DE10238069A1

DE10238069A1 - MALDI-Matrix

Info

Publication number: DE10238069A1
Application number: DE10238069A
Authority: DE
Inventors: Günther Dr. Boehm; Bernd Dr. Stahl; Marko Mank
Original assignee: Nutricia NV
Current assignee: Nutricia NV
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2002-08-19
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2004023147A2; CN1675554A; JP2005536759A; CA2496018A1; WO2004023147A3; EP1549958A2; AU2003258549A1; US20050158863A1

Abstract

Bereitgestellt werden Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen, UV-Licht absorbierenden Substanz. Diese Matrizes zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine bei Raumtemperatur ionische Flüssigkeit darstellen, dass das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 3-Aminochinolin, Pyridin, einem primären Amin, an dessen N-Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter C¶1¶-C¶11¶-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, und einem sekundären und tertiären Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten C¶1¶-C¶8¶-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest handelt, und dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure, Picolinsäure, 3-Hydroxypicolinsäure, Nikotinsäure, 5-Chloro-2-mercaptobenzothiazol, 6-Aza-2-thiothymin, 2', 4', 6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat, 2', 6'-Dihydroxyacetophenon, 9H-Pyridol[3, 4-b]indol, Dithranol und trans-3-Indolacrylsäure. Mit diesen flüssigen Matrizes können fehlerfreiere und reproduzierbarere Analysenwerte erhalten werden, wobei insbesondere die Verknüpfung der reinen ...

