DE112008000814B4

DE112008000814B4 - Bioartifizielles Lebersystem, das einen mit Gelperlen gepackten Bioreaktor verwendet

Info

Publication number: DE112008000814B4
Application number: DE112008000814T
Authority: DE
Inventors: Jung Keug Park; Sung Koo Kim; Suk Koo Lee; Young-Jin Kim; Doo-Hoon Lee; Ji-hyun Lee; Hee-Hoon Yoon; Jae-Nam Ryu; Choon-Hyuck Kwon; Jeong-Kwon Noh; Hey-Jung Park
Original assignee: Lifecord Inc; PARK Jung Keug
Current assignee: Lifecord Inc; PARK Jung Keug
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2028-03-29
Also published as: GB2462946A; CN101668494B; DE112008000814T5; GB2462946B; US20100126923A1; KR100886003B1; WO2008120918A1; CA2681798C; KR20080088817A; CA2681798A1; GB0916948D0; US8329457B2; CN101668494A

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart ein bioartifizielles Lebersystem mit einem Festbettreaktor, der mit Gelperlen, die Hepatozyten eines Tieres enthalten, gepackt ist, einem Plasmareservoir, einem Plasmaseparator und einer Abflusskammer, wobei das Plasma Reservoir an einer höheren Position angeordnet ist als der Bioreaktor, ein Ventilationsfilter in Kontakt mit der Atmosphäre auf der Oberseite des Plasmareservoirs vorgesehen ist und die Oberseite des Plasmareservoirs direkt mit der Abflusskammer über eine Verbindungsleitung verbunden ist. Das erfindungsgemäße System führt die essentiellen Leberfunktionen aus, ohne das Problem der Gelperlenschädigung oder der Kanalbildung.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein bioartifizielles Lebersystem, das einen mit Gelperlen, die Hepatozyten eines Tieres enthalten, gepackten Bioreaktor verwendet.
Biorektoren sind beispielsweise aus der US 6 858 146 B1 und insbesondere aus der KR 1020020066507 A und der KR 1020060048546 A bekannt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Leber führt über 500 Vitalfunktionen aus, einschließlich Entgiftung toxischer Substanzen, Synthese und Sekretion von Gallensäuren und Gallenpigmenten, Synthese und Metabolismus von Plasmaproteinen und Metabolismus von Glukose und Lipiden. Daher ist es, anders als beim Herzen und der Niere, nicht möglich solche Leberfunktionen durch ein einfaches System mit einer Pumpe oder einer Dialysemembran zu ersetzen (siehe Mito M., Artificial Organs, 10, 214–218, 1986). Obwohl Lebertransplantationspatienten gemäß dem Scientific Registry of United Network for Organ Sharing zuletzt eine hohe Überlebensrate gezeigt haben können nur ungefähr 10% der registrierten Patienten eine Lebertransplantation in den Vereingten Staaten wegen des extremen Mangels an Organspendern erhalten und die Anzahl der Patienten, die während des Wartens auf eine Lebertransplantation sterben, ist rapide angestiegen.
Daher ist es dringend notwendig, eine brauchbare Leberunterstützungsvorrichtung, wie etwa eine künstliche Leber, zu entwickeln, die effizient und vorteilhaft angewendet werden kann, um einen Patienten am Leben zu halten und die Folgen eines Leberversagens einschließlich neurologischer Schädigungen während der Wiederherstellung der Leberfunktionen oder der Regeneration der nativen Leber des Patienten und während der Wartezeit zum Empfangen einer Lebertransplantation zu minimieren.
Daher wurden eine Anzahl von Studien an einem Tierhepatozyten verwendenden bioartifiziellen Lebersystem durchgeführt, das verschiedene biologische Funktionen der Hepatozyten ausführen kann (siehe Kamlot A. et al., Biotechnol Bioeng., 50, 382–391, 1996). Eine solche bioartifizielle Leber mit Hepatozyten kann die Symptome des Leberversagens mindern und die Überlebensdauer verlängern durch Ausführen der Schritte: Separieren von Plasma aus dem Blutstrom eines Patienten, Behandeln des Plasmas in einem mit Hepatozyten dicht gepackten Bioreaktor und Rückführen des behandelten Plasmas zum Patienten. Entsprechend muss eine brauchbare bioartifizielle Leber in der Lage sein, Hepatozyten zu kultivieren, während deren Funktion aufrechterhalten bleibt, und auch eine hohe Durchsatzkapazität haben.
