DE1049335B

DE1049335B - Verfahren zur Herstellung von FIavinadenin-Dinucleotid (Gärung)

Info

Publication number: DE1049335B
Application number: DENDAT1049335D
Authority: DE
Inventors: Yoshio Yamamoto Hyogo und Juzo Kaneko Osaka Toru Masuda (Japan)
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication date: 1959-01-29

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Flavinadenin-Dinucleotid, im folgenden kurz als FAD bezeichnet.

Sträub (Nature, 14.1,603 [1938]) und Warburg und Christi an (Biochem.Z.,295,261 ;298,150 [1938]) isolierten ein aktives Coenzym der d-a-Aminosäureoxydase aus Hefe usw. und identifizierten dieses als FAD, das sich aus 1 Molekül Riboflavin, 1 Molekül Adenosin und 2 Molekülen Phosphorsäure zusammensetzt. Nach diesen Berichten ist FAD im Körper der Mikroorganismen außerordentlich weit verbreitet. Aus Hefe wird jedoch das FAD am zweckmäßigsten erhalten.

Das FAD hat als Coenzym eine große Bedeutung bei der Oxydation im lebenden Organismus. In der Leukoform wirkt ... es als wasserstoffaufnehmende Komponente. Enzyme, die das FAD als Coenzym erfordern, sind d-a-Aminosäureoxydase, DPN-Cytochrom C, Reductase, Diaphola.se I, Glucose-dehydrase (Notatin), Aldehydoxydase, Xanthinoxydase, Chininoxydase, Histaminase, Fumarinsaurehydra.se usw. Das FAD ist eine für den lebenden Organismus wesentliche Substanz und wird auch als ein notwendiges Reagenz bei dem Studium von Enzymen und der enzymatischen. Bestimmung von Substraten verwendet.

Warburg und Christian stellten das FAD etwa wie folgt dar: Aus dem Extrakt des Ausgangsmaterials (Hefe) wird das Eiweiß entfernt und das FAD aus dem Extrakt in einem Lösungsmittel aufgenommen, wobei von der Verschiedenheit der Verteilungskoeffizienten in den zwei Lösungsmitteln Gebrauch gemacht wird. Hierauf wird das FAD als Silbersalz gefällt und schließlich über das Bariumsalz isoliert. In diesem Fall ist die Ausbeute sehr gering. Sie beträgt nur 1,3 mg aus 1 kg Pferdenieren oder -leber oder 2,6 mg aus 1 kg Hefe. Darüber hinaus ist das Verfahren für die industrielle Herstellung von FAD nidhit nur zu kompliziert, sondern, auch nicht wirtschaftlich.

Die Erfinder haben früher festgestellt, daß rohes Vitamin B₂, im folgenden kurz V. B₂ bezeichnet, das durch submerse Kultur von Eremothecium ashbyii erhältlich ist, geringe Verunreinigungen an FAD enthält, während in dem Myzel des Pilzes große Mengen FAD vorhanden sind. Nach eifrigen Studien fanden die Erfinder ferner folgendes:

Der V. B₂ erzeugende Pilz wächst wahrend des ersten Kulturstadiums gut, aber nach einer Weile hört die Gewichtszunahme des Myzels auf, und das Gewicht nimmt allmählich ab. Die Zeit, während der das Gewicht des Myzels zunimmt, wird als Wachstumsperiode und die hierauf folgende Zeit, als Retrogressionsperiode bezeichnet. Die Abnahme des Gewichtes Verfahren zur Herstellung
von Flavinadenin-Dinucleotid (Gärung)

Anmelden

Takeda Pharmaceutical Industries; Ltd._r
Osaka (Japan)

Vertreter: Dr.-Ing. A. v. Kreisler, Dr.-Ing; K. Schönwald,

Dipl.-Chem. Dr. phil. H. Siebeneicher
^X5 und Dr.-Ing. Th. Meyer, Patentanwälte, ·:.

Köln 1, Deichmannhaus -

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 8. Juli und 9. Juli 1954 ■ ■ "'.