Description

Die Erfindung betrifft Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen, UV-Licht absorbierenden Substanz und die Verwendung derartiger Matrizes.
Die Ultraviolett-Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie wird im allgemeinen abgekürzt als UV-MALDI-MS.
Das Analysenprinzip der UV-MALDI-MS basiert auf einer Matrixunterstützten Laserdesorption und Ionisierung von Molekülen einschließlich Biomolekülen aus einer Kokristallisation aus einem Analyt und einer UV-Licht-absorbierenden Matrixsubstanz. Derartige UV-Lichtabsorbierenden Substanzen werden vereinfacht auch MALDI-Matrix genannt.
Übliche MALDI-Matrizes sind beispielsweise 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) und trans-3,5-Dimethoxy-4-Hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure).
Die Kokristallisation von Analyt und Matrix wird beispielsweise erreicht, indem man üblicherweise wässrige Lösungen der genannten UV-Lichtabsorbierenden Matrixsubstanzen und des Analyten auf einem Metallprobenträger mischt und trocknet. Die aus der festen Phase der Kokristallisation erzeugten Ionen werden anschließend mit massenspektrometrischen Analysatoren, die beispielsweise auf dem TOF-, Quadrupol-, Ionenfallen- oder FTICR-Prinzip oder auf einer Kombination dieser Techniken basieren, nachgewiesen.
Die UV-MALDI-MS wird vorwiegend eingesetzt zu massenspektrometrischen Analysen von Molekülen bzw. von Biomolekülen, beispielsweise Kohlenhydraten, Proteinen, Peptiden, Nukleotiden und Lipiden einschließlich deren entsprechender Konjugate wie Glycoproteine, Lipoproteine etc. Auch die direkte Charakterisierung ganzer Zellen und Mikroorganismen mittels MALDI-MS-Analyse ist möglich. Diesbezüglich wird beispielsweise verwiesen auf Alomirah HF, Alli I, Konishi Y.,Applications of mass spectrometry to food proteins and peptides, J. Chromatogr. A. 2000 Sep 29;893(1):1-21. Review; Kussmann M, Roepstorff P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS, Methods Mol. Biol. 2000;146:405-24; Bonk T., Humney A., MALDI-TOF-MS analysis of Protein and DNA, Neuroscientist, 2001, 27(5), 465-72.
Die MALDI-MS verfügt über viele Vorteile. Dazu zählt die hohe Empfindlichkeit der Analyse (Femto – bis Attomolbereich bei Isolaten), eine hohe Toleranz gegenüber Verunreinigungen und verschiedenen Puffersubstanzen, die einfache Probenpräparation („Dried Droplet-Verfahren") und die Einbindung des MALDI-MS-Prinzips in Hochdurchsatzanalysen.
Desweiteren ist es möglich, Enzyme auf den MALDI-Targets bzw. den MALDI-Probenträgern einzusetzen um Modifikationen an den zu untersuchenden Molekülen durchzuführen und diese massenspektrometrisch nachzuweisen. Dazu wird eine Lösung aus Enzym, Analyt/Substrat und einer neutralen herkömmlichen MALDI-Matrix wie ATT direkt auf das MALDI-Target appliziert. Die ablaufende enzymatische Reaktion wird anschließend durch Trocknen und Kokristallisation des Ansatzes gestoppt. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels MALDI kann dann nach der eigentlichen enzymatischen Reaktion wie üblich durchgeführt werden Alternativ kann auch eine saure Matrix wie etwa DHB zur Beendigung einer enzymatischen Reaktion nachträglich zum Reaktionsansatz zugegeben werden.
Ein wesentlicher Nachteil der MALDI-MS-Analyse mit einer festen Matrix oder einer festen Analytpräparation ist allerdings die oft hohe Varianz der Signalintensitäten des Analyten bei der Desorption von unterschiedlichen Stellen der gleichen Präparation bzw. des gleichen Präparates. Diese Varianz beruht einerseits darauf, dass die Analytmoleküle über die Oberfläche der getrockneten Präparation unterschiedlich verteilt sind. Andererseits ist die Ursache dafür in dem unterschiedlichen Einbau verschiedener Substanzklassen in das Kristallgitter der getrockneten Kokristallisation von Analyt/Probe und Matrix zu sehen. Es sind nun bereits verschiedene Präparationsverfahren vorgeschlagen worden, um homogenere Kristallisationen zu erreichen. Dazu zählt beispielsweise die Dünnschichtpräparation (Vorm O., Roepstorf, P., Mann M., Anal, Chem., 64, 1992, 1879-1884), die Präparation auf dünnen Schichten von Matrixkristallen, die als Kristallisationskeime dienen, die Anwendung von Nitrozellulosezusätzen sowie Fucose und das Lösen üblicher MALDI-Matrizes wie DHB oder CHCA in Glycerin (Sze ET, Chan TW, Wang G. Formulation of matrix solutions for use in matrix-assisted laser desorption/ionization of biomolecules. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 1998 Feb;9(2):166-74). Diese optimierten Verfahren lösen jedoch immer nur Probleme aus Teilbereichen der MALDI-MS-Analytik.
Es sind auch schon ionische Flüssigkeiten aus einem Aminsalz einer organischen Säure als Matrizes für die MALDI-MS vorgeschlagen worden, man vergleiche D. W. Armstrong et al, Anal. Chem. 2001, 73, 3679-3686,. Dabei handelt es sich um Aminsalze verschiedener Zimtsäurederivate bzw. aus Aminochinolin und CHCA (Kolli VSK, Orlando R, Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10:923-926).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Matrizes für die UV-MALDI-MS bereitzustellen, mit denen fehlerfreiere und reproduzierbarere Analysenwerte erhalten werden können, wobei insbesondere die Verknüpfung der reinen massenspektrometrischen Analyse mit den zusätzlichen Erkenntnissen aus enzymatischen Reaktionen/Modifikationen mit der Möglichkeit eines Monitoring gegeben sein soll.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Matrizes gemäß der Lehre des Ansprüche 1 bis 4 sowie durch die Verwendung dieser Matrizes in Form einer ionischen Flüssigkeit nach der Lehre der Verwendungsansprüche.
Gegenstand der Erfindung sind neue Matrizes, und zwar solche, die ionische Flüssigkeiten darstellen und somit bei Raumtemperatur flüssig sind. Diese Matrizes sind aufgebaut aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen, UV-Licht absorbierenden Substanz. Bei dem Amin handelt es sich um 3-Aminochinolin, um Pyridin, um ein primäres Amin, an dessen N-Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter C₁-C₁₁-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, oder um ein tertiäres oder sekundäres Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten C₁-C₈-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest handelt.
Die genannten C₁-C₈-Alkylreste können somit 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 C-Atome besitzen, wobei die C₁-C₁₁-Alkylreste bei den primären Aminen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 C-Atome besitzen können.
Zu den erfindungsgemäß eingesetzten Aminen zählen somit folgende:

– ein primäres Amin, an dessen N-Atom ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, n-Pentyl-, iso-Pentyl-, n-Hexyl-, iso-Hexyl-, n-Heptyl-, iso-Heptyl-, n-Octyl-, iso-Octyl-, n-Nonyl-, iso-Nonyl-, n-Decyl, iso-Decyl-, n-Undedcyl- oder iso-Undecyl-Rest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, oder ein Phenylrest gebunden ist.
– ein sekundäres oder tertiäres Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, n-Pentyl-, iso-Pentyl-, n-Hexyl-, iso-Hexyl-, n-Heptyl-, iso-Heptyl-, n-Octyl- und iso-Octyl-Resten, die durch eine OH-Gruppe substituiert sein können, und einem Phenylrest.
– 3-Amino-chinolin oder Pyridin.

Die oben aufgeführten iso-Resten umfassen alle möglichen Isomere.
Bei der organischen Substanz handelt es sich um 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure, Picolinsäure, 3-Hydroxypicolinsäure, Nikotinsäure, 5-Chloro-2-mercaptobenzothiazol, 6-Aza-2-thiothymin, 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat, 2',6'-Dihydroxyacetophenon, 9H-Pyridol[3,4-b]indol, Dithranol und trans-3-Indolacrylsäure. Es werden somit solche Matrizes beansprucht, die bei Raumtemperatur als ionische Flüssigkeit vorliegen. Diese ionische Flüssigkeit wird aufgrund einer Säure Base Reaktion erzeugt aus einem genannten Amin mit der Funktion eines Protonenakzeptors und einer genannten UV-Licht absorbierenden Substanz mit der Funktion eines Protonendonators.
Bei dem Amin handelt es sich vorzugsweise um Anilin, Ethanolamin, Ethylamin. n-Butylamin, N,N-Diethylamin, N,N-Diethylanilin, N,N-Diethylmethylamin, N,N-Dimethylamin, Triethylamin, Tri-n-propylamin, Tri-n-butylamin, 3-Aminochinolin und Pyridin.
Zu den neuen Matrizes gehören vorzugsweise 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin und 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure-Butylamin.
Die neuen Matrizes sind dadurch erhältlich, dass ein als Protonenakzeptor reagierendes, oben beschriebenes Amin mit einer als Protonendonator reagierenden organischen, UV-Licht absorbierenden, oben beschriebenen Substanz in einem Molverhältnis von 0,5 : 1 bis 1 0,5 und vorzugsweise im molaren Verhältnis umgesetzt wird, indem beispielsweise diese beiden Reaktanden miteinander in Kontakt gebracht werden. Ist nur einer der Reaktanden flüssig, dann kann der feste Reaktand zu dem flüssigen Reaktanden hinzugegeben werden und vice versa. Im Falle von zwei flüssigen Reaktanden können diese zusammengegeben werden. Vorzugsweise werden die beiden Reaktanden jedoch in einem Lösungsmittel miteinander in Kontakt gebracht, das nach der Umsetzung entfernt wird, vorzugsweise durch Abziehen des Lösungsmittels, insbesondere im Vakuum. Werden bei dieser Umsetzung bzw. nach dem Entfernen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur flüssige Reaktionsprodukte erhalten, dann handelt es sich um erfindungsgemäße ionische Flüssigkeiten bzw. Matrizes.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der neuen Matrizes sowie bekannter Matrizes in Form von ionischen Flüssigkeiten aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und von Zimtsäure oder einem Zimtsäurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um Pyridin oder um 3-Aminochinolin handelt, als Medium zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reaktionsprodukte mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie.
Diese bekannten flüssigen Matrizes sind beschrieben an dem bereits oben genannten Ort, nämlich von D. W. Armstrong et al in Anal. Chem. 2001, 73, 3679-3686.
Die neuen Matrizes und die bekannten Matrizes werden im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als erfindungsgemäße Matrizes bezeichnet.
