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Verfahren zur Herstellung von optisch inaktive oder linksdrehendem
6 -Hydroxy-y-oxonorvalin L-8-Hydroxy-y-oxonorvalin ist ein neues Antibiotikum, das
in einem bestimmten Boden durch den Pilz Streptomyces akiyoshiensis erzeugt wird.
Diesem neuen Antibiotikum wurde die Bezeichnung »HON« gegeben.
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Es wurde nun ein Verfahren zur synthetischen Herstellung des neuen
Antibiotikums gefunden.
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Das optisch inaktive d-Hydroxy-y-oxonorvalin wird erfindungsgemäß
gebildet, wenn man eine Verbindung der allgemeinen Formel I
in der R1 Halogen, Hydroxy oder einen niederen Acyloxyrest und R2, R3 und R4 die
gleichen oder verschiedene niedere Alkylreste bedeuten, der Hydrolyse und Decarboxylierung
unterwirft.
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Die Ausgangsverbindung (I) kann beispielsweise nach dem in Helvetica
Chimica Acta, 35, S. 407 (1952), oder 38, S. 22 (1955), beschriebenen Verfahren
gewonnen werden.
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Wenn die Verbindung (I) hydrolysiert wird, wird R1 in eine Hydroxylgruppe
umgewandelt, und -COOR2, -COOR3 und -NHCOR4 werden zu einer Carboxyl-, Carboxyl-
bzw. Aminogruppe hydrolysiert. Je nach den angewendeten Reaktionsbedingungen kann
die Hydrolyse auch stufenweise durchgeführt werden.
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Zur Hydrolyse verwendet man vorzugsweise die Hydroxyde oder Carbonate
von Alkali- oder Erdalkalimetallen oder Mineralsäuren, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure
und Phosphorsäure. Die Reaktion wird zweckmäßig unter Erhitzen in einem Lösungsmittel,
z. B. in Wasser oder Alkoholen, durchgeführt.
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Da die Hydrolyse im allgemeinen unter Erwärmen durchgeführt wird,
findet die Abspaltung des Carboxylrestes gleichzeitig mit der Hydrolyse statt. Bisweilen
findet die Abspaltung statt, bevor alle -COOR2-, -COOR3- und -NHCOR4-Grupper hydrolysiert
sind, so daß ein d- oder N-substituiertes Derivat von y-Oxonorvalin oder dessen
Ester gebildet wird. Wird jedoch die Hydrolyse bei sehr niedriger Temperatur durchgeführt,
findet die Abspaltung nicht oder in einigen Fällen nur in geringem Maße statt. In
solchen Fällen kann man das Produkt in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels,
wie Wasser, auf eine sehr hohe Temperatur erhitzen, um die Abspaltung durchzuführen.
Hierbei kann die Abspaltung durch Zusatz von organischen oder
anorganischen Basen,
z. B. Alkalihydroxyd oder Pyridinbasen, ausgelöst werden.
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Das 6-Hydroxy-y-oxonorvalin besitzt ein asymmetrisches Zentrum und
entsteht daher als DL-Verbindung. Ferner haben auch die Zwischenverbindungen ein
Asymmetriezentrum, und man kann daher sowohl die Zwischenverbindungen als auch das
Endprodukt in die optisch aktiven Verbindungen spalten.
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Die optische Spaltung wird nach einem an sich bekannten Verfahren,
das für Aminosäuren oder ihre Derivate anwendbar ist, durchgeführt. Hierbei wird
die inaktive Verbindung mit Hilfe einer optisch aktiven Säure oder Base in die Diastereoisomeren
übergeführt. Anschließend wird das eine oder beide der Diastereoisomeren durch fraktionierte
Kristallisation isoliert und eine optisch aktive Verbindung aus dem isolierten Isomeren
oder aus der Mutterlauge gewonnen.
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Als organische Basen können hierbei Alkaloide, wie Brucin, Strychnin
und Chinin, und andere organische Basen, wie Ephedrin und Phenylisopropylamin, verwendet
werden. Als organische Säuren eignen sich beispielsweise Weinsäure und Camphersulfonsäure.
