DE10340068A1

DE10340068A1 - Substrate für die Inhibierung der Adenylierungsdomänen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen

Info

Publication number: DE10340068A1
Application number: DE10340068A
Authority: DE
Inventors: Mohamed A. Prof. Dr. Marahiel; Jürgen Dr. May; Robert Finking; Ulrich Prof. Dr. Koert; Nina Bandur
Original assignee: Transmit Gesellschaft fuer Technologietransfer mbH
Current assignee: Philipps-Universitaet Marburg 35037 Marburg De
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2003-08-28
Publication date: 2005-03-24

Abstract

Aminoacyl-Sulfamoyl-Adenosin-Derivaten können als Substrat-Analoga zur Inhibierung der Adenylierungsdomänen nichtribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS) verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt Substrate bereit, die die NRPS-A-Domänen spezifisch inhibieren, sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Substraten, d.h. Aminoacyl-Adenylat-Substratanaloga, für die Inhibierung von Adenylierungsdomänen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS) bereit. Diese Aminoacyl-Adenylatsubstrate sind nützliche Mittel zur Untersuchung von Substratbindung und Substratselektivität von NRPS A-Domänen. Des Weiteren sind sie als Inhibitoren der Synthesewege in Pathogenitätsprozessen von pharmakologischer Bedeutung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete Biologie, Molekularbiologie, Chemie, medizinische Chemie, Landwirtschaft sowie Veterinär- und Humanmedizin.

Mikroorganismen sind bekannte Produzenten bioaktiver Peptide, welche wichtige Bestandteile der modernen Medizin geworden sind und deren ausgedehnter Wirkungsbereich von antibiotisch über immunsuppressiv bis hin zu zytostatisch und toxisch reicht. Darunter befinden sich beispielsweise wichtige antimikrobielle Wirkstoffe wie das Heptapeptid Vancomycin oder immunsuppressive Substanzen wie das zyklische Undecapeptid Cyclosporin (A. M. A. van Wageningen, P. N. Kirkpatrick, D. H. Williams, B. R. Harris, J. K. Kershaw, N. J. Lennard, M. Jones, S. J. Jones, P. J. Solenberg, Chem Biol 1998, 5, 155-162; G. Weber, K. Schorgendorfer, E. Schneider-Scherzer, E. Leitner, Curr Genet 1994, 26, 120-125). Beide werden von nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) hergestellt, bei denen es sich um in Modulen organisierte komplexe Enzyme handelt, die mehrstufige Reaktionen katalysieren (D. E. Cane, C. T. Walsh, C. Khosla, Science 1998, 282, 63-68; M. A. Marahiel, T. Stachelhaus, H. D. Mootz, Chem Rev 1997, 97, 2651-2674). Ein für die Inkorporation einer Aminosäure in das Endprodukt benötigtes Modul beinhaltet eine Adenylierungs-(A)-Domäne für die Substraterkennung, ein 4'-Phosphopanthetheinabhängiges Carrierprotein (CP), das das aktivierte Substrat und die wachsende Kette bereithält, und eine Kondensations-(C)-Domäne für die Ausbildung der Peptidbindung. Zusätzlich kann das aktivierte Substrat auch durch optionale, NRPS-assoziierte Domänen, die das Substrat epimerisieren, methylieren, N-formylieren oder durch postsynthetische Enzyme, die das Substrat glykosylieren oder halogenieren, verändert werden, weshalb die Endprodukte schwer zugänglich für die chemische Synthese sind (C. T. Walsh, H. Chen, T. A. Keating, B. K. Hubbard, H. C. Losey, L. Luo, C. G. Marshall, D. A. Miller, H. M. Patel, Curr Opin Chem Biol 2001, 5, 525-534). A-Domänen aktivieren neben proteinogenen Aminosäuren auch einige nicht proteinogene Aminosäuren sowie Carbonsäuren. Diese Domänen aktivieren spezifisch ein Substrat in Form des korrespondierenden Acyladenylats, wobei ATP verbraucht wird (R. Dieckmann, Y. O. Lee, H. van Liempt, H. von Dohren, H. Kleinkauf, FEBS Lett 1995, 357, 212-216; T. Stachelhaus, M. A. Marahiel, J Biol Chem 1995, 270, 6163-6169; H. D. Mootz, M. A. Marahiel, J Bacteriol 1997, 179, 6843-6850). Die Kristallstrukturen zweier A-Domänen wurden aufgeklärt. Die Kristallstruktur der Gramicidin S-Synthetase A, GrsA, der Phenylalanin aktivierenden A-Domäne aus Bacillus brevis, gab Aufschluss über den so genannten „nicht-ribosomalen Code", der die Vorhersage der Spezifität einer A-Domäne gestattet (E. Conti, T. Stachelhaus, M. A. Marahiel, P. Brick, Embo J 1997, 16, 4174-4183; T. Stachelhaus, H. D. Mootz, M. A. Marahiel, Chem Biol 1999, 6, 493-505). Diese Voraussage war auf die Aminosäure aktivierenden A-Domänen beschränkt, bis kürzlich die Struktur von DhbE aufgeklärt wurde, wodurch der Code auf Carbonsäure aktivierende A-Domänen erweitert wurde (J. J. May, N. Keßler, M. A. Marahiel, M. T. Stubbs, Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 12120-12125). Obwohl NRPS A-Domänen dieselbe enzymatische Aktivität wie andere Adenylat bildende Enzyme aufweisen, zum Beispiel Aminoacyl-tRNA-Synthetasen der ribosomalen Proteinsynthese, sind diese Enzyme weder auf der Sequenz- noch auf der Strukturebene miteinander verwandt (K. Turgay, M. Krause, M. A. Marahiel, Mol Microbiol 1992, 6, 529-546; J. G. Arnez, D. Moras, Trends Biochem Sci 1997, 22, 203-206; G. Eriani, M. Delarue, O. Poch, J. Gangloff, D. Moras, Nature 1990, 347, 203-206; T. Weber, M. A. Marahiel, Structure (Camb) 2001, 9, R3-9). Stattdessen sind A-Domänen strukturell mit den Luciferasen aus Photinus pyralis verwandt (E. Conti, N. P. Franks, P. Brick, Structure 1996, 4, 287-298). Wir stellen hier die Anwendung der ersten A-Domänen-Inhibitoren vor. Diese Acyladenylat-Analoga erwiesen sich nicht nur als ausgezeichnete Inhibitoren. Darüber hinaus vergrößert ihre Modifizierung mit Linkern, welche die Bindung an eine Matrix gestattet, die Anzahl der möglichen Verwendungen.

