CN101668494B - 利用装填有凝胶珠的生物反应器的生物人工肝系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物人工肝系统，包含装填有含动物肝细胞的凝胶珠的固定床生物反应器，血浆储器血浆分离器和流出小室，其中所述血浆储器的位置高于所述生物反应器，在血浆储器顶部提供了接触大气的通风过滤器，并且所述血浆储器的顶部通过连接管线直接连接流出小室。本发明的系统令人满意地执行肝脏的主要功能而没有凝胶珠破坏或通道形成的问题。

Description

利用装填有凝胶珠的生物反应器的生物人工肝系统

技术领域

本发明涉及利用装填有凝胶珠(gel bead)的生物反应器的生物人工肝系统(bioartificial liver system)，所述凝胶珠含有动物的肝细胞。

背景技术

肝执行超过500项重要功能，包括毒性物质的解毒，胆酸或胆色素的合成和分泌，血浆蛋白的合成和代谢，以及葡萄糖和脂质的代谢。因此，与心和肾不同，不可能通过简单的包含泵或透析膜的系统来取代所述的肝功能(见Mito M.，Artificial Organs，10，214-218，1986)。尽管根据ScientificRegistry of United Network for Organ Sharing，最近肝移植患者已经显示了高存活率，在美国由于器官供者非常少仅仅大约10％的登记的患者可接受肝移植，而且等待肝移植的过程中就去世的患者的数目快速增加。

因此，非常需要开发可行的肝支持器件，诸如人工肝，其可有效并方便地应用以保持患者生存并且最小化肝功能衰竭的后遗症，包括在肝功能恢复或患者自体肝再生过程中以及接受肝移植的等待期间的神经损伤。

因此，利用动物肝细胞对生物人工肝系统进行了多项研究，其可执行肝细胞的多种生物功能(见Kamlot A.et al.，Biotechnol Bioeng.，50，382-391，1996)。所述包含肝细胞的生物人工肝通过以下过程可明显缓解肝功能衰竭的症状，并延长存活期：从患者血流分离血浆，在密集地装填有肝细胞的生物反应器中处理所述的血浆，并将经处理的血浆回输给患者。因此，可行的生物人工肝必须能培养肝细胞同时保持它们的功能完整并具有高通过容量(throughput capacity)。

肾透析中所用的中空纤维反应器由于其技术开发充分已经用于生物人工肝系统。但是，这种类型的反应器仅可容纳少量肝细胞，从而限制反应器的通过容量(见Demetriou A.A.et al.，Ann.Surg.，239，660-667，2004)。

为了解决上述问题，报道了一种凝胶珠型或胶囊型生物反应器，其中肝细胞装在凝胶珠或胶囊中(见David B.et.al.，Int.J.Artif.Organs.，27(4)，284-293，2004；and Xu Q.et al.，Ann.Clin.Lab.Sci.，34(1)，87-93，2004)。然而，这种类型的固定床生物反应器有一些问题，诸如由于循环施压造成易碎凝胶珠的破坏以及通道形成(channeling)导致的氧和营养物质的耗竭从而导致肝细胞坏死。

因此，最近开发的凝胶珠生物反应器大多为流化床的形式，其中凝胶珠随生物反应器的流体的流动自由移动(见David B.et al.，Int.J.Artif.Organs，27(4)，284-293，2004；M.Desille et al.，Crit.Care Med.，30(3)，658-663，2002；Y.J.Hwang et al.，Transpl.Proc.，32，2349-2351，2000；C.Legallais et al.，Artificial Organs，24(7)，519-525，2000)。

然而，所述流化床反应器的缺点在于其与固定床反应器相比具有相对较大的反应器体积并且血浆通过率低至不可接受(见M.Desille et al.，Crit.Care Med.，30(3)，658-663，2002；and Y.J.Hwang et al.，Transpl.Proc.，32，2349-2351，2000，E.Dore et al.，Therapeutic Apheresis，3(3)，264-267，1999)。在这方面，已经报道考虑到肝细胞的氧消耗率，具有2×10¹⁰肝细胞的流化反应器需要至少150ml/min的血浆流速以提供足够的氧(见Florence J.et al.，Biotechnol.Bioeng.，50，404-415，1996)。

