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Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung einer oxydativ
entfernbaren Schutzgruppe Als Hilfsmittel für die Synthese von Peptiden ist eine
große Anzahl von Gruppen vorgeschlagen worden, welche die endständige Aminogruppe
schützen und zum Schluß der Synthese wieder leicht entfernt werden können. Von diesen
wird der Carbobenzoxyrest am häufigsten angewendet. Alle praktisch angewandten Schutzgruppen
besitzen die Eigenschaft, daß sie sich nur auf hydrolytischem oder reduktivem Wege
abtrennen lassen.
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In der Formylgruppe wurde nun ein Rest gefunden, der ebenfalls die
Wirkung einer Schutzgruppe für terminale Aminogruppen besitzt, sich aber nach vollzogener
Peptidbildung auf oxydativem Wege abspalten läßt. Als besonders geeignet zur Abtrennung
dieser Gruppe aus synthetischen Formyl-Peptiden erwiesen sich wäßrige Wasserstoffperoxydlösungen
mäßiger Konzentration.
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Es ist bereits bekannt, Peptidsynthesen unter Verwendung der N-Formyl-Schutzgruppe
durchzuführen, wobei dann aber die Formylgruppe mittels alkoholischer Salzsäure
abgespalten wurde; hierbei wurden indessen schlechte Ausbeuten erhalten (Fortschritte
der Chemie organischer Naturstoffe, 13 [1956], S. 460).
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Es ist ferner versucht worden, als oxydativ mittels Wasserstoffperoxyd
entfernbare Schutzgruppe den Rest der Brenztraubensäure zu verwenden, jedoch mit
geringem Erfolg (Angew. Chemie, 69 [1957], S.363, linke Spalte, Abs. 2).
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Die erfindungsgemäße Verwendung der Formylgruppe bringt mehrere methodische
Vorteile. Die Einführung der Formylgruppe in die Ausgangsaminosäure gelingt bequem
und in guter Ausbeute mittels konzentrierter Ameisensäure und Essigsäureanhydrid,
also leicht zugänglichen und billigen Reagenzien. Aus der so gewonnenen Formylaminosäure
wird nach bekannten Methoden ein Formyl-Peptid synthetisiert und von diesem die
Formylgruppe dann oxydativ wieder abgetrennt. Diese oxydative Abtrennung weist gegenüber
den sonst üblichem hydrolytischen oder reduktiven Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe
verschiedene Vorzüge auf: Die Abtrennung kann in kurzer Zeit ohne besondere Vorkehrungen
mit einem jederzeit greifbaren Reagenz, z. B. Wasserstoffperoxyd, durchgeführt werden,
wobei ein Überschuß dieses Oxydationsmittels auf Grund seiner Flüchtigkeit nicht
stört. Die Oxydationsbedingungen lassen sich in weiten Grenzen variieren, und die
Oxydation kann, was wegen der Unlöslichkeit höherer Peptide in organischen Lösungsmitteln
von Wichtigkeit ist, in wäßriger Lösung vorgenommen, also auch empfindlichen Peptiden
angepaßt werden. Außerdem werden die nach diesem Verfahren gewonnenen freien Peptide
in guter Ausbeute und sehr rein erhalten. Beispiele 1. DL-Alanyl-alanin a) Formyl-DL-alanin
17,8 g DL-Alanin wurden in 336 ml 100°/oiger Ameisensäure gelöst und unter Rühren
bei Zimmertemperatur tropfenweise 112 1n1 Essigsäureanhydrid eingetragen. Nach 1stündiger
Reaktionsdauer wurde die Lösung im Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Die erhaltene
Kristallmasse wurde aus Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 770/,; Schmp.
: 149'C. b) Formyl-DL-alanyl-alanin-äthylester 3,51 g Formyl-DL-alanin wurden in
200 ml Dioxan unter Erwärmen in Lösung gebracht. Zu der erkalteten Lösung wurden
3,51 g DL-Alaninäthylester in 20 ml Methylenchlorid sowie 6,5g N,N'-Dicyclohexyl-carbodümid
in 20 ml Methylenchlorid unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben. Die Lösung wurde
2 Stunden gerührt und über Nacht stehengelassen. Nach Absaugen des ausgeschiedenen
Harnstoffes wurde das Lösungsmittel im Vakuum bei 35°C vollständig entfernt, der
Rückstand in 150 ml Methylenchlorid aufgenommen und mit 25 ml 5°/oiger Salzsäure
sowie 25 ml 5°/oigerNatriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Anschließend wurde
das Methylenchlorid im Vakuum entfernt und aus dem Rückstand der Formyl-Peptidester
mit heißem Wasser herausgelöst. Die wäßrige Lösung wurde dann im Vakuum bis zur
Kristallabscheidung
konzentriert. Ausbeute: 600/,;
Schmp.: 95 bis 97°C aus Essigester-Petroläther.