Da die erfindungsgemäße Matrix flüssig ist, liegt eine homogene Verteilung des Analyten in dieser Matrix vor. Daher treten die oben geschilderten Probleme mit den festen Matrizes nicht auf. So findet beispielsweise keine Segregation verschiedener Analytkomponenten an verschiedenen Punkten der Präparation statt. Daher kann eine UV-MALDI-MS mit einer flüssigen Matrix auch für Zwecke einer quantitativen Analyse eingesetzt werden, die bisher nur in wenigen Ausnahmefällen möglich war, beispielsweise durch den Einsatz isotopenmarkierter interner Standards.
Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von ionischen Flüssigkeiten als Matrix besteht darin, dass das Matrix/Analytgemisch nicht trocken sein muss. Dies führt zu einer Zeitersparnis bei der Herstellung der Präparation.
Allerdings ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen Matrizes bzw. die erfindungsgemäßen ionischen Flüssigkeiten zusammen mit einem Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, Isopropanol sowie langkettigeren Alkoholen und Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran zum Einsatz zu bringen, um die Viskosität der ionischen Matrix zu verringern und besser handhabbar, beispielsweise pipettierbar zu machen. Weiterhin kann durch den Einsatz der genannten Lösungsmittel die Solubilisierung der Analyten in der Matrix verbessert werden.
Die erfindungsgemäßen Matrizes können problemlos in bereits existierenden UV-MALDI-Massenspektrometern eingesetzt werden, die beispielsweise mit N₂-Lasern ausgerüstet sind.
Mit einer flüssigen Matrix ist zudem die Analyse eines breiten Spektrums von Molekülen möglich. Dazu zählen technische Polymere und Biopolymere wie Kohlenhydrate, z. B. Oligosaccharide, Proteine, Peptide, Lipide, Nukleinsäuren, Sekundärmetabolite, Pharmaka und deren Konjugate, beipielsweise Glyko- sowie Lipokonjugate und auch sekundäre Pflanzenmetabolite (z.B. Flavonoide inklusive Procyanidine etc.).
Mit den erfindungsgemäßen Matrizes ist es zudem möglich, Reaktionsabläufe und Reaktionsverläufe einschließlich Kinetiken zu untersuchen, ohne die Reaktion zu einem willkürlichen Zeitpunkt stoppen zu müssen. Dies gilt vorzugsweise für Reaktionen, die durch Enzyme, insbesondere Glycosidasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden. So können insbesondere enzymatische Spaltungen von Peptiden/Proteinen mittels Proteasen (z.B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Aminopeptidase, Carboxypeptidase) sowie Spaltungen von Kohlenhydraten und Glycoconjugaten mittels Glycosidasen (z.B.: Fucosidasen, Sialidasen, Galactosidasen, Hexosaminidasen, Pectinasen, Lyasen) und darüber hinaus Spaltungen von Lipiden (Triglyceriden, Phospholipide, Glycolipide) und Nukleinsäuren (DNA, RNA) untersucht werden. Ferner können auch Synthesereaktionen in der MALDI-Matrix mittels Transferasen wie etwa Transglycosidasen verfolgt werden.
Analyte mit hoher Konzentration können unverdünnt direkt präpariert und vermessen werden. Zudem ist eine simultane Detektion von unterschiedlichen Analyten mit geringer vom Desorptionsort abhängiger Varianz möglich. Dies gilt auch für Analyte unterschiedlicher Substanzklassen mit unter Umständen unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften.
Der Einsatz einer flüssigen Matrix ermöglicht auch die Analyse labiler Analyte. Es wird dabei davon ausgegangen, ohne an diese Erklärung gebunden zu sein, dass die Desorption von einer flüssigen Matrix schonender verläuft, da der Analyt nicht aus dem Kristallgitter sondern aus einer Flüssigkeit in die Gasphase übergeht.
Bedingt dadurch, dass der pH-Wert der erfindungsgemäßen Matrizes näher an physiologischen Werten von nicht-kovalenten Komplexen und säurelabilen Molekülen liegt, können auch derartige Analyten vermessen werden.
