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Die
Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von
Erlen-Polyphenolgerbstoff
durch Extraktion von Erlenrinde mit heißem Wasser und Anreicherung
des Hauptbestandteils Oregonin mit Hilfe eines Adsorberharzes auf
Acrylester-Basis, gemäß den Patentansprüchen. Oregonin
der Formel I ist ein Polyphenol-O-Glycosid, das sich als wertvoller
phytopharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoff eignet.
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Oregonin
der Formel I wurde als wasserlöslicher
Hauptbestandteil der Rinde von Oregon-Erle, Alnus oregona Nutt.
aber auch vieler europäischer
Erlen, z.B. Alnus glutinosa (L.), A. incana (L.) und A. cordata
(Loisel.) Desf. erkannt (Karchesy, J.J. at al., J. Chem. Soc., Chem.
Comm. 1974, 16, 649–650,
Guz, N. & Lorenz, P.
et al., Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 471–474).
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Aus
der Literatur sind vielfältige
biologische Wirkungen von Oregonin bekannt. So wirkt die Substanz der
Formel I z.B. entzündungshemmend,
durch Inhibierung von Cyclooxygenase-2 (COX-2) und Stickstoffoxidsynthase
(i-NOS).
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COX-2
und i-NOS sind dem Fachmann als proteinogene Entzündungsfaktoren
bekannt (Lee, M.W. et al., Planta Med., 2000, 66, 551–553, Lee
M.W. et al., Biological & Pharmaceutical
Bulletin 2000, 23, 517–518.). Weiterhin
zeigt Oregonin der Formel I antibakterielle Wirkungen (Saxena, G.
et al., Int. J. Pharmacocnosy, 1995, 33, 33–36) und ist ein natürliches
Antioxidants (Gonzales-Larado, R.F. et al., Rev. Latinoam. Quim.
1997, 25, 62–70).
Aufgrund seiner Chelatisierungs-Eigenschaften,
z.B. mit Metallionen farbige Komplexe zu bilden, eignet es sich
auch für
die Färbung
von Naturfasern. Die phenolischen Hydroxylgruppen und die Hydroxyl-Gruppen
des D-Xylose-Restes im Oregonin bestimmen seine hydrophilen Eigenschaften,
wie beispielsweise eine gute Löslichkeit
in protischen Lösungsmitteln
(z.B. Alkohole, Wasser), sowie die Fähigkeit, durch semipermeable
biologische Membranen zu diffundieren. Beides sind wichtige Voraussetzungen
für die
Verwendung in Kosmetika bzw. pharmazeutischen Formulierungen.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung sollte es sein ein einfaches und billiges
Verfahren aufzuzeigen, mit welchem die Hochanreicherung und Isolierung
von Erlen-Polyphenolen
bzw. Oregonin auch in industriellem Maßstab gelingt.
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Durch
Extraktion von Erlenrinde mit Wasser oder Alkoholen, wie es in der
GB 1019271 beschrieben wird,
gelingt die Anreicherung der Polyphenol-Bestandteile (insbesondere
Oregonin) nur zu sehr geringem Prozentsatz. Andere in der Literatur
beschriebene Verfahren zur Reinisolierung von Oregonin der Formel
I setzen aufwendige chromatographische Reinigungen voraus, liefern
nur geringe Ausbeuten und sind somit nicht für eine rentable industrielle
Gewinnung der Substanz geeignet.
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Die Erfindung
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Die
gestellte Aufgabe wurde überraschenderweise
gelöst
durch Selektiv-Extraktion eines Heißwasser-Auszuges von Erlenrinde
mit Hilfe eines Adsorberharzes auf Acrylester-Basis (Amberlit® XAD-7,
Rohm & Haas Co.).