Ein zur Nierendialyse verwendeter Hohlfaserreaktor wurde aufgrund seiner gut entwickelten Technologie für ein bioartifizielles Lebersystem verwendet. Jedoch kann diese Art Reaktor nur eine kleine Menge an Hepatozyten aufnehmen, wodurch die Durchsatzkapazität des Reaktors begrenzt ist (siehe Demetriou A. A. et al., Ann. Surg., 239, 660–667, 2004).
Um das oben genannte Problem zu lösen, wurde von einem Gelperlentyp- oder Kapseltyp-Bioreaktor berichtet, in dem Hepatozyten in Gelperlen oder Kapseln gepackt sind (David B. et al., Int. J. Artif. Organs., 27(4), 284–293, 2004 und Xu Q. et al., Ann. Clin. Lab. Sci., 34(1), 87–93, 2004). Jedoch hat diese Art Festbettbioreaktor mehrere Probleme, wie etwa Schädigung der fragilen Gelperlen, die durch den angelegten Druck für die Zirkulierung verursacht werden und Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, die durch Kanalbildung verursacht wird, welche zur Nekrose der Hepatozyten führen.
Daher sind die meisten der zuletzt entwickelten Gelperlentyp-Bioreaktoren in der Form von Flüssigbetten, in denen sich die Gelperlen mit dem Fluss der Flüssigkeit im Reaktor frei bewegen (siehe David B. et al., Int. J. Artif. Organs., 27(4), 284–293, 2004; M. Desille et al., Crit. Care Med., 30(3), 658–663, 2002; Y. J. Hwang et al., Transpl. Proc., 32, 2349–2351, 2000 und C. Legallais et al., Artificial Organs, 24(7), 519–525, 2000).
Jedoch ist ein Flüssigkeitsbettreaktor dadurch nachteilig, dass er verglichen mit einem Festbettreaktor ein relativ größeres Reaktorvolumen hat und die Plasmadurchsatzrate unakzeptabel niedrig ist (M. Desille et al., Crit. Care Med., 30(3), 658–663, 2002 und Y. J. Hwang et al., Transpl. Proc., 32, 2349–2351, 2000, E. Dore et al., Therapeutic Apheresis, 3(3), 264–267, 1999). Diesbezüglich wurde berichtet, dass, beachtet man eine Sauerstoffsverbrauchsrate der Hepatozyten, ein Flüssigkeitsreaktor mit 2 × 10¹⁰ Hepatozyten eine Plasmadurchflussrate von wenigstens 150 ml/min benötigt, um ausreichend Sauerstoff bereitzustellen (siehe Florence J. et al., Biotechnol. Bioeng., 50, 404–415, 1996).
Um die vorgenannten Probleme zu lösen, wurde ein Gelperlentyp gepackter Upflow Festbettreaktor vorgeschlagen (siehe T. M. Rahman et al., Artificial Organs, 28(5), 476–482, 2004), aber dieser hat das Problem, dass die Durchflussrate zu gering zum Behandeln eines Patienten mit Leberversagen ist.
