DE1037653B - Verfahren zur Gewinnung eines neuen Vitamin-B-Faktors - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung eines neuen Vitamin-Bl,-Faktors Gegenstand der Erfindung ist die Gewinnung eines neuen schwefelhaltigen Vitamin-B"-Faktors, des 2-Methylmercaptoadenincobalaminanalogon aus Faulschlamm.
• Der neue Vitamin-BRFaktor unterscheidet sich von den übrigen bisher bekannten B12 Faktoren durch seinen basischen Anteil. Er besitzt nämlich als Baustein 2-Methylmercaptoadenin an Stelle von 5,6-Dimethylbeazimidazol (im Vitamin B12), 5-Hydroxybenzimidazol (im Faktor III), Adenin (im Pseudovitamin B12) bzw. 2-Methyladenin (im Faktor A).
• Die nachfolgend beschriebene Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Gewinnung des oben als 2-Methvlmercaptoadenin-cobalaminanalogon bezeichneten Produktes.
• Als Quelle zur Gewinnung dieser Substanz dient der bei der Abwasserreinigung anfallende Faulschlamm, der bekanntlich als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Vitamin B12 oder anderen B12 Faktoren verwendet werden kann (s. deutsche P,tentseh3-ift @92?,.16).
• Das Verfahren selbst besteht in einer sinnvollen Kombination bereits bekannter Methoden und beruht da:auf, daß das auf die übliche Weise hergestellte und für die weitere chromatographische Reinigung geeignete trockene Kieselgurpräparat einer zweistufigen zellulosechromatographischen Trennung unterworfen wird.
• In der ersten Stufe dient als Entwickler wasserhaltiges sekundäres Butanol oder wasserhaltiges n-Butanol mit oder ohne Zusatz von chromatotröpen Salzen (vgl. W. Friedrich, G. Gross u. K. Bernhauer, Mikrochim. Acta 1956, S. 134), wie z. B. Kaliumperchlorat oder Natriumtetraphenyloborat, wobei der Entwickler erfindungsgemäß zusätzlich nur eine beschränkte Menge CN-Ionen enthält, nämlich so viel, als dazu ausreicht, um den neuen schwefelhaltigen Faktor als Monocyanokomplex (in Form einer rotgefärbten Zone) in der Chromatographiersäule wandern zu lassen. Um dies zu erreichen, genügt es im allgemeinen, dem Entwickler 0,1 bis 0,5 ml 10°/aiger Blausäurelösung je Liter zuzusetzen. Die genaue Menge an Blausäure richtet sich nach der Beschaffenheit des Cellulosematerials und ist jeweils zu ermitteln. Unter diesen Bedingungen läuft der neue schwefelhaltige B12 Faktor als Monocyanokomplex nur ein wenig langsamer als Vitamin B12 und Faktor Ib und läßt sich von den langsamer laufenden Faktoren, wie Faktor 11I, Faktor A und Pseudovitamin Bit, gut trennen.
• In der zweiten Stufe ist der Entwickler bis auf die verwendete Menge an CN-Ionen der gleiche. Man setzt ihm nun aber erfindungsgemäß mehr CN-Ionen zu, nämlich so viel, daß der schwefelhaltige B12 Faktor als Dicvanokomplex (violett gefärbt) in der Chromatographiersäule wandert. Um dies zu erreichen, muß man im allgemeinen dem Entwickler 1 bis 3 ml 10°/oiger Blausäurelösung je Liter zusetzen. Unter diesen Bedingungen läuft der neue schwefelhaltige B12 Faktor als Dicyanokomplex ungefähr so rasch wie Faktor III und läßt sich von den schnelleren Faktoren, wie z. B. Vitamin B12 und Faktor l b, gut trennen. Das in der zweiten chromatographischen Stufe erhaltene Konzentrat enthält nun den schwefelhaltigen B12 Faktor in reiner Form und kann in üblicher Weise zum kristallisierten Produkt verarbeitet werden.
