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Verfahren zum Präparieren von zur Transplantation bestimmten tierischen
Knochen, Knorpeln, Sehnen oder Muskelhäuten Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Präparieren von zur Transplantation oder Implantation bestimmten tierischen
Knochen, Knorpeln, Sehnen oder Muskelhäuten.
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Es sind zahlreiche Verfahren zur Präparierung von zur Transplantation
bestimmten tierischen Knochen, Knorpeln u. dgl. bekannt. So werden nach einem Verfahren
die Knochen von Weichgewebe, Fettsubstanzen und Blutfarbstoff befreit, dann mit
Eiweißentfernungsmitteln, z. B. 10°/oiger Wasserstoffperoxydlösung oder Trypsinlösung,
behandelt und gegebenenfalls schließlich mit lipophilen niedrigsiedenden Lösungsmitteln
nachbehandelt. Weiterhin ist bekannt, zur Transplantation bestimmte tierische Knochen
derartig zu präparieren, daß sie während dieser Präparierung noch ein gewisses Zellwachstum
zeigen und dennoch ihr Artspezifität verlieren. Zu diesem Zweck werden frische Knochen
unmittelbar nach dem Schlachten in eine ein Antibiotikum oder Sulfonamid enthaltende
Blutplasma- oder Blutserumlösung der gleichen Tierart verbracht und bei einer Temperatur
von vorzugweise etwa 5'C gehalten. Gemäß einem anderen Verfahren zur Herstellung
von Knochenpräparaten für die Transplantation werden tierische Knochen in gefrorenem
Zustand in ein ein Antibiotikum oder Sulfonamid enthaltendes Bad verbracht, das
einen Blutbestandteil der gleichen Tierart enthält, pulverisiert und mit Plasmakuchen
der gleichen Tierart als Bindemittel versetzt. Schließlich ist es bekannt, »anorganische
Knochen« durch Extraktion von Knochengewebe mit Äthylendiamin, gegebenenfalls unter
vorherigem Auskochen mit Wasser, herzustellen.
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Alle diese Verfahren ergeben jedoch Produkte, die zur Transplantation
bzw. Implantation nicht allen medizinischen Anforderungen genügen. Entweder wird
das Kollagen der Knochensubstanz durch die Präparierung zu stark geschädigt, oder
Serumproteine werden durch die Behandlung denaturiert und verbleiben im Gewebe,
wodurch die Revitalisierung des Transplantats erschwert, wenn nicht unmöglich gemacht
wird. Auch ist es unerwünscht, Knochen- bzw. Knorpelausgangsmaterial wegen der Gefahr
einer Sensibilisierung, Allergie oder einer Resistenzentwicklung bei den zu behandelnden
Patienten mit einem Antibiotikum oder Sulfonamid zu behandeln.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden diese Nachteile vermieden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Präparieren von zur Transplantation bestimmten
tierischen Knochen, Knorpeln, Sehnen oder Muskelhäuten unter Entfernung von anhaftendem
Weichgewebe und unter aufeinanderfolgender Entfernung der Eiweiß- und Fettstoffe,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Ausgangsmaterial in einer sterilen wäßrigen,
0,5 bis 5 °/o Salz und 0,5 bis 20/, eines Sterilisationsmittels, besonders ß-Propiolacton
enthaltenden Lösung eingeweicht wird, mit der 0,5- bis 2,0°/oigen wäßrigen Lösung
einer nichtionischen grenzflächenaktiven Verbindung, dann mit einem lipophilen organischen
Lösungsmittel und schließlich mit frischer Lösung der grenzfiächenaktiven Verbindung
extrahiert wird, hierauf bis zur Entfernung von Behandlungsmitteln mit Wasser gewaschen,
sterilisiert und gegebenenfalls lyophilisiert wird.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren können Knochen, Knorpel, Sehnen und
Muskelhäute beliebiger tierischer Herkunft verwendet werden. Als Warmblüter kommen
z. B. Rinder, Schweine, Schafe, Pferde, Hunde in Frage. Die Knochen und Knorpel,
insbesondere die Knochen großer Tiere, z. B. von Kälbern, werden bevorzugt verwendet.
