DE10240859A1

DE10240859A1 - Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop und Verfahren zur Verarbeitung von elektronenmikroskopischen Bilddaten

Info

Publication number: DE10240859A1
Application number: DE10240859A
Authority: DE
Inventors: Kuniaki Nagayama; Radostin S Danev
Original assignee: Jeol Ltd
Current assignee: Jeol Ltd
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2003-08-28
Anticipated expiration: 2022-09-05
Also published as: US20030066964A1; DE10240859B4; US6674078B2; JP4328044B2; JP2003100249A

Abstract

Eine Phasenmanipulation wird verwendet, um ein elektronenmikroskopisches Bild mit hohem Kontrast zu erzeugen. Eine Phasenplatte wird an der hinteren Bildebene einer Objektivlinse angeordnet und verwendet, um Operationen auf Phasen durchzuführen, um Konstrasttransferfunktionen (CTFs) in ungerade Funktionen zu transformieren. Auf diese Art und Weise wird ein differentielles Kontrastbild erhalten.

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Elektronenmikroskop und insbesondere das Funktionsprinzip eines Verfahrens, das nur durch Beeinflussung der Phasen der Elektronen durch Verwendung einer Phasenplatte ein Leistungsvermögen erreicht, das mit demjenigen eines differentiellen Interferenzkonstrastverfahrens in der Lichtmikroskopie vergleichbar ist. Dieses Verfahren ermöglicht die Kontrastverstärkung von elektronenmikroskopischen Bildern und dreidimensionalen topographischen Bildern und stellt ein neues Abbildungsverfahren dar. Die Erfindung betrifft auch ein experimentelles Verfahren, dem dieses Funktionsprinzip zugrunde liegt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Im Allgemeinen gibt es vier Arten der Transmissionsmikroskopie, die bezüglich ihrer Aufnahmeverfahren deutlich voneinander verschieden sind, d. h. i) Hellfeldmikroskopie, ii) Dunkelfeldmikroskopie, iii) Phasenkontrastmikroskopie und iv) differentielle Interferenzkontrastmikroskopie.
Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie und Phasenkontrastmikroskopie wurden wegen der folgenden Gründe in der Form von Transmissionselektronenmikroskopie realisiert. Bei der Lichtmikroskopie werden komplizierte Operationen (d. h. Aufspalten in zwei einfallende Wellen und Wiedervereinigung der durch eine Probe gesendeten Wellen) mit einfallenden Wellen in einem realen Raum durchgeführt. Für das bestehende optische Elektronenlinsensystem ist es technisch schwierig, diese komplexen Operationen durchzuführen. Es ist bekannt, dass die Schlieren-Technologie nahe an die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie herankommt und auf dem Einsetzen eines Feldes von sichtbeschränkenden halbkreisförmigen Aperturen in die Bildebene hinter der Objektivlinse beruht. Diese Technik ist auch als Einseitenbandholographie bekannt (L. Reimer, Transmission Electron Microscopy: Physics of Image Formation and Microanalysis, Ausgabe 4, Springer, New York, 1997). Diese Technologie wurde jedoch nicht verwendet, da die Hälfte der Raumfrequenzkomponenten verloren gehen und das resultierende Bild sehr schwierig zu interpretieren ist.
Die in der Lichtmikroskopie verwendete differentielle Interferenzkontrastmikroskopie bildet topographisch Veränderungen der Phasen von einfallenden Wellen ab, welche durch eine transparente Probe erzeugt werden. Der Unterschied zwischen dem Phasenkontrastmikroskop, welches für eine transparente Probe verwendet wird und dem differentiellen Interferenzkontrastmikroskop besteht darin, dass nicht Phasen sondern deren Derivate (welche als Unterschiede bezeichnet werden sollten, da sie begrenzte Verschiebungsunterschiede darstellen) abgebildet werden. Folglich werden zwei Wollaston-Prismen auf gegenüberliegenden Seiten einer Probe angeordnet. Die einfallenden Wellen werden durch das erste Prisma in zwei geringfügig lateral versetzte Strahlen aufgespalten. Nach dem Durchgang durch die Probe vereinigt das zweite Prisma die zwei durchgeleiteten Strahlen in einen Strahl entlang der gleichen optischen Achse und die resultierende Interferenz wird nachgewiesen. Folglich wird der durch die Probe erzeugte laterale Unterschied der Phasenvariation (Phasenunterschied) in ein Intensitätsbild umgesetzt. Dies erlaubt somit eine Abbildung.