Aminoacyl-tRNA-Synthetasen wurden durch die Aminoacyl-Analoga 5'-O-[N-(Aminoacyl)-sulfamoyl]-adenosin erfolgreich inhibiert (A. K. Forrest, R. L. Jarvest, L. M. Mensah, P. J. O'Hanlon, A. J. Pope, R. J. Sheppard, Bioorg Med Chem Lett 2000, 10, 1871-1874). So wurde beispielsweise die Alanyl-tRNA-Synthetase aus E. coli durch das Alanylderivat dieser Verbindung inhibiert (H. Ueda, S. Yoshimitsu, N. Hayashi, J. Mitsunaga, Y. In, M. Doi, M. Inoue, T. Ishida, Biochim Biophys Acta 1991, 1080, 126-134).

Die A-Domäne der NRPS wird oft als Core-Region der NRPS bezeichnet, da sie für die Substraterkennung und Aktivierung verantwortlich ist. A-Domänen gehören ebenso wie Luciferasen, Acyl-CoA-Ligasen, 4-Coumarat-Ligasen und Chlorbenzoat-Ligasen zur Superfamilie der Adenylat bildenden Enzyme. Das so genannte P-loop-Motiv oder Walker-Motiv A ist charakteristisch für alle Mitglieder der Familie der Adenylat bildenden Enzyme (M. Saraste, P.R. Sibbald, A. Wittinghofer, Trends Biochem Sci 1990, 15, 430-434). Das P-loop-Motiv stellt das Bindungsmotiv für AMP dar und definiert die Proteinfamilie (K. Turgay, M. Krause, M.A. Marahiel, Mol Microbiol 1992, 6, 529-546). Der erste Schritt der durch A-Domänen katalysierten zweistufigen Reaktion ist identisch mit der ersten chemischen Reaktion, die durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen I und II katalysiert wird (G. Eriani, M. Delarue, O. Poch, J. Gangloff, D. Moras, Nature 1990, 347, 203-206). Dennoch ist dem Fachmann bekannt, dass weder die Primärstruktur noch die dreidimensionale Struktur dieser beiden Proteinfamilien zueinander homolog sind (E. Conti, T. Stachelhaus, M.A. Marahiel, P. Brick Embo J 1997, 16, 4174-4183). Die Klassifizie rung der aaRS in Klasse I bzw. Klasse II resultiert aus ihrer unterschiedlichen Proteinfaltung und ihren Katalysemechanismen. Schon diese Proteinfamilie zeigt deutlich, dass identische chemische Reaktionen mit unterschiedlichen Mitteln durchgeführt werden können. Das aktive Zentrum von Enzymen, die zur Superfamilie der Adenylat bildenden Proteine gehören, unterscheidet sich signifikant vom aktiven Zentrum der aaRS. Weder das HIGH-Motiv noch die Motive 1-3, die beide in aaRS konserviert sind, können innerhalb der Superfamilie der Adenylat bildenden Enzyme nachgewiesen werden (T. Weber, M.A. Marahiel, Structure (Camb), 2001, 9, R3-R9).