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Wird auf diese Weise erhaltenes L-o-Hydroxyy-oxonorvalin mit dem
Antibiotikum zusammengeschmolzen, das aus einer Inkubationsbrühe von Streptomyces
akiyoshiensis gewonnen wurde, wird
keine Erniedrigung des Schmelzpunktes
festgestellt.
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Außerdem stimmen die sonstigen physikalisch-chemischen Eigenschaften
des L-o-Hydroxy-y-oxonorvalins mit denen des Antibiotikums vollständig überein.
Auch in ihren antibakteriellen Eigenschaften ist kein Unterschied festzustellen.
Das synthetische L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin entspricht daher dem auf biologischem
Wege gewonnenen Antibiotikum. Es hat folgende physikalische Eigenschaften: 1. Relative
Drehung: [0ç]g7 = -8,20 (c = 3,40/0 in Wasser).
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2. Der Rf-Wert des Papier-Teilungschromatogramms (aufsteigendes Verfahren),
entwickelt mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4: 2: 1), beträgt 0,22.
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3. L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin reduziert sowohl ammoniakalisches Silbernitrat
als auch Fehlingsche Lösung, und beim Erhitzen von L-o-Hydroxyy-oxonorvalin zusammen
mit einer verdünnten Natriumhydroxydlösung wird Rotfärbung festgestellt.
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4. L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin ist eine amphotere Substanz und bildet
daher Salze mit Säuren oder Basen.
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5. pK'a = 2, 9,1 (elektrolytische Dissoziationskonstante der Aminosäure).
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6. L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin ist in Wasser leicht löslich und in
anderen Lösungsmitteln fast unlöslich.
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7. Die Infrarotabsorption von L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin in einer
flüssigen Paraffinsuspension, beobachtet durch Natriumchloridprismen, ist in Fig.
1 dargestellt. Die Absorptionsbanden sind nachstehend angegeben: 3,13, 3,7, 3,8,
4,05, 5,05, 5,83, 6,12, 6,25 6,3, 6,7, 7,12, 7,5, 7,95, 8,65, 8,8, 9,0 9,25, 9,55,
10,3, 10,9, 12,7, 12,8 und 14,0p.
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8. Die Ultraviolettabsorption von L-o-Hydroxyy-oxonorvalin in einer
wäßrigen Lösung ist in Fig. 2 dargestellt. Das Absorptionsmaximum wurde mit 271dz
(r = 24) festgestellt.
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9. L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin ist unter schwach sauren Bedingungen
sehr stabil, und die antibiotische Wirksamkeit wird selbst dann nicht verringert,
wenn es bei PH 3,0 für 15 Minuten auf 100"C erhitzt wird. Andererseits ist L-o-Hydroxyy-oxonorvalin
unter basischen Bedingungen verhältnismäßig instabil und wird unter Rotfärbung fast
vollständig zersetzt, wenn es bei p 8,6 für 15 Minuten auf 100"C erhitzt wird.
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Beispiel 1 Eine Mischung aus 1,0 g Acetamino-(y-bromacetonyl)-malonsäurediäthylester
und 10 cm3 10 0/0iger Salzsäure wird 1 Stunde auf dem Wasserbad erhitzt.
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Nach Verdünnung des Reaktionsgemisches mit Wasser wird die Salzsäure
mit >)Amberlite IR-45 (Type OH)« (Handelsname) entfernt. Die Lösung wird unter
vermindertem Druck eingeengt. Nach Entfärbung mit Aktivkohle wird das Konzentrat
in Wasser gelöst. Der wäßrigen Lösung wird Aceton zugesetzt, wobei 0,1 g DL-a-Hydroxy-y-oxonorvalin
in Form weißer Nadeln ausgeschieden wird.