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Das zur Präparierung verwendete Material des Tieres kann in Abhängigkeit
von dem beabsichtigten Verwendungszweck in Größe und Form verändert werden. So können
z. B. kortikale bzw. kompakte Kalbsknochen in Stücke verschiedener Größe zerschnitten
werden.
Spongiöse Knochen können in Stücke zerschnitten oder bis zur gewünschten Teilchengröße
vermahlen werden. Rippen - eine kortikalspongiöse Art von Knochen - sind nach dem
Zerschneiden zu entsprechenden Größen besonders geeignet. Kälberembryoknochen oder
-knorpel z. B. von Augenhöhlen, Unterkieferknochen, Nasenscheidewänden, Nasenknorpeln
und Hirnschalen können in der Gesichtschirurgie und Rhinologie verwendet werden.
Die erfindungsgemäß behandelten Präparate werden von den Empfangsgeweben, in die
sie als Transplantat bzw. Implantat eingeführt worden sind, gut vertragen.
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Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die Knochen bzw. anderweitigen
Gewebe zunächst unter hygienischen Bedingungen aus dem Tierkörper exzidiert. Das
Material wird dann von sämtlichen anhängenden äußeren Geweben gesäubert und mit
steriler, verdünnter Natriumchloridlösung oder einer anderen physiologischen Salzlösung,
wie physiologischer Lösung nach E a r 1, Lösung nach T y r o d e, gespült. Das Gewebe
kann dann für chirurgische Zwecke in verschiedene Größen und Formen geschnitten
werden. Kortikale Knochen können z. B. in Stücke verschiedener Größe zerschnitten
werden. Spongiöse Scheiben von den Epiphysen langer Knochen erhalten werden. Der
Rest kann in Würfel geschnitten und dann vermahlen werden.
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Das Material wird vor der ersten Extraktion in einem flüssigen Sterilisationsmedium
gelagert. Diese Vorbehandlungsstufe dient zur Auslaugung einiger Serumproteine.
Bei dieser Arbeitsweise wird das tierische Material in sterile Behalter gebracht,
die mit steriler Salzlösung, die ein Sterilisationsmittel, wie flüssiges f-Propiolacton,
enthält, gefüllt sind. Es wird eine sterile Salzlösung mit einer Konzentration von
etwa 0,5 bis 5 °/o verwendet. Die Behälter sollen genügend groß sein, um. das 5-
bis 15fache Volumen der Salzlösung aufnehmen zu können. Die Behälter werden dann
verschlossen und in der Kälte, z. B. bei einer Temperatur von etwa 0 bis 10`C, bis
zu etwa 30 Tagen gelagert. Es können etwa 0,5 bis 2,0°/o Sterilisationsmittel verwendet
werden.
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Dann wird das Material mit einer wäßrigen Lösung extrahiert, die etwa
0,5 bis 2,00/, einer nichtionischen arenzflächenaktiven Verbindung enthält. Beispiele
für nichtionische grenzflächenaktive Verbindungen oder Dispergiermittel sind die
komplexen Ester und Ester-Äther, wie die partiellen Ester höherer ungesättigter
Fettsäuren mit Anhydriden von mehrwertigen Alkoholen und deren Polyoxyäthylenderivaten
(vgl. Merek-Index, 7. Ausgabe, 1960, S. 970). Polyoxyäthylen-(20)-sorbitan-monooleat
wird bevorzugt. Das Material wird mit etwa 5 bis etwa 15 Volumina der vorgenannten
wäßrigen Lösung je Gewichtsteil Festsubstanz gewaschen. Die Extraktion wird bei
etwa Raumtemperatur, vorzugsweise unter dauerndem Rühren, etwa 20 bis 30 Stunden
fortgesetzt. Die Lösung der grenzflächenaktiven Verbindung wird dann entfernt und
das Material mit Wasser gespült.
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Anschließend wird mit einem organischen Fettlösungsmittel, wie Chloroform,
einem niedrigmolekularen aliphatischen Alkohol, Aceton oder deren Gemischen, extrahiert.