Überraschend und im Widerspruch zum Stand der Technik zeigt die vorliegende Erfindung, dass 5'-O-[N-(Phenylalanyl)-sulfamoyl]-adenosin 6 und 5'-O-[N-(Leucyl)-sulfamoyl]-adenosin 7 (Beispiel 1) A-Domänen inhibieren, wobei dies auf ihrer Ähnlichkeit zu aaRS in Bezug auf die enzymatische Aktivität beider Enzym-Superfamilien basiert.

Zwei A-Domänen wurden ausgewählt, um die Funktionalität der Analoga 6 und 7 zu prüfen. Die GrsA A-Domäne (PheA) wurde ausgewählt, da sie in Gegenwart der Substrate AMP und Phenylalanin kristallisiert wurde, wodurch detaillierte Informationen über die Bindungs- und Katalysemechanismen gewonnen wurden. Bei der zweiten A-Domäne, LeuA, handelt es sich um die ausgeschnittene A-Domäne der Surfactin-Synthetase SrfA-C aus Bacillus subtilis. Die korrespondierenden Genfragmente beider A-Domänen, d.h. PheA und LeuA wurden kloniert (1), die Proteine wurden als Strep-tag-II-Fusionen in E. coli produziert und anschließend mit Hilfe einer Streptactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Vor Durchführung weiterer Experimente wurden die Substratspezifität und die kinetischen Konstanten beider Enzyme bestimmt. PheA aktivierte spezifisch L- und D-Phenylalanin. Erwartungsgemäß aktivierte LeuA L-Leucin mit einer geringfügigen Nebenspezifität für L-Isoleucine (nicht gezeigt). Die K_M Werte von PheA und LeuA für ihre jeweilige Aminosäure wurden in ATP/PP_i- Austauschreaktionen bestimmt, um einen Vergleich zu den nachfolgenden Inhibitorstudien zu erhalten. In dieser Reaktion wird die Rückreaktion der Adenylatbildung gemessen. Die Verwendung von ³²P-Pyrophosphat in diesen Reaktionen führt zur Inkorporation von ³²P-Phosphat in ATP, die der Aktivität einer A-Domäne direkt proportional ist. Hierfür wurden die Enzyme im Fall von PheA entweder mit L- oder D-Phe oder mit L-Leu im Fall von LeuA inkubiert. Für PheA ergab sich ein K_M von 9.3 ± 0.8 μM und ein K_M von 19.0 ± 1.3 μM für L-Phe bzw. D-Phe. LeuA wies einen K_M von 642 ± 36 μM für L-Leu auf. Die Werte für PheA unterscheiden sich signifikant von den zuvor für dasselbe, His-gekoppelte Protein bestimmten Werten (T. Stachelhaus, M. A. Marahiel, J Biol Chem 1995, 270, 6163-6169). Unterschiede in der Protein-Kopplung, Reinigungsstrategie und dem Puffersystem könnten für diesen erhöhten K_M-Wert verantwortlich sein. Auf der anderen Seite stimmen die Werte für LeuA gut mit den früher bestimmten überein (G. Galli, F. Rodriguez, P. Cosmina, C. Pratesi, R. Nogarotto, F. de Ferra, G. Grandi, Biochim Biophys Acta 1994, 1205, 19-28).