Wenn die Probe dünn ist, wird der Elektronenstrahl wenig absorbiert und geht beinahe vollständig hindurch. Das heisst, dass man davon ausgehen kann, dass die durch ein Elektronenmikroskop untersuchten Proben transparent sind. Aus diesem Grund sollte das dem Elektronenmikroskop zugrunde liegende Abbildungsverfahren die Phasenkontrastmikroskopie oder die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie sein, aber keines der beiden wird heutzutage verwendet. Im Falle der ersten Technologie ist die Funktionsweise verstanden, die Phasenplatte ist jedoch mit dem Problem hinsichtlich Aufladungseffekten behaftet. Wenn andererseits die letztere Technologie angewendet wird, ist es notwendig, Biprismen und Ablenkplatten in einer komplizierten Art und Weise zu kombinieren, wenn beabsichtigt wird, genau so zu arbeiten wie mit der zuvor erwähnten mikroskopischen Realraum-Technik. Folglich war es schwierig einen ebenso einfachen Aufbau wie bei der Lichtmikroskopie zu erreichen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Zahlreiche Operationen im Realraum können oft durch Vorgänge in einem k- Raum ersetzt werden, d. h. Operationen auf die Phasen der Elektronenwellen an der hinteren Bildebene (Beugungsebene) einer Objektivlinse, wenn entsprechende Vorkehrungen getroffen werden. Ein Beispiel ist die Installation einer Zernike-Phasenplatte an der hinteren Bildplatte (Japanische Patentanmeldung Nr. 2000-85493, eingereicht durch Nagayama und Danev). Damit solche Operationen leicht durchgeführt werden können, ist die hintere Bildebene natürlich auf ein Beleuchtungssystem mit einer punktförmigen Lichtquelle beschränkt, welches eine hintere Bildebene klar definieren kann. Solange diese Bedingungen erfüllt sind, können Leistungen erreicht werden, die ähnlich sind zu denjenigen, die durch differentielle Interferenzkontrastmikroskopie erreicht werden, indem eine neue Phasenplatte (d. h. eine halbkreisförmige Phasenplatte, welche die Hälfte des Sichtfeldes der Bildebene verdeckt) installiert wird. Diese Phasenplatte verzögert die Phasen der einfallenden Wellen um π. Vorzugsweise besteht die Phasenplatte aus einer dünnen amorphen Folie, die ein Lichtelement verwendet, welches ein geringes Maß an Streuung aufweist. Beispiele umfassen Folien aus amorphem Kohlenstoff, Folien aus amorphem Aluminium und Folien aus amorphem Silicium.
Dies wird ausführlicher unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Zunächst wird die Phasenplatte an der hinteren Bildebene (Pb) einer Objektivlinse angeordnet, die in einem wie in Fig. 11 gezeigten Transmissionselektronenmikroskop angeordnet ist. Wenn die von einer Lichtquelle ausgehenden einfallenden Elektronen nicht unmittelbar vor der Objektivlinse eine vollständig parallele Beleuchtung erzeugen, ist der Brennpunkt der einfallenden Wellen (der Kreis des geringsten Überkreuzens) über oder unter der Bildebene versetzt. In diesem Fall ist ein Bewegungsmechanismus notwendig, um den Phasenplattenhalter in die Bildebene zu bewegen. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf den Fall, dass dieser Bewegungsmechanismus vorhanden ist.
Fig. 1 zeigt eine erfindungsgemässe halbkreisförmige Phasenplatte. Üblicherweise nimmt die in die hintere Bildebene (Pb) der in Fig. 11 gezeigten Objektivlinse eingeschobene Phasenplatte einen wie in Fig. 1 gezeigten Umriss an. Die durch die Bezugszahl 1 gekennzeichnete halbkreisförmige Phasenplatte besteht aus einer dünnen Folie, die auf einem kreisförmigen Phasenplattenhalter 2 angeordnet ist. Die halbkreisförmige Platte 1 und der Phasenplattenhalter 2 werden zusammen als Phasenplattenanordnung bezeichnet. Die dünne Folie der Phasenplatte 1 bedeckt den Phasenplattenhalter 2.
Fig. 2 zeigt eine Aufsicht und eine Seitenansicht der Phasenplattenanordnung. Die Aufsicht (a) der Phasenplattenanordnung zeigt die Oberseite. Der durch die Phasenplattenanordnung besetzte Halbkreis wird als Phasenplattenhalbkreis bezeichnet. Der verbleibende Halbkreis wird als Halbkreisöffnung bezeichnet. Durchgehende einfallende Wellen werden an einer Stelle 3 fokussiert, durch welche die optischen Achsen gehen. Dieser Punkt ist der Diffraktionspunkt nullter Ordnung und eine Einstellung wird immer vorgenommen, um diesen Punkt auf die Seite der halbkreisförmigen Öffnung zu bringen. Eine Seitenansicht der Phasenplattenanordnung ist in (b) gezeigt. Die Anordnung der zwei Komponenten der Phasenplattenanordnung zueinander kann der Fig. 2 entnommen werden.
Fig. 3 zeigt das Koordinatensystem der Diffraktionsebene (Bildebene), das von der halbkreisförmigen Phasenplatte abhängt. Für eine Übereinstimmung mit der Theorie wird ein wie in Fig. 3 gezeigtes Koordinatensystem wird um die Phasenplattenanordnung herum errichtet. Der Brennpunkt (Diffraktionspunkt nullter Ordnung) der durchgehenden, einfallenden Wellen dient als Ursprung. Die einem Fourier-transformierten k-Raum entsprechenden Koordinatenachsen (k_x, k_y) werden wie gezeigt auf der Brennebene angeordnet. Die halbkreisförmige Phasenplatte bedeckt die Halbebene auf der Seite k_x < 0, wie in Fig. 3 gezeigt. Man beachte, dass k_x und k_y x- bzw. y-Komponenten eines zweidimensionalen räumlichen Frequenzvektors κ sind. Der Vektor κ korreliert mit einem Realvektor r auf der Brennebene durch die folgende Gleichung:

wobei h die Wellenlänge der Elektronenwellen und f der Abstand des Brennpunkts von der Objektivlinse ist.
Wenn Elektronen durch einen dünnen Film mit einer gleichmässigen Dicke und einer gleichmässigen Zusammensetzung durchgehen, werden die Phasen der Wellen durch die folgende Formel (D. Willasch, Optic 44, 17 (1975)) verschoben:

wobei λ die Dicke der dünnen Folie der Phasenplatte ist, V das Innenpotential des folienartigen Materials ist, U_o die Beschleunigungsspannung ist und α eine Konstante (= 0.9785 × 10^-6V^-1) ist.
Wenn in Fig. 3 die optische Achse unendlich nahe an die Kante der dünnen Folie gebracht wird, wird die Wirkung der Phasenplatte dargestellt durch:

wobei exp (iφ) auf die Halbebene des Bildes des k-Raumes der Streuwellen angewendet wird. Wenn ein schwaches Objekt als Probe verwendet wird, das geringe Variationen bezüglich der Amplitude und Phase verursacht, geht beinahe jede einfallende Welle durch den Brennpunkt 3 hindurch, ohne dabei gestreut zu werden. Die Effekte der Phasenplattenanordnung erscheinen als Modulation der Amplitude und der Phase aufgrund der folgenden Kontrasttransferfunktionen (CTFs):

Amplituden-CTF: 2cos[γ(|κ|) + φ/2]exp(-isgn(k_x)φ/2) (4)

Phasen-CTF: -2sin[γ(|κ|) + φ/2]exp(-isgn(k_x)φ/2) (5)

wobei sgn(k_x) eine Signumfunktion und sgn(k_x) = 1, (k_x ≥ 0) und sgn(k_x) = -1, (k_x < 0) ist. γ(|κ|) ist eine Phasenverzögerung, die durch die sphärische Aberration der Objektivlinse und durch Defokussieren verursacht wird. Die Phasenverzögerung hängt von der Raumfrequenz ab und wird durch die folgende Formel (L. Reimer) beschrieben:

wobei Cs der sphärische Aberrationskoeffizient und ΔZ die Defokussierung ist.
Wenn die Phasenplatte entfernt wird (φ = 0 in Gleichung (3)), sind die oben beschriebenen Gleichungen (4) bzw. (5) gegeben durch:

Amplituden-CTF: 2cosγ(|κ|) (7)

Phasen-CTF: -2sinγ(|κ|) (8)
Daraus folgt, dass CTFs erhalten werden, die auch bei der normalen Elektronenmikroskopie erhalten werden.
Insbesondere im Fall einer sehr dünnen Probe, treten geringe Amplitudenvariationen auf und somit wird die Phasen-CTF auf die Phasenkomponente angewendet und in ein beobachtetes Intensitätsbild umgewandelt. Bei der normalen Elektronenmikroskopie führt diese sinusartige CTF zu verschiedenen Schwierigkeiten, umfassend geringen Kontrast und Modulation des Bildes.
Bezüglich φ ist der Fall, bei dem φ = -π ist speziell wichtig bei bestimmten Anwendungen. Durch das Einsetzen von φ = -π in die Gleichungen (4) und (5) ergibt sich exp(isgn(k_x)π/2) = isgn (k_x). Folglich vereinfachen sich die Gleichungen (4) bzw. (5) in die Formen:

Amplituden-CTF: i2sgn(k_x)sinγ(|κ|) (9)

Phasen-CTF: i2sgn(k_x)cosγ(|κ|) (10)
Dies wird in Fig. 4 veranschaulicht, welche die Ergebnisse von Simulationen der Kontrasttransferfunktionen (CTFs) eines differentiellen Kontrastmikroskops darstellt, wobei die Phasenverzögerung der halbkreisförmigen Phasenplatte π, die Defokussierung 0 und die Beschleunigungsspannung 300 kV beträgt. In Fig. 4 zeigt (a) die auf die Amplitude angewendete CTF, während (b) die auf die Phasenkomponenten angewendete Phasen-CTF zeigt.
Im Vergleich zu den CTFs (Gleichungen (7) und (8)) eines normalen Elektronenmikroskops, werden drei unterschiedliche Merkmale beobachtet. Das erste ist, dass die entsprechenden Beziehungen bezüglich der Sinusfunktion und der Cosinusfunktion vertauscht sind und cosγ(|κ|) in der Phasen-CTF erscheint.
Das zweite Merkmal ist, dass die Signumfunktion sgn(k_x) angewendet wird. Als Ergebnis, werden die Amplituden- und Phasen-CTFs, die intrinsisch geradzahlige Funktionen sind, in ungerade Funktionen umgewandelt. Das dritte Merkmal ist, dass die imaginäre Einheit i verwendet wird. Das erste Merkmal bedeutet, dass der Bildkontrast in dem Phasenobjekt verbessert wird, da die Phasen-CTF die gleiche Kontrasttransferfunktion wie bei einem Phasenkontrastbild ist. Das dritte Merkmal ist nicht intrinsisch. Es bezieht sich auf die Umwandlung einer Realfunktion in einen Fourier-transformierten Realraum. Eine wichtige Eigenschaft ist das zweite Merkmal. CTFs die geradzahlige Funktion sind, werden in ungerade Funktionen umgewandelt. Dies führt zu einem differentiellen Kontrastbild. Dies wird im Folgenden ausführlich beschrieben.
Gleichung (10) wird durch die Summe von zwei rechtwinkligen Funktionen angenähert: (-Π(k_x/k_c + 1/2) + Π(k_x/k_c - 1/2)). Fig. 5 stellt den differentiellen Kontrast dar, bei dem die angenäherte Phasen-CTF verwendet wird. Die Phasen- CTF der Fig. 4 (b) wird durch zwei rechtwinklige Funktionen (Π(x)) mit entgegengesetzten Vorzeichen angenähert. Die Frequenz des ersten Nullpunkts in Fig. 4 (b) wird so eingestellt, dass sie k_c entspricht. Da Signale, die in dem durch |κ| > k_c gegebenen Bereich durch die in diesem Bereich auftretende schnelle Schwingungsmodulation in der ursprünglichen Funktion auf Null herausgemittelt werden, wird |κ| > k_c auf 0 eingestellt.
Fig. 5(b) ist die Fourier-Transformierte der rechtwinkligen Funktion (Fig. 5(a)) mit entgegengesetztem Vorzeichen, welche für die Annäherung verwendet wird und gegeben ist durch:
Die Fourier-Transformierte einer auf Phasenkomponenten wirkenden CTF ergibt eine von einem Punkt ausgehende Funktion eines Realraumbildes. Folglich zeigt Fig. 5(b) eine von einem Punkt ausgehende Funktion, d. h. das Maß der Unschärfe eines Bildes, wenn ein infinitesimal kleiner Punkt ein Bild bildet. Die Wirkung entspricht dem Fall, bei dem die Funktion der Gleichung (11) zu einem idealen Bild mit positivem Brennpunkt (das als Ausgangsbild bezeichnet werden kann) ohne Aberration gefaltet werden kann.