Darüberhinaus ermöglichen die flüssigen Matrices auch eine Kopplung von analytischen und präparativen chromatographischen Methoden wie der HPLC, GPC, HPAEC mit der MALDI-MS. So können etwa im Atmospheric Pressure MALDI-Modus die Matrix und das Säuleneluat in bzw. vor der Quelle gemischt werden. Bei offline MALDI-Analyse können geeignete Probenapplikationsroboter Säuleneluate parallel mit flüssiger Matrix auf Targets applizieren, um so kontinuierlich, unter „Abbildung" einer hohen chromatographischen Trennung, eine verbesserte Analyse zu gewährleisten.
Die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie kann neben LC auch mit Elektrophoresetechniken (wie FFE-, PAGE- oder CE-Techniken ) ggf. unter Einsatz von Probenapplikationsrobotern kombiniert/gekoppelt werden.
Gegenstand der Erfindung ist zudem ein Verfahren gemäß der Lehre der Verfahrensansprüche.
Die Erfindung wird im folgenden anhand bevorzugte Ausführungsformen erläuternder Beispiele näher beschrieben. Prinzipiell sind die erfindungsgemäßen Matrizes dadurch herstellbar, das ein als Protonenakzeptor reagierendes Amin in äquimolarer Menge zu einer als Protonendonator reagierenden organischen Substanz, die UV-Licht absorbiert, hinzugegeben wird. Die Umsetzung wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Es wird eine ionische Flüssigkeit bzw. ein flüssiges Salz erhalten, das hochvakuumstabil ist und als UV-MALDI-Matrix eingesetzt werden kann.
Beispiel 1
Herstellung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin (DHB-Bu):
308,4 mg 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min). Das Endvolumen des erhaltenen DHB-Bu betrug etwa 200 μl.
Beispiel 2
Herstellung von 5-Methoxysalicylsäure-Butylamin (MSA-Bu):
336,4 mg 5-Methoxysalicylsäure (MSA; wird auch als 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure bezeichnet) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dazu wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden ca. 200 μl MSA-Butylamin (MSA-Bu) erhalten.
Durch Vermischen von Butylamin-DHB mit Butylamin-MSA (10 : 1) (v/v) kann Butylamin-DHBS hergestellt werden.
Beispiel 3
Herstellung α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Butylamin (CHCA-Bu):
378,4 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) wurden in 10 ml Methanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden 200 μl α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Butylamin (CHCA-Bu) erhalten.
Beispiel 4
Herstellung Sinapinsäure-Triethylamin:
378,4 mg Sinapinsäure (trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-zimtsäure) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 278,4 μl Triethylamin hinzugegeben. Die Aufarbeitung erfolgte entsprechend Beispiel 1. Es wurden 200 μl Sinapinsäure-Triethylamin erhalten.
Beispiel 5
Herstellung von 6-Aza-2-Thiothymin-Butylamin (ATT-Bu):
286,4 mg 6-Aza-2-Thiothymin (ATT) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min.). Das Endvolumen des erhaltenen ATT-Bu betrug etwa 200 μl.
Beispiel 6
Herstellung von 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat-Butylamin (THAP-Butylamin):
372,4 mg 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydra (THAP) wurden in 10 ml Ethanol gelöst. Dann wurden 198,4 μl Butylamin (Bu) hinzugegeben.
Das Lösungsmittel wurde bei ca. 40 °C sowie ca. 43 mbar abgezogen, bis keine Volumenreduktion mehr erfolgte (ca. 30 min.). Das Endvolumen des erhaltenen THAP-Bu betrug etwa 200 μl.
Zur Verringerung der Viskosität der erhaltenen ionischen Matrizes können diese jeweils mit einem Lösungsmittel, beispielsweise reinem Ethanol im Verhältnis 1 : 1 V/V verdünnt werden und sind dann gut pipettierbar
Beispiel 7
Die Herstellung einer Matrix-Analytpräparation kann nach folgender allgemeinen Arbeitsweise erfolgen:

1. 1 μl flüssige ionische Matrix A (unverdünnt oder 1:1 (v/v) in EtOH oder Lösungsmittel B) werden mit 1 μl Analyt C in einem geeignetem Lösungsmittel D auf einer MALDI-Probenplatte (Stainless Steel Target) vermischt.
2. Alternativ kann die Präparation wie unter 1. erfolgen, jedoch nach vorheriger Entsalzung des Analyten durch Inkubation in einer 1:1 (v/v) Verdünnung mit einem Crown-Ether bzw. mit Ionenaustauschern.
3. Die MALDI-Probenplatte mit der vorgemischten Probe wird direkt in das MALDI-Hochvakuum transferiert. Dann erfolgt die Durchführung der MALDI MS Analyse.

Als Matrix A können alle hier beschriebenen ionischen Flüssigkeiten und insbesondere folgende eingesetzt werden: Butylamin-CHCA, Butylamin-DHB, Butylamin-MSA, Butylamin-DHBS und Triethylamin-Sinapinsäure.
Als Lösungsmittel B können folgende eingesetzt werden: Aceton, Acetonitril, Methanol (MetOH), Ethanol (EtOH), Butanol, Isopropanol, Chloroform und H₂O.
Bei dem Analyt C kann es sich um folgende Substanzklassen handeln:

1. Technische Polymeren (z.B. PEG, Polyacrylamide, PE),
2. Kohlenhydraten (z.B. Mono-, Di-, Tri-, Oligo- und Polysaccharide, homopolymerer und heteropolymerer Zusammensetzung),
3. Proteine und Peptide,
4. Lipide,
5. Konjugate obiger Analyte,
6. Mono-, Di, -Tri-, Oligo- und Polynucleotide,
7. sekundäre Pflanzenmetabolite ( Phenolische Substanzen, Flavonoide etc.),
8. Atome die im Hochvakuum nicht flüchtig sind (z.B. Alkali-, Erdalkalimetalle (wie Na, K, Ca, Mg), Metalle (wie Fe, Zn, Sn, Cu, Cr, etc.).

Als Lösungsmittel D können folgende dienen: Wässrige oder angesäuerte Lösung von 10-80 % MetOH, EtOH, H₂O, Aceton, Acetonitril, Isopropanol, Butanol, Chloroform, DMSO, DMF, Glycerin und THF.
Die Lösung kann z.B. mit 0,1-5% TFA, Essigsäure oder Ameisensäure angesäuert werden.
Beispiel 8
In den oben beschriebenen Matrizes können Reaktionen von (Bio)Polymeren und insbesondere enzymatische Reaktionen durchgeführt werden. Die Matrix dient dabei zusätzlich als Medium bzw. als „Reaktions-Container". Die Reaktionsverläufe können dann unmittelbar und kontinuierlich massenspektroskopisch verfolgt werden.
Für die Herstellung der entsprechenden Präparationen kann man wie folgt vorgehen (allgemeine Arbeitsweise):
0,5μl flüssige ionische Matrix A (unverdünnt oder 1:1 (v/v) werden in EtOH oder einem anderem geeigneten Lösungsmittel) mit 0,5 μl eines Enzyms B_(ca. 1 μg/μl) in einem geeigneten Lösungsmittel/Puffer C sowie mit 0,5 μl eines Substrats D (ca. 1 μg/μl ) in einem geeigneten Lösungsmittel/Puffer auf einer MALDI-Probenplatte homogen vermischt. Danach erfolgt ein direkter Transfer der MALDI-Probenplatte mit dem vorgemischten enzymatischen Ansatz in der ionischen flüssigen MALDI-Matrix in das MALDI-Hochvakuum.
Als Matrix A können diejenigen eingesetzt werden, die im Beispiel 7 aufgeführt sind.
Als Enzym B können folgende Enzymklassen Verwendung finden: Hydrolasen, Isomerasen, Lyasen, Transferasen, Oxidoreduktasen und Ligasen.
Als Lösungsmittel/Puffer C sind folgende einsetzbar.: H₂O, Carbonatpuffer, Ammoniumacetatpuffer, Tris-Puffer oder ein anderes geeignetes und MS kompatibles Puffersystem oder Lösungsmittel.
Das Enzym/Substratverhältnis in der fertigen Matrix-Enzym-Substratlösung beträgt dabei 1:1 bis 1:300 (w/w) oder mehr.
Anwendungsbeispiele:

– Desialisierung eines Trisaccharides aus humaner Milch: 0,5μl Sialidase aus Clostridium Perfringens 1 μg/μl (ca. 0,1 U/μl) in 25mM NH₄-Acetatpuffer bei pH 5.0) mit 0,5μl Sialyllactose 1 μg/μl in H₂O und mit 0,5μl DHB-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Defucosylierung eines Pentasaccharides aus humaner Milch: 0,5μl α-Fucosidase aus Rinderniere 1 μg/μl (ca. 2mU/μl) in 25mM NH₄-Acetatpuffer bei pH 5.0) mit 0,5μl LNFP 1 μg/μl in H₂O und mit 0,5μl DHB-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Deglykosilierung eines Glykoproteins: 0,5μl PNGase F aus Flavobacterium Meningosepticum, rekombinant 1 μg/μl (ca. 0,5U/μl) in 20mM Tris-Puffer pH 7.5 mit 0,5μl RNAse B 1 μg/μl in H₂O und mit 1 μl CHCA-Bu oder DHB-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferrieren.
– Enzym. Hydrolyse von humanem Casein: 0,5μl Trypsin mit TPCK aus bovinem Pancreas 0,01-1 μg/μl (ca. 0,074 -7,4 U/μl) mit 0,5μl β-casein 1 μg/μl in Imidazolpuffer 12,5mM pH 7.6 und mit 1 μl CHCA-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Carboxypeptidasenverdau zur Sequenzanalyse eines Peptides: 0,5μl Carboxypeptidase aus Saccharomyces Cerevisiae (CPY) 0,2μg/μl (ca. 20mU/μl) mit 0,5μl Peptid 0,1-1μg/μl in 60mM Diammoniumhydrogencitratpuffer pH 5 und mit 1 μl CHCA-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Aminopeptidasenverdau zur Sequenzanalyse eines Peptides: 0,5μl Aminopeptidase aus Aeromonas Protolytica 0,2μg/μl (ca. 20mU/μl) mit 0,5μl Peptid 0,1-1 μg/μl in Tricinpuffer pH 8 +ZnCl₂ und mit 1 μl CHCA-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Dephosphorylierung eines Phosphoglykopeptides: 0,5μl saure Phosphatase aus Kartoffeln 0,01-1 μg/μl (ca. 0,02 -2 U/μl) mit 0,5μl β-casein 1 μg/μl in 25mM NH₄-Acetatpuffer bei pH 5 und mit 1 μl CHCA-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Dephosphorylierung eines Phospholipids: 0,5μl Phospholipase A₂ aus Honigbienengift 0,01 μg/μl (ca. 10mU/μl) mit Phosphatidylcholin diheptadecanoyl 1 μg/μl in MetOH/ CHCl₃ (2:1) und mit 1 μl DHB-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Deglykosilierung eines Glykolipids/Gangliosids: 0,5μl Ceramidglykanase aus Marobdella Decora 1 μg/μl (ca. 10 mU/μl) in 20mM Tris-Puffer pH 7.0 mit bovinem Gangliosid GM1 1μg/μl in H₂O und mit 1 μl CHCA-Bu oder DHB-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.
– Sequenzierung eines Oligonucleotides: 0,5μl Phosphodiesterase I aus Crotalus Adamanteus Gift ca. 1 mU/μl in 20mM Tris-Puffer pH 8.0 mit 0,5μl Oligonucleotid in H₂O 1 μg/μl und mit 1 μl CNCA-Bu (1:1 in EtOH) auf MALDI-Probenplatte mischen und direkt ins MALDI-MS Hochvakuum transferieren.

Die Aufnahme der MALDI-MS-Spektren erfolgt z.B. nach 0, 5, 10, 20, 30, 60 und 120 Minuten. Die MS-Analyse kann, wenn nötig, auch bis auf einige Tage nach Ansatz der Mischung ausgedehnt werden
Auf die oben beschriebene Weise ist z.B. auch ein einfaches Screening von Substraten oder Reaktionsprodukten möglich. So können beispielsweise mehrere hundert verschiedene Substrate mit einem Enzym auf nur einer Proben-Platte inkubiert werden. Dazu sind nur geringste Mengen Enzym und Substrat (0,5 μl bei beispielsweise 1 μg/μl) erforderlich. Über die massenspektrometrische Analyse können beispielsweise Kinetiken im Vakuum verfolgt werden. Diese Anwendung birgt unter Ausnutzung bereits bestehender automatischer Messprogramme ein sehr hohes Potential bezüglich Automatisierung und Kostenersparnis.
Dies gilt beispielsweise im Falle des Einsatzes von Sialidase zur Desialisierung von Sialyllactose in DHB-Bu und im Falle des Einsatzes von PNGaseF zur Deglykosilierung von Glycopeptiden/-Proteinen in DHB-Bu.
Weiterhin können die oben beschriebenen Matrizes in kombinierten LC-MALDI-MS oder in Elektrophorese-MALDI-MS Verfahren (PAGE, CE, FFE) eingesetzt werden.