Gegenstand der Erfindung ist somit ein verbessertes Verfahren zur
Gewinnung des Erlen-Polyphenolgerbstoffs Oregonin durch Extraktion
eines Heißwasser-Auszuges
von Erlenrinde, mit Hilfe des Adsorberharzes Amberlit® XAD-7,
Waschen des Harzes mit Wasser und Auswaschen der somit angereicherten
Polyphenole (besonders Oregonin) mit Hilfe von Alkoholen.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
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Verfahren
zur Herstellung von Polyphenolgerbstoff Oregonin der Formel I durch
Extraktion der getrockneten und gemahlenen Rinden verschiedener
europäischer
bzw. nordamerikanischer Erlenarten z.B. Alnus glutinosa L., Alnus
incana L., Alnus cordata (Loisel.) Desf. oder Alnus oregona Nutt.
mit 50–120 °C heißem Wasser
oder wäßrigem Alkohol,
wobei man vorzugsweise mit einem Verhältnis der Droge zum Lösemittel
von 1 : 5 bis 1 : 10 arbeitet. Bevorzugte Temperaturen für die Durchführung der
Extraktion liegen im Bereich des Siedepunktes des eingesetzten Lösemittels.
Die Extraktion wird üblicherweise
unter Rühren
der Extraktionsmischung durchgeführt
und bei Normaldruck. Das erfindungsmäßige Verfahren kann jedoch
auch unter vermindertem oder erhöhtem
Druck durchgeführt
werden. Die Anwendung von erhöhtem
Druck ist insbesondere dann angezeigt, wenn man die Extraktion der
Erlenrinde bei einer Temperatur durchführen möchte, bei der das Lösungsmittel
unter Normaldruck siedet. Geeignete Lösungsmittel für die Extraktion
sind zum Beispiel: Wasser, wäßriges Ethanol,
Methanol oder Aceton. Die Extraktion wird vorzugsweise zwei- bis
dreimal wiederholt, wobei man jeweils von der Droge abfiltriert,
abnutscht bzw. über
eine Filterpresse abpreßt.
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In
dem hier beschriebenen erfindungsmäßigen Verfahren werden anschließend mit
Hilfe des Adsorberharzes Amberlite® XAD-7
alle mittelpolaren Verbindungen, insbesondere Polyphenol-Glycoside,
selektiv gebunden. Hochpolare Substanzen und alle nicht wirksamen
Verbindungen, wie z.B. Zucker und Salze werden in der bevorzugten
Ausführungsform
nach Adsorption ausgewaschen. Die Abscheidung der Erlen-Polyphenole
erfolgt vorzugsweise mit Hilfe einer Festbett-Extraktion, wobei
man das gewaschene Amberlit® XAD-7 in einem Büchner-Trichter
mit Frittenboden vorlegt, den wäßrigen Extrakt
von oben aufgibt und langsam durch das Harz durchlaufen läßt. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
kann die Festbett-Extraktion mit dem XAD-Harz auch in einem Chromatographie-Rohr
oder Hänge-Gefäß mit Fritten-
bzw. Siebboden durchgeführt werden.
Es versteht sich von selbst, dass eine Anwendung von Über- oder
Unterdruck das Durchlaufen des Extraktes durch das XAD-Harz beschleunigt.
Bei Beschleunigung des Prozesses können jedoch aufgrund zu geringer
Verweilzeiten Verluste auftreten.
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Amberlite® XAD-7,
ein Homopolymer aus Trimethylolpropan-trimethacrylat, ist ein schwach
polares Adsorberharz, welches aufgrund der hohen Affinität seiner
Ankergruppen für
schwach saure phenolische OH-Gruppen sich besonders gut für die Adsorbtion
von Polyphenolen und Polyphenol-Gycosiden eignet. Das Adsorberharz
ist z.B. von Rhom & Haas
Co. in Form harter unlöslicher
Perlen (Oberfläche:
450 m2/g; Teilchengröße: 20–50 mesh) kommerziell erhältlich.
Bevorzugt verwendet man 1 Teil XAD-7 für die Adsorbtion von Polyphenol
aus 10 Teilen wäßrigem Erlenextrakt.