Die Gleichung (11) kann in die Form sinπk_cx - sinc(πk_cx) umformuliert werden. Der erste Term sinπk_cx bewegt die sinc-Funktion (sinc(πk_cx) = sinπk_cx/πk_cx) nach rechts und links, wodurch das Vorzeichen geändert wird. Wie aus Fig. 5 (d) entnommen werden kann, ist das Ergebnis die Summe von zwei Funktionen mit entgegengesetzten Vorzeichen. Die Gleichung (11) kann in der Form der Summe von δ-Funktionen dargestellt werden, die entgegengesetzte Vorzeichen haben und voneinander durch 1/k_c getrennt sind:
Ein tatsächliches Bild ist die Überlagerung der entsprechenden angenäherten Formel (Gleichung (12)) und dem Ausgangsbild. Folglich wird ihre Differenz erzeugt.
Insbesondere ist dieses Verfahren gleichbedeutend mit dem Bewegen des Ausgangsbildes nach links und rechts um 1/2 k_c und Verwenden der Differenz zwischen ihnen, da sie bezüglich des Vorzeichens entgegengesetzt sind. Die Verschiebung 1/2 k_c wird anhand der Position des ersten Nullpunkts in der CTF von Fig. 4(b) bestimmt. In der Praxis weist das Ausgangsbild eine durch die Funktionen bestimmte Punktverbreiterung auf, da es sich um eine Überlagerung von sinc-Funktionen handelt und folglich ist die Auflösung begrenzt.
Bis jetzt wurde die Wirkungsweise einen differentiellen Kontrastmikroskops beschrieben. Die differentielle Natur und die Eigenschaft, wonach die Phasen- CTF in cosγ(|κ|) (d. h. eine Eigenschaft, die dem differentiellen Phasenmikroskop entspricht) übergeht, leiten sich von der Tatsache ab, dass CTFs in ungerade Funktionen umgewandelt werden. Die Umwandlung zu ungeraden Funktionen beruht auf der folgenden Formel, die eine Funktion der Phasenplatte ist:
Die Eigenschaft dieser differentiellen Kontrastmikroskopie entspricht bezüglich der folgenden zwei Punkte derjenigen der differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie, welche in der Lichtmikroskopie verwendet wird: i) das Verfahren entspricht demjenigen der differentiellen Mikroskopie und ii) die CTF ist dieselbe, wie diejenige eines Phasendifferenzbildes. Aufgrund dieser Merkmale stellt das resultierende Bild eine wie in Fig. 8 gezeigte dreidimensionale topographische Darstellung dar. Deshalb wird dieses Verfahren als differentielle Interferenzkontrastmikroskopie bezeichnet. Die vorliegende Erfindung führt jedoch ein vollständig neues Verfahren ein, das auf der Beeinflussung von Phasen in einem k-Raum beruht. Um Zweideutigkeiten zu vermeiden, wird die neue Bezeichnung "differentielle Kontrastmikroskopie" eingeführt. Es wird nun eine Operation für das numerische Zurückführen der Signum-Modulation der k_x-Ebene in den Ursprungszustand diskutiert, was ein Kennzeichen eines differentiellen Mikroskops darstellt. Dies wird dadurch erreicht, dass eine Multiplikationsfunktion der folgenden Funktion auf das Fourier-transformierte Bild des erhaltenen Bildes angewendet wird:
Dieser Funktionsterm wird mit den intrinsischen CTFs (4) und (5) multipliziert, was zu den folgenden CTFs führt:
Diese CTFs sind im Gegensatz zu den CTFs der Fig. 4 geradzahlige Funktionen und weisen keine deutlich sichtbaren differentiellen Effekte auf. Wenn φ = -π in die Gleichungen (16) und (17) eingesetzt wird, ergeben sich für die CTFs die folgenden geradzahligen Funktionen:

Amplituden-CTF: sinγ(|κ|) (17)

Phasen-CTF: cosγ(|κ|) (18)
Diese CTFs unterscheiden sich nicht von den CTFs, die bei der Phasenkontrastmikroskopie unter Verwendung einer Zernike-Phasenplatte auftreten (oben zitierte Japanische Patentanmeldung Nr. 2000-85493, eingereicht durch Nagayama und Danev; R. Danev und K. Nagayama, Ultramikroskopie 88, 243 (2001)).
Folglich kann selbst ein komplexes Beobachtungsverfahren entwickelt werden, indem unter Verwendung von Demodulationsberechnungen ein herkömmliches Verfahren mit differentieller Kontrastmikroskopie kombiniert wird (K. Nagayama, J. Phys. Soc. of Jpn. 68, 811 (1999); R. Danev und K. Nagayama, J. Phys. Soc. of Jpn. 70, 696 (2001)).
Andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden im Verlauf der nun folgenden Beschreibung klar werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemässen halbkreisförmigen Phasenplatte;
Fig. 2(a) ist eine Aufsicht der in Fig. 1 gezeigten halbkreisförmigen Phasenplatte;
Fig. 2(b) ist eine Seitenansicht der in Fig. 1 gezeigten halbkreisförmigen Phasenplatte;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das ein von einer halbkreisförmigen Phasenplatte abhängiges Koordinatensystem für eine Beugungsebene (Brennebene) zeigt;
Fig. 4(a) ist ein Diagramm, das eine mit einer Amplitude assoziierte CTF zeigt;
Fig. 4(b) ist ein Diagramm, das eine mit Phasen assoziierte CTF zeigt;
Fig. 5 zeigt verschiedene Darstellungsarten für den differentiellen Kontrast, wobei eine angenäherte Phasen-CTF verwendet wird;
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen einem Brennpunkt und einer halbkreisförmigen dünnen Folie, die eine Phasenplatte bei der differentiellen Kontrastmikroskopie bildet, veranschaulicht;
Fig. 7(a) ist eine Aufsicht auf eine aus einer dünnen Folie bestehende Phasenplatte zur Verwendung in der differentiellen Kontrastmikroskopie, wobei die Phasenplatte unter Berücksichtigung der mechanischen Stabilität der dünnen Folie mit einer rechtwinkligen Öffnung versehen ist.
Fig. 7(b) ist ein Diagramm, das den entsprechenden frequenzabhängigen Kontrast veranschaulicht;
Fig. 8 zeigt Bilder von Zellschnitten eines Nierentubuli, wobei die Bilder in der oberen Reihe durch normale Mikroskopie aufgenommen wurden und die den gleichen Bereichen entsprechenden Bilder der unteren Reihen mittels differentieller Kontrastmikroskopie aufgenommen wurden;
Fig. 9 zeigt ein anderes Beispiel einer bei der differentiellen Kontrastmikroskopie verwendeten Phasenplatte, wobei die Phasenplatte unter Berücksichtigung der mechanischen Stabilität einer dünnen Folie, welche die Phasenplatte bildet, entwickelt wurde;
Fig. 10(a) zeigt ein Beispiel einer Phasenplatte, die es ermöglicht, die differentielle Richtung (und folglich die Richtung des Lichtes und des Schattens eines topographischen Bildes) aus vier Richtungen auszuwählen;
Fig. 10(b) ist eine Aufsicht einer Phasenplatte, die es ermöglicht, die differentielle Richtung von irgendeiner gewünschten Richtung auszuwählen; und
Fig. 11 ist ein Diagramm, das den Aufbau eines Transmissionselektronenmikroskops zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Im Folgenden werden die Ergebnisse von bestimmten Versuchen mit differentieller Elektronenmikroskopie beschrieben.
Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen einem Brennpunkt und einer halbkreisförmigen dünnen Folie, die als Phasenplatte bei der differentiellen Kontrastelektronenmikroskopie eingesetzt wird. Wenn sich die optische Achse (3 in Fig. 6) in einem beträchtlichen Abstand von der Kante der Phasenplatte befindet, kann kein differentieller Kontrast von niedrigfrequenten Komponenten erwartet werden. In diesem Fall stellt jede unterschiedliche Fourier-transformierte Komponente ein unterschiedliches Maß an Kontrast dar, wie in Fig. 6(b) gezeigt, welche eine schematische Ansicht ist, die die Koordinaten (k_x, k_y) veranschaulicht, wenn die Kanten der dünnen Folie (d. h. Phasenplatte) auf die k_y-Achse gelegt werden und die Frequenz-Komponenten in CTFs erscheinen. Der Bereich 4 führt zu dem gleichen Kontrast wie in der normalen Mikroskopie. Bezüglich der Phasen ist die CTF vom Sinus-Typ. Nur der Bereich 5 führt zu einem differentiellen Kontrast. Bezüglich der Phasen ist die CTF vom Cosinus-Typ. Deshalb befindet sich der Brennpunkt 3 bei praktischen Anwendungen vorzugsweise so nahe wie möglich an den Kanten der dünnen Folie.