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c) Formyl-DL-alanyl-alanin 2 g Formyl-DL-alanyl-alaninester wurden
in 20m1 Dioxan gelöst und dann 40 ml 0,320 n-Barytlauge zugegeben. Nach 1stündiger
Verseifungsdauer wurde mit der äquivalenten Menge 1 n-Schwefelsäure neutralisiert,
der Bariumsulfatniederschlag in. der Wärme abfiltriert und das Filtrat im Vakuum
bis zur beginnenden Kristallabscheidung eingeengt, dann über Nacht stehengelassen
und nach der Abtrennung der Kristallmasse die Mutterlauge nochmals eingeengt. Ausbeute:
89°/0; Schmp.: 161 bis 163°C aus Essigester. d) Entfernung der Formylgruppe
2,7 g Formyl-DL-alanyl-alanin wurden mit 16,5 ml 150/0igem Wasserstoffperoxyd 2
Stunden bei 60°C auf dem Wasserbad erwärmt. Anschließend wurde die Lösung mit Salzsäure
auf pA 2 bis 3 gebracht und durch Extraktion mit Essigester im Kutscher-Steudel-Apparat
von Resten des Formyl-Peptids befreit. Nach Eindampfen der wäßrigen Lösung und Trocknen
des Rückstandes über P,05: DL-Alanyl-alanin - HCl. Ausbeute: 90°/0; Schmp.: 98 bis
102°C. 2. L-Valyl-glycin a) Formyl-L-valin 20 g L-Valin wurden in 341 ml Ameisensäure
gelöst und unter Rühren bei Eiskühlung 119,6m1 Acetanhydrid zugegeben. Nach 2stündiger
Reaktionsdauer wurden 110 ml Wasser hinzugefügt und die Lösung im Vakuum eingedampft.
Es wurden 22,5g Formyl-L-valin gewonnen. Ausbeute: 83"/,; Schmp.: 152 bis 153°C
aus Essigester; [ca]ö : -E-17,0°. b) Formyl-L-valyl-glycin-äthylester Die
Darstellung des Formyl-Peptidesters erfolgte 4.0 nach J. C. Sheehan und Mitarbeiter,
J. Amer. chem. Soc., 80, 1154 [1958]. Ausbeute: 82%; Schmp.: 154°C aus Essigester;
[%]'D: -50,8°. c) Formyl-L-valyl-glycin 4,2g Formyl-L-valyl-glycinester wurden in
40m1 Äthanol gelöst und mit 55 ml 0,467 n-Barytlauge versetzt. Die Verseifungsdauer
betrug 1 Stunde. Nach der darauffolgenden Neutralisation mit 22,2 ml 1 n-Schwefelsäure
wurde der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Ausbeute:
810/0; Schmp. : 219 bis 221'C aus Wasser; [cc] D : -48,8'.
d)
Entfernung der Schutzgruppe 1 g Formyl-Peptid wurde mit 8 g 150/0igem Wasserstoffperoxyd
2 Stunden bei 60°C umgesetzt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte wie bei Beispiel
1, d). Ausbeute: 70 0/0; Hydrochlorid Schmp. : 144 bis 147°C; [oc]ö : -E-42,8°.
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3. Glycyl-L-valin a) Formyl-glycin 15 g Glycin (0,2 Mol) wurden in
336 ml Ameisensäure gelöst und 112 ml Acetanhydrid tropfenweise unter Rühren zugeführt.
Die Temperatur stieg bis auf 45°C an. Nach Konzentrierung der Lösung im Vakuum wurde
das Formyl-glycin aus Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 850/,), Schmp. : 149 bis
151'C.
b) Formyl-glycyl-L-valinäthylester 3,09 g Formyl-glycin (0,03 Mol)
wurden in einem Gemisch von 150m1 aus gleichen Anteilen Dioxan und Methylenchlorid
gelöst. Dazu wurden 4,35 g (0,03 Mol) L-Valinester in 15 ml Methylenchlorid und
die äquimolekulare Menge N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid hinzugefügt. Die weitere
Verarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1, b). Ausbeute: 86"/,; [a] ö -14,3°.
c) Formyl-glycyl-L-valin 6 g des öligen Formyl-glycyl-L-valinäthylesters wurden
in 40 ml Äthanol gelöst und zur Verseifung 85 ml 0,375 n-Barytlauge hinzugefügt.
Die Verseifungsdauer betrug 1 Stunde. Nach Abfiltrieren des Bariumsulfatniederschlages
in der Wärme wurde das Filtrat im Vakuum auf dem Wasserbad bei 35°C eingeengt. Ausbeute:
86°/0; Schmp.: 244 bis 247°C aus Alkohol-Essigester; [,x]": -f-12,9°. d)
Entfernung der Schutzgruppe Das Dipeptid wurde nach der Oxydation mit 6 Äquivalenten
150/0igem Wasserstoffperoxyd unter den üblichen Bedingungen als Hydrochlorid isoliert.
Ausbeute: 700/,; [ix] ö : -6,2'.