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Verfahren zur Gewinnung von fermentativ nicht spaltbaren, in organischen
Lösungsmitteln löslichen Inhaltsstoffen aus Pflanzen Die Erfindung bezieht sich
auf ein Verfahren zum Extrahieren von fermentativ nicht spaltbaren, in organischen
Lösungsmitteln löslichen Inhaltsstoffen aus Pflanzen, gemäß welchem Enzyme, die
durch zur Gattung Trichoderma gehörende Pilze erzeugt werden, auf ein pflanzliches
Material zur Einwirkung gebracht werden, um hochmolekulare Stoffe, wie Cellulose,
Hemicellulose, Pektin, Protein und Alginsäure, in der Pflanzenstruktur aufzulösen
oder zu zersetzen, um so die Pflanzenstruktur zu zerstören und das Extrahieren der
gewünschten pflanzlichen Stoffe zu erleichtern.
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Die zur Gattung Trichoderma gehörenden Pilze erzeugen Enzyme, welche
die vorgenannten hochmolekularen Stoffe zersetzen, welche Pflanzen aufbauen, wie
Cellulase, Hemicellulase, Pektinase, Alginase und Protease. Daher können Kulturen,
Filtrate von Kulturen, Extrakte und enzymhaltige Pulver, welche sich aus den Extrakten
absetzen, mit guter Wirkung zu diesem Zweck benutzt werden.
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Außer den Pilzen, die zur Gattung Trichoderma gehören, sind einige
wenige Stämme bekannt, die Enzyme der vorstehend erwähnten Art erzeugen. Die von
ihnen erzeugten Enzyme sind jedoch schwächer als die Enzyme, die von den zur Gattung
Trichoderma gehörenden Pilzen erzeugt werden, soweit es sich um die auflösende oder
zersetzende Wirkung auf natürliche pflanzliche Strukturen handelt, so daß also diese
Enzyme für den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht geeignet sind. Beispielsweise
ist ein in Amerika hergestelltes, im Handel erhältliches Cellulasepräparat, das
sich von Aspergillus niger ableitet, zur Vorbehandlung für die Extraktion pflanzlicher
Stoffe verwendet worden; es wurden aber hierbei keine besseren Wirkungen erzielt
als bei der üblichen Extraktionsmethode ohne Anwendung eines Enzyms.
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Als Pilze, die zur Gattung Trichoderma gehören und für die vorliegende
Erfindung verwendet werden, können genannt werden: Trichoderma koningi, Trichoderma
viride und Trichoderma lignorum.
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Bisher ist die Extraktion der gewünschten pflanzlichen Stoffe meistens
durchgeführt worden nach einer Methode gemäß welcher ein pflanzliches Material,
wie es in der Natur vorkommt oder nach dem Trocknen, in feine Stückchen zerschnitten
und der Extraktion mit Wasser oder einem organischen Lösungsmittel unterworfen wurde,
um die gewünschten Bestandteile zu gewinnen.
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Bei diesem Verfahren dringt das Extraktionsmittel in die Pflanzenstruktur
von der Außenfläche der genannten feinen pflanzlichen Teile ein und löst die gewünschten
Komponenten, die aus der Struktur des Pflanzenmaterials infolge Diffusion austreten
und extrahiert werden. Im allgemeinen ist die erforderliche Zeit für das Eindringen
und für die Diffusion so lang, daß bei Anwendung der obenerwähnten gewöhnlichen
Extraktionsmethode ein beträchtlicher Zeitraum für die Extraktion erforderlich ist.
Mit der Absicht, die Geschwindigkeit der Penetration und der Diffusion zwecks Verringerung
der Extraktionszeit zu erhöhen, sind bei der Extraktion Maßnahmen, wie Erwärmen
und Rühren, angewandt worden. Bei der Diffusion bewegt sich der gelöste Stoff immer
von der hohen Konzentration zur niedrigen Konzentration. Da bei der obenerwähnten
Extraktionsmethode Diffusion angewendet wird, ist die Konzentration der gewünschten
Komponenten in der Pflanzenstruktur immer höher als diejenige der genannten Ingredienzien
in dem aus dem Pflanzenmaterial abgetrennten Lösungsmittel. Es ist daher bei einer
solchen Arbeitsweise prinzipiell unmöglich, die gewünschten Komponenten vollständig
zu extrahieren.
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Um das Maß der Extraktion zu erhöhen, müßte die Extraktion wiederholt
werden.
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Ein Problem bei der üblichen Extraktionsmethode besteht ferner darin,
daß im Falle der Anwendung eines organischen Lösungsmittels als Extraktionsmittel
das Pflanzenmaterial notwendigerweise vor der
Extraktion getrocknet
werden muß. Wenn ferner das Lösungsmittel ein gutes Lösungsvermögen für die gewünschten
Komponenten hat, kann trotzdem eine Beschränkung vorliegen, daß man dieses Mittel
nicht als Extraktionsmittel benutzen kann, wenn seine Penetration in die Pflanzenstruktur
hinein niedrig ist.