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Beispiel 2 Eine Mischung aus 3,5 g Acetamino-(y-bromacetonyl)-malonsäurediäthylester,
12 g Bariumcarbo-
nat (frisch gefällt) und 30 cm3 Wasser wird auf dem Wasserbad in
einem Kohlendioxydstrom 6 Stunden auf 95 bis 100"C erhitzt. Nach Abkühlen wird die
Mischung filtriert und der Niederschlag mit Wasser gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit
vereinigte Filtrat wird durch eine mit 40 cm3 )>Amberlite IR-120 (Type H)« (Handelsname)
gefüllte Kolonne geleitet und das Harz mit Wasser gewaschen, wobei ein Eluat mit
einem pH-Wert unter 4,0 erhalten wird. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf
30 cm eingeengt. Dem Konzentrat werden 10 cm3 konzentrierte Salzsäure zugegeben
und das Gemisch dann 1 Stunde auf dem Wasserbad erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird
mit 40 cm3 Wasser verdünnt und die Lösung durch eine mit 100 cm3 »Amberlite IR-45
(Type OH)« (Handelsname) gefüllte Kolonne geleitet.
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Das Harz wird mit Wasser gewaschen und ein Eluat aufgefangen, das
eine gelbe Ninhydrinreaktion aufweist. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf
5 cm3 eingeengt. Nach Entfärbung des Konzentrats mit Aktivkohle wird das dreifache
Volumen an Aceton zugegeben, wobei sich ein Rohprodukt abscheidet. Das Produkt wird
in einer geringen Wassermenge gelöst und die Lösung mit Aktivkohle entfärbt.
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Nach zweimaliger Wiederholung der Reinigung werden 0,6 g DL-8-Hydroxy-y-oxonorvalin
in Form weißer Nadeln erhalten.
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Beispiel 3 Einer Lösung von 3,5 g Acetamino-(y-brom-acetonyl)-malonsäurediäthylester
in 70 cm3 Äthanol wird tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung
von 0,88 g Natriumhydroxyd, 3,5 cm3 Wasser und 14 cm3 Äthanol zugegeben, wobei der
pn-Wert der Mischung unter 8,0 gehalten wird. Die Mischung wird weitere 3 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt und dann 8 Stunden auf einem Wasserbad auf 95 bis 1000
C unter Rückfluß erhitzt. Nach Zusatz von 70 cm3 Wasser wird das Gemisch durch 20
cm3 >eAmberlite IR-120 (Type H)« (Handelsname) geleitet. Das Harz wird mit Wasser
gewaschen und ein Eluat mit einem pn-Wert unter 4,0 aufgefangen. Das Eluat wird
unter vermindertem Druck auf etwa 30 cm3 eingeengt. Das Konzentrat wird 1 Stunde
mit 10 cm3 konzentrierter Salzsäure auf dem Wasserbad erhitzt. Eine Mischung der
Lösung mit 40 cm3 Wasser wird durch 100 cm3 )>Amberlite IR-45 (Type OH)« (Handelsname)
geleitet und die Säule mit Wasser gewaschen, wobei Fraktionen erhalten werden, die
mit Ninhydrin unter Gelbfärbung reagieren. Die Fraktionen werden unter vermindertem
Druck auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingeengt.
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Das Konzentrat wird mit Aktivkohle entfärbt und dann mit dem dreifachen
Volumen an Aceton versetzt, wobei 140 mg Rohkristalle abgeschieden werden. Eine
Lösung der Rohkristalle in einer geringen Wassermenge wird mit Aktivkohle entfärbt
und Aceton zugesetzt. Nach zweimaliger Wiederholung der Rohkristallisation werden
60 mg DL-8-Hydroxy-y-oxonorvalin erhalten.
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Beispiel 4 Eine Lösung von 12 g Acetamino-(y-brom-acetonyl)-malonsäurediäthylester
in 36 cm3 Eisessig werden 4 g wasserfreies Kaliumacetat zugegeben. Die Mischung
wird unter Rühren 6 Stunden auf 60 bis 75° C erwärmt.
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Nach Abkühlung wird das gebildete Kaliumbromid
entfernt.
Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand in Äthylacetat
gelöst.