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Die
Desorbtion des auf dem XAD-Harz angereicherten Erlen-Polyphenols
erfolgt in dem erfindungsmäßigen Verfahren üblicherweise
mit Ethanol, Methanol, iso- oder n-Propanol. Das Lösungsmittel kann durch Destillation
unter vermindertem Druck zurückgewonnen
werden, wodurch das erfindungsmäßige Verfahren sehr
wirtschaftlich arbeitet. Als Rückstand
wird üblicherweise
Erlen-Polyphenol
mit einem hohen Gehaltan Oregonin der Formel I erhalten. Der im
Erlen-Polyphenol
spektralphotometrisch bestimmbare Polyphenolglycosid-Gehalt beträgt gewöhnlich mindestens
70 % (ber. als Oregonin). Es ist überraschend, daß durch
Anwendung von XAD-7 eine Selektivextraktion und damit eine Hochanreicherung
von Oregonin in einem Schritt gelingt. Damit wird ein wesentlich
höherer
Oregonin-Gehalt
erzielt, als bei der Durchführung
einer einfachen. Extraktion mit Ethanol oder Wasser und anschließendem Aufkonzentrieren
durch Verdampfen des Lösemittels. Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist damit wirtschaftlicher und erreicht im Vergleich zu den Verfahren
des Standes der Technik höhere
Raum-Zeit-Ausbeuten. Das Verfahren hat außerdem den Vorteil, dass nur
unbenkliche und umweltverträgliche
Lösungsmittel
(z.B. Alkohole) verwendet werden. Die nach Verdampfen oder Abdestillieren
im Festextrakt enthaltenen Lösungsmittel-Rückstände sind
nur gering und unbedenklich. Damit eignet sich ein so gewonnenes
Erlen-Polyphenol bzw. Oregonin als pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoff.
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Nach
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann das XAD-Harz sehr leicht durch nachfolgendes Waschen mit Alkohol,
verdünnter
Natronlauge, verdünnter
Salzsäure
und Wasser regeneriert werden. Durch die leichte Regenierbarkeit
und einfache Handhabung des verwendeten Adsorberharzes XAD-7 kann
das erfindungsmäßige Verfahren
auch im Technikums- bzw. industriellen Maßstab mit hoher Wirtschaftlichkeit
durchgeführt
werden.
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Neben
Oregonin der Formel I konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
auch andere Biarylheptanoide der Formeln II und III angereichert
werden, die als Nebenbestandteile je nach Erlen-Art in unterschiedlichen
Konzentrationen vorkommen. Solche dem Oregonin ähnliche Biarylheptanoide wurden
durch Vergleich ihrer Massenspektren mit Literaturspektren bekannter
Verbindungen identifiziert. Damit kann das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren
auch zur Herstellung bzw. Anreicherung anderer Biarylheptanoide der
Formel II und III verwendet werden,
worin
R
1 und R
2 für H, OH
oder OCH
3 und R
3 bzw.
R
4 für
H, OH oder eine Zuckereinheit (z.B. D-Glucose, D-Xylose) steht.
Als Rohmaterial für
die Isolierung der Biarylheptanoide der allgemeinen Formeln I bis
III sind für das
erfindungsmäßige Verfahren
Baum-Rinden verschiedener Betulaceae-Arten (z.B. Alnus, Betula)
aber auch Pinus-Arten geeignet (s. a. Lee, K.K. et al., J. Nat.
Prod. 61, 1407–1409).
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Oregonin
der Formel I und Biarylheptanoide der Formel II und III können beispielsweise
als Antioxidantien, Zellproliferations-Beschleuniger (z.B.
JP 10237087 ) oder allgemein
als kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe verwendet werden.
Von besonderem Interesse ist dabei der Schutz des Zellgewebes vor
oxidativem und nitrosativem Stress, der z.B. durch Bildung von reaktiven
Molekülspezies
(Radikale) initiiert wird. Oxidativer bzw. nitrosativer Stress ist
eine Sammelbezeichnung für
die Belastung der lebenden Zelle durch Anreicherung giftiger oxidierender
oder nitrierender Verbindungen (reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies: H
2O
2, O
2-,
NO, ONOO-, HO-, Singulett-Sauerstoff und Hydroperoxid-Anionen).