Töru Masuda, YöshiÖ Yamamoto,

Hyogo und Juzo Kaneko, Osaka (Japan),

sind als Erfinder genannt worden

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des Myzels während der Retrogressionsperiode scheint durch starke Autolyse des Myzels verursacht zu werden. ■ > ■. ■ . . ■ t

Während der Wachstumsperiode wird im Myzel nur wenig FAD gebildet und angereichert, wahrscheinlich weil das FAD zerstört und aus dem Myzel ■ ausgeschieden wird. In der Retrogressionsperiode reichert sich das FAD im Myzel aber merklich an, und nach einiger Zeit wird ein Maximum erreicht. Danach sinkt jedoch die FAD-Menge wieder : allmählich, und schließlich wird das gesamte FAD durch Autolyse des Myzels zerstört. Soll die Kultur zur Gewinnung von FÄD dienen, so muß die Züchtung nach einer gewissen Zeit unterbrochen werden. Die zur. Erreichung der Retrogressionsperiode und der maximalen r Anreiche-' rung des FAD notwendige Zeit hängt von den Kulturbedingungen und der Art des verwendeten Pilzstamtnes ab. In einem bestimmten Fall hört beispielsweise die Zunahme des Gewichtes des Myzels naöh. ungefähr 50stündiger Kultur auf, und das Gewicht bleibt bis zu etwa 140 Stunden fast unverändert. Es sinkt jedoch hierauf merklich. Die Anreicherung des FAD erreicht bei etwa 120 Stunden ihr Maximum. Das zum besten Zeitpunkt während der Retrogressionsperiode abge-

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trennte Myzel enthält 0,15^lbis 0,3 g oder mehr FAD Lösungsmittel, wie flüssigem Phenol, in dem FAD

in 10,0 g trockenem. Myzel, während das während der einen großen Verteilungskoeffizienten hat, geschüttelt,

Wachstumsperiode abgetrennte Myzel im besten Falle so wandern die Flavine einschließlich FAD in das

nur 0,06 g FAD in 10,0 g trockenem Myzel enthält. organische Lösungsmittel. Wird die organische Lösung

Als V.B₂' erzeugender» Mikroorganismus wird ' 5 mit einem Lösungsmittel, wie Äther, zur Erniedrigung Eremothecium ashbyii, Ashbya gossippi od. dgl. ver- des Verteilungskoeffizienten des FAD gemischt und wendet und zur Erzeugung von FAD aerob auf einem mit Wasser geschüttelt, so gehen die Flavine wiederfesten oder flüssigen Medium kultiviert. Sie werden um in die wäßrige Schicht. Wird andererseits der aber vorzugsweise in tiefen Bottichen unter den unten Extrakt mit einem Lösungsmittel, wie Benzylalkohol, beschriebenen Bedingungen kultiviert. io in dem das V. B₂ einen großen Verteilungskoeffizienten

Wie bei der Herstellung von V. B₂ enthält das hat, geschüttelt, so wandert das V. B₂ des Extraktes Medium Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen, in das Lösungsmittel, während das FAD in dem Phosphate, andere anorganische Salze und in vielen wäßrigen Extrakt verbleibt. Wird ein Pyridin-Fällen eine Spur von Metallen. Die Metalle sind im Methanol-Extrakt des Myzels konzentriert, mit einem allgemeinen spurenweise als Verunreinigungen in 15 gleichen Volumen Chloroform gemischt und mit anderen Substanzen des Mediums enthalten. Als Wasser ausgeschüttelt, so geht das FAD in das Wasser Kohlenstoffverbindungen werden wasserlösliche Kohle- über, während sich das V-B₂ abscheidet. Auf dieser hydrate, wie Röhrzucker, Glukose, Maltose, Fruktose Grundlage kann die Abtrennung des FAD im Gegenusw., und als Stickstoffverbindungen z. B. Fleisch- strom oder chromatographisch durchgeführt werden. extrakt, Peptone, Aminosäuren, hydrolysiertes oder 20 Auch der Unterschied in der Adsorptionsfähigkeit nicht hydrolysiertes Fischfleisch, Sojabohneneiweiß, zwischen dem FAD und anderen Substanzen kann zur das Myzel als solches oder von verarbeiteten faserigen Abtrennung des FAD verwendet werden. Wird z. B. Pilzen des Penicilliums oder anderer Arten usw. und der Extrakt des Myzels mit einem Adsorbens, wie als anorganische Substanzen Kalium-, Natrium-, CaI- aktiver Kohle, gemischt, so kann das adsorbierte FAD ciurh-, Magnesium-, Schwefel-, Eisenverbindungen 25 mit einem Lösungsmittel eluiert werden. Das Lösungsund gewisse Elemente in. Spuren verwendet. Die Zu- mittel kann das gleiche wie bei der Extraktion oder gäbe einer geringen Menge an Nikotinsäure, Inosit, ein anderes sein. Es wird je nach der Art des ver-Pantothensäure, Vitamin B₁₂ und anderen, wachstum- wendeten Adsorbens und der Menge der adsorbierten fördernden Substanzen, wirkt sich günstig aus. Substanzen gewählt.