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Die Äthylacetatlösung wird nacheinander mit Wasser, einer wäßrigen
Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt. Dem Rückstand wird Äther zugesetzt, um das Produkt
zu kristallisieren. Umkristallisation des Produktes aus Äthanol ergibt 9,5 g Acetamino-(y
-acetoxy-acetonyl) -malonsäurediäthylester mit einem Schmelzpunkt von 105 bis 106°C.
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Berechnet für Cl4H2lO8N C 50,75010, H 6,390/o, N4,230/0; gefunden
. . . . . . . C 50,49 OIo, H 6,23 %, N 4,12 0/o.
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Eine Mischung aus 3,3 g des vorgenannten Produkts und 33 cm3 10 obiger
Salzsäure läßt man 1 Stunde sieden. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt
und dem Konzentrat Wasser zugesetzt. Nach Entfärbung mit Aktivkohle wird die Lösung
mit Pyridin neutralisiert. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und
dem Konzentrat Äthanol zugegeben, wobei sich ein blaßbrauner Niederschlag bildet.
Nach Entfärbung einer heißen wäßrigen Lösung des Niederschlages wird Aceton zugesetzt,
wobei 0,8 g DL-b-Hydroxy-y-oxonorvalin in Form weißer Kristalle abgeschieden werden.
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Beispiel 5 Einer Lösung von 7 g Kaliumhydroxyd in 70 cm3 wasserfreiem
Methanol werden 10 g Äthylacetat zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gekocht.
Nach Abkühlung werden 35,2 g Acetamino-(γ-bromacetonyl)-malonsäurediäthylester
der Lösung zugegeben. Das Gemisch wird eine Weile gerührt und dann 5 Stunden gekocht.
Nach Abkühlung wird das gebildete Kaliumbromid entfernt und das Filtrat unter vermindertem
Druck eingeengt. Eine Lösung des Rückstandes in Äthylacetat wird mit Wasser gewaschen
und getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck werden
30 g rohes Acetamino-(y-hydroxy-acetonyl)-malonsäurediäthylester als blaßgelbe harzartige
Substanz erhalten.
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3 g des vorgenannten Produktes werden auf dem Wasserbad 1 Stunde
mit 30cm3 10 0/0iger Salzsäure erhitzt. Die Salzsäure wird durch Destillation unter
vermindertem Druck entfernt. Eine wäßrige Lösung des Rückstandes wird durch eine
mit 200 cm3)>Amberlite IR-45 (Type OH)« (Handelsname) gefüllte Kolonne geleitet
und die Säule mit Wasser gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Eluat wird
unter vermindertem Druck eingeengt. Dem mit Aktivkohle entfärbten Konzentrat wird
Aceton zugesetzt, wobei 0,5 g DL-8-Hydroxy-y-oxonorvalin ausgeschieden werden.
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Berechnet für C5HO4N. . C 40,81 0/o H 6,170!o, N 9n52°/o; gefunden
. . . . . . . . C40,63%, H6,20%, N9,64°/o.
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Beispiel 6 Einer Lösung von 23,2 g Acetamino-(y-hydroxyacetonyl)-malonsäurediäthylester
in 230 cm3 Äthanol wird tropfenweise unter Rühren eine Lösung aus 6,8 g Natriumhydroxyd,
27 cm3 Wasser und 100 cm3 Äthanol zugegeben. Es scheidet sich ein blaßgelber
Niederschlag
ab. Eine Lösung der Fällung in 400 cm3 Wasser wird durch eine mit 200 cm3 »Amberlite
IR-120 (Type H)« (Handelsname) gefüllte Kolonne geleitet und die Säule mit Wasser
gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Eluat wird unter vermindertem Druck
eingeengt. Nach Zusatz von Aceton zum Konzentrat scheiden sich 6,5 g Acetamino-(y-hydroxyacetonyl)-malonsäure
mit einem Schmelzpunkt von 125 bis 1300C (Zersetzung) in Form weißer Kristalle ab.