为了克服上述问题，推荐了凝胶珠型填充的流上行式固定床反应器(gel bead type-packed upflow fixed-bed reactor)(见T.M.Rahman et al.，Artificial Organs，28(5)，476-482，2004)，但其问题在于通过率对于治疗肝功能衰竭患者而言过小。

此外，对于常规流下行式反应器(downflow reactor)(见F.Meuwly et al.，J.Biotechnology，122，122-129，2006)，填充物质在利用具有高强度和多孔性的盘式纤维填充物质(disk type fibrous packing material)时不会产生损伤，而该反应器的性能会受损，或者可由于利用管状泵产生的高压而发生循环流体流出。

发明内容

因此，本发明的目的是提供利用装填有凝胶珠的生物反应器的生物人工肝系统，其不具有凝胶珠损坏和通道形成的问题。

附图简述

本发明的以上和其他目的和特征将通过以下说明以及附图的描述变得明显，所述附图分别显示：

图1：是本发明生物人工肝系统的示意图；

图2：韩国专利公开No.2006-48546中所述常规流上行式固定床生物人工肝系统的示意图；

图3：含有肝细胞聚集物的藻酸盐凝胶的显微镜下图片；

图4：利用本发明的生物人工肝系统的体外性能检测的结果；

图5A：对以下情况观察到的被诱导肝功能衰竭的猪的血氨浓度随时间的改变：不利用生物人工肝系统(肝功能衰竭对照组)；利用生物人工肝系统，其中肝细胞没有装填在生物反应器中(生物反应器对照组)；以及利用本发明的生物人工肝系统(受试组)；

图5B：对以下情况观察到的被诱导肝功能衰竭的猪的存活时间：不利用生物人工肝系统(肝功能衰竭对照组)；利用生物人工肝系统，其中肝细胞没有装填在生物反应器中(生物反应器对照组)；以及利用本发明的生物人工肝系统(受试组)；

图6A：显示PCR分析结果的图片，以通过检测循环流体中GAPDH基因的存在来检查凝胶珠在本发明的生物人工肝系统中或在常规流上行式固定床生物人工肝系统中是否被破坏；和

图6B：显示利用韩国专利公开No.2006-48546所述的常规流上行式固定床生物人工肝系统之后被破坏的珠的图片。

<附图中参考数字的简要说明>

1：生物反应器                            2：血浆储器

3：流出小室                              4：连接管线

5：流速控制泵                            6：血浆分离器

7：患者                                  8：氧合器

9：流体平面差(fluid level difference)    10：通风过滤器(ventilation filter)

11：气动检测仪(pneumatic detector)       12：筛网

13：血浆入口管线(plasma inlet line)      14，15：血浆出口管线(plasmaoutlet lines)

发明内容

根据本发明，提供了生物人工肝系统，其包含装填有含动物肝细胞的凝胶珠的固定床生物反应器，血浆储器，血浆分离器和流出小室，其中所述血浆储器的位置高于所述生物反应器，在血浆储器顶部提供了接触大气的通风过滤器，并且所述血浆储器的顶部通过连接管线直接连接流出小室。

参照图1，患者血液7通过血浆分离器6，分离得到血浆以便在本发明的生物人工肝系统中循环。氧合器8用氧饱和循环血浆并将血浆保持在适于肝细胞保温的温度。随后，氧饱和血浆通过血浆入口管线13导入生物反应器1的顶部。

装填有含肝细胞的凝胶珠的生物反应器是本发明系统用于执行类似正常肝的功能、从导入的血浆中去除毒性物质以及分泌肝细胞合成的有用的血浆蛋白的核心元件之一。根据本发明，由于生物反应器1以固定床的形式操作，其内部空间完全装填有凝胶珠而没有任何空间。此外，在生物反应器1的顶部和底部，提供孔大小为50-500μm的筛网21以将凝胶珠保持在生物反应器中。所述筛网由生物相容材料诸如不锈钢，聚酯，尼龙以及聚氨酯。

作为保持在凝胶珠中的肝细胞，可使用分离自猪的肝细胞，并且5×10⁶-5×10⁷个细胞可以直径50-200μm的聚集体的形式包裹在每1ml凝胶珠中。

本发明中，生物反应器1的猪兔优选具有100-1800ml的体积以及0.1-0.2cm²/ml的比(specific)横截面积以保证有效的流速而不导致通道形成。生物反应器1可由聚碳酸酯，不锈钢或玻璃制成，优选透明材料诸如聚碳酸酯和玻璃，其有利于观察凝胶珠。