Vor der quantitativen Bestimmung beider Enzyme mit ihrem jeweiligen Inhibitor wurde ein qualitativer Assay durchgeführt, um die Qualität und Spezifität der Inhibierung durch 6 und 7 zu ermitteln. Diese und die folgenden Assays mit einem Linker-modifizierten Inhibitor (siehe unten) wiesen eine Inhibierung bis hin zum totalen Verlust der Aktivität der A-Domänen auf. Außerdem wurde keine Kreuzinhibierung zwischen den beiden A-Domänen beobachtet, was die erwartete Spezifität der Inhibitoren aufzeigt (nicht gezeigt). Um die K_i-Werte zu bestimmen, wurde die Konzentration des Inhibitors variiert, während die Substratkonzentration konstant gehalten wurde. Für jede der beiden A-Domänen wurden die Datensätze in Dreifachbestimmung ermittelt. Die Inhibitorkonzentration wurde gegen die cpm^–1 aus den ATP/PP_i-Austauschreaktionen als Dixon-Plot aufgetragen. Die beiden K_i-Werte für 5'-O-[N-(L-Phenyl)-sulfamoyl]-adenosin 6 mit PheA und L-Phe oder D-Phe als Substrat sind (innerhalb des experimentellen Fehlers) mit je weils 61 nM bzw. 63 nM identisch (2a und b). Der K_i für 5'-O-[N-(L-Leucyl)-sulfamoyl]-adenosin mit LeuA war mit 8.4 nM sogar noch niedriger (2c). Durch diese Werte, die bis zu fünf Größenordnungen niedriger sind als die entsprechenden K_M Werte der A-Domänen, sind diese Verbindungen besonders geeignete Inhibitoren. Es ist überraschend, dass, obwohl die Konformation des von A-Domänen gebildeten Adenylats erheblich von demjenigen abweicht, welches von tRNA-Synthetasen gebildet wird, die selben Inhibitoren für beide Enzymklassen verwendet werden können (T. Weber, M. A. Marahiel, Structure (Camb) 2001, 9, R3-9). Darüber hinaus sind die kinetischen und Inhibitorkonstanten für PheA vergleichbar mit denjenigen, die für die Isoleucyl-tRNA-Synthetase aus S. aureus bestimmt wurden (A. J. Pope, J. Lapointe, L. Mensah, N. Benson, M. J. B. Brown, K. J. Moore, J Biol Chem 1998, 273, 31680-31690; A. J. Pope, K. J. Moore, M. McVey, L. Mensah, N. Benson, N. Osbourne, N. Broom, M. J. B. Brown, P. O'Hanlon, J Biol Chem 1998, 273, 31691-31701). Ein Vergleich der Strukturen der GrsA-Domäne mit gebundenem Substrat mit der Luciferasestruktur ohne Substrat deutete auf ein Schließen der aktiven Stelle bei Bindung des Substrates hin, wie es auch für die LysyltRNA-Synthetase aus T. thermophilus in Gegenwart eines Sulfamoylanalogons des Lysyl-Adenylats. gezeigt wurde (E. Conti, T. Stachelhaus, M. A. Marahiel, P. Brick, Embo J 1997, 16, 4174-4183; S. Cusack, A. Yaremchuk, M. Tukalo, Embo J 1996, 15, 6321-6334). Daher können solche Inhibitoren zur Untersuchung des Reaktionsmechanismus der NRPS-A-Domänen verwendet werden und außerdem ihre Kristallisation erleichtern. Die Kristallisation ganzer NRPS-Module ist bis heute fehlgeschlagen, und diese Inhibitoren könnten sich als wertvoll für das Einfrieren eines Zustands der ansonsten flexiblen Strukturen solcher Module erweisen und damit die Kristallisation ermöglichen. Des Weiteren könnten diese Inhibitoren die Tür zur chemischen Genetik öffnen, indem die nicht proteinogenen Aminoacyl-Sulfamoyl-Adenosin-Derivate NRPS-Signalwege im Voraus begrenzen oder inhibieren (S. L. Schreiber, Bioorg Med Chem 1998, 6, 1127-1152). Um eine mögliche Verwendung dieser Adenylat-Analoga als Matrix gebundene Inhibitoren zu untersuchen, wurde ferner ein Phenyl-Adenylat-Analogon mit einem flexiblen 2'-O-[Polyether-biotin]-Linker (Verbindung 8) synthetisiert. Das Biotin dient als Bindungsstelle für eine Streptactin- oder Streptavidinmatrix. Dieser linkermodifizierte Inhibitor wurde im Hinblick auf seine Funktionalität untersucht, und es wurde festgestellt, dass es verglichen mit dem linker-freien Inhibitor keinen Unterschied in der Inhibierung gibt. Wie aus 3 ersichtlich ist, führten gleiche Mengen des Linker-freien Inhibitors 6 und des Linkermodifizierten Inhibitors 8 zur gleichen Inhibierung, was darauf hindeutet, dass beide Inhibitoren denselben K_i besitzen.

