DE1179547B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 11ª‰-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe - Google Patents

Description

• Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 11ß-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen llß-Hydroxylierung von 11-unsubstituierten, gegebenenfalls weitere Substituenten und/ oder Doppelbindungen enthaltenden A4-3,20-Dioxo-16a-alkyl-pregnenverbindungen oder ihren funktionellen Derivaten mit Enzymen von Pilzen der Art Mucor griseocyanus.
• Es ist bereits bekannt, daß Mueor griseocyanus Desoxycorticosteron und Progesteron zur Hauptsache in 14-Stellung hydroxyliert; neben dem 14-Hydroxy-steroid entstehen kleine Mengen von 8- und 9-Hydroxyderivaten. Bei anderen Corticosteroiden tritt auch Oxydation in 6-Stellung auf; so entstehen z. B. bei der Inkubation von Reichsteins Substanz S erhebliche Mengen sowohl des 14-Hydroxy- als auch des 6-Hydroxyderivats, und in Spuren kann auch Hydrocortison nachgewiesen werden. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei Anwesenheit einer 16a-ständigen Alkylgruppe, z. B. einer Methylgruppe, die Oxydation vorwiegend im Sinne der llß-Hydroxylierung verläuft und daß die 14-Hydroxylierung ganz unterbunden ist. Es ist weiter bekannt, daß zur llß-Hydroxylierung von 6a - Fluor -16a - methyl- oder 6a,17 a - Dirnethyl - corticoiden Nebennierenhomogenate oder Enzyme von Curvularia lunata verwendet werden. Mit ersteren erzielt man Ausbeuten von 30 bis 50% mit letzteren 30 bis 70%; letztere verursachen jedoch auch die Bildung der schwer separierbaren 14a-Hydroxycorticoide. Demgegenüber können gemäß vorliegender Erfindung 1 iß-hydroxylierte 44-3,20-Dioxo-16a-alkyl-pregnenverbindungen in Ausbeuten zwischen 65 und 80% und praktisch frei von unerwünschten Nebenprodukten hergestellt werden.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man bei der mikrobiologischen llß-Hydroxylierung von 11-unsubstituierten, gegebenenfalls weitere Substituenten und/ oder Doppelbindungen enthaltenden 44-3,20-Dioxo-16a-alkyl-pregnenverbindungen oder deren funktionellen Derivaten Enzyme von Pilzen der Art Mucor griseocyanus verwendet.
• Die Ausgangsstoffe können auch weitere Substituenten und/oder Doppelbindungen aufweisen. Als Substituenten seien besonders erwähnt: freie oder funktionell abgewandelte Hydroxy-, Oxo- oder Carboxylgruppen, insbesondere Hydroxygruppen in Stellung 17 bzw. 21, ferner Halogenatome, wie Fluor oder Chlor, insbesondere in 6-Stellung. Unter den funktionell abgewandelten Hydroxygruppen sind insbesondere verätherte und veresterte Hydroxygruppen, z. B. mit einer niederen aliphatischen Carbonsäure veresterte Hydroxygruppen, zu verstehen. Als funktionell abgewandelte Oxoverbindungen sind insbesondere Ketale, Enolderivate, wie Enoläther, Enolester und Enamine, ferner stickstoffhaltige Derivate, wie Hydrazone, Oxime und Semicarbazone, in Betracht zu ziehen. Oxo-oder Säuregruppen können vorzugsweise in 18-Stellung vorhanden sein. Schließlich können auch weitere Kohlenwasserstoffreste, wie Alkylgruppen, insbesondere Methylgruppen, z. B. in 1-, 2- oder 6-Stellung, vorhanden sein. Von den als Ausgangsstoff zu verwendenden mehrfach ungesättigten Verbindungen seien insbesondere die 1-Dehydro-derivate genannt.
• Die genannten Ausgangsstoffe werden verfahrensgemäß in an sich bekannter Weise mit Kulturen des genannten Pilzes unter an sich bekannten aeroben Bedingungen irrkubiert. Das Wachstum erfolgt in Oberflächenkultur oder, technisch vorteilhaft, submers, wobei man schüttelt und rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. ,Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenanntes Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die -genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthxlenglykol, zu und inkubiert weiter. Schließlich trennt 'man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die gebildete Ilß-Hydroxyverbindung in bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation oder überführung in funktionelle Derivate, wie. Ester. Dieselben Umsetzungen lassen sich auch- durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die genannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.