Weiter, im Fall eines herkömmlichen Downflow Reaktors (siehe F. Meuwly et al., J. Biotechnology, 122, 122–129, 2006), tritt keine Schädigung des Packmaterials auf, wenn ein scheibenartiges faseriges Packmaterial hoher Festigkeit und Porosität als Zellhalter verwendet wird, aber die Leistung dieses Reaktors mag sich verschlechtern oder der Ausfluss des zirkulierenden Fluids kann auftreten aufgrund des durch die Verwendung einer Schlauchpumpe erzeugten hohen Drucks.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein bioartifizielles Lebersystem unter Verwendung eines mit Gelperlen gepackten Bioreaktors bereitzustellen, das frei von solchen Problemen wie Schädigung der Gelperlen und Kanalbildung ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben stehende und andere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich aus der folgenden Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen, die jeweils zeigen:
1 ein schematisches Diagramm des bioartifiziellen Lebersystems der vorliegenden Erfindung;
2 ein schematisches Diagramm des herkömmlichen Upflow Festbett bioartifiziellen Lebersystems, das in der koreanischen Offenlegungsschrift Publikationsnr. 2006-48546 offenbart ist;
3 ein mikroskopisches Bild von Alginatgelperlen, die Aggregate von Hepatozyten enthalten;
4 die Ergebnisse eines in vitro Leistungstests unter Verwendung des bioartifiziellen Lebersystems der vorliegenden Erfindung;
5A zeitabhängige Änderungen der Blutammoniumkonzentration von Schweinen, in denen Leberversagen induziert wurde, beobachtet für die Fälle des Verwenden: keines bioartifiziellen Lebersystems (Kontrollgruppe für Leberversagen); eines bioartifiziellen Lebersystems, wobei die Hepatozyten nicht innerhalb des Bioreaktors gepackt sind (Kontrollgruppe für den Bioreaktor); und des bioartifiziellen Lebersystems der vorliegenden Erfindung (Testgruppe);
5B Überlebensraten Schweinen, in denen Leberversagen induziert wurde, beobachtet für die Fälle des Verwendens: keines bioartifiziellen Lebersystems (Kontrollgruppe für Leberversagen); eines bioartifiziellen Lebersystems, wobei die Hepatozyten nicht innerhalb des Bioreaktors gepackt sind (Kontrollgruppe für den Bioreaktor); und des bioartifiziellen Lebersystems der vorliegenden Erfindung (Testgruppe);
6A ein Bild, das die PCR Analyseergebnisse zeigt, um zu überprüfen, welche Gelperlen im bioartifiziellen Lebersystem der vorliegenden Erfindung oder im herkömmlichen Upflow Festbett geschädigt sind, durch Erfassen des Vorhandenseins von GAPDH Genen im zirkulierenden Fluid; und
6B ein Bild, das geschädigte Perlen nach dem Verwenden des herkömmlichen Upflow Festbett bioartifiziellen Lebersystems, das in der koreanischen Offenlegungsschrift Nr. 2006-48546 offenbart ist, zeigt.
Bezugszeichenliste

1: Bioreaktor
2: Plasmareservoir
3: Abflusskammer
4: Verbindungsleitung
5: Flussratensteuerungspumpe
6: Plasmaseparator
7: Patient
8: Oxygenator
9: Flüssigkeitshöhenunterschied
10: Ventilationsfilter
11: pneumatischer Detektor
12: Netze
13: Plasmaeinlassleitung
14, 15: Plasmaauslassleitungen

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt: ein bioartifizielles Lebersystem mit einem Festbettbioreaktor, der mit Gelperlen, die Hepatozyten eines Tieres enthalten, gepackt ist, einem Plasmareservoir, einem Plasmaseparator und einer Abflusskammer, wobei das Plasmareservoir an einer höheren Position oberhalb des Bioreaktors angeordnet ist, ein Ventilationsfilter in Kontakt mit der Atmosphäre an der Oberseite des Plasmareservoirs vorgesehen ist und die Oberseite des Plasmareservoirs direkt mit der Abflusskammer über eine Verbindungsleitung verbunden ist.
Bezugnehmend auf 1 passiert das Patientenblut 7 den Plasmaseparator 6 zum Isolieren des im bioartifiziellen Lebersystem der vorliegenden Erfindung zu zirkulierenden Plasmas. Der Oxygenator 8 sättigt das zirkulierende Plasma mit Sauerstoff und hält das Plasma auf einer für die Inkubation von Hepatozyten geeigneten Temperatur. Dann wird das mit Sauerstoff gesättigte Plasma über eine Plasmaeinlassleitung 13 auf der Oberseite des Bioreaktors 1 eingeführt.
Der mit Gelperlen, die Hepatozyten aufweisen, gepackte Bioreaktor ist eines der Kernelemente des erfindungsgemäßen Systems zum Ausführen der Funktionen ähnlich einer normalen Leber, Entfernen giftiger Substanzen aus dem eingeführten Plasma und Sezernieren nützlicher Plasmaproteine, die von den Hepatozyten synthetisiert wurden. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, weil der Bioreaktor 1 in der Form eines Festbetts betrieben wird, ist dessen innerer Raum vollständig mit Gelperlen ohne jeden Zwischenraum gepackt. Weiter sind auf der Oberseite und der Unterseite des Bioreaktors 1 Netze 12 mit einer Porengröße von 50 bis 500 μm vorgesehen, um die Gelperlen im Bioreaktor zurückzuhalten. Die Netze können aus einem biokompatiblen Material, wie etwa rostfreiem Stahl, Polyester, Nylon und Polyurethan hergestellt sein.