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Eine Lösung von 2,3 g des vorgenannten Produktes in 20 cm3 10 0/0iger
Salzsäure wird 1 Stunde auf dem Wasserbad erhitzt und das Gemisch anschließend auf
die im Beispiel 5 beschriebene Weise weiterbehandelt.
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Es werden 0,2 g DL-8-Hydroxy-y-oxonorvalin in Form weißer Kristalle
erhalten.
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Man kann auch eine Lösung von 2,3 g der wie oben als Zwischenprodukt
erhaltenenAcetamino-(y-hydroxyacetonyl)-malonsäure in 20 cm3 Wasser 10 Minuten zum
Sieden erhitzen, wobei kräftige Kohlendioxydbildung stattfindet. Die Einengung des
Reaktionsgemisches unter vermindertem Druck ergibt 2,0 g N-Acetyl-8-hydroxy-y-oxonorvalin
in Form einer blaßgelben harzartigen Substanz.
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Nach Erhitzen des letzteren Produktes mit 20 cm3 10 0/0iger Salzsäure
wird auf die im Beispiel 5 beschriebene Weise weiterbehandelt. Erhalten werden 0,2
g DL-8-Hydroxy-y-oxonorvalin in Form weißer Kristalle.
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Beispiel 7 Die optische Spaltung von DL-N-Acetyl-8-hydroxyy-oxonorvalin
wird unter Verwendung von Bruch vorgenommen, wobei sich 600mg des Brucinsalzes der
Verbindung mit der L-Konfiguration aus 3,4 g DL-N-Acetyl-#-hydroxy-γ-oxonorvalin
bilden (Schmelzpunkt 119 bis 124°C). Das Brucin wird aus einer wäßrigen Lösung des
Salzes mit »Amberlite IR-120 (Type H)« (Handelsname) entfernt. Durch Einengen der
wäßrigen Lösung wird L-N-Acetyl-d-hydroxyy-oxonorvalin erhalten. Dieses Produkt
wird auf die im Beispiel 6 beschriebene Weise hydrolysiert, wobei 30 mg L-8-Hydroxy-y-oxonorvalin
gebildet werden, dessen Wert für [X]2D0 = -6,0° beträgt (c = 1% in Wasser).
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Beispiel 8 Einer äthanolischen Lösung von 3,4 g DL-N-Acetyld-hydroxy-y-oxonorvalin
werden 10 g Brucin zugesetzt.
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Das Gemisch wird erhitzt, bis es homogen ist. Dem Gemisch wird Äther
zugesetzt, wobei ein Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird aus Äthanol umkristallisiert,
wobei ein Brucinsalz von L-N-Acetyl-6-hydroxy-y-oxonorvalin in Form weißer Nadeln
mit einem Schmelzpunkt von 119 bis 124"C erhalten wird.
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Eine wäßrige Lösung des Brucinsalzes wird zur Entfernung des Brucins
durch eine mit »Amberlite IR-120 (Type OH)« (Handelsname) gefüllte Kolonne geleitet.
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Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei L-N-Acetyl-6-hydroxy-y-oxonorvalin
als blaßgelbe, harzartige Substanz zurückbleibt. Nach Erhitzen des Produktes für
1 Stunde mit 10 0i0iger Salzsäure auf dem Wasserbad wird das Gemisch unter vermindertem
Druck eingeengt. Eine wäßrige Lösung des Rückstandes wird durch eine mit »Amberlite
IR-45 (Type OH)« (Handelsname) gefüllte Kolonne geleitet und die Säure mit Wasser
gewaschen. Das mit dem
Waschwasser vereinte Eluat wird unter vermindertem
Druck eingeengt und mit Aceton versetzt. Die ausgeschiedenen weißen Kristalle werden
aus Wasser-Aceton umkristallisiert, wobei L-o-Hydroxy-y-oxonorvalin in Form weißer
Prismen erhalten wird. [ON]2DO = 60 (c = 101, in Wasser). Die Ausbeuten sind hierbei
die gleichen wie im Beispiel 7.