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Es soll nun ein Verfahren zum Extrahieren von Chlorophyll aus Pflanzenblättern
als Beispiel erläutert werden. Zur Zeit wird für diesen Zweck ein organisches Lösungsmittel
verwendet, und es ist also notwendig, die Pflanzenblätter vor der Extraktion zu
trocknen. Ein Lösungsmittel, wie Athylacetat, das Chlorophyll gut löst hat eine
so geringe Penetration in die pflanzliche Struktur hinein, daß es nicht als Extraktionsmittel
verwendet werden kann. Daher wird Aceton benutzt, das ein geringeres Lösungsvermögen
hat, aber eine hohe Penetration besitzt.
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Wie oben beschrieben, stehen alle technischen Probleme der üblichen
Extraktionsmethoden in Verbindung mit der Frage der Penetration und der Diffusion
in der pflanzlichen Struktur.
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Gemäß vorliegender Erfindung wird eine Arbeitsweise vorgeschlagen,
nach welcher vor der Extraktion Cellulose, Hemicellulose, Pektin, Alginsäure und
Protein, welche Bestandteile der pflanzlichen Struktur darstellen, gelöst oder zersetzt
werden durch Enzyme, die erzeugt sind von den Pilzen, die zur Gattung Trichoderma
gehören, um so die pflanzliche Struktur zu zerstören und die technischen Nachteile
des bekannten Verfahrens zu vermeiden. Im Vergleich zu der üblichen Extraktionsmethode
bietet die vorliegende Erfindung folgende hervorstechenden Vorteile: 1. Da die pflanzliche
Struktur zerstört worden ist, kann die Extraktion innerhalb sehr kurzer Zeit vollendet
werden, ohne daß außerdem Zeit anderweitig erforderlich wäre für Diffusion und Penetration.
Es bedarf keiner Erwärmung, und daher tritt nur eine geringe Zersetzung der zu gewinnenden
Komponenten durch Temperatureinwirkung ein.
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2. Ein derartiges Trocknen des pflanzlichen Materials, wie es bei
der Anwendung eines organischen Lösungsmittels erforderlich ist, kommt in Wegfall.
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3. Die Extraktionswirksamkeit ist so groß, daß es möglich ist, die
gewünschten pflanzlichen Komponenten mit einer geringen Menge Lösungsmittel vollständig
zu extrahieren.
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4. Es besteht keine Beschränkung bezüglich der Wahl des extrahierenden
Lösungsmittels, welche durch die Penetration des Lösungsmittels bestimmt wird. Daher
können die meisten technischen Lösungsmittel mit hoher Lösungsaktivität verwendet
werden.
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5. Die Extraktion erfolgt so leicht, daß jedes Lösungsmittel mit
hoher Lösungsaktivität angewandt werden kann. Daher kann der Extraktionsprozeß vereinfacht
und der Konzentrierungsprozeß u. dgl. erspart werden.
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Ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichem Chlorophyll oder
Chlorophyllin aus Pflanzenblättern soll nachstehend beispielsweise erläutert werden:
Bei der üblichen Methode wird nach dem Trocknen der Pflanzenblätter Chlorophyll
aus diesen mit 300/oigem wässerigem Aceton wiederholt extrahiert.
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Sämtliche Extrakte werden vereinigt. Der Rückstand, welcher nach der
Destillation von Aceton zurückbleibt, wird in Butylacetat gelöst und dann mit einem
Alkali behandelt, um eine wässerige Lösung von Chlorophyllin zu erhalten.
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Andererseits werden nach dem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung
rohe Pflanzenblätter im ursprünglichen Zustand mit Enzymen behandelt, die extrahiert
worden sind aus der Kultur eines Pilzes, der zur Gattung Trichoderma gehört, um
die Struktur zu zerstören und in Wasser zu lösen. Chlorophyll wird dann direkt aus
der Lösung mit Butylacetat extrahiert und darauf zwecks Gewinnung einer wässerigen
Lösung von Chlorophyllin mit einem Alkali behandelt. Es können also, verglichen
mit der bekannten Methode, nicht nur die Arbeitsgänge und Apparaturen zum Trocknen,
wie Acetonextraktion und die Destillation von Aceton erspart werden, sondern trotz
der Vereinfachung der Prozesse kann die Ausbeute der Extraktion von etwa 600/0 auf
mehr als 90 ovo erhöht werden.
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Es kann also gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung eine äußerst
vorteilhafte Methode zur Extraktion pflanzlicher Bestandteile geschaffen hat.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert.