Ähnlich wie in einer von Keefe et al. beschriebene Methode könnten A-Domänen mit veränderter Spezifität aus einer error prone PCR erstellten A-Domänen-Bibliothek isoliert und die Enzyme anschließend in vitro produziert werden (A. D. Keefe, J. W. Szostak, Nature 2001, 410, 715-718). Deshalb stellen diese Inhibitoren leistungsfähige Mittel dar, um NRPSen im Hinblick auf die Entwicklung von Peptiden mit neuartigen Aktivitäten zu modifizieren.

Diese Beispiele veranschaulichen die Allgemeingültigkeit dieses Ansatzes zur Generierung selektiver Inhibitoren für NRPS-A-Domänen. Obwohl bis heute einige Hundert verschiedene Substrate entdeckt wurden, sollten geringfügige Veränderungen der Synthese genügen, um den gewünschten spezifischen Inhibitor für jede A-Domäne herzustellen (M. A. Marahiel, T. Stachelhaus, H. D. Mootz, Chem Rev 1997, 97, 2651-2674).

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Inhibitor für die Adenylierungsdomänen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS) zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Aminoacyl-Sulfamoyl-Adenosin- Derivate, die nicht hydrolysierbar sind und spezifisch an NRPS A-Domänen binden.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen NRPS A-Domänen-Inhibitoren bereit zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die nachstehende Synthesevorschrift.

Synthese von 5'-O-[N-(D-Alanyl)-sulfamoyl]-adenosin·2TFA (5)

2',3'-O-Isopropyliden-5'-O-sulfamoyl-adenosin (3)

2,000 g (6.53 mmol) 2',3'-O-Isopropyliden-adenosin (1) wurden in vier Portionen zu einer Suspension von 1,045 g (26,12 mmol) Natriumhydrid (60% in Mineralöl) in 100 mL THF unter Argonatmosphäre gegeben. Nach 75 min Rühren bei 55 °C wurde das Gemisch auf 0 °C abgekühlt. Eine Lösung von 289 mg (2,5 mmol) Sulfamoylchlorid 2, die nach Literaturvorschrift hergestellt wurde (W. Schneider, G. Kessler, H.-A. Lehmann, Z. anorg. allg. Chem. 1968, 356, 239-243), in 15 mL THF wurde innerhalb von 30 min zugetropft, wobei die Temperatur bei 1-3°C gehalten wurde. Das Gemisch wurde für weitere 3 h bei 0°C gerührt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 7 mL Methanol beendet. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen, und der Rückstand wurde in Wasser gelöst, an Kieselgel absorbiert und über Flash-Chromatographie (CHCl₃:MeOH 9:1) gereinigt; das ergab 1,741 g (4,51 mmol, 86%) Sufamoyl-Adenosin 3 in Form eines farblosen Schaums. ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8.22 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.53 (s, br, 2H), 7.31 (s, br, 2H), 6.22 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.42 (dd, J = 6.3, 2.4 Hz, 1H), 5.07 (dd, J = 6.3, 3.0 Hz, 1H), 4.44-4.33 (m, 1H), 4.28-4.03 (m, 1H), 1.54 (s, 3H), 1.33 (s, 3H). MS (ESI): 387 (M + H⁺).

2',3'-O-Isopropyliden-5'-O-[N-(N-tert-Butoxycarbonyl-D-alanyl)-sulfamoyl]-adenosin (4)

Eine Lösung von 182 mg (0,63 mmol) Boc-D-Ala-OSu in 0,5 mL DMF wurde innerhalb von 30 min zu einer Lösung von 245 mg (0,63 mmol) 2',3'-O-Isopropyliden-5'-O-sulfamoyladenosin 3 in 4 mL DMF gegeben. Das Gemisch wurde für 3 h bei Raumtemperatur gerührt, bevor das organische Lösungsmittel im Vakuum abgezogen wurde. Der Rückstand wurde in 20 mL Wasser aufgenommen und viermal mit insgesamt 125 mL CHCl₃ und einmal mit 25 mL CHCl₃:iPrOH 5:1 extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit 20 mL einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum und Reinigung über Flash-Chromatographie (CHCl₃:MeOH:iPrOH 8:1:1) ergab 260 mg (0,47 mmol, 74%) Sulfamoyl-Adenosin 4 in Form eines farblosen Feststoffes MS (ESI): 558 (M + H⁺).