Es werden etwa 5 bis 15 Volumina verwendet. Die Extraktion wird etwa 20 bis 30 Stunden
bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wird ein- bis sechsmal extrahiert, jedesmal
unter Verwendung frischen Lösungsmittels. Nach der letzten Extraktion mit dem Fettlösungsmittel
wird das Lösungsmittel entfernt, das Material mit Wasser gespült und dann erneut
mit der Lösung einer nichtionischen grenzflächenaktiven Verbindung extrahiert. Bei
dieser Stufe ist es wichtig, eine sich ununterbrochen erneuernde Lösung zu verwenden
oder bei chargenweiser Arbeitsweise mindestens zwei getrennte Extraktionen unter
Verwendung einer frischen Lösung für jede Extraktion durchzuführen. Es werden die
gleichen Volumina und Konzentrationen der Lösungen, wie sie oben angegeben wurden,
angewendet.
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Zuletzt wird die Lösung der grenzflächenaktiven Verbindung entfernt
und das Material mit ununterbrochen erneutem Wasser etwa 48 bis 200 Stunden bei
Raumtemperatur gewaschen.
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Das präparierte Material kann dann sterilisiert werden. Dies kann
durch Eintauchen des Materials in eine wäßrige Lösung von ß-Propiolacton einer Konzentration
von etwa 1 bis 1,5°/a über einen Zeitraum von etwa 48 bis 72 Stunden bei oder unterhalb
von Raumtemperatur, z. B. bei etwa 0 bis +5°C, erfolgen. Das Material kann auch
anderweitig sterilisiert werden, z. B. durch kathodische Bestrahlung. Die Sterilisierlösung
wird dann entfernt und das Material mit sterilem Wasser gewaschen.
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In diesem Zustand wird das sterilisierte Material lyophilisiert, wenn
es bis zur Verwendung sicher gelagert werden soll. Die Lyophilisierung kann dadurch
bewirkt werden, daß man das sterilisierte Material in sterile, bedeckte Schalen
bringt, etwa 12 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von etwa -20 bis -80°C (Temperatur
des eingefrorenen Materials) einfriert und sodann im Vakuum (z. B. bei etwa 50 Torr
oder darunter) etwa 24 bis 240 Stunden bei einer Temperatur des Materials bis zu
etwa +30°C trocknet. Das lyophilisierte Material kann dann zur Lagerung in sterile
Behälter eingeschlossen werden.
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Innerhalb der angegebenen Bereiche führt die Einhaltung bestimmter
Bedingungen zu besonders günstigen Ergebnissen in bezug auf die Qualität des erhaltenen
Produktes sowie die Bequemlichkeit der Herstellungweise. Diese Bedingungen sind:
Von der Sterilisationslösung zum Einweichen werden mindestens 10 Volumina je Gewichtsteil
des zu präparierenden Materials verwendet. Das Material wird in dieser Lösung 5
bis 15 Tage bei 4 bis 5°C gelagert. Für die nachfolgenden Operationen wird eine
1 °/oige Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleatlösung für jeden Waschvorgang mit
dem grenzflächenaktiven Mittel, Chloroform-Methanol (2: 1 Vol.) für die Fettextraktion
und eine 1°/oige ,B-Propiolactonlösung zur Sterilisation bei Raumtemperatur über
einen Zeitraum von 48 Stunden verwendet. Bei jedem Waschvorgang oder jeder Extraktion
im erfindungsgemäßen Verfahren sollen etwa 10 Volumina Lösung je Gewichtsteil des
zu präparierenden Materials verwendet werden.
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Obwohl die Erfindung als chargenweises Verfahren beschrieben wurde,
kann natürlich auch nach einem kontinuierlichen Verfahren gearbeitet werden.
