfersalze bis auf einen analytisch gerade noch nachweisbaren Rest gesenkt
werden muß.
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Weiter hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Hauptmenge der zu
vergärenden Kohlehydrate nicht auf einmal zuzugeben, sondern in der Art eines aus
anderen Gärungen bekannten Zulaüfverfahrens schubweise: oder kontinuierlich. zuzugeben.
Es -war dabei .die Frage- zu lösen; von welchem Faktor die Zulaufgeschwindigkeit
abhängig gemacht werden muß. Wird nämlich der Zuckerspiegel der Maische, ählich
wie bei bekannten Gärverfahren, sehr niedrig,- fast beim Minimum gehalten, so, führt
diese Maßnahme bei der Itaconsäuregährung zu keinen brauchbaren Resultaten. -Erfindungsgemäß
verläuft die Gärung gut und zügig, wenn man den Zulauf so regelt; daß in der Maische
ständig;10' bis 40 g,- vorzugsweise ' 15 bis '20'9, Zucker je Liter vorhanden sind.
Gleichzeitig muß. ein PH-Wert, der- von der Art des'verwendeten Rohmaterials abhängt,
eingehalten werden. Praktisch geht man dabei so vor, daß man, nach Erreichung einer
-guten Umwandlungsgescwindigkeit den gerade vorhandenen Zuckergehalt bestimmt und
jetzt die- weitere Kohlehydrafzugabe .nach der gebildeten, -.stündlich titrierbaren
Säure berechnet. Man weiß, d'aß-für die Bildung-von 1- kg Itaconsäure ungefähr
.1,3 bis 1,4 kg Zucker rforderlich sind, und man berechnet auf Grund dieses Verhältnisses
die Menge des Zuckers, der in der nächsten Stunde zulaufen muß, um immer beim gleichen
Zuckerspiegel in der Maische zu bleiben. Bei Verwendung stark gepufferter Rohstoffe,
wie z. B. Melasselösungen, muß dabei zusätzlich das. pH in der Gärbrühe beachtet
werden.
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Es hat sich für die Durchführung dieses Verfahrens als besonders vorteilhaft
erwiesen, die Belüftung mit rotierenden Feinstbelüftern des Systems V o g e 1-b
u s c h vorzunehmen.
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Die praktische Durchführung des Verfahrens gestaltet sich so, wie
es aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich ist.
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Beispiel 1 100 kg Rübenmelasse mit einem Zuckergehalt von 48 % werden
auf 300 1 (160 g Zucker je Liter) verdünnt und nach einer der bekannten Methoden
geklärt. Besonders vorteilhafterweise bedient man sich der alkalischen Kochmethode,
wie sie -in der deutschen Patentschrift 972 034 beschrieben ist. Die erhaltene Melasselösung
wird mit einer anorganischen Säure oder mit Itaconsäure, vorzugsweise mit Mutterlauge
von der Kristallisation, auf pH 6,0 bis 6,5 eingestellt, sterilisiert und noch heiß
mit so viel Kaliumferrocyanid versetzt, daß nach einstündigem Stehen in der filtrierten
Lösung noch mindestens 5 mg Ferrocyanid je Liter nachweisbar -sind. Diese
Kaliumferrpcyunidmenge
wird. durch Vorversuch ermittelt. Der zehnte Teil dieser Vorratslösung (301) wird
in das 600.1 fassende, mit Vogelbuschbelüftung, Kühlvorrichtung und den üblichen
Apparaturen, ausgestattete Gärgefäß gebracht, mit . sterilem Wasser auf ein Volumen
von 1301 (37 g Zucker je Liter) verdünnt, mit 20 g Diammoniumphosphat, 100 g Ammoniumsulfat
und 50g Magnesiumsulfat versetzt, das pH durch Mineralsäurezusatz auf 5,5 reduziert
und auf Gärtemperatur eingestellt. Es werden jetzt noch 3,5 g Kaliumferrocyanid
in Form einer 10o/oigen Lösung zugegeben, so daß die Gärlösung jetzt ungefähr 28
mg Ferrocyanid je Liter enthält. Diese Gärlösung wird mit Sporen von A. terreus
ATCC 10020 in einer solchen Menge beimpft, daß eine Sporendichte von 10s bis 104/m1
erhalten wird. Die Vogelbuschbelüftung wird in Gang gesetzt, und es wird durch 48
Stunden mit allmählich von 0,8 bis 1,5 Nm3 Luft je Stunde steigend belüftet. Nach
dieser Zeit haben sich kompakte Mycelaggregate gebildet, und das pH ist auf 3,0
gefallen. Die Titration ergibt einen Wert, der 15 g Itaconsäure je Liter entsprechen
würde, und der Zuckergehalt ist auf 11 g/l gefallen. Jetzt werden 3 g Zinksulfat
in Lösung zugesetzt und in einer filtrierten Probe noch geringe Mengen, weniger
als 5 mg/l, Ferrocyanid nachgewiesen. Es wird mit dem Zulauf der restlichen Melasselösung
begonnen, der so geregelt wird, daß der Zuckergehalt sich bei 15 bis 20 g/1 hält
und das pH einen Wert von 3,2 nicht übersteigt. Die Belüftung wird hierbei allmählich
bis auf 6 Nm3/h gesteigert und durch Kühlung eine Temperatur von 33 bis 35° C eingehalten.
