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Verfahren zur Reinigung von Hydroxocobalamin Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Hydroxocobalamin (auch Vitamin B12v
genannt) aus diesen Stoff enthaltenden Mischungen.
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Man weiß, daß das Vitamin B12b sich von dem Vitamin B12 (oder Cyanocobalamin)
dadurch unterscheidet, daß in dem ersteren an dem Kobalt eine Hydroxylgruppe sitzt,
welche in dem letzteren durch eine Cyanidgruppe ersetzt ist.
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Für den pharmazeutischen Gebrauch zieht man heute das Hydroxocobalamin
dem Cyanocobalamin vor, da das erstere, welches basische Eigenschaften aufweist,
leichter in den Stoffwechsel des Menschen eintritt.
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Zur Herstellung von Hydroxocobalamin geht man in der Regel von Cyanocobalamin
aus, welches man reduziert. Die erhaltene Lösung wird dann unter Überführung des
Cobalamins in Hydroxocob.alamin oxydiert.
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Das nach den verschiedenen Verfahren erhaltene Rohprodukt muß vor
seiner Verwendung gereinigt werden.
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Um dieses Rohprodukt in ein technisch reines Produkt überzuführen,
ist es bekannt, das rohe Hydroxocobalamin wieder in von C02 befreitem Wasser zu
lösen und den pH-Wert auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 einzustellen, worauf ein
in Wasser lösliches organisches Lösungsmittel, und zwar Aceton, Dioxan oder Tetrahydrofuran,
zugegeben wird. Dann läßt man bei tiefer Temperatur (5 bis 10° C) stehen und erhält
durch Kristallisation Hydroxocobalaminkristalle mit einem Reinheitsgrad von etwa
70%: dieses Produkt stellt das technische Hydroxocobalamin dar.
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Es ist auch bekannt, daß man die Reinheit des technischen Produkts
dadurch verbessern kann, daß man dieses einer chromatographischen Trennung, insbesondere
an einer Aluminiumoxydsäule, unterwirft. Auf diese Weise kann man einen wesentlichen
Teil des nicht umgesetzten Cyanocobalamins abtrennen.
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Die 30% Verunreinigungen bestehen aus Feuchtigkeit, aus nicht umgesetztem
Cyanocobalamin und aus während der vorhergehenden Kristallisation mitgerissenen
Salzen.
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Diese Verunreinigungen können die Stabilität des Hydrexocobalamins
gefährden, welches sich im Laufe der Zeit abbaut. Die Instabilität des Hydroxocobalamins
ist übrigens in der Literatur bekannt, und man hat bereits vorgeschlagen, den Hydroxocobalaminlösu@,gen
zu diesem Zweck Puffer oder StabilisierungsrMtel zuzugeben; diese Stoffe können
jedoch seine therapeutische Wirkung herabsetzen. Das erfindungsgemäße Verfahren
beseitigt die den früheren Reinigungsverfahren anhaftenden Nachteile und ermöglicht
die Erzielung eines stark angereicherten Produkts (mit einem Reinheitsgrad von über
95%), welches infolgedessen äußerst stabil ist. Die so erhaltenen wäßrigen Lösungen
von Hydroxocobalamin können einen pH-Wert von etwa 8 aufweisen und bleiben trotzdem
während mehrerer Monate stabil, wenn sie bei Raumtemperatur, jedoch vor Licht geschützt,
aufbewahrt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnet sich im wesentlichen dadurch,
daß man eine wäßrige Lösung des technisch reinen Hydroxocobalamin-Hydrochlorids
oder -Sulfats nacheinander durch zwei Ionenaustauscherharze schickt, wovon das erste
ein amphoteres »Schlangenkäfig«-Polyelektrolyt und das zweite ein stark basisches
Harz ist, worauf das Eluat mit einer vielfachen Menge an Aceton, Tetrahydrofuran
oder Dioxan vermischt und die sich abscheidenden Kristalle des reinen Hydroxocobalamins
isoliert werden.
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Das erstverwendete Ionenaustauscherharz ist amphoter und ist unter
der Bezeichnung »Schlangenk'äfig-Polyelektrolyt« bekannt (Ind. Engng., 49 [1957],
S. 1812).
Harze dieser Art werden allgemein auch als »ionenverzögernde
Harze« bezeichnet, da das Hindurchwandern von Ionen durch eine solche Säule durch
die Eigenschaften des Harzes, Ionen zu adsorbieren, verzögert wird. Dieses Harz
kann z. B. ein unter der Bezeichnung »Retardion« bekanntes und von der Firma The
Dow Chemical Company, Midland, Michigan, verkauftes sein.
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Im Falle der Erfindung bindet dieses Harz die von dem Hydroxocobalamin
mitgeführten neutralen Salze, und es kann durch einfaches Waschen mit reinem Wasser
wieder regeneriert werden.
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Das stark basische Harz besitzt stark basische, aktive Gruppen. Diese
Harze können durch Hindurchleiten einer verdünnten Lösung basischer Verbindungen
(Natriumhydroxyd, Ammoniak usw.) und anschließendes Waschen regeneriert werden.