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Es wurde festgestellt, daß die oben beschriebenen Arbeitsgänge in
der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen, damit brauchbare Ergebnisse
erzielt werden. Es ist z. B. wichtig, die Serumproteine vor der Fettextraktion mit
der Lösung der grenzflächenaktiven Verbindung zu entfernen, um ihre Denaturierung
zu vermeiden, wodurch sie schwer
löslich werden würden. Die Extraktion
der Fette, gefolgt von einer zweiten Extraktion mit der Lösung der grenzflächenaktiven
Verbindung und dem Waschen mit Wasser, führt in dieser Reihenfolge am besten zur
Entfernung von Fett, Serumproteinen und den Behandlungsmitteln. Darüber hinaus wird
das Kollagen-Gerüst praktisch nicht angegriffen, so daß die dem Gewebe innewohnende
Festigkeit beibehalten bleibt.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel l Ausgewählte
Kälber einer großknochigen Rasse (Holstein) mit einem Gewicht von 80 bis 100 kg
werden vor der Schlachtung abgewaschen. Unmittelbar nach der Schlachtung werden
die Vorderbeine am Gelenkpunkt entfernt (einschließlich aller Gewebe und Haut).
Die Hufe werden entfernt und die Beine gewaschen, beschnitten, gespült und in Bottiche
gelegt, die genügend Sterilisierlösung enthalten (Polyäthoxypolypropoxyäthanol-Jodkomplex,
Polyäthylenglykol-Nonylphenyläther-Jodkomplex), so daß die Beine bedeckt sind, und
dann in einen sterilen Arbeitsraum gebracht. Die Exstirpation bzw. Exzision der
Knochen erfolgt unter den üblichen aseptischen Bedingungen.
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Die Knochen werden von anhaftendem Material gründlich gereinigt. Die
gereinigten Knochen werden in spongiöse und kortikale Knochen getrennt, indem sie
mit einer langsam arbeitenden sterilen Bandsäge zerschnitten werden. Spongiöse Scheiben
werden in einer Größe von etwa 7,6 -1,27 - 0,63 cm vom Gelenkende des Knochens
abgeschnitten. Der Rest wird in Würfel von 1,27 bis 2,54 cm Größe zerschnitten und
in einer sterilen Mahlvorrichtung gemahlen. Die Splitter werden in einem sterilen
Behälter gesammelt.
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Die kortikalen Schäfte werden halbiert, das Knochenmark entfernt und
die Hälften des Rindenknochens mit steriler 0,85°/oiger wäßriger Natriumchloridlösung
gespült. Sie werden dann zu einer Breite von 1,27 bis 1,59 cm zugeschnitten.
Die kortikalen Stücke werden von spongiösem Knochenmaterial gereinigt. Aus vier
Beinen werden zwanzig kortikale Knochenstücke von 12,6 cm, zehn kortikale Knochenstücke
von 7,6 cm, zwanzig Scheiben spongiöse Knochen von 7,6 cm Größe und 2000 g gemahlene
spongiöse Knochen erhalten.
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Die kortikalen Knochen werden der Länge nach in sterile Behälter gelegt,
die dann vollständig mit einer sterilen Lösung, die 0,85 °/o Natriumchlorid, 1,68
°/o Natriumbicarbonat und 1 % ß-Propiolacton enthält, gefüllt, verschlossen
und 30 Tage bei 5°C gelagert werden. Die spongiösen Scheiben werden in ähnlicher
Weise in getrennte sterile Behälter gebracht, die mit der Sterilisationslösung gefüllt
werden, verschlossen und 30 Tage bei 5'C gelagert.
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Sämtliche Knochen werden dann in Körbe gelegt und in Gefäße eingebracht,
die 10 Volumina einer 1 °/oigen wäßrigen Lösung von Polyoxyäthylen-(20)-sorbitanmonooleat
(mit destilliertem Wasser bereitet) je Gewichtsteil Knochen enthalten. Es wird 24
Stunden bei Raumtemperatur ständig gerührt. Die Netzmittellösung wird entfernt und
der Knochen dreimal mit je 10 Volumina destilliertem Wasser gewaschen. In das Gefäß
werden dann 10 Volumina einer Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) je Gewichtsteil
Knochen gegeben. Die Knochen werden bei Raumtemperatur 24 Stunden in dem organischen
Lösungsmittel gerührt. Die Chloroform-Methanol-Mischung wird entfernt und der Knochen
dreimal mit je 10 Volumina destilliertem Wasser gewaschen. In den Behälter werden
dann 10 Volumina einer 1°/oigen wäßrigeil Lösung des vorgenannten Netzmittels je
1 Gewichtsteil Knochen gegeben. Der Knochen wird 24 Stunden bei Raumtemperatur in
der Netzmittellösung gerührt. Die Lösung wird entfernt, die gleiche Menge frischer
Netzmittellösung hinzugegeben und das Waschen unter Einhaltung der gleichen Zeit
wiederholt.