Als in den Gelperlen enthaltene Hepatozyten können diejenigen aus einem Schwein separierten verwendet werden und 5 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen können pro 1 ml Gelperlen in der Form von Aggregaten mit einem Durchmesser von 50 bis 200 μm eingekapselt werden.
In der vorliegenden Erfindung hat der Körper des Bioreaktors 1 bevorzugt ein Volumen von 100 bis 1800 ml und eine spezifische Querschnittsfläche von 0,1 bis 0,2 cm²/ml zum Sicherstellen einer effizienten Durchflussrate ohne Kanalbildung zu erzeugen. Der Bioreaktor 1 kann aus einem Polycarbonat, rostfreiem Stahl oder Glas hergestellt sein und ist bevorzugt ein transparentes Material wie etwa Polycarbonat und Glas, welches die Beobachtung der Gelperlen ermöglicht.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, weil das Plasma auf der Oberseite des Bioreaktors 1 eingeführt und am Boden abgeführt wird, sind die Oberseite und die Unterseite des Bioreaktors 1 mit einer Plasmaeinlassleitung 13 und der Plasmaauslassleitung 14, die außerhalb des Bioreaktors 1 vorgesehen sind, verbunden.
Das aus der Plasmaauslassleitung 14 austretende Plasma ist zur Abflusskammer 3 geleitet, welche mit dem oberen Luftraum des Plasmareservoirs 2 über die Verbindungsleitung 4 verbunden ist und das Plasma wird aus der Abflusskammer 3 in das Plasmareservoir 2 über die Auslassleitung 15 unter Verwendung einer Flussratensteuerungspumpe 5 gepumpt.
Nachdem der Plasmafluss aus der Abflusskammer 3 in das Plasmareservoir 2 durch die Flussratensteuerungspumpe 5 eingeführt worden ist, wird ein Anteil des Plasmas an den Patienten 7 über den Plasmaseparator 6 rückgeführt und der verbleibende Teil wird mit dem Patientenplasma 7, das dem Plasmaseparator 6 zugeführt wird, vermischt, welches wieder im erfindungsgemäßen System zirkuliert wird.
Das charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Systems ist, dass, während der innere Druck des Plasmareservoirs 2 bei atmosphärischem Druck durch Verwenden des Ventilationsfilters 10 gehalten wird, die Zirkulation des Plasmas durch den vom Flüssigkeitshöhenunterschied 9 zwischen dem im Plasmareservoir 2 zurückgehaltenen Plasma und dem Plasma in der Verbindungsleitung 4, die mit der Abflusskammer 3 verbunden ist, erzeugten Druck angetrieben wird. Entsprechend kann der maximale Druck, der am Bioreaktor 1 anliegt, durch Einstellen der Länge der vertikalen Höhe der Verbindungsleitung 4 gesteuert werden (die Differenz 9 zwischen dem Flüssigkeitspegel des Plasmareservoirs 2 und dem der Verbindungsleitung 4). Die Verbindungsleitung 4 kann in verschiedenen Formen installiert sein, wie etwa einer geneigten Form um die gewünschte vertikale Höhe zu erreichen.
Berücksichtigt man, dass der bevorzugte Druckbereich, der am Bioreaktor 1 angelegt wird, 3 bis 45 mm Hg ist, hat die Verbindungsleitung 4 eine bevorzugte vertikale Höhe von 4 bis 61 cm. Übersteigt der an den Bioreaktor 1 angelegte Druck 45 mm Hg, besteht das Risiko des Gelperlenbruchs. Sind die Gelperlen erst einmal geschädigt, können die darin enthaltenen tierischen Hepatozyten in das Plasma entweichen, welches Antikörper im Plasma veranlassen kann, Nekrose der Hepatozyten zu verursachen oder im Rückführen kontaminierten Plasmas an den Patienten 7 resultiert, in dem Kontamination des Plasmas durch infektiöse Mikroorganismen verursacht wird, welche selten in den Hepatozyten vorhanden sind.