Claims

Matrizes für die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie aus einem Salz eines als Protonenakzeptor reagierenden Amins und einer als Protonendonator reagierenden organischen, UV-Licht absorbierenden Substanz dadurch gekennzeichnet, dass die Matrizes eine bei Raumtemperatur ionische Flüssigkeit darstellen, dass das Amin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Aminochinolin, Pyridin, einem primären Amin, an dessen N-Atom ein Phenylrest oder ein gerader oder verzweigter, gesättigter C₁-C₁₁-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, gebunden ist, und einem sekundären und tertiären Amin, an dessen N-Atom zwei oder drei Reste gebunden sind, die gleich oder verschieden sein können und bei denen es sich um einen geraden oder verzweigten, gesättigten C₁-C₈-Alkylrest, der durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann, und einen Phenylrest handelt, und dass die organische Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 2-Hydroxy-5-methoxy-benzoesäure, Picolinsäure, 3-Hydroxypicolinsäure, Nikotinsäure, 5-Chloro-2-mercaptobenzothiazol, 6-Aza-2-thiothymin, 2',4',6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat, 2',6'-Dihydroxyaceto-phenon, 9H-Pyridol[3,4-b]indol, Dithranol und trans-3-Indolacrylsäure.
Matrizes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Amin um Anilin, Ethanolamin, Ethylamin. n-Butylamin, N,N-Diethylamin, N,N-Diethylanilin, N,N-Diethylmethylamin, N,N-Dimethylamin, Triethylamin, Tri-n-propylamin, Tri-n-butylamin, 3-Aminochinolin und Pyridin handelt.
Matrizes nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Matrizes um 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Butylamin oder 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure-Butylamin handelt.
Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Lösungsmittel versetzt sind.
Verwendung der ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der Ultraviolett Matrixunterstützten Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie und insbesondere zur quantitativen oder qualitativen Ultraviolett Matrixunterstützten Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie.
Verwendung der ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4 und von bei Raumtemperatur flüssigen, ionische Flüssigkeiten darstellenden Matrizes aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und von Zimtsäure oder einem Zimtsäurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um 3-Aminochinolin und um Pyridin handelt, als Medium zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reaktionsprodukte mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionen durch Enzyme, insbesondere durch Glycosidasen, Proteanen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden, und es sich bei den (Bio)Polymeren um Peptide, Proteinen, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren, Sekundärmetabolite und/oder Pharmaka sowie deren Konjugate handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie mit analytischer oder präparativer Flüssigchromatographie, insbesondere HPLC, GPC und HPAEC, oder Elektrophorese-Techniken, insbesondere CE, CEC, PAGE und FFE, kombiniert wird.
Verfahren zur Durchführung von Reaktionen mit (Bio)Polymeren und zur Überwachung dieser Reaktionen sowie zur Analyse der dabei entstehenden Reaktionsprodukte, wobei diese Reaktionen insbesondere durch Enzyme, vorzugsweise Glycosidasen, Proteasen, Nukleasen, Lipasen oder Lyasen, katalysiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass diese Reaktionen in einer eine ionische Flüssigkeit darstellenden Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder in einer eine ionische Flüssigkeit darstellenden Matrix aus einem Salz aus einem als Protonenakzeptor reagierenden Amin und aus Zimtsäure oder einem Zimtsäurederivat, wobei es sich bei dem Amin um eine solches, an dessen N-Atom ein, zwei oder drei Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl- Rest(e), der/die durch eine OH-Gruppe substituiert sein kann/können, und/oder ein Phenylrest gebunden ist/sind, um 3-Aminochinolin oder um Pyridin handelt, durchgeführt und mittels der Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie überwacht werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultraviolett Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/lonisations-Massenspektrometrie mit analytischer oder präparativer Flüssigchromatographie (HPLC, GPC, HPAEC)- oder Elektrophorese-Techniken (CE, CEC, PAGE, FFE,) kombiniert wird.