5'-O-[N-(D-Alanyl) -sulfamoyl]-adenosin·2TFA (5)

116 mg (0,30 mmol) des geschützten Adenosinsulfonamids 4 wurden in 3,5 mL Wasser gelöst, und 3,5 mL TFA wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abziehen der Lösungsmittel im Vakuum wurde das Rohprodukt über HPLC gereinigt (zweistufiger Gradient von H₂O TFA (0,1%) (Puffer A) zu Acetonitril TFA (0,1%) (Puffer B)), erster Schritt von 5% Puffer B auf 25% in 7 CV (19,64 mL) Flussrate 6 mL/min, zweiter Schritt von 25% Puffer B auf 100 in 1 CV (19,64 mL) Flussrate 6 mL/min ergibt 134 mg (0,27 mmol) des reinen entschützten Adenosinsulfonamids 5.

Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die oben angegebene Synthesevorschrift leicht sowohl auf andere D- und L-Aminosäure-Sulfamoyl-Adenosin-Derivate als auch auf β-Aminosäure- und Carbonsäure-Sulfamoyl-Adenosin-Derivate angepasst werden kann. Geeignete Carbonsäuren sind z.B. 2,3-Dihydroxybenzoesäure oder Salicylsäure. Des Weiteren ist der Fachmann mit Methoden der Derivatisierung und/oder Modifizierung des Riboserings vertraut. Außerdem ist es Stand der Technik, die oben angegebene Adeningruppe durch andere Purin- oder Pyrimidinringe zu ersetzen.

1. Synthese der Inhibitoren
Herstellung von 5'-O-[N-(L-Phenylalanyl)-sulfamoyl]-adenosin (6)
Dieser Inhibitor wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren aus 4 und dem entsprechenden N-Boc-L-Phenylalanin-O-succinimidester über das 2',3'-O-Isopropyliden-geschützte Zwischenprodukt und Entschützen erhalten.
Herstellung von 5'-O-[N-(L-Leucinyl)-sulfamoyl]-adenosin (7)
Dieser Inhibitor wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren aus 4 und dem entsprechenden N-Boc-L-Leucin-O-succinimidester über das 2',3'-O-Isopropyliden-geschützte Zwischenprodukt (73% Ausbeute) und Entschützen (24% Ausbeute) erhalten.
2. HPLC-Reinigung der Inhibitoren 6 und 7

Die HPLC-Reinigungen wurden auf einer Vision-Workstation, BioCAD Family (PerSeptiveBiosystems) auf einer LiChroCART 250-10-Säule, LiChrospher 100, RP18 10 μM (Merck, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Folgende Bedingungen wurden angewendet:

Flussrate:	3 mL/min
UV-Detektor:	260 and 275 nm
Äquilibrierungsphase:	100 Wasser für 10 min
Beladungsphase:	Injektionsvolumen bis zu 500 μL
Waschphase:	100 Wasser für 2 min
Elutionsphase:	Gradient bis 80% Acetonitril in 100 min
Reinigungsphase:	100 Acetonitril für 5 min