Die halbkreisförmige Phasenplattenanordnung wurde durch den unten beschriebenen Arbeitsablauf hergestellt. Zuerst wurde eine amorphe Kohlenstofffolie mit einer gleichmässigen Dicke hergestellt. Diese Kohlenstofffolie entspricht einer Verschiebung von -π und einer dünnen Folie von etwa 60 nm. Die Kohlenstofffolie wurde auf einer Glimmerfolie durch Vakuumverdampfung gebildet. Danach wurde die Kohlenstofffolie im Wasser abgelöst und schwamm auf dem Wasser. Diese dünne Kohlenstofffolie wurde mit einem Einlochgitter aus Molybdän aufgenommen. Das gesamte Loch war mit einer Kohlenstofffolie bedeckt. Die Probe wurde in ein fokussiertes Ionenstrahlsystem eingebracht. Ein Teil der dünnen Kohlenstofffolie wurde weggeschnitten. Insbesondere wurde, wie in Fig. 7(a) gezeigt, ein quadratisches Loch 6 aus dem folgenden Grund gebildet. Die dünne Folie steht unter Spannung. Wenn die Folie wie in Fig. 6(a) geschnitten würde, würde die Spannung verloren gehen. Die Kanten der halbkreisförmigen Phasenplatte würden sich biegen. Geradlinige Kanten könnten nicht verwirklicht werden. Wenn die Fläche des herausgeschnittenen rechteckigen Anteils im Vergleich zur Fläche des Lochs gering ist, wird die Spannung aufrechterhalten. Die Kanten des Rechtecks werden sich nicht biegen. In diesem Fall stellen die Frequenzkomponenten des k-Raums den folgenden Kontrast bereit. Wie in Fig. 7(b) gezeigt ergibt der Bereich 4 einen zur normalen Elektronenmikroskopie vergleichbaren Kontrast. Der Bereich 5 ergibt einen differentiellen Kontrast. Der Bereich 7 ergibt einen Kontrast, der vergleichbar ist mit demjenigen Kontrast, der durch eine Zernike-Phasenplatte erzeugt wird. Das heisst, das sich ein Phasendifferenzkontrast ergibt, wenn φ -π/2 ist. Wenn φ = -π ist, ergibt sich ein normaler Kontrast.
Ein Beispiel eines differentiellen Kontrastbildes, das durch ein 300 kV Elektronenmikroskop erzeugt wurde, bei dem die in der Fig. 7(a) gezeigte Phasenplattenanordnung verwendet wurde, wird unten beschrieben. Die Phasenplattenanordnung ist mit einer Apertur versehen, die einen Durchmesser von 50 µm aufweist. Ein Teil von der Grösse eines 20 µm Rechtecks wurde herausgeschnitten. Die Beziehung φ = -π wird verwendet. Die Dicke der dünnen Folie beträgt 60 µm.
Fig. 8 zeigt Bilder von Zellschnitten eines Nierentubuli. Die obere Reihe zeigt ein Bild, das durch normale Mikroskopie erzeugt wurde. Die untere Reihe zeigt ein Bild desselben Ausschnitts, das durch differentielle Kontrastmikroskopie erzeugt wurde. Die diese Bilder erzeugende Probe wurde nur durch Osmium-Fixierung angefärbt. Im Allgemeinen ist diese Anfärbungsmethode vorteilhaft, um den Gewebeschnitt zu bewahren, der Farbkontrast ist jedoch gering. Wie in der oberen Reihe von Fig. 8 gezeigt, ist der Kontrast so gering, dass das Bild durch normale Mikroskopie nicht vergrössert werden kann. Die untere Reihe von Fig. 8 zeigt ein Bild desselben Ausschnitts, das durch differentielle Kontrastmikroskopie aufgenommen wurde. Zwei unterschiedliche Merkmale fallen auf. Das erste ist der ziemlich hohe Kontrast. Das zweite ist die dreidimensionale topographische Bilddarstellung. Diese Merkmale sind dieselben, wie diejenigen, die erhalten werden, wenn eine transparente Probe mittels eines differentiellen Interferenzkontrastlichtmikroskopes beobachtet wird. Als Ergebnis können hyperfeine Strukturen von Zellbildern mit einer ausserordentlich hohen Genauigkeit und hohen Auflösung schlüssig aufgeklärt werden. Für Vergleichszwecke, wurde zuerst ein differentielles Kontrastbild aufgenommen. Dann erfolgte die normale Mikroskopie. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die topographische Darstellung nicht das Resultat des Ätzens aufgrund der Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl ist.
Ein kreisförmiges Stück kann auch aus der Phasenplatte des differentiellen Kontrastmikroskops ausgeschnitten werden, da diese eine grössere Stabilität aufweist als eine Folie und weil ein breiterer differentieller Bereich gesichert werden kann. Dies ist schematisch in Fig. 9(a) gezeigt. Ein kreisförmiger, ausgeschnittener Bereich 8 kann den Brennpunkt 3 sehr nahe an seiner Kante aufweisen. Fig. 9(b) zeigt die Kontrastverteilung in einem k-Raum. Der Bereich 4 ist ein normaler Bildbereich. Der Bereich 5 ist ein differentieller Kontrastbereich. Der Bereich 7 ist ein einer Zernike-Phasenplatte entsprechender Kontrastbereich.
Desweiteren kann auch eine Apertur verwendet werden, welche 1,5-mal der Breite der Apertur entspricht, die in dem in den Figs. 7 und 8 gezeigten Mikroskop verwendet wird. Ein rechteckiges oder kreisförmiges Loch kann in der Mitte der Apertur angeordnet sein (Fig. 10). In Falle eines Rechtecks kann sich das Strahlzentrum in der Nähe der vier Kanten befinden. Im Fall eines kreisförmigen Lochs kann sich das Strahlzentrum in der Nähe irgendeiner willkürlich gewählten Kante befinden. Da die Mittelstellung des Strahls die Richtung der Verschiebung bestimmt, kann die Richtung von Licht und Schatten im Bild im Falle des rechteckigen Lochs der Fig. 10(a) auf vier Richtungen und im Fall des kreisförmigen Lochs der Fig. 10(b) auf irgendeine willkürlich gewählte Richtung eingestellt werden.
Auf diese Art und Weise können in der vorliegenden Erfindung Operationen auf Phasen durchgeführt werden, indem eine Phasenplatte verwendet wird, die an der hinteren Bildebene einer Objektivlinse angeordnet ist. Folglich wird die Amplitude und die Phase einer Kontrasttransferfunktion moduliert. Die Phasenverzögerung wird eingestellt. Folglich kann eine Transformation in ungerade Funktionen erreicht werden. Somit kann der Bildkontrast eines Phasenobjektes erhöht werden. Es können Effekte erreicht werden, die denjenigen entsprechen, die durch differentielle Interferenzkontrastmikroskopie erzeugt werden. Auf diese Art und Weise kann ein differentielles kontrastmikroskopisches Bild erhalten werden.