Die Schlauchpumpe 5 steuert die Plasmaflussrate, um den Flüssigkeitshöhenunterschied bei einem gewünschten Wert zu halten. Obwohl die maximale Plasmaflussrate durch die vertikale Höhe der Verbindungsleitung bestimmt ist, wird die Zirkulationsrate daher im erfindungsgemäßen System im Wesentlichen durch die Schlauchpumpe 5 gesteuert. In anderen Worten, abhängig von der durch die Schlauchpumpe 5 gesteuerten Flussrate, füllt das Plasma aus der Abflusskammer 3 die Verbindungsleitung 4 bis die Flussrate des Plasmas im Gleichgewicht mit der des aus dem Bioreaktor 1 abgeflossenen Plasmas ist, bei welchem Punkt der Flüssigkeitshöhenunterschied 9 bestimmt ist. Der Flüssigkeitshöhenunterschied 9 ist bevorzugt 20 bis 40 cm und ein Flüssigkeitshöhenunterschied 9 von 20 cm, z. B., entspricht ungefähr einer Plasmaflussrate von 52 ml/min. In diesem Zusammenhang erzeugt der Flüssigkeitshöhenunterschied 9 von 40 cm einen Druck von ungefähr 29,4 mm Hg, der am Bioreaktor 1 anliegt, und um Gelperlenbruch zu verhindern, ist es bevorzugt, den Flüssigkeitshöhenunterschied bei einem Wert nicht größer als 40 cm zu halten.
Weiter, im erfindungsgemäßen System, im Fall, dass geschwächte Perlen die Passage des Plasmas behindern oder andere unerwartete Probleme im Bioreaktor 1 auftreten, bewirkt die resultierende Druckänderung die Plasmahöhenänderung in der Verbindungsleitung 4, gefolgt durch eine Änderung in der Flüssigkeitshöhendifferenz 9 und daher kann jede Veränderung im Plasmadruck unmittelbar erfasst werden. Speziell können solche Druckänderungen in Echtzeit unter Verwendung eines pneumatischen Detektors 11, der an der Verbindungsleitung 4 installiert ist, überprüft werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen System, weil Plasma durch den Bioreaktor 1 von der Oberseite zu der Unterseite durch die Druckdifferenz, die durch die Flüssigkeitshöhendifferenz 9 erzeugt wird, zirkuliert, kann Kanalbildung oder Gelperlenschädigung nicht auftreten. Zusätzlich bietet das erfindungsgemäße System eine stabile und effektive Flussrate und zeigt exzellente Leistungscharakteristika beim Beseitigen von Toxinen aus dem Plasma und Bereitstellen notwendiger Proteine auf. Daher ist es sehr nützlich als Leberunterstützungsvorrichtung.
Die folgenden Beispiele werden nur zum Zweck der Erklärung gegeben und sind nicht gedacht, den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
Beispiel: Herstellung des bioartifiziellen Lebersystems gemäß der vorliegenden Erfindung
1) Isolierung und Kultivierung von Schweinehepatozyten
Eine große Menge Hepatozyten wurde aus Schwein unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert (siehe Sielaff T. D. et al., Transplantation, 27, 1459–63, 1995) wie folgt.
Eine 10 kg Eberkreuzung (Landrace x Yorhshire x Duroc, Medi-pig Korea, Chun-An, Korea) wurde über Nacht mit Zugang zu Wasser nicht gefüttert. Der Eber wurde mit Ketamin (20 mg/kg, Yuhan Corporation) und Xylazin (2 mg/kg, Bayer Korea, Ltd.) betäubt, gefolgt von Inhalation mit Enfluran (Choongwae Pharma Corporation) durch endotracheale Intubation und dann wurde Nocuron (Muskelrelaxans, 01, mg/kg, Hanwha Pharma) injiziert. Nach Öffnen des Abdomens wurde ein Tubus an die Pfortader angeschlossen.
Die Leber wurde mit einer Perfusionslösung (NaCl 8 g/l, KCl 0.4/l, NaH₂PO₄·2H₂O 0,078 g/l, NaH₂PO₄·12H₂O 0,151 g/l, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethan-sulfonsäure, Sigma Chem Co.) 2,38 g/l, EDTA (Ethylenediamintetraacetat, Gibco BRL Co.) 0,19 g/l, Natriumhydrogencarbonat 0,35 g/l, Glukose 0,9 g/l, Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 10 mg/ml und Amphotericin B 25 μg/ml) perfundiert und die so behandelte Leber wurde entfernt.