Letztere können
im Zellgewebe z.B. Lipide oder Proteine zerstören. Der oxidative/nitrosative
Stress kann durch Umwelteinflüsse
wie Strahlungs-Einwirkung, Xenobiotika, Schwermetall-Ionen oder
Ischämie/ Reperfusion
(zeitweise Unterbrechung der Blutzufuhr eines Organs) induziert
werden und spielt nachweislich eine Rolle z.B. bei der Hautalterung,
sowie bei der Entstehung einer Reihe akuter und chronischer Erkrankungen
(z.B. Entzündungen,
Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlaganfall und Krebs).
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Die
Entstehung von nitrosativen Stress wird insbesondere durch die Bildung
des Radikals Stickstoffmonoxid (NO) und seiner Folgeprodukte ausgelöst. In Macrophagen
oder auch Mikroglia-Zellen, also Körperzellen die der Immunabwehr
dienen, wird bei Entzündungsprozessen
das Enzym iNOS (induzierbare Stickoxidsynthase) expremiert, welches
aus der Aminosäure
L-Arginin das Radikal Stickoxid (NO) unter Bildung von L-Citrullin
erzeugt. Obgleich die anti-oxidativen und die Radikalfänger-Wirkung
von Erlenextrakt in der Literatur beschrieben sind (Gonzales-Larado,
R.F. et al., Rev. Latinoam. Quim. 1997, 25, 62–70), wurde unseres Wissens
nach bisher kein direkter experimenteller Nachweis der Radikalfänger-Wirkung
von Oregonin der Formel I aufgezeigt. Überraschenderweise zeigte sich,
dass das durch das erfindungsgemäße Verfahren
gewonnene Oregonin der Formel I eine sehr starke Radikalfänger(Scavenger)-Wirkung
besitzt, was von uns an der Reaktion der Verbindung mit dem stabilen
Radikal DPPH (2,2-Diphenylpikryl-1-hydrazyl)
als Modellsubstanz nachgewiesen werden konnte. Die Scavenger-Eigenschaften
des Oregonins übersteigen
sogar die der Ascorbinsäure
(Vitamin C) und von Trolox® ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karbonsäure), einem
Vitamin E-Analogon. Damit ist das durch die Erfindung gewonnene
Erlen-Polyphenol bzw. Oregonin der Formel I als Radikalfänger für die verschiedensten
Anwendungen geignet.
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Beispiel 1:
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790
g getrocknete und gemahlene Erlenrinde (vorzugsweise von Schwarzerle,
Alnus glutinosa L. oder Grauerle, Alnus incana L.) werden zusammen
mit 4.5 Ltr. Leitungswasser 30 min. unter ständigem Umrühren zum Sieden erwärmt. Anschließend läßt man 30
min. abkühlen
und filtriert die Droge über
ein Filtertuch. Man wiederholt die Extraktion noch zweimal in analoger
Weise mit je 4.0 Ltr. Wasser. Die vereinigten wäßrigen Extrakte läßt man über Nacht
stehen und filtriert über
einen Faltenfilter. Den wäßrigen Extrakt
eluiert man anschließend
langsam über
1 kg Amberlite XAD-7 (Fluka), welches zuvor mit 8 Ltr. Wasser gewaschen
wurde. Die Elution kann z.B. in einer Chromatographie-Säule oder
in einem Büchner-Trichter mit Frittenboden
erfolgen. Anschließend
wäscht
man das XAD-Harz 4 × mit
je 5.0 Ltr. Wasser und danach 4 × mit je 1.0 Ltr. 96%igem Ethanol.
Der ethanolische Extrakt wird am Rotationsverdampfer unter vermindertem
Druck zur sirupösen
Konsistenz eingeengt. Ausbeute: 109 g rotbrauner Extrakt (13.8 %
ber. auf eingesetzte Drogenmenge). Polyphenol-Gehalt: 72% ber. als
Oregonin im naturfeuchten Produkt (spektralphot. in MeOH, λmax. =
283 nm, log ε = 3.75).