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Die Netzmittellösung wird entfernt und der Knochen mit fließendem,
filtriertem, entsalztem Wasser 120 Stunden bei Raumtemperatur gewaschen.
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Der bearbeitete Knochen wird dann durch Eintauchen in 10 Volumina
einer 1 °/oigen ß-Propiolactonlösung je 1 Gewichtsteil Knochen sterilisiert. Die
Lösung wurde wie folgt bereitet: Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . .
. 8,5 g Natriumbicarbonat . . . . . . . . . . . . . . 16,8 g Steriles Wasser zur
Injektion, gekühlt auf 5°C ..................... 990 ccm ß-Propiolacton, zugesetzt
nach der Lösung der Salze . . . . . . . . . . . . . 10 ccm Der Behälter mit dem
Knochen und der Sterilisationslösung wird verschlossen und 48 Stunden bei Raumtemperatur
gehalten, wonach der Knochen entfernt wird.
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Der sterilisierte Knochen wird ablaufen gelassen, mit sterilem, destilliertem
Wasser gewaschen, in sterile, bedeckte Schalen gebracht und 12 Stunden bei -40°C
eingefroren. Der gefrorene Knochen wird 24 Stunden bei einem Druck von 0,05 mm Hg
und einer Temperatur von -20°C getrocknet. Die Temperatur der Schalen wird dann
auf Raumtemperatur erhöht.
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Das Vakuum wird mit sterilem, gefiltertem Stickstoff aufgehoben. Die
Knochen werden aus den Schalen herausgenommen und dann unter aseptischen Bedingungen
in sterile Behälter übergeführt, die unter einem Mindestvakuum von 150 mm Hg verschlossen
werden. Beispiel 2 Kälberembryonen von etwa 3 Monaten Alter werden während der Schlachtung
zusammen mit der intakten Placenta entfernt. Die intakten Beutel werden in geeignete
Behälter gebracht, mit Wasser gewaschen, mit Sterilisierlösung bedeckt und in den
sterilen Operationsraum gebracht. Die Placenta wird zerschnitten, der Fötus entfernt,
und aus dem Kopfbereich werden Embryoknochen und -knorpel unter den üblichen aseptischen
Bedingungen exstirpiert.
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Die ganze Hirnschale, zwei kleine Augenhöhlen und zweiunddreißig Augenhöhlensplitter
werden entfernt. Sämtliche Gewebe und Zahnkeime werden aus dem Kieferraum entfernt.
Jede Unterkieferhälfte wird in Viertel geschnitten. Der Nasenknorpel wird in Quadrate
von etwa 1,27 cm Größe zerschnitten. Sämtliche Knochen und Knorpel werden mit steriler
0,85°/oiger Salzlösung gespült, und jede Gewebeart wird gesondert in einen Behälter
gebracht, der mit Sterilisierlösung (etwa 10 Volumteile je Gewichtsteil Knochen)
gefüllt ist, verschlossen und 30 Tage bei 5'C gelagert.
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Die Embryoknochen und -knorpel werden dann in der gleichen Reihenfolge
wie im Beispiel l weiterbearbeitet. Die behandelten Embryoknochen und
-knorpel
werden gemäß Beispiel 1 sterilisiert und lyophilisiert. Das Material wird dann unter
aseptischen Bedingungen in sterile Behälter übergeführt und unter einem Mindestvakuum
von 150 mm Hg gelagert.