Die resultierende Leber, die auf eine saubere Bank gelegt wurde, wurde erneut mit einer zweiten Perfusionslösung (Collagenase (Gibco BRL) 0,5 g/l, Trypsininhibitor (Gibco BRL) 0,05 g/l, NaCl 8 g/l, KCl 0,4 g/l, CaCl₂ 0.56 g/l NaH₂PO₄·2H₂O 0,078 g/l, Na₂HPO₄·12H₂O 0,151 g/l, HEPES 2,381 g/l, Natriumhydrogencarbonat 0,35 g/l, Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 10 mg/ml und Amphotericin B 25 μg/ml) perfundiert, während die Leber mit ausreichend Sauerstoff mit einer künstlichen Herz-Lungenmaschine (CapioxSX-10, Terumo, Japan) versorgt wurde und die Perfusionslösung bei 37°C und die Perfusionsrate bei nicht weniger als 700 ml/min gehalten wurden.
Die Leberkapsel wie auch die verbleibenden Gewebe wurden entfernt und dann wurden 2,0 × 10¹⁰ Hepatozyten durch Waschen nach wiederholter Zentrifugation (vier Mal, jedes Mal für 2 Minuten bei 500 Upm) isoliert.
Ein Teil der so erhaltenen Hepatozyten wurde genommen, um die Lebensfähigkeit der Zellen gemäß dem Trypanblau-Farbausschlussverfahren zu testen. Als Ergebnis wurde 89% Zelllebensfähigkeit gemessen.
Die isolierten Hepatozyten wurden zu 11 eines Suspensionskulturmediums (Williams' E Medium enthaltend Insulin 5 mg/l, Albumin 0,1% und epithelialen Zellwachstumsfaktor 20 μg/ml, Sigma Chemical Company) hinzugegeben, angeordnet in einer Spinnerflasche auf eine Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml und die resultierende Suspension wurde für 10 bis 20 Stunden kultiviert. Wenn die kultivierten Hepatozyten Hepatozytenaggregate mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 70 μm gebildet hatten, wurden die Aggregate aus dem Kulturmedium entnommen.
2) Herstellung von Hepatozyten enthaltenden Gelperlen
Die aus Schritt 1) erhaltenen Hepatozytenaggregate (Gesamtanzahl der Hepatozyten: 2 × 10¹⁰, 100 ml) wurden mit 1,5% Alginatlösung (500 ml) gemischt und die resultierende Mixtur wurde tropfenweise zu 100 mM CaCl₂ Lösung unter Verwendung eines Mehrfachdüseninjektors gegeben, um Gelperlen zu bilden. Die Gelperlen wurden vier Mal mit Williams' E Medium gewaschen um verbleibende Calciumionen zu entfernen. Wie in 3 gezeigt, hatten die resultierenden Gelperlen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1,1 mm, wie durch Mikroskopie bestätigt.
3) Herstellung des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems
Das bioartifiziellen Lebersystem der vorliegenden Erfindung, das in 1 gezeigt ist, wurde durch Packen der Hepatozyten enthaltenden Gelperlen, die aus Schritt 2) erhalten wurden, in einem Bioreaktor mit einem Volumen von 550 ml hergestellt. In diesem Fall wurde die Länge der Verbindungsleitung 4 auf 40 cm eingestellt.
Experimentelles Beispiel 1: In vitro Leistungstest des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems
Um die Behandlung eines Patienten mit akutem Leberversagen zu simulieren wurde das bioartifizielle Lebersystem der vorliegenden Erfindung mit einer Kulturmediumsuspension (Williams' E Medium enthaltend Insulin 5 mg/ml, Albumin 0,1% und epithelialer Zellwachstumsfaktor 20 μg/ml, Sigma Chemical Company) enthaltend 1300 μg/dl Ammonium (übertriebene Bedingung) für die ersten 7 Stunden versorgt und darauf folgend mit einer Kulturmediumsuspension enthaltend 420 μg/dl Ammonium (der in einem Fall akuten Leberversagens beobachtete Wert) für 4 Stunden, wobei die Zuführrate jedes Mediums auf 6 ml/min gesetzt wurde.
Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass nach einer solchen Behandlung ungefähr 77% des Ammoniums aus dem Medium entfernt worden war und solch eine hohe Detoxifikationskapazität blieb auch nach 11 Stunden unverändert.
Experimentelles Beispiel 2: Leistungstest für die Leber unterstützende Funktion unter Verwendung eines Schweins mit Leberversagen
Ein Ferkel mit einem Gewicht von ungefähr 50 kg (erhältlich als internationales Versuchstier, 3 bis 4 Monate alt) wurde systematisch betäubt und endotrachealer Intubation unterworfen, gefolgt vom Sichern eines Blutgefäßes zum Sammeln einer Blutprobe. Die Betäubung wurde aufrechterhalten durch Unterwerfen des Tieres der Inhalation von Enfluran (Choongwae Pharma Corporation).