• Der nach dem geschilderten Verfahren gewonnene neue Faktor besitzt folgende Eigenschaften: Er kristallisiert aus wasserhaltigem Aceton sehr rasch in verhältnismäßig groben Prismen. In seinem Absorptionsspektrum fehlt das für Vitamin B12 charakteristische Maximum bei 278 m#t" dagegen ist ein schwaches Maximum bei 302 m#t (Ei m 92) vorhanden; die sonstigen Maxima gleichen denen der anderen Bit Arten. Das Maximum bei 278 m#t kommt in der Dicyanoform in der üblichen Stärke zum Vorschein. Der neue B12 Faktor verhält sich im pH-Bereich 1,9 bis 12 elektrophoretisch neutral, in seiner papierchromatographischen U'anderung unterscheidet er sich (als Dicyanokomplex) nicht sehr beträchtlich von Faktor III (Tab. 1).
• Der neue Vitamin-B12-Faktor reagiert mit salpetriger Säure unter Bildung eines weiteren neuen schwefelhaltigen B12 Faktors (Tab. 1). Auf Grund seiner Bildungsweise und seiner Eigenschaften ist dieser Faktor als 2 - Methylmercapto - 6 - hydroxy purin - cobalaminanalogon zu bezeichnen. Dieser Faktor hat ein für ^Cobalamine« typisches Absorptionsspektrum (Maxima bei 278, 361 und 548 m#t). Er verhält sich elektrophoretisch schwach sauer in neutralen Puffern.
• Durch Abbau des neuen Faktors mit Cerhydroxyd (s. W. Friedrich u. K. Bernhauer, Chem. Ber. 89, 2507, 1956) und Chromatographie des Hydrolysates an einem basischen Ionenaustauscher, wie z. B. den unter dem geschützten Namen Dowex-2 im Handel erhältlichen Produkt wird Faktor B und ein Nucleosid, 2-Methylmercapto-7-(d-ribofuranosido)-adenin, erhalten. Das Nucleosid kann nach weiterer Reinigung mit Hilfe des carboxylhaltigen Ionenaustauschers, der unter dem geschützten Namen Amberlite IRC-50 im Handel erhältlich ist, in ganz reinem Zustand gewonnen werden. Es fällt dann als amorphes, farbloses, gut wasserlösliches Pulver an. Das Absorptionsspektrum des Nucleosides hat folgende Maxima: In 0,1 n-HCl bei 247 m#t (e = 21,1 - 103) und bei 189,5 m#t (e = 10,3 - 103); in 0,1 n-KOH bei 238 m#t (E = 21,4 - 103) und bei 287,5 %t (e = 6,1 - 103). Im Papierchromatogramm läuft das Nucleosid etwas schneller als Adenosin. Nach Entwicklung mit: (1) n-Butanol-Äthanol-Wasser-N H3 bzw. mit (2) wassergesättigtem n-Butanol werden für R Adeao,m die Werte (1) 1,17 und (2) 1,21 gefunden (vgl. F. Cramer, Papierchromatographie, 2. Auflage, Verlag Chemie GMBH., Weinheim (Bergstr.) 1953; Papier: Schleicher &- Schüll Nr. 1043 A; aufsteigend). Die Flecke des Nucleosides fluoreszieren im UV-Licht hellblau. Durch Hydrolyse des Nucleosides mit 0,05 n-HCl bei 100- während 15 Minuten entsteht im molaren Verhältnis 1 : 1 d-Ribose und 2-liethvlmercaptoadenin. Tabelle 1. Papierchromatographisches Verhalten der neuen B12 Faktoren) (schwefelhaltige Faktoren als Dicyanokomplexe)