根据本发明，由于血浆从生物反应器1的顶部引入而从其底部流出，生物反应器1的顶部和底部分别连接生物反应器1外部提供的血浆入口管线13和血浆出口管线14。

离开血浆出口管线14的血浆被引入流出小室3，其经由连接管线4连接血浆储器2的上部气室，来自流出小室3的血浆经由出口管线15利用流速控制泵5而泵入血浆储器2。

来自流出小室3的血浆流通过流速控制泵5导入血浆储器2，部分血浆通过血浆分离器6回输给患者7，余下的部分与导入血浆分离器6中的患者7的血浆再混合，然后再次进入本发明的系统中循环。

本发明系统的特征在于，当血浆储器2的内部压力利用通气过滤器10保持在大气压时，血浆的循环由保存在血浆储器2中的血浆和连接流出小室3的连接管线4中的血浆之间的流体平面差产生的压力来驱动。因此，施加于生物反应器1的最大压力可通过调节连接管线4的垂直高度来控制(血浆储器2的流体平面与连接管线4的流体平面之间的差9)。连接管线4可以各种形式安装，诸如倾斜的形式以满足所需的垂直高度。

考虑到优选施加于生物反应器1的压力范围是3-45mmHg，连接管线4优选具有4-61cm的垂直高度。如果施加于生物反应器1的压力超过45mmHg，则可能出现凝胶珠破裂。如果凝胶珠损坏，包含在其中的动物肝细胞漏入血浆，诱导血浆中产生抗体导致肝细胞坏死，或导致污染血浆回输到患者7中，其中血浆的污染可由罕见地存在肝细胞中的感染性微生物导致。

流速控制泵控制血浆流速以保持流体平面差在所需的值。因此，在本发明的系统中，尽管最大血浆流速通过连接管线4的垂直高度确定，循环速率主要由流速控制泵5控制。换言之，根据流速控制泵5控制的流速，流出小室3的血浆充满连接管线4指导血浆流速与来自生物反应器1流出的血浆的流速平衡，此时可确定流体平面差9。优选，离体平面差9为20-40cm，20cm的流体平面差例如大约对应血浆流速250ml/min。40cm的流体平面差9产生大约29.4mmHg的施加在生物反应器1上的压力，并且为了防止凝胶珠破坏，优选保持流体平面差9不超过40cm。

此外，本发明的系统中，如果弱化株阻塞血浆通道，或其他意料之外的问题出现在生物反应器1中，产生的压力改变导致连接管线4中血浆平面改变由此导致流体平面差9改变，由此任何血浆压力的改变可迅速检测。具体地，所述压力改变可通过利用装置在连接管线4上的气动检测仪11实时检测。

根据本发明的系统，由于血浆循环在离体平面差9产生的压力差的驱动下通过生物反应器1的顶部到达底部，通道形成或凝胶珠损坏不出现。此外，本发明的系统提供稳定有效的流速，显示在去除血浆毒素以及提供必须蛋白质方面极好的性质。因此，其是非常有用的肝支持期间。

以下实施例仅仅为了说明，并非意图限制本发明的范围。

实施例：制备根据本发明的生物人工肝系统

1)分离和培养猪肝细胞

如下大量肝细胞利用常规方法分离自猪(见Sielaff T.D.et al.，Transplantation，27，1459-63，1995)。

对10kg杂交野猪(Landrace x Yorkshire x Duroc，Medi-pig Korea，Chun-An，Korea)禁食过夜，可饮水。利用氯胺酮(20mg/kg，Yuhan Corporation)和赛拉嗪(2mg/kg，Bayer Korea，Ltd.)麻醉所述的野猪，然后通过气管内插管吸入恩氟烷(Choongwae Pharma corporation)，接着注射nocuron(肌肉松弛剂，0.1mg/kg，Hanwha Pharma)。切开腹腔后，进行门静脉插管。

用第一灌洗液(NaCl 8g/l，KCl 0.4g/l，NaH₂PO₄·2H₂O 0.078g/l，Na₂HPO₄·12H₂O 0.151g/l，HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷-磺酸，SigmaChem Co.)2.38g/l，EDTA(乙二胺四乙酸，Gibco BRL Co.)0.19g/l，碳酸氢钠0.35g/l，葡萄糖0.9g/l，青霉素100unit/ml，链霉素10mg/ml和两性霉素B25μg/ml)灌洗肝，切出经过处理的肝。

