DE1069102B

DE1069102B - Verfahren zur Herstellung von Lysin-Racemase

Info

Publication number: DE1069102B
Application number: DENDAT1069102D
Authority: DE
Inventors: New York N. Y. Hsinig Tsung Huan (V. St. A.)
Original assignee: Charles Pfizer and Co Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Publication date: 1959-11-19

Description

Verfahren zur Herstellung von Lysin-Racemase Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Enzyms zur Racemisierung von Lysin durch Züchtung von Kulturen gewisser Mikroorganismen.
In der Literatur ist bisher noch nicht über die Existenz Lysin racemisierender Stoffe - im nachstehenden als Lysin-Racemase bezeichnet - in irgendwelchen Mikroorganismen berichtet worden. Es wurde nun gefunden, daß überraschenderweise gewisse Mikroorganismen, wenn sie unter speziellen Bedingungen auf Nährmedien gezüchtet werden, Lysin-Racemase bilden, die sich in der chemischen Industrie für die synthetische Herstellung von 1-Lysin als sehr wertvoll erwiesen hat.
Synthetisches Lysin wird auf chemischem Wege in Form der racemischen Verbindung, z. B. dl-Lysin, hergestellt, aus dem 1-Lysin durch ein Standardspaltungsverfahren erhalten wird. Die Ausnutzung des zurückbleibenden d-Lysins, das 50 °/o der racemischen Verbindung ausmacht, ist für die chemische Industrie von höchster Bedeutung, um das Potential der synthetischen Herstellung des 1-Lysins zu erhöhen.
Nach den USA.-Patentschriften 2 586154 und 2 536 360 kann das d-Lysin durch Racemisierung auf chemischem Wege teilweise in dl-Lysin umgewandelt werden. Das 1-Lysin wird dann nach üblichen Verfahren aus der Racem-Verbindung abgespalten und das restliche d-Lysin wiederum racemisiert und gespalten, um weiteres 1-Lysin herzustellen. Es ist bekannt, daß 1-Lysin eine sehr wichtige Aminosäure ist.
Es wurde nun gefunden, daß durch Verwendung von Lysin-Racemase, die aus gewissen Mikroorganismen gewonnen wird, die Racemisierung von d-Lysin zu dl-Lysin mit 100°/oiger Umwandlung durch ein einfaches, nachstehend beschriebenes Verfahren möglich ist. 1-Lysin wird mit gleichen Ergebnissen auf die gleiche Weise racemisiert. Damit wurde ein neues Enzym gefunden, das in der chemischen Industrie bei der Herstellung von 1-Lysin von äußerster Wichtigkeit ist.
Das Verfahren zur Herstellung dieses neuen und wertvollen Enzyms (Lysin-Racemase) besteht darin, gewisse Mikroorganismen in Nährmedien zu züchten. Es ist dabei wichtig, daß das Medium Quellen für Kohlehydrat, organischen Stickstoff und anorganischen Stickstoff, z. B. Ammoniumsalze, enthält. Die Organismen werden auf Nähragar übertragen und von dem Schrägnährboden unter sterilen Bedingungen auf die beschriebenen Nährmedien abgeschwemmt. Man läßt die geimpften, sterilen Lösungen mehrere Stunden bis 1 Tag bei 20 bis 40°C sich entwickeln, um Impfmaterial für größere Kessel mit Rührwerk und Lüftungsanlage zu schaffen, die für eine submerse Gärung verwandt werden, obwohl gegebenenfalls auch Oberflächengärung angewandt werden kann.
Die submerse Gärung wird während einer für ein maximales Wachstum erforderlichen Zeit durchgeführt, die je nach den Mengen der verfügbaren Nährstoffe zwischen mehreren Stunden und mehreren Tagen liegen kann. Bei den beschriebenen Nährmedien war nach etwa 1 Tag das maximale Wachstum erreicht, das nach Standardverfahren, z. B. Messungen der Trübung, bestimmt wurde. Es ist selbstverständlich, daß zur Herstellung von Lysin-Racemase, die sich in den Bakterienzellen bei fortschreitendem Wachstum bildet und darin enthalten ist, kein maximales Wachstum des Organismus erforderlich ist. Lediglich im Interesse der Herstellung möglichst großer Lysin-Racemase-Mengen werden die Organismen in den beschriebenen Nährmedien einem maximalen Wachstum ausgesetzt. Das Nährsubstrat wird auf einen p11-Wert von 6,0 bis 8,0 eingestellt, der bevorzugte p11-Bereich liegt zwischen 6,5 und 7,5.
Bei der Gärung wird eine Temperatur zwischen 20 und 40°C eingehalten, Temperaturen zwischen 25 und 40°C haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