3. Mikrobiologie und Biochemie
Allgemeine Verfahren
E. coli wurde auf LB-Medium gezüchtet. Antibiotika wurden in den folgenden Konzentrationen verwendet, Ampicillin 100 μg/mL. Für die E. coli-Verfahren, wie z.B. Transformation und Plasmidpräparation, wurden Standardprotokolle verwendet. Vent-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland) oder Pwo Polymerase (Roche, Mannheim, Deutschland) wurden für die Amplifikation der Genfragmente zum Zweck der Klonierung und Expression verwendet. Oligonukleotide wurde von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) bezogen.
Herstellung der Plasmide
Herstellung von pASK-IBA3-PheA – Ein Fragment des GrsA-Gens, das für die B. brevis GrsA-A-Domäne (PheA) codiert, wurde mittels PCR mit den Oligonukleotiden 5'- TATCCGCGGTCATGCTCAAAATAAAAATGG-3' und 5'-TATCCATGGGTTAAATCAGGTTCCGGC-3' (Restriktionsstellen sind unterstrichen) aus chromosomaler DNA von B. Brevis ATCC 9999 amplifiziert und nach Restriktionsverdau des amplifizierten Fragments in die SacII- und NcoI-Stellen von pASK-IBA3 (IBA, Göttingen, Deutschland) ligiert. Das resultierende Plasmid pASK-IBA3-PheA codiert für das rekombinante PheA mit einem C-terminalen Tag GLSAWSHPQFEK und vier zusätzlichen N-terminale Aminosäuren GDRG.
Konstruktion von pASK-IBA3-LeuA – Ein Fragment des SrfA-C-Gens, das für die B. subtilis-SrfA-C-A-Domäne (LeuA) codiert, wurde mittels PCR mit den Oligonukleotiden 5'-TATCCGCGGGCCTGTCAGCACGATCAA-3' und 5'-TATCCATGGTCCTGATCAGGTTTTGGGAG-3' aus chromosomaler DNA von B. subtilis ATCC 21332 amplifiziert und nach Restriktionsverdau des amplifizierten Fragments in die SacII- und NcoI-Stellen von pASK-IBA3 (IBA, Göttingen, Deutschland) ligiert. Das resultierende Plasmid pASK-IBA3-LeuA codiert für das rekombinante LeuA mit einem C-terminalen Tag GLSAWSHPQFEK und vier zusätzlichen, N-terminalen Aminosäuren GDRG.
Überproduktion und Reinigung der rekombinanten Proteine
E. coli XL1-blue (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) wurde mit pASK-IBA3-PheA oder pASK-IBA3-LeuA transformiert, um die Strep-Tag-II-Fusionsproteine PheA und LeuA zu produzieren. 1 mL einer Übernachtkultur dieser Stämme in LB wurde in 100 mL desselben Mediums inokkuliert. Die Kultur inkubierte bei 30 °C und 250 rpm. Die Expression wurde durch Zugabe von 5 μL einer Anhydrotetracyclin-Lösung (2 mg/mL DMF) bei einer A₆₀₀ von 0,5 eingeleitet, und die Kultur inkubierte für weitere 3 h, bevor sie durch Zentrifugation bei 4.500 g und 4°C geerntet wurde. Die Zellen wurden in 1.5 mL Puffer W (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)) resuspendiert und durch drei Passagen in einer gekühlten French Press aufgeschlossen. Der so erhaltene Rohextrakt wurde bei 36.000 g bei 4°C für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine nach Herstellerangabe mit 2 × 2,5 mL Puffer W äquilibrierte Streptactin-Säule (Säulenvolumen 1 mL) ohne Überdruck (IBA, Göttingen, Germany) überführt. Nachdem die Probe vollständig in die Matrix eingedrungen war, wurde die Säule fünfmal mit 1 mL Puffer W gewaschen, und es wurden 1 mL-Fraktionen gesammelt. Das Protein wurde mit 6 × 0,5 mL Puffer E (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM Desthiobiotin (pH 8,0)) eluiert, 0.5 mL-Fraktionen wurden gesammelt. Die Säule wurde durch dreimaliges Waschen mit 5 ml Puffer R (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM HABA (pH 8,0)) regeneriert, gefolgt von der Entfernung des Puffers R durch zweimaliges Waschen mit 4 mL Puffer W. Das Vorliegen des jeweiligen Proteins in den Fraktionen wurde mittels SDS-Polyamidgelelektrophorese nachgewiesen (12,5 Laemmli-Gele).
ATP/PP_i-Austauschreaktion
Dieser Assay wurde im Wesentlichen wie unter T. Stachelhaus, H.D. Mootz, M.A. Marahiel, Chem Biol 1999, 6, 493-505 beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsgemische enthielten 200 nM Enzym, 0,5 mM Aminosäure, 2 mM dATP, 0,05 mM PP_i, 10 mM MgCl₂, 0,15 μCi [³²P]-PP_i in einem Endvolumen von 100 μL Puffer W, und wurden für 10 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 500 μL eiskalter Stoppmischung beendet (100 mM Natriumpyrophosphat, 560 mM Perchlorsäure, 1,2% (w/v) Aktivkohle (Norit A)). Die Proben wurden auf dem Vortex geschüttelt und die Aktivkohle durch 1-minütige Zentrifugation bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge gesammelt. Das Pellet wurde zweimal mit 1 mL Wasser gewaschen und anschließend in 500 μL Wasser resuspendiert. Die resuspendierte Aktivkohle wurde mit 3,5 mL Rotiszint Eco Plus-Szintillatorflüssigkeit (Roth, Karlsruhe, Deutschland) gemischt und in einem 1900CA Tri-Carb-Flüssigszintillationszähler (Packard, Dreieich, Deutschland) gezählt.
Um die kinetischen Konstanten zu bestimmen, wurden die das Enzym und die Aminosäure enthaltenden Mischungen (in Dreifachbestimmung) in 50 μL Puffer W für 1 min auf 37°C vorgeheizt, bevor die restlichen Komponenten in 50 mL Puffer W zugegeben wurden. Die Reaktion wurde 1 min lang bei 37°C fortgesetzt, bevor die Stoppmischung zugefügt wurde. Das Aktivkohlepellet wurde zwei- statt dreimal gewaschen.
Um die Funktionalität und Spezifität der Aminoacyl-Adenylat-Analoga zu untersuchen, wurden 5'-O-[N-(Phenylalanyl)-sulfamoyl]-adenosin 6 and 5'-O-[N-(Leucyl)-sulfamoyl]-adenosin 7 im ATP/PP_i-Austauschassay in Endkonzentrationen von 0,5 mM eingesetzt. Reaktionsgemische, die den Inhibitor, aber nicht die Substrataminosäure enthielten, wurden bei 37°C für 1 min vorinkubiert. Die Kontrollreaktionen enthielten entweder keine Aminosäure oder keinen Inhibitor.
Für die Bestimmung der K_i-Werte wurde die Inhibitorkonzentration variiert, während die Konzentration der Substrataminosäure konstant gehalten wurde. Messungen wurden für drei verschiedene Substratkonzentrationen durchgeführt. Im Falle des PheA betrug die Konzentration von L-Phe oder D-Phe 0,005, 0,01 bzw. 0,02 mM, wohingegen die Konzentration des 5'-O-[N-(Phenylalanyl)-sulfamoyl]adenosins 6 von 0 bis 0,05 mM variierte. Die Konzentration des L-Leu für LeuA betrug entweder 0,2, 0,5 oder 2 mM, während die Konzentration von 5'-O-[N-(Leucyl)-sulfamoyl]-adenosin 7 von 0 bis 10 nM variierte.
Für Vergleichsstudien mit 5'-O-[N-(Phenylalanyl)-sulfamoyl]-adenosin 6 und 2'-O-[Polyether-biotin]-5'-O-[N-(Phenylalanyl)-sulfamoyl]-adenosin 8 wurden beide Verbindungen im Reaktionsgemisch in Endkonzentrationen von 2, 5, 10, 50 und 100 mM eingesetzt (Doppelbestimmung), wobei das Reaktionsgemisch im gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der kinetischen Konstanten durchgeführten ATP/PP_i-Austauschassay 200 nM PheA und 10 μM L-Phe enthielt.
[Figurenbeschreibung]
1: Der modulare Aufbau des Gramicidin S- und des Surfactin-Biosyntheseoperons zeigen die exakte Position der für die Klonierung ausgewählten A-Domänen. Abkürzungen: Sc, SacII; N, NcoI.
2: Dixon-Plots der Inhibierungsstudien mit den rekombinanten Proteinen und den linker-losen Inhibitoren 6 und 7. (A) PheA mit Inhibitor 6 und L-Phe, (B) PheA mit Inhibitor 6 und D-Phe, (C) LeuA mit Inhibitor 7 und L-Leu. Die Konzentration der Inhibitoren wurde wie folgt variiert: PheA, 0 bis 0,05 μM; LeuA, 0 bis 10 nM. Die Aminosäurekonzentrationen sind in der Figur angegeben.
3 Vergleichsstudien des linker-losen Inhibitors 6 und des linker-modifizierten Inhibitors 8. Die Konzentration beider Inhibitoren wurde von 2-100 nM variiert, während die Aminosäurekonzentration in den ATP/PP_i-Austauschassays konstant gehalten wurde. Einander entsprechende Säulen besitzen dieselbe Graustufe.