得到的肝置于干净的工作台上，用第二灌洗液(胶原蛋白酶(Gibco BRL)0.5g/l，胰酶抑制剂(Gibco BRL)0.05g/l，NaCl 8g/l，KCl 0.4g/l，CaCl₂ 0.56g/l，NaH₂PO₄·2H₂O 0.078g/l，Na₂HPO₄·12H₂O 0.151g/l，HEPES 2.381g/l，碳酸氢钠0.35g/l，青霉素100unit/ml，链霉素10mg/ml和两性霉素B 25μg/ml)再次灌洗，同时用人工心-肺仪(CapioxSX-10，Terumo，Japan)供给充足的氧并将灌洗液维持在37℃，灌洗速率不超过700ml/min。

肝包膜以及残余物质被去除，重复离心(四次，每次500rpm 2min)，通过洗涤分离2.0×10¹⁰肝细胞。

部分肝细胞由此获得，用于根据锥虫蓝染色排除法检测细胞存活力。结果，测定发现89％的细胞存活。

分离的肝细胞加入1L悬浮培养基(Williams’E培养基，包含胰岛素5mg/l，白蛋白0.1％和上皮细胞生长因子20μg/ml，Sigma ChemicalCompany)，置于旋转瓶中达浓度1.5×10⁶细胞/ml，产生的悬浮物培养10-20小时。当培养的肝细胞形成平均直径70μm的肝细胞聚集物时，从培养基收获聚集物。

2)制备含有肝细胞的凝胶珠

步骤1)中收获的肝细胞聚集物(肝细胞总数：2×10¹⁰，100ml)与1.5％藻酸盐溶液(500ml)混合，所得混合物利用多喷嘴注射器逐滴加入100mMCaCl₂溶液形成凝胶珠。用Williams’E培养基洗涤凝胶珠四次，去除多余的钙粒子。如图3所示，产生的凝胶珠的平均直径为1.1mm，如显微镜检证实的那样。

3)本发明生物人工肝系统的制备

本发明的生物人工肝系统显示于图1，通过将步骤2)所得含肝细胞的凝胶珠装填到体积550ml的生物反应器中制备。在这种情况中，连接管线4的长度调为40cm。

实验实施例1：本发明生物人工肝系统的体外性能检测

为了模拟实际肝功能衰竭患者的治疗，在开始的7小时将含有1300μg/dl氨(夸大的条件)的悬浮培养基(Williams’E培养基，含有胰岛素5mg/l，白蛋白0.1％和表皮细胞生长因子20μg/ml，Sigma Chemical Company)提供给本发明的生物人工肝系统，然后提供含有420μg/dl氨(实际肝功能衰竭病例中观察到的水平)4小时，其中每种培养基的补料速率设定为6ml/min。

图4所示结果显示所述处理之后，大约77％的氨从培养基中去除，甚至在11小时之后高解毒能力仍保持不变。

实验实施例2：利用肝功能衰竭猪的肝支持功能的性能检测

约50kg的小猪(可作为国际实验动物获得，3-4月龄)全身麻醉，并接受气管内插管，然后固定血管收集血样。麻醉通过使得动物吸入恩氟烷(Choongwae Pharma Corporation)来维持。

切开麻醉小猪腹腔之后，肝下下腔静脉以及门静脉被并列造口使得血流从旁路通过到达经静脉，由此诱导肝功能衰竭。

将双腔管插入被诱导肝功能衰竭小猪的经静脉内，连接本发明生物人工肝系统的血浆分离器(6，Cobe Spectra，Gambro BCT，USA)。

操作条件如下：

血浆分离器中的血液循环速率：90ml/min

分离自血液以及存在血浆分离器中的血浆的流速：40ml/min

通过生物反应器的循环速率：250ml/min

流体平面差：20cm

开始操作系统后，每小时自动脉收集血液样品以测定血氨浓度(受试组)。对对照组进行相同的操作：不连接生物人工肝系统的被诱导肝功能衰竭的猪(肝功能衰竭对照组)；连接生物人工肝系统但未将肝细胞装填在生物反应器中(生物反应器对照组)。此外，测定每组中猪的存活时间。

如图5A和5B所示，利用本发明生物人工肝系统的受试组的血氨浓度明显低于对照组的所述浓度，受试组的存活时间与对照组相比延长大约7.5小时。因此，确认本发明的生物人工肝系统可用于急性肝功能衰竭患者的恢复或寿命延长。