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Die Verwendung eines stark basischen Harzes anschließend an das neutrale
Harz widerspricht der bekannten Laboratoriumspraxis, bei welcher abschließend durch
das neutrale Harz filtriert wird.
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Die Harze werden zweckmäßig in übereinander angeordnete Säulen eingefüllt,
welche nacheinander von der zu reinigenden Lösung durchlaufen werden. Jede dieser
Säulen besitzt einen porösen Boden, auf welchem die Harzkörner aufliegen.
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Die Durchführung des Verfahrens wird durch den pH-Wert der am Ausgang
der letzten Säule aufgefangenen Lösung reguliert, welcher mindestens 7 betragen
muß. Um zu vermeiden, daß eine zu große Menge des Produkts in den Säulen zurückgehalten
wird, kann man die Lösung dadurch vorantreiben, daß man ein von Mineralstoffen befreites
Wasser hinterherschickt.
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Die am Ausgang der Säulen erhaltene Flüssigkeit wird durch Zugabe
von Aceton, Tetrahydrofuran oder Dioxan zur Auskristallisation gebracht. Die gebildeten
Kristalle werden abfiltriert, mit einem dieser Lösungsmittel oder Äther gewaschen
und dann getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein Produkt mit einem Reinheitsgrad
von mindestens 95%.
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Nachstehend werden einige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens näher erläutert. Beispiel 1 Man löst 0,20g Hydroxocobalamin-Hydrochlorid
(technisch rein) in 50 cm3 destilliertem Wasser und schickt die so erhaltene Lösung
durch zwei übereinander angeordnete Säulen; zuerst durch eine Säule mit einem Durchmesser
von 25 mm und einer Höhe von 100 mm, die mit einem »Retardion« benannten Harz der
Dow Chemical Company (Retardion 11 A 8) gefüllt ist. Nach Austritt aus der ersten
Säule gelangt die Flüssigkeit in eine zweite Säule mit gleichen Abmessungen, die
ein stark basisches Harz, z. B. das »Dowex 2« genannte der Dow Company, enthält.
Die Durchflußgeschwindigkeit durch diese Säulen wird auf 2 cm3/Minute eingestellt.
Wenn die Flüssigkeit beim Austritt aus der zweiten Säule beginnt sich rosa zu färben,
fängt man die Lösung auf. Während der ganzen Dauer dieses Vorgangs läßt man einen
reinen Stickstoffstrom durch den Auffangkolben streichen, um den Zutritt der Kohlensäure
der Luft zu dem Hydroxocobalamin zu verhindern. Man treibt dann die in der ersten
Säule zurückgehaltene Mutterlauge durch von Mineralstoffen befreites Wasser aus,
dessen Volumen dem in der Säule zurückgehaltenen Flüssigkeitsvolumen entspricht.
Dann treibt man die in der zweiten Säule zurückgehaltene Lösung durch ein gleiches
Volumen von Mineralstoffen befreitem Wasser (zweimal 10 cm3) aus.
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Nach Zugabe von 9 Volumina Tetrahydrofuran zu der aufgefangenen Flüssigkeit
läßt man die Lösung bei 5 bis 10° C stehen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert,
mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Man erhält auf diese Weise 0,12 g Kristalle, die aus etwa
0,115g reinem Hydroxocobalan-iin mit einem Reinheitsgrad von 96 % bestehen.
Beispiel 2 Man löst 30 g technisch reines Hydroxocobalamin-Sulfat in 7,51 destilliertem
Wasser. Die so erhaltene Lösung wird während etwa 3 Stunden durch zwei Säulen geschickt,
und zwar zuerst durch eine mit »Retardion 11 A 8« gefüllte Säule und dann durch
eine mit »Amberilte IRA 400« der Firma Röhm & Haas, Philadelphia, gefüllte Säule.
Diese beiden Säulen haben einen Durchmesser von 600 mm und eine Höhe von 250 mm.
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Beim Austtrit aus den Säulen wird die rosagefärbte Flüssigkeit unter
Stickstoff aufgefangen. Man versetzt sie mit 9 Volumina Aceton und läßt während
24 Stunden zwischen 0 und 10° C auskristallisieren. Die gebildeten Kristalle werden
abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält
26 g Hydroxocobalamin, das 25 g des reinen Produkts enthält, was einem Reinheitsgrad
von 96% entspricht.
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Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hydroxocobalamin
liegt in Form dunkelroter Kristalle vor, die in Wasser und Alkohol löslich, jedoch
in Chloroform, Äther und Aceton unlöslich sind.
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Dieses Hydroxocobalamin ist bei einem pH-Wert von 8 in wäßriger Lösung
ohne Zusatz von Stabilisatoren oder Puffern stabil, was seine große Reinheit beweist.
Diese wird im übrigen auch durch die p11-Kurve, durch biologische Titrationen oder
auch durch optische Spektrographie bewiesen.