Die Charakterisierung des Oregonins erfolgte durch dünnschichtchromatographische
Untersuchung mit Hilfe einer Vergleichssubstanz (Rf =
0,54; DC-System: CHCl3 MeOH : H2O
= 10 : 5 : 1; Detektion mittels Anisaldehyd/Schwefelsäure-Reagenz).
Die 1H- und 13C-NMR-Daten
des Oregonins entsprachen der Literatur (Ohta, Shinji et al., J.
Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1984, 8, 1635–1642). Die Regeneration des
XAD-Harzes erfolgt durch Spülen
mit Ethanol, anschließend
mit 0.1 proz. NaOH (wt/vol), 0.1 proz. HCl (wt/vol) und Wasser, bis
die ablaufende Spülflüssigkeit
pH-neutral ist.
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Beispiel 2:
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1.0
kg gemahlene Erlenrinde (Alnus glutinosa L.) wird mit 5.0 Ltr. Ethanol/Wasser
90/10 (vol/vol) 2 h gerührt
und weitere 36 h stehengelassen. Anschließend filtriert man die Droge
ab und engt das Filtrat am Rotationsverdampfer bis zur sirupösen Konsistenz
ein. Der so erhaltene rotbraune Sirup wird dann in 2.0 Ltr. warmem
Wasser gelöst,
ca. 30 min. gerührt
und über
eine Filternutsche filtriert. Das Filtrat gibt man nachfolgend, wie
im Beispiel 1 beschrieben, über
XAD-Harz, wäscht
mit Wasser und eluiert das Polyphenol mit Ethanol. Nach Abdestillieren
des Lösungsmittels
erhält
man 105 g rotbraunen sirupösen
Extrakt (10.5% ber. auf Drogenmenge). Polyphenol-Gehalt: 82 % ber.
als Oregonin im naturfeuchten Produkt (spectralphot.). Gehaltsbestimmung
Rein-Oregonin (HPLC-MS): 52,5 % (ber. a. Naturfeuchte). MS (ESI,
negativer Modus) f. Oregonin MW 478. Die Verbindung der Formel III,
worin R1 = R2 =
OH, R3 = H und R4 =
D-Glucose (MW = 494) und die Verbindung der Formel III, worin R1 = R2 = OH, R3 = H und R4 = D-Xylose (MW = 464)
wurden als Nebenverbindungen identifiziert.
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Beispiel 3:
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Analog
Beispiel 1 wird Erlenrinde mit Wasser heiß extrahiert. Der so gewonnene
Auszug wird filtriert, das Filtrat mit dem XAD-Harz versetzt und
für ca.
1 h gerührt.
Anschließend
wird das Harz abgenutscht und wie im Beispiel 1 mit Wasser gewaschen
und danach das Polyphenol mit Alkohol eluiert.
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Beispiel 4 – Prüfung der
durch die Erfindung hergestellten Substanz auf ihre Radikalfängerwirkung
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Die
Reaktion von Oregonin mit dem stabilen Radikal DPPH (2,2-Diphenylpikryl-1-hydrazyl) zeigt in methanolischer
Lösung
(0.1 mM) nach 30 min. Inkubation bei 37°C einen deutlich stärkeren Effekt
im Vergleich zu klassischen Radikalfängern, wie z.B. Ascorbinsäure und
Trolox, bei gleichen verwendeten Konzentrationen, s. 1. (IC50-Werte
f. Oregonin = 5.97μM,
f. Vitamin C = 18.0 μM,
f. Trolox 17.8 μM).
Die Stammlösungen von
Oregonin in DMSO (2.5, 5.0, 10 und 25 mM) wurden jeweils mit der
DPPH-Lösung
(MeOH) 1 : 1000 zum Erreichen der entsprechenden Zielkonzentration
verdünnt
und inkubiert. Die Extinktion von DPPH wurde spektralphotometrisch
gemessen (λmax. = 516 nm). Die Daten repräsentieren
die Mittelwerte (± SEM)
aus 3 Messungen (n = 3). DMSO (1 μl/ml)
zeigte selbst keinen Einfluß auf
DPPH.