Nach dem Wachstum der Organismen, die auf Grund eines im nachstehenden beschriebenen Versuchs ausgewählt werden, kann der Lysin racemisierende Stoff auf verschiedene Weise gewonnen werden. Die Bakterienzellen werden mit Lysin in Berührung gebracht, nachdem das Nährsubstrat auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 8,0 und etwa 8,5, eingestellt worden ist. Das Gärmedium wird dann mit einer dünnen Toluolschicht bedeckt, um Verunreinigung zu verhindern. Nachdem das Gemisch 10 bis 30 Minuten geschüttelt worden ist, läßt man es mehrere Stunden bis 2 Tage, je nach der Menge des zu racemisierenden Lysins, zwischen :twa 20 und etwa 40°C stehen. Die -vorzugsweise an-;ewendete Temperatur liegt zwischen etwa 25 und etwa WC. Es ist nicht notwendig, das Enzym (Lysin-Zacemase) von den Bakterienzellen zu trennen, da das :ysin die Zellwände durchdringt und mit der Lysin-Zacemase in den Zellen in Berührung kommt.
Bei einem zweiten Verfahren werden die Bakterienellen aus dem Nährsubstrat entfernt, nach gründlichem Maschen mit Wasser in einem w äßrigen Medium ,uspendiert und auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, rorzugsweise 8,0 bis 8,5, gepuffert. Ein Gärmedium der m Beispiel l beschriebenen Zusammensetzung ergab E,2 bis 4,7 g getrocknete Bakterienzellen je Liter, ob-;leich bei Verwendung eines reicheren Nährmittels auch nehr Bakterienzellen erhalten werden können.
Obwohl die Wirksamkeit des Enzyms in den Zellen selbst sich ausgezeichnet für die Racemisierung von @ysin eignet, kann Lysin-Racemase nach irgendeinem ler verschiedenen Verfahren, die zu zellfreienAuftrbeitungsprodukten führen, aus den Zellen gelöst werden. Tierbei wird Mahlen, insbesondere mit Schleifstoffen, ,vie pulverisiertem Glas oder Sand, die Verwendung von Ultraschallenergie, wiederholtes schnelles Gefrieren und auftauen usw. angewandt. Genauere Beschreibungen für lie Verwendung isolierter, wieder suspendierter Zellen ind zellfreier Ausarbeitungsprodukte werden in den Lehrbüchern »Manometric Technique in Tissue Meta-)olismu von M. W. Umbreit und Mitarbeiter, Burgess Publishing Company, Minneapolis (1949), und »Respira-:ory Enzymesc; von H. Lardy, Burgess Publishing Jompany, Minneapolis (1949), gegeben.
Die Organismen, bei denen eine Lysin-Racemase-Bildung unter den erfindungsgemäßen Bedingungen angetroffen wurde, sind Arten der Gattung Proteus und ier Gattung Escherichia, die in den öffentlichen Kulturen-?ammlungen, z. B. American Type Culture Collection of Washington, D. C., leicht erhältlich sind, wo z. B. die folgenden Arten zu beziehen sind: P. vulgaris, ATCC4669, P. ammoniae, ATCC 7002, P. mirabilis, ATCC 9921, P. americanus, ATCC 4675, P. paraamericanus, ATCC 3059, P. rettgeri, ATCC 9918, P. spingidis, ATCC 6911, E, anindolica, ATCC 6879, E. freundii, ATCC 8454; P. inconstans, ATCC 12013.
Die Organismen, die Lysin-Racemase bilden, können leicht nach einem verhältnismäßig einfachen Verfahren bestimmt werden, man stellt die Anwesenheit von 1-Lysin in einem Reaktionsgemisch, das durch Zusammenbringen von d-Lysin mit den zu untersuchenden Organismen erhalten wird, fest. Die Niethode kann eine der verschiedenen bekannten Standardmethoden sein, z. B. kann man die enzymatische Dekarboxylierung des 1-Lysins verwenden, d. h. 1-Lysindekarboxylase durch Bacterium candaveris NCCT 6578, und Messen des entwickelten Kohlendioxydes. Das Verfahren wird in Standardwerken, wie z. B. »Methods in Enzymology«, von S. P. Colowick und N. 0. Kaplan, Bd. 3, S. 462, Academic Press, New York (1957), hinreichend beschrieben.
Die Mengen von d-Lysin, die racemisiert werden, hängen in erster Linie von der Menge der verwendeten Enzymsubstanz der Bakterienzellen, d. h. der in den Bakterienzellen enthaltenen Lysin-Racemase, ab. Im allgemeinen wurden bei Verwendung der Bakterienzellen von 1 1 des beschriebenen Nährsubstrats bei 100°/oiger Umwandlung in die racemische Verbindung, dl-Lysin, 80 bis 150 g d-Lysin, als Hydrochlorid, racemisiert. Nach Beendigung der Umsetzung wird der 1-Lysin-Gehalt des Gemisches mit 5001., bezogen auf den Gesamtlysingehalt nach dem beschriebenen Enzymtest mit 1-Lysindekarboxylase, bestimmt, das bedeutet eine 100°/oige Umwandlung von d-Lysin in dl-Lysin. Der Gesamtlysingehalt des Reaktionsmediums wird unter Verwendung von Standardverfahren durch quantitative Papierchromatographie bestimmt.