Nachdem das Abdomen des betäubten Ferkels geöffnet wurde, wurden die infrahepatische untere Vena cava und die Pfortader nach Art der Seite-zu-Seite Anastomose verbunden, um den Blutstrom zur Drosselvene umzuleiten, wodurch Leberversagen verursacht wurde.
Ein doppellumiger Katheter wurde in die Drosselvene des Ferkels mit induziertem Leberversagen eingeführt und mit dem Plasmaseparator (6, Cobe Spectra, Gambro BCT, USA) des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems verbunden.
Die Betriebsbedingungen waren wie folgt:
Die Blutzirkulationsrate innerhalb des Plasmaseparators: 90 ml/min Flussrate des aus dem Blut separiertem Plasmas und bestehend im Plasmaseparator: 40 ml/min
Zirkulationsrate durch den Bioreaktor: 250 ml/min
Flüssigkeitshöhenunterschied: 20 cm
Nach Inbetriebnahme des Systems wurden stündlich Blutproben aus der Arterie genommen, um die Blutammoniumkonzentration (Testgruppe) zu nehmen. Dieselbe Prozedur wurde mit den Kontrollgruppen wiederholt: Schweine mit induziertem Leberversagen, die an kein bioartifiziellen Lebersystem angeschlossen waren (Kontrollgruppe für Leberversagen); solche, die an ein bioartifiziellen Lebersystems angeschlossen waren, bei dem die Hepatozyten nicht in dem Bioreaktor gepackt waren (Kontrollgruppe für den Bioreaktor). Weiter wurde die Überlebensdauer der Schweine in jeder Gruppe bestimmt.
Wie in 5A und 5B gezeigt war die Blutammoniumkonzentration, die in der Testgruppe unter Verwendung des bioartifiziellen Lebersystems beobachtet wurde bemerkenswert geringer als diejenige der Kontrollgruppen und die Überlebensdauer der Testgruppe wurde ungefähr 7,5 Stunden gegenüber den Kontrollgruppen verlängert. Entsprechend wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße bioartifizielle Lebersystem nützlich für die Wiederherstellung oder Lebensverlängerung von Patienten mit akutem Leberversagen ist.
Experimentelles Beispiel 3: Vergleich der Gelperlenschädigung zwischen dem erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystem und einem herkömmlichen System
Um die überlegene Stabilität des erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystems zu belegen, wurde ein bioartifiziellen Lebersystems in derselben Art wie in dem oben genannten Beispiel hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Volumen eines Bioreaktors auf 260 ml geändert wurde.
In der Zwischenzeit wurde ein vergleichbares System, wie in 2 dargestellt, hergestellt in Übereinstimmung mit dem herkömmlichen Verfahren (siehe koreanische Patentveröffentlichung Nr. 2006-48546 ) durch: Packen von Hepatozyten enthaltenden Gelperlen, die wie in den Schritten 1) und 2) des oben genannten Beispiels hergestellt wurden, in einem Bioreaktor mit einem Volumen von 260 ml; Einstellen der oberen Platte des Bioreaktors um den oberen Pegel der natürlich präzipitierenden Gelperlen um 20% zusammenzupressen; und Zirkulieren des Plasmas von der Unterseite zur Oberseite des Bioreaktors durch Verwenden einer Schlauchpumpe.
Eine Testlösung wurde erhalten durch Mischen des Schweineplasmas, das aus dem erfindungsgemäßen bioartifiziellen Lebersystem nach Durchführen des experimentellen Beispiels 2 zurückgewonnen wurde, mit einer Kulturmediumsuspension, die dieselbe Zusammensetzung wie die im experimentellen Beispiel 1 Verwendete, in einem Volumenverhältnis von 2:1.
Die Testlösung wurde durch jedes System bei einer Flussrate von 300 ml/min zirkuliert. Im erfindungsgemäßen System wurde die Flüssigkeitshöhendifferenz zwischen dem Plasma, das in der Verbindungsleitung gefüllt war und dem des Plasmareservoirs bei 40 cm gehalten.