Claims

Ein Inhibitor der Adenylierungsdomänen nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen (NRPS), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Inhibitor um Aminoacyl-Sulfamoyl-Adenosin-Derivate handelt, die nicht hydrolysierbar sind und spezifisch an NRPS-A-Domänen binden.
Ein Verfahren zur Herstellung von NRPS-A-Domänen-Inhibitoren, umfassend die folgenden Schritte: – in Kontakt bringen eines 2'3'-O-geschützten 5'-O-Nukleosids mit Sulfamoylchlorid, um das entsprechende 2',3'-O-geschützte 5'-O-Sulfamoyl-Nukleosid zu bilden – Reinigung des 5'-O-Sulfamoyl-Nukleosids – gereinigtes 5'-O-Sulfamoyl-Nukleosid mit einem Bocgeschützten Aminosäure-OSu-Derivat in Kontakt bringen, so dass das entsprechende 2',3'-O-geschützte 5'-O-[N-[N-tert-Butoxycarbonyl-aminoacidyl)-sulfamoyl]-nucleosid entsteht – Reinigung des 2',3'-O-geschützten 5'-O-[N-[N-tert-Butoxycarbonyl-aminoacidyl)-sulfamoyl]-nucleosids – Entfernung aller Schutzgruppen – Reinigung des Produktes
Verwendung eines NRPS-A-Domänen-Inhibitors gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 in einer therapeutischen Zusammensetzung.