Die Kultur" kann bei einem p_H von etwa 5 bis 8, 30 In den folgenden Beispielen wird die Erfindung

vorzugsweise bei einem p_H von 5,5 bis 7,5, und zweck- näher erläutert:

mäßigerweise bei einem; pß von 6,3 bis 7,0 durch- Beispiel 1
geführt werden. Die Temperatur der Kultur beträgt

etwa 20 bis 35° C, vorzugsweise '27 bis 32° C. Die Polypeptone 0,8 °/o

Menge der während der Kultur durchgeleiteten Luft 35 Bonitoextrakt 0,8 °/o

wird gemäß den anderen Bedingungen und der Art Glukose 2,0 °/o

der Beanspruchung genau eingestellt. Kaliumphosphat 0,2 %

Das in dem Myzel enthaltene FAD kann vorteilhaft Magnesiumsulfat 0,1 Vo

mit Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel Natriumchlorid 0,1%

extrahiert werden. Niedrige aliphatische Alkohole 40 Sojabohnenöl 1,1 %

oder Ketone, Pyridine ul dgl. können für diesen 400 1 einer wäßrigen Lösung des obigen Gemisches

Zweck verwendet werden.. Wasser und wäßrige werden auf ein p_H von 6,0 eingestellt, mit einer KuI-

Lösungen sind gut extrahierende Lösungsmittel und tür von Eremotecium ashbyii geimpft und bei 28° C

wirtschaftlich. Es ist zweckmäßig, die enzymatische während 65 Stunden vergoren, worauf unter Erhalt

Aktivität des Myzels zu hemmen oder das Myzel zu 45 von etwa. 8 kg des nassen Myzels abfiltriert wird.

zerstören, bevor die Extraktion stattfindet, um die Zer- 1 kg des Myzels wird mit 3 1 Wasser von 80° C wäh-

setzung des FAD durch; Autolyse zu verhindern. Wird rend 15 Minuten unter Rühren extrahiert, der Extrakt

Wasser oder ein wäßriges Lösungsmittel verwendet, hierauf abfiltriert und der Rückstand noch einmal mit

so können die Zerstörung des Myzels und die wir- 1 1 Wasser von 80° C während 15 Minuten extrahiert

kungsvolle Extraktion bei 60 bis 100° C erreicht 50 und abfiltriert. Die vereinigten Extrakte werden, so-

werden. Als wäßriges Lösungsmittel wird eine wäßrige dann mit Eiswasser gekühlt und im Dunkeln während

Lösung verschiedener anorganischer oder organischer etwa 3 Stunden stehengelassen. Hierauf wird das

Verbindungen oder Pufferlösungen verwendet. Das abgeschiedene V. B₂ abfiltriert. Zu dem Filtrat werden

Lösungsmittel wird entsprechend den erforderlichen 20 ecm Eisessig gegeben und darauf 2 kg Ammonium-

p_H-Werten und anderen Bedingungen gewählt, wobei 55 sulfat. Die Mischung wird 3 Stunden an einem kühlen

ein p_H nahe dem Neutralpunkt geeignet ist, da ein zu dunklen Ort stehengelassen, dann, das abgeschiedene

saures oder ein zu alkalisches p_H das FAD zersetzen Eiweiß abfiltriert. Das Filtrat wird mit etwa 300 ecm

würde. !- flüssigem Phenol ausgeschüttelt und die Phenolschicht

' Das FAD kann aus dem Extrakt wie folgt abge- abgetrennt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt,

trennt werden: Falls der Extrakt wäßrig ist, wird 60 Die vereinigten Phenolschichten werden zweimal mit

zunächst durch Zugabe einer organischen Säure oder dem gleichen Volumen einer gesättigten Natrium-

von Ammoniumsulfat das Eiweiß, niedergeschlagen chloridlösung ausgewaschen. Der Phenolschicht wird

und entfernt. Falls dagegen das Filtrat konzentriert hierauf das gleiche Volumen Äther zugegeben und das

ist und ein wasserfreies, hydrophyles organisches Gemisch mit je 100 ecm Wasser viermal extrahiert.