实验实施例3：比较本发明的生物人工肝系统与常规生物人工肝系统的凝胶珠破坏

为了证实本发明生物人工肝系统的优越稳定性，生物人工肝系统以与上述实施例中所述相同的方法制备，但生物反应器1的体积改变为260ml。

同时，图2所示比较系统根据常规方法制备(见Korean Patent Laid-open Publication No.2006-48546)：将如上述实施例步骤1)和2)中所述制备的含有肝细胞的凝胶珠装填在体积260ml的生物反应器中；调节生物反应器的上板以压迫自然沉淀的凝胶珠的上界20％；以及利用管状泵将血浆从生物反应器的底部循环到顶部。

受试溶液通过以2∶1的体积比混合在实验实施例2之后收获自生物人工肝系统的猪血浆与具有与实验实施例1中所用悬浮培养基相同组成的悬浮培养基混合获得.

受试溶液通过每个系统以流速300ml/min循环。在本发明的系统中，连接管线中充满的血浆与血浆储器中的血浆之间的流体平面差保持在40cm。

每2小时取15ml每种受试溶液，同时在每个系统中在上述条件下循环受试溶液6小时，在3000rpm离心10min以去除上清，加入锥虫蓝到总体积100μl。

由此获得的每种溶液转移到凹面载玻片上，总细胞数利用显微镜测定。

结果显示于表1。

表1

如表1所示，比较系统中，漏出凝胶珠的肝细胞数目在4小时循环后明显增加，而本发明的系统中，漏出细胞数甚至在循环6小时之后仍保持不变。

循环6小时后，从两个生物反应器的每个中进一步收集50ml样品，在4,000rpm离心4℃，从分离自每种样品的细胞利用DNeasy Kit(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)提取DNA(gDNA)。

PCR分析利用由此提取的DNA作为模板，并利用针对看家基因GAPDH基因的正向引物(SEQ ID NO：1)和反向引物(SEQ ID NO：2)。作为对照，最初的受试溶液以相同方式分析。

如图6A所示，本发明系统中的循环样品中没有检测到细胞，而比较相同中循环的样品中检测到细胞的存在。

同时，上述实验后，从本发明和比较系统的每个生物反应器收集5ml凝胶珠。根据显微镜检，本发明系统的凝胶珠没有损坏，而比较系统凝胶珠中大约共150个凝胶珠明显损坏(图6B)。

因此，可以肯定本发明的系统有效防止肝细胞漏出凝胶珠，而常规流上行式固定床系统则相反。

本发明根据上述实施方案描述，但应理解本领域技术人员可对其进行各种改变而仍在本发明范围内。

Claims (8)

1.生物人工肝系统，包含

装填有含哺乳动物肝细胞的凝胶珠的固定床生物反应器；

血浆储器，其与所述生物反应器成流体连通；

血浆分离器，其从血液分离血浆并将血浆提供至所述生物反应器；

流出小室，其接收来自所述生物反应器的血浆并通过连接流出小室和血浆储器顶部的连接管线将血浆提供至血浆储器；和

通风过滤器，其接触大气并位于血浆储器顶部，

其中所述生物反应器接收来自血浆分离器和血浆储器的血浆，和

其中所述血浆储器的位置高于所述生物反应器并将接收自流出小室的血浆提供至所述血浆分离器和生物反应器。

2.权利要求1的生物人工肝系统，其中所述生物反应器在其顶部和底部包含孔径为50-500μm的筛网。

3.权利要求1的生物人工肝系统，其中所述凝胶珠包含猪肝细胞。

4.权利要求1的生物人工肝系统，其中所述凝胶珠包含5x10⁶-5x10⁷肝细胞每毫升。

5.权利要求1的生物人工肝系统，其中包含在凝胶珠中的肝细胞为直径50-200μm的聚集体的形式。

6.权利要求1的生物人工肝系统，其中所述生物反应器的体积为100-1800ml，比横截面积为0.1-0.2cm²每毫升生物反应器体积。

7.权利要求1的生物人工肝系统，其中施加于所述生物反应器的压力是3-45mmHg。

8.权利要求1的生物人工肝系统，其中所述连接血浆储器顶部和流出小室的连接管线的垂直高度为4-61cm。

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