15 ml jeder Testlösung wurden jede 2 Stunden genommen, während die Testlösung durch jedes System unter den oben genannten Bedingungen für 6 Stunden zirkulierte, bei 3000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu verwerfen, und Trypanblau wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 μl hinzugegeben.
Jede so erhaltene Lösung wurde auf einen konkaven Objektträger überführt und die Gesamtzellanzahl wurde unter einem Mikroskop gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Perfusionszeit (h)	Zellanzahl pro 15 ml
	Vergleichssystem (ein herkömmlicher Festbett Bioreaktor)	erfindungsgemäßes System (Bioreaktor, bei dem die Perfusion durch einen Flüssigkeitshöhenunterschied angetrieben ist)
0	2	3
2	9	2
4	20	1
6	21	2

Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist die Anzahl der Hepatozyten im Vergleichssystem, die aus den Gelperlen entwichen sind nach 4 Stunden Zirkulation deutlich erhöht, wohingegen die Anzahl der befreiten Zellen im erfindungsgemäßen System auch nach 6 Stunden Zirkulation unverändert geblieben ist.
Weiter wurde eine 50 ml Probe aus jedem der zwei Bioreaktoren nach 6 Stunden Zirkulation entnommen und bei 4000 Upm bei 4°C zentrifugiert und die genomische DNA (gDNA) wurde aus den aus jeder Probe isolierten Zellen unter Verwendung des DNeasy Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) extrahiert.
PCR Analyse wurde unter Verwendung der so extrahierten DNA als Template und forward primer (SEQ ID NO: 1) und ein reverse primer (SEQ ID NO: 2) für das GAPDH Gen, das Housekeeping Gen, durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde die anfängliche Testlösung in derselben Weise analysiert.
Wie in 6A gezeigt, wurden keine Zellen in der im erfindungsgemäßen System zirkulierenden Probe detektiert, wohingegen das Vorhandensein von Zellen in der im Vergleichssystem zirkulierenden Probe erfasst wurde.
Währenddessen, nach den oben genannten Experimenten, wurden 5 ml Gelperlen von jedem Bioreaktor des erfindungsgemäßen und Vergleichssystems entnommen. Gemäß mikroskopischer Untersuchung wurde keine Schädigung der Gelperlen des erfindungsgemäßen Systems beobachtet, wohingegen beträchtliche Schädigungen von ungefähr 150 Gelperlen insgesamt bei den Gelperlen des Vergleichssystems beobachtet wurden (6B).
Folglich wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße System effizient verhindert, dass, im Gegensatz zum herkömmlichen Upflow Festbettsystem, Hepatozyten aus den Gelperlen entweichen.
Während die Erfindung im Hinblick auf die oben aufgeführten speziellen Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, sollte anerkannt werden, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen an der Erfindung vom Fachmann vorgenommen werden können, die ebenso in den Umfang der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, fallen.

Claims

Bioartifizielles Lebersystem mit einem Festbettbioreaktor, der mit Gelperlen, die Hepatozyten eines Säugetieres enthalten, gepackt ist, einem Plasmareservoir, einem Plasmaseparator und einer Abflusskammer, wobei das Plasmareservoir an einer höheren Position als der Bioreaktor angeordnet ist, ein Ventilationsfilter in Kontakt mit der Atmosphäre auf der Oberseite des Plasmareservoirs vorgesehen ist und die Oberseite des Plasmareservoirs direkt mit der Abflusskammer über eine Verbindungsleitung verbunden ist.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei der Bioreaktor an dessen Oberseite und dessen Boden Netze mit einer Porengröße von 50 bis 500 μm aufweist.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei die Gelperlen Schweinehepatozyten enthalten.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei die Gelperlen 5 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ Hepatozyten pro Milliliter enthalten.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten, die in den Gelperlen enthalten sind, in der Form von Aggregaten mit einem Durchmesser von 50 bis 200 μm sind.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei der Bioreaktor ein Volumen von 100 bis 1800 ml und eine spezifische Querschnittsfläche von 0,1 bis 0,2 cm² pro Milliliter Reaktorvolumen hat.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei der an den Bioreaktor angelegte Druck 3 bis 45 mm Hg ist.
Bioartifizielles Lebersystem nach Anspruch 1, wobei die Verbindungsleitung, die die Oberseite des Plasmareservoirs mit der Abflusskammer verbindet, eine vertikale Höhe von 4 bis 61 cm hat.