• Nach dem Verfahren der Erfindung können aus 11-unsubstituierten, gegebenenfalls weitere Substituenten und/öder Doppelbindungen enthaltenden J4-3,20-Diketo-16a-alkyl-pregnenverbindungen oder funktionellen Derivaten derselben, z. B. den entsprechenden Mono- oder Diketalen, die bekannten therapeutisch wirksamen Ilß-Hydroxysteroide der Pregnanreihe, z. B. die Corticosteroide und ihre Substitutionsprodukte, hergestellt werden. Verfahrensprodukte von besonderer Bedeutung sind z. B. J4- bzw. JI,4-Verbindungen der allgemeinen Formel worin X Chlor oder Fluor, RI Wasserstoff oder ein Halogenatom4- und R2 eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxygruppe darstellt.
• So läßt sich z. B. aus J4-3,20-Dioxo-6a-fluor-17a,21-dihydroxy-16a-methyl-pregnen durch die verfahrensgemäße 'Inkubation mit einer Kultur von Mucor griseocyahus in sehr guter Ausbeute das glucocorticoid hochwirksame 6a-Fluor-16a-methylhydrocortison darstellen.
• Die Aüsgang'sstoffe sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Methoden herstellen.
• Beispiel 1 Sechs 500 - ml - Erlenmeyerkolben mit je 100 ml einer Nährlösun 'g'; welche pro Liter 20g Pepton, 50 g Rohglukose und 5 ml Maisquellwasser enthält und auf pH 6,2 eingestellt ist, werden 30 Minuten bei 1,1 atü sterilisiert und nach Abkühlung auf Raumtemperatur' -mit einer Sporensuspension von Mucor griseocyanus (Ciba Stamm Nr. 15) beimpft. Nach 44 Stunden werden die sechs Kulturen mit je 1 ml einer 3%igen Lösung von 44-3,20-Dioxo-6a-fluor-16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnen (insgesamt 180 mg Substrat) versetzt und weitere 67 Stunden bei 26 bis 28°C geschüttelt.
• Hierauf werden die Kulturen gemeinsam auf einem Nylonfilter abgenutscht, das Mycel mehrmals gründlich mit Athylacetat verrieben und abgequetscht, das Kulturfiltrat mit Natriumchiorid gesättigt und mit drei Portionen von 180, 150 und 120 ml Athylacetat ausgeschüttelt. Die Auszüge werden mit 30 ml 20%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit 30 ml Wasser neutralgewaschen. Nach Trocknung der Athylacetatlösungen mit Natriumsulfat und Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum bei einer Badtemperatur von 50°C verbleiben 349 mg eines größtenteils öligen Rückstandes. Dieser wird an 5,4 g desaktiviertem Silicagel (Davison Nr. 922, mit 15 Gewichtsprozent Wasser desaktiviert) chromatographiert. Elution mit Methylenchlorid-Aceton (95 : 5) liefert Ausgangsmaterial, während anschließend mit (9: 1)-Gemisch 122 mg rohes 44 - 3,20 - Dioxo - 6,a - fluor-16a-methyl-Ilß,17a,21-trihydroxy-pregnen eluiert werden. Dieses schmilzt nach Umkristallisation aus einem Aceton-Äther-Gemisch bei 212 bis 214°C; [a12 = + 105° (c = 0,31 Dioxan).
• Beispiel 2 Arbeitet man, wie im Beispiel l beschrieben, jedoch mit 10-1-Schüttelenten, welche 41 Nährmedium enthalten, so erhält man aus 1,5 gJ4-3,20-Dioxo-6a-fluor-16a-methyl- i 7a,21-dihydroxy-pregnen 2,55g eines halbfesten Rückstandes. Dieser liefert nach Behandlung mit Aktivkohle und zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton-Ather das erwünschte d4-3,20-Dioxo-6a-fluor-16a-methyl-1 l ß,17a,2 i -trihydroxy-pregnen in einer Totalausbeute von 81%. Das erhaltene Produkt ist mit dem im Beispiel 1 beschriebenen in jeder Hinsicht identisch.

Claims (3)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von llß-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe aus 11-unsubstituierten, gegebenenfalls weitere Substituenten und/oder Doppelbindungen enthaltenden J4-3,20-Dioxo-16a-alkyl-pregnenverbindungen oder ihren funktionellen Derivaten, d a d u r c h gekennzeichnet, daß man Enzyme aus Pilzen der Art M ucor griseocyanus verwendet.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoffe d4-bzw. JI.4-Verbindungen der allgemeinen Formel in welcher X Chlor- oder Fluor, R, Wasserstoff oder ein Halogenatom und R2 eine freie oder funktionell abgewandelte Hydroxygruppe bedeutet, insbesondere das 44-6a-Fluor-3,20-dioxo-17a,21-dihydroxy-16a-methylpregnen, verwendet.
3. 3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangsstoffe mit einer wachsenden Kultur von Pilzen der Art Mucor griseocyanus unter aeroben Bedingungen inkubiert. In Betracht gezogene Druckschriften: Proc. Chem. Soc., 1959, S.87; Journal Am. Chem. Soc., Bd. 82 (l960), S. 2318ff.; Chemistry & Industry, 1960, S. 1163/1164.