Claims

1. Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop, umfassend eine Objektivlinse, welche die hintere Bildebene bildet, eine Phasenplatte, die in der hinteren Bildebene angeordnet ist, und Mittel zur Durchführung von Operationen auf Phasen, wobei die Phasenplatte verwendet wird, um die Kontrasttransferfunktionen in ungerade Funktionen umzuwandeln, wodurch ein differentielles Kontrastbild erhalten wird.

2. Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop nach Anspruch 1, wobei die Phasenplatte eine halbkreisförmige Phasenplatte ist, die Phasen um π verzögert.

3. Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop nach Anspruch 1, wobei die Phasenplatte aus einer dünnen Folie, welche als Phasenplatte fungiert, besteht, wobei die dünne Folie einen rechteckig ausgeschnittenen Bereich aufweist, wobei die dünne Folie eine vollständige Abdeckung über eine Aperturöffnung mit einem Zentrum bereitstellt und wobei der rechteckig ausgeschnittene Bereich so angeordnet ist, dass seine Kanten oder sein Zentrum mit dem Zentrum der Apertur überlappen.

4. Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop nach Anspruch 1, wobei die Phasenplatte aus einer dünnen Folie, welche als Phasenplatte fungiert, besteht, wobei die dünne Folie einen kreisförmig ausgeschnittenen Bereich aufweist, wobei die dünne Folie eine vollständige Abdeckung über eine Aperturöffnung mit einem Zentrum bereitstellt und wobei der kreisförmig ausgeschnittene Bereich so angeordnet ist, dass seine Kanten oder sein Zentrum mit dem Zentrum der Apertur überlappen.

5. Differentielles Kontrasttransmissionselektronenmikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei eine räumliche Verschiebung, die zwischen einer optischen Achse und einer Kante der Phasenplatte erzeugt wurde, um einen differentiellen Kontrast zu erzeugen, mittels des Ausmaßes der Defokussierung kontrolliert wird.

6. Verfahren zur Datenverarbeitung eines elektronenmikroskopischen Bildes, umfassend die Schritte:
Fourier-Transformieren eines durch das Elektronenmikroskop nach Anspruch 2 erhaltenen Bildes; und
Verarbeiten, um die durch eine Phasenplatte verursachte Phasenverzögerung auf Null abzugleichen, wodurch ein Phasendifferenzkontrastbild wiedergegeben wird.

7. Verfahren zur Datenverarbeitung eines elektronenmikroskopischen Bildes, umfassend die Schritte:
Erhalten eines Phasendifferenzbildes von einer Probe gemäss Anspruch 5;
Erhalten eines normalen elektronenmikroskopischen Bildes von der gleichen Probe; und
Kombinieren des Differenzbildes und des normalen elektronenmikroskopischen Bildes, um ein komplexes Bild zu erzeugen.