Lösungsmittel, wie Alkohol, zugegeben wird, scheidet 65 Die vereinigten Extrakte werden mit etwa.500 ecm

sich FAD ab. . Benzylalkohol ausgeschüttelt, Dieses. Verfahren wird

■Der Unterschied in dem Verteilungskoeffizienten viermal zur Entfernung des V. B₂ angewandt. Die.

des FAD in^f zwei Lösungsmitteln wird ebenfalls zur wäßrige Schicht wird schließlich mit. dem gleichen

Abtrennung des FAD benutzt. Wird z. B. der von Volumen Äther ausgewaschen, im Vakuum auf etwa

Eiweiß befreite Extrakt mit einem organischen 70 50 ecm eingeengt und in etwa 500 ecm 99°/oigen

Alkohol gegossen. Nach dem Abkühlen mit Eiswasser wird das abgeschiedene FAD abfiltriert.

Beispiel 2

Dieselbe Vergärung wie im Beispiel 1 wird während 120 Stunden durchgeführt, wobei etwa 7,5 kg des nassen Myzels erhalten werden. 1 kg des Myzels wird wie im Beispiel 1 behandelt, und es wird gelbes FAD-haltiges Pulver erhalten.

Beispiel 3

1 kg des nassen, nach Beispiel 2 erhaltenen Myzels wird mit Wasser von 80° C extrahiert und abfiltriert. 100 g aktive Kohle werden zu 4 1 des Filtrates gegeben, worauf das Gemisch durchgeschüttelt und abfiltriert wird. Dasselbe Verfahren wird noch zweimal unter Verwendung von 50 und 30 g aktiver Kohle wiederholt. Die aktive Kohle wird hierauf viermal mit je etwa 400 ecm 5O°/oigem Pyridin unter Erwärmung auf einem Wasserbad während 30 Minuten extrahiert und heiß abfiltriert. Das Filtrat wird zur vollständigen Entfernung des Pyridins eingeengt, worauf die eingeengte Lösung viermal mit dem gleichen Volumen Benzylalkohol ausgeschüttelt wird. Die wäßrige Schicht wird mit dem gleichen Volumen Äther ausgewaschen, im Vakuum auf etwa 50 ecm eingeengt und in etwa 500 ecm 99°/oigen Alkohol gegossen, worauf nach dem Abkühlen mit Eiswasser das ausgeschiedene FAD abfiltriert wird.

Beispiel 4

Ein Gemisch von Wasser und Pyridin im Verhältnis von 20 : 80 wird 1 kg des nassen, nach Beispiel 2 erhaltenen Myzels zugefügt und das Gemisch auf dem Wasserbad erhitzt, worauf es an der Wasserstrahlpumpe abgesaugt wird. Dieses Verfahren wird zur vollständigen Extraktion wiederholt. Die vereinigten Filtrate werden gegebenenfalls nach einem; nochmaligen Filtrieren im Vakuum auf etwa 300 ecm eingeengt und hierauf mit Chloroform zur teilweisen Entfernung des V. B₂ ausgeschüttelt. Nach dem Waschen mit Äther wird die wäßrige Schicht wiederholt mit je etwa 500 ecm Benzylalkohol zur vollständigen Ent-

ίο fernung des V. B₂ geschüttelt. Die wäßrige Schicht wird mit dem gleichen Volumen Äther gewaschen, im Vakuum auf etwa 50 ecm eingeengt und in etwa 500 ecm 99°/oigen Alkohol gegossen. Nach dem Abkühlen mit Eiswasser wird das ausgeschiedene FAD abfiltriert.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Flavinadenin-Dinucleotid aus Vitamin B₂ erzeugenden Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossippi in üblicher Weise gezüchtet, das Myzel nach Beendigung seiner Gewichtszunahme mit Wasser oder einem wäßrigen organischen Lösungsmittel bei annähernd neutraler Reaktion extrahiert und das Flavinadenin-Dinucleotid gegebenenfalls durch Verteilungsextraktion oder auf chromatographischetn Wege oder durch Adsorption und Elution isoliert wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:
»Enzymologie« von Otto Hof f mann-Ostenhof, Wien, 1954, S. 509 und 512.