  2-Methylmercapto-

  2.Methylmercapto- 6-hydroxypurin-

  Entwickler adenincobalamin- cobalamin-

  analogon analogon**)

  RB,_ RFakt.III RB,, I RFakt.I Il

  a .............. 0,82 1,1 0,62 0,87

  b .............. 0,75 1,07 0,43 0,60

  c .............. 0,65 0,93 0,59 0,88

  d .............. 0,43 ! 0,8 0,34 0,56

  *) Papierchromatogramme aufsteigend, Entwicklungsdauer

  24Stunden, Schleicher & Schüll-Papier 2043A, EutRickler

  (stets CH-haltig):

  a = wassergesättigtes sekundäres Butanol, b = wasser-

  haltiges sekundäres Butanol + NH,,c = wassergesättigtes

  sekundäres Butanol mit Kaliumperchlorat, d = wasserge-

  sättigtes sekundäres Butanol mit 0,5 °/a Natriumtetraphe-

  nvloborat.

  **) Darstellungausdem2-Methylmercaptoadenincobalaminan-

  alogon siehe unten.

  Der neue Faktor ist pharmakologisch von Interesse. Man kann ihn aber auch z. B. mittels Cerhydroxyd zu Faktor B abbauen und dieses biosynthetisch zur Herstellung von Vitamin B12 oder anderen B12 Faktoren verwenden. Beispiel 16 cbm Faulschlamm werden in üblicher Weise zum Kieselgur-Trockenpräparat verarbeitet, das sämtliche B12 Faktoren des Ausgangsmediums enthält. Bei der Zellulosechromatographie in halbtechnischem Ausmaß mit n-Butanol, enthaltend Kaliumperchlorat und 0,3 ml 10°/Qiger Blausäurelösung je Liter als Entwickler, erscheint knapp nach den Zonen des Vitamins B12 und des Faktors 11) eine Bande, die in einer gesonderten Fraktion aufgefangen wird. Aus dieser erhält man in üblicher Weise 150 g Kieselgur-Trockenpräparat, das mit 4 ml 10°,/jger wäßriger Blausäurelösung versetzt und nach dem Vermischen in vier Säulen (je 60 x 230 mm) aus Zellulosepulver (Whatman Standard Grade) eingefüllt wird. Bei der Entwicklung mit einem Gemisch aus 750 ml sekundärem Butanol, 250 ml Wasser, 2 ml 10°;'oiger wäßriger Blausäure und Kaliumperchlorat (bis zur Sättigung) läuft eine kräftige violette Zone des Faktors Ib voran, der eine violettrote Zone des 2-Methyimercaptoadenincobalaminanalogon folgt. Die zueinander gehörigen Fraktionen werden vereint und mit Petroläther versetzt. Die wäßrige Phase wird mit Phenol-o-Dichlorbenzol extrahiert, der organische Extrakt mit Wasser gewaschen und nach Zusatz von sekundärem Butanol und Diisopropyläther mit Wasser extrahiert, der wäßrige Extrakt nach dem Waschen mit einem Gemisch aus sekundärem Butanol und Diisopropyläther im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und in üblicher Weise durch Zusatz von Aceton zur Kristallisation gebracht. Die Substanz kristallisiert sehr rasch. Die Ausbeute an wasserhaltigem Produkt (etwa 13 °ä Wasser) beträgt 1930 mg.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Gewinnung des 2-Methylmercaptoadenin-cobalamirranalogons, eines neuen, zur -Vitamin-B"-Gruppe" gehörigen Faktors, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus Faulschlamm gewonnenes Konzentrat einer kombinierten zweistufigen cellulosechromatographischen Trennung und Reinigung unter Verwendung von zwei Cyanidkonzentrationen im Entwickler unterworfen wird, wobei der neue Faktor zunächst mit Hilfe eines cvanidarmen Entwicklers als Monocy anokomplex von -Faktor 111, A und Pseudovitamin B12 und sodann mit Hilfe eines cyanidreicheren Entwicklers als Dicyanokomplex von Vitamin B12 und Faktor I b getrennt und in an sich bekannter Weise kristallisiert wird.