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Beispiel 1 Trichoderma koningi wurde auf einen Nährboden geimpft,
der aus 1 kg Weizenkleie bestand, welcher eine im wesentlichen gleiche Menge Wasser
zugefügt worden war. Der Ansatz wurde 4 Tage bei 270 C gehalten. 10 1 einer Enzymlösung,
die erhalten worden war durch Extrahieren des Nährbodens mit einer zwanzigfachen
Menge Wasser und welche Cellulase, Hemicellulase, Xylanase, Pektinase, Protopektinase
und Protease enthielt, wurde zugesetzt zu 2 kg rohen Kleeblättern. Das Gemisch wurde
auf pH 4,5 eingestellt und 8 Stunden bei 460 C stehengelassen.
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Hierdurch wurde die Struktur der Kleeblätter zerstört und aufgelöst.
Zu der Lösung wurden 100 ccm einer 50/oigen Kupfersulfatlösung zugegeben. Dann wurde
Chlorophyll aus der Lösung extrahiert mit Butylacetat in einer Menge von etwa der
Hälfte. Der Extrakt wurde mit einem Alkali behandelt, um Chlorophyllin in eine wässerige
Phase überzuführen.
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So wurde 1,0 1 einer wässerigen Lösung erhalten, die 25 mg Natrium-Kupfer-Chlorophyllin
pro Kubikzentimeter enthielt.
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Beispiel 2 Trichoderma lignorum wurde auf 1 kg Weizenkleie geimpft,
zu welcher eine praktisch gleiche Menge Wasser zugesetzt worden war. Die Kultur
blieb 4 Tage bei 270 C stehen. 10 1 einer Enzymlösung, die erhalten worden war durch
Extrahieren des Kulturnährbodens mit Wasser in der 10flachen Menge wurden zu 5 kg
roher Chlorella zugesetzt und 4 Stunden bei einem pH von 5,0 und bei 400 C zur Einwirkung
gebracht, um das Pflanzenmaterial zu lösen.
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Die Lösung wurde dann in der gleichen Weise behandelt wie in Beispiel
1. Es wurden 1,5 1 einer wässerigen Natrium-Kupfer-Chlorophyllin-Lösung mit 50 mg/ccm
erhalten.
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Beispiel 3 Trichoderma viride wurde bei 300 C 3 Tage gezüchtet in
einem Nährmedium, bestehend aus 1 kg
Weizenkleie, Ammoniumsulfat
in einer Menge von 1 Gewichtsprozent der Weizenkleie, einer Spur Mangansulfat und
einer im wesentlichen gleichen Menge Wasser. 11 einer Enzymlösung, die erhalten
worden war durch Extrahieren des vorstehend beschriebenen Nährmediums mit Wasser
in lOfacher Menge, wurde auf 1 kg rohe gemahlene Karotten bei 450 C während 6 Stunden
zur Einwirkung gebracht. Die so erhaltene Lösung wurde dann zweimal mit Petroläther
in einer Menge von einem Viertel der Lösung extrahiert. Der nach dem Abdestillieren
des Petroläthers anfallende Rückstand wurde mit Äthanol versetzt, um das Karotin
auszufällen. Die Ausbeute betrug 60 mg.
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Beispiel 4 Trichoderma koningi wurde ausgesät auf einem Nährboden,
bestehend aus 1 kg rohen gemahlenen Karotten, 1 kg Weizenkleie und etwa 0,3 1 Wasser.
Das Gemisch blieb bei 270 C 4 Tage stehen. Zu dem Nährmedium wurden 21 Wasser zugegeben,
und das Medium wurde dann durch ein Sieb von 40 Maschen filtriert und ergab etwa
3 1 einer Karottenlösung.
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Diese Lösung wurde dreimal mit 0,51 Petroläther extrahiert. Der nach
dem Abdestillieren des Petroläthers erhaltene Rückstand wurde zwecks Ausscheidung
des Karotins mit Äthanol versetzt. Die Ausbeute betrug 55 mg.
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Beispiel 5 5 g eines Enzympulvers, das erhalten worden war durch
Trocknen eines Niederschlages, der gewonnen war durch Zugabe von Äthanol in doppelter
Menge zu der in Beispiel 1 erwähnten Enzymlösung, wurden zugesetzt zu 10 kg rohen
gemahlenen Zwiebeln von Narzissen (Sorte King Alfred) und wurden 5 Stunden bei 450
C zur Einwirkung gebracht, um die Zwiebeln zu lösen. Die Lösung wurde dann auf pH
8,0 ein-
gestellt und dreimal mit Äthylacetat in einer Menge von einem Fünftel der
Lösung extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dann abdestilliert, und man erhielt einen
Extrakt, welchem 50 ccm Aceton zugesetzt wurden. Wenn dann Bromwasserstoffgas durch
das Gemisch hindurchgeleitet wurde, erhielt man etwa 0,5 g Kristalle von rohem Gallantaminhydrobromid.