Das dl-Lysin wird aus dem Reaktionsmedium in fast reiner Form nach irgendeinem bekannten Verfahren gewonnen, z. B. durch Adsorption auf einem Schwefelsäureharz, wie Amberlite IR-120 (Ammonium cycle) (Röhm & Haas Co.), Eluieren mit verdünntem Alkali und Trocknen des Ausflusses. Eine zusätzliche Reinigung wirdgegebenenfallsnach Standardkristallisationsverfahren durchgeführt. Der 1-Lysin-Gehalt der kristallinen racemischen Verbindung kann weiterhin durch mikrobiologische Versuche dargestellt werden, z. B. durch Züchtung von Leuconostoc mesenteroides, unter Anwendung von Standardverfahren, die auf den absoluten Anforderungen des Mikroorganismus für die Aminosäure beruht. Dieses Verfahren ist aus Standardlehrbüchern ersichtlich, z. B. »The Microbiological Assay of Vitamin B Complex and Amino Acidsa von F. C. Barton Wright, Pitman & Sons, London (1952). Beispiel 1 P. vulgaris, ATCC 4669, wurde auf ein Agarnährmedium übertragen, das unter sterilen Bedingungen von einem Schrägnährboden in 500 ccm des folgenden Mediums in einen Fernbachkolben abgeschwemmt wurde, der vorher durch eine 30 Minuten dauernde Behandlung im Autoklav bei einem Druck von 1,4 kg/cm' sterilisiert worden war:

g/1

K2HP04 ............................ 7,0

KH,P04 ............................ 3,0

Trinatriumcitrat .... . . . . . . . . . . . . . . . ... 0,4

MgS04 - 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 0,1

Hefeextrakt ......................... 0,5

Glukose (getrennt sterilisiert) .......... 10,0

(N H4)2 S 04 .......................... 0,1

Der Organismus wurde in diesem Medium unter 20stündigem Schütteln bei 28°C gezüchtet.

100 cm3 der Impfstoffkultur wurden unter sterilen Bedingungen zu 21 des folgenden Mediums zugefügt, das vorher durch 60 Minuten andauernde Behandlung bei einem Druck von 1,4 kg/cm2 im Autoklav sterilisiert worden war.

g/1

Maisquellwasser ...................... 20

(N H4)2 HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 10

Scheideschlamm roher Rüben ............ 20

Rohes Glycerin ......................... 10

Mg S 04 - 7 11,0 ........................ 1

Einstellung des p11-Wertes auf 7,5 mit NH40H

Das geimpfte Medium wurde unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 1750 Umdrehungen/Min. 22 Stunden bei 28°C bebrütet. Die Brühe wurde papierchromatographiert, das die Abwesenheit von Lysin zeigte.