Nach 5 Tagen ist die ganze Melasselösung verbraucht, und die Gärung wird nach 12
Stunden Nachbelüftung mit 3 Nm3/h abgestellt. Statt der insgesamt eingefüllten 4001
finden sich im Gärgefäß infolge von Verdunstungsverlusten noch 3601, die folgende
Analysenresultate ergeben:
| Itaconsäure vorhanden durch Titration . 32,9 kg |
| Itaconsäure durch Bromierung . . . . . . . . 31,3 kg |
Diese Ausbeute entspricht 65,2 % auf eingesetzten Zucker oder 85,5 % der Theorie.
Beispiel 2 Technischer Stärkezucker wird in heißem Wasser gelöst und die Lösung
auf einen Glucosegehalt von 160g/1 eingestellt. Diese Lösung wird über einen Kationenaustauscher
des Typs Dowex 50 oder einen ähnlichen geleitet. 3001 dieser Lösung, enthaltend
48 kg Glucose, werden sterilisiert und steril aufbewahrt. 301 werden in das im Beispiel
1 verwendete Gefäß gebracht, durch Zusatz entkationisierten, sterilen Wassers auf
1301 verdünnt, das pH wird auf 2,5 eingestellt, und es werden folgende Nährsalze
zugegeben: 250g Ammoniumsulfat, 20g Kaliumammoniumphosphat, 100g Magnesiumsulfat,
65g
Hefeextrakt.
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Zum Schluß setzt man noch 4,5g Kaliumferrocyanid zu, und die Kontrolle
ergibt in der filtrierten Probe einen Gehalt von 31 mg Ferrocyanid je Liter. Es
wird mit Sporen von A. terreus ATCC 10020 beimpft und so weiter verfahren, wie im
Beispiel 1 angegeben. Der Zulauf wird ohne Rücksicht auf das pH so geregelt, daß
der Glucosegehalt zwischen 15 und 20 g/1 bleibt. Der Zulauf dauert 1/z Tag länger,
und am Ende liegen 3501 Gärbrühe vor, die folgende Analysenresultate ergeben:
| Itaconsäure durch Titration ..... 30,1 kg |
| Itaconsäure durch Bromierung : : . 28;8,kg |
Dies entspricht einer Ausbeute von 60 % auf eingesetzte Glucose oder 83 % der Theorie.
Beispiel 3 Durch alkalische Kochung, Klärung, Ansäuern mit Mineralsäure und Behandlung
mit Kaliumferrocyanid waren 5250 ml steriler Rübenmelasselösung von pH 6,1 gewonnen
worden, die 829,5 g Zucker und überschüssiges Ferrocyanid in einer Menge von 22
mg/1 enthielten. In einem Laborgärgefäß von 101 mit Vogelbuschbelüftung wurden 1800
ml Sterilwasser vorgelegt, dem 500 ml der sterilen Melasselösung und die üblichen
mineralischen Nährsalze zugegeben wurden. Das pH der Mischung wurde mit Salzsäure
auf pH 5,5 eingestellt und die Lösung mit 9,5 ml einer Sporensuspension, die 8 -
106 Sporen von A. terreus NRRL 265 enthielt, bei 34° C beimpft. Durch Zugabe
von 10o/oiger Ferrocyanidlösung wurde ein Ferrocyanidspiegel von 30 mg/1 eingestellt.
Die Belüftung wurde mit 251 Luft je Stunde begonnen und .im späteren Verlauf bis
auf 3001/h gesteigert. 45 Stunden nach der Beimpfung war das pH auf 3,0 gefallen
und der Zuckergehalt von dem ursprünglichen Gehalt von 33 g/1 auf 12 g/1 zurückgegangen.
Der Ferrocyanidspiegel wurde durch Zugabe von Zinksulfatlösung auf 5 mg/1 gesenkt
und mit dem Zulauf der verbliebenen 3450 ml Melasselösung begonnen. Während der
Gärung wurde der Ferrocyanidspiegel durch Zugabe von geringen Mengen Kaliumferrocyanid
immer wieder auf einen Wert von 5 mg/1 eingeregelt. Nach 120 Stunden war der Zulauf
beendet, es wurde durch 12 Stunden nachbelüftet und die Gärung dann abgebrochen.
Die Analyse von vier Parallelversuchen ergab Titrationswerte von 560 bis 580 g Itaconsäure
je Versuch und Bromierungswerte von 510 bis 550 g Rein-Itaconsäure, was Ausbeuten
von 61,6 bis 66,2 % auf eingesetzten Zucker entspricht.
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Für die Durchführung des geschilderten Verfahrens ist es unwesentlich,
ob für die Sterilisierung und Nährsalzzugabe irgendeine andere abweichende Arbeitsweise
(z. B. Nährsalzzugabe schon vor der Sterilisation oder Sterilisation im Gärgefäß
selbst oder getrennte Zubereitung der Kohlehydratlösungen für die Wachstums- und
Säuerungsphase) eingehalten wird.