20g d-Lysin-hydrochlorid wurden zu 250 crn3 dieser Brühe hinzugefügt. Mittels Ammoniumhydroxyd wurde das Gemisch auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt und 4 cm3 Toluol zugegeben. Die Mischung wurde dann 10 Minuten geschüttelt und 20 Stunden bei 28°C im Brutofen gehalten. Nach dieser Zeit war das d-Lysin in 100°/oiger Ausbeute in dl-Lysin umgewandelt. Das 1-Lysin wurde nach einem Standardverfahren bei 50 % des gesamten Lysingehaltes durch einen Enzymversuch mit 1-Lysindekarboxylase von Bacterium cadaveris, NCTC 6578, untersucht.
Mit Salzsäure wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 3,4 eingestellt und dann filtriert. dl-Lysin wurde durch eine Ionenaustauschbehandlung mit Schwefelsäureharz Amberlite IR-120 gewonnen. Das Standardkristallisationsverfahren zur Reinigung ergab reines dl-Lysin-hydrochlorid. Der 1-Lysin-Gehalt dieses Gemisches wurde nach Standardverfahren als 50°/oige mikrobiologische Untersuchung mit Leuconostoc-mesenteorids-Züchtung bestimmt. Die optische Drehung ist gleich Null.

Beispiel 2 Ein Versuch wurde wie im Beispiel l durchgeführt, mit der Abänderung, daB das Gärmedium die folgende Zusammensetzung hatte:

g/1

K,HP04 ............................ 7,0

(N H4)2 H P 04 ........................ 3,0

(N H4)2 S04 .......................... 1,5

M9S04 - 7 H20 ...................... 0,1

Hefeextrakt ......................... 0,2

Glycosemonohydrat (getrennt sterilisiert) 10,0

Das Gärverfahren wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt und die Organismen, wie angegeben, verwertet. Dabei wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

Beispiel 3 P. vulgaris, ATCC 4669, wurde nach dem gleichen Verfahren wie Beispiell gezüchtet. Nach maximalem Wachstum wurde die Gärbrühe zentrifugiert und die Bakterienzellen gründlich mit Wasser gewaschen. Die getrockneten Zellen aus 1 1 Gärbrühe wogen 4,5 g.
Die Bakterienzellen aus 250 cm3 Gärbrühe wurden erneut in Wasser suspendiert, das Medium mit einem Puffermittel auf einen pH-Wert von 8,3 eingestellt und 4 cm3 Toluol hinzugefügt. Dann wurden 20 g d-Lysin zugefügt und die Racemisierung, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung des Organismus P. Ammoniae, ATCC 7002, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 5 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung des Organismus P. mirabilis, ATCC 9921, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 6 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von 1-Lysin mit gleichen Ergebnissen wiederholt. Beispiel 7 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von P. paraamericanus, ATCC 6059, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 8 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von P. americanus, ATCC 4675, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 9 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von P. rettgeri, ATCC 9918, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 10.
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von P. sphingidis, ATCC 6911, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 11 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von E. anindolica, ATCC 6879, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 12 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von E. freundii, ATCC 8454, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
Beispiel 13 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von P. inconstans, ATCC 12013, mit gleichen Ergebnissen wiederholt.

Claims

PATENTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von Lysin-Racemase, dadurch gekennzeichnet, daB man einen Stamm eines Mikroorganismus der Art Proteus vulgaris, P. ammoniae, P. mirabilis, P. americanus, P. paraamericanus, P. rettgeri, P. spingidis, P. inconstans, Escherichia anindolica oder E. freundii in einem wäBrigen Nährmedium, das Quellen von Kohlehydraten, organischem und anorganischem Stickstoff enthält, bei einem anfänglichen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0 züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB man den Organismus unter submersen, aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C züchtet.