CN102472755A - 用于分子的激光解吸离子化质谱的表面涂层 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于激光解吸离子化质谱的方法，使用苯胺或苯胺衍生物、或丙烯酸苯酯或丙烯酸苯酯衍生物的聚合物。所述聚合物是UV吸收聚合物，在该聚合物上可以沉积样品探针。通过使用UV激光束，能够解吸和离子化样品分子。可不再需要添加UV吸收基质材料。
Description
技术领域
本发明涉及使用聚合物作为UV吸收介质(absorption medium)的激光解吸离子化质谱（laser desorption ionization mass spectrometry）方法，其中将感兴趣的样品探针(sample probe)沉积在所述作为UV吸收介质的聚合物上。
背景技术
质谱（MS）是用于测定各种化合物的分子质量的广泛使用的分析方法。其涉及样品分子向气相的转移和所述分子的离子化(ionization)。使用高真空中的电或磁场基于分子离子的质荷（m/z）比将它们分离。在过去的十年期间，MS已经被证实是用于生物聚合物如蛋白质和肽的精确和灵敏分析的杰出技术。随着软离子化技术如电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸离子化（MALDI）的采用，其变得有可能将这些非挥发性的、大的、和热不稳定的分子转移到气相中并离子化而不离解它们。
在基质辅助激光解吸离子化中，样品分子与所谓的基质（UV吸收芳族化合物，其大大过量地加入所述样品）共结晶。脉冲UV激光为材料例如待被分析的蛋白质的离子化和解吸提供能量。所述基质吸收光子能量并将其转移到所述样品。在大多数情况下，将MALDI离子化与飞行时间（TOF）分析器结合。通过将离子加速到无场飞行管中并测量它们的飞行时间实现它们的分离。所述离子的飞行时间与它们的m/z值成比例。利用MALDI-TOF-MS，能够离子化并分析具有超过105 Da的质量的分子而无明显的碎裂。
在实施MALDI-MS之前，为了除去盐和洗涤剂并降低样品的复杂性，必须将复杂样品如细胞溶胞产物(lysates)和临床样品如血清初步分离(prefractionated)。一般的初步分离方法包括液相色谱、电泳和等电聚焦。在20世纪90年代早期，通过引入与表面增强亲和捕获（SEAC）、以后的表面增强激光解吸离子化（SELDI）中的色谱样品初步分离的结合，和通过在称为表面增强净解吸 (SEND)的方法中基质对样品支架板的共价结合进一步改良了MALDI。
在SELDI中，在结合样品分子的子群的色谱表面上将样品初步分离。每个样品在靶表面（芯片）的一个点上进行分离。所述色谱靶容纳在特定支架（所谓的微量滴定板形式的生物处理器，其使得能够在同一时间快速处理大量的样品）中。通过用缓冲液洗涤除去未结合的分子。与MALDI相似，在MS测试前作为最后的步骤将UV吸收化合物（“基质”）添加到所述点。从色谱表面直接实施所述样品的离子化。如同在MALDI-MS中，基质的添加是样品制备过程中最敏感的步骤之一。基质溶液非常易挥发并且通常以非常小的体积（0.5-2μL）添加。所述基质溶液溶解所述生物样品分子并且所述基质材料与这些生物分子共结晶。移液和共结晶都取决于周围空气的温度和湿度。因此，MALDI和SELDI方法中的大部分变动都与基质添加步骤有关。而且，采用MALDI或SELDI的低分子量生物聚合物的分析被这样一个事实所阻碍：基质本身也被离子化和解吸。这在低质量（约低于1000-1500 Da）提供了强背景信号，使得非常难以（如果不是不可能）在该低质量范围中检测样品物类。
从血清能够获得示出例如癌症的早期阶段或宿主对感染的反应的诊断质谱蛋白质组图样(proteomic patterns)。光谱图样作为诊断鉴别物(discriminator)的方法代表了新的诊断模式。所述图样本身是鉴别物，不依赖于蛋白质或肽的识别。但是，MALDI-和SELDI-MS都几乎不能用于该领域中的常规试验，主要是因为主要源于例如色谱靶和所述敏感的基质添加步骤的有限的重现性（大的变动系数）。
发明内容
可能存在对不受强的背景信号限制的激光解吸离子化质谱方法的需求。可能存在对使得添加基质化合物变得多余的方法的进一步的需求。
本发明的第一方面提供了激光解吸离子化质谱方法，包括以下步骤：
（a）将含有样品分子的样品探针沉积在样品支架(holder)的表面，所述表面包含含有UV吸收芳族单体单元的聚合物；
（b）用UV激光束照射所述样品探针和/或所述表面，从而实现所述样品分子的离子化和/或解吸；和
（c）测定离子化的样品分子的质量。
本发明的一个基本思想是通过聚合材料的表面消除对基质材料的需要，如迄今为止例如在MALDI或SELDI技术中常规使用的那样。本发明人发现这能够通过本发明的方法和特别是通过使用具有UV吸收芳族单元的聚合物实现。
在本发明的第一方面的一个实施方案中，所述吸收性芳族单体单元可以选自苯胺或苯胺衍生物，或丙烯酸苯酯或丙烯酸苯酯衍生物。
在本发明的另一实施方案中，所述苯胺衍生物可以包含根据式I的化合物
（I）
其中
R1独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
x为1到4。
在又一实施方案中，所述丙烯酸苯酯衍生物可以包含式II的化合物
（II）
其中
R2独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代的或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
y为1到5。
在本发明的第一方面的一个进一步的实施方案中，所述UV吸收芳族单体单元选自苯胺、3-氨基苯甲酸和丙烯酸对硝基苯酯。
在本发明的第一方面的再一实施方案中，所述聚合物是均聚物或共聚物。
在本发明的第一方面的另一实施方案中，所述聚合物是苯胺、3-氨基苯甲酸或丙烯酸对硝基苯酯的均聚物，或苯胺和3-氨基苯甲酸的共聚物。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，所述表面包含在基底支架的基底上的聚合物的涂层，或固定在基底支架上的本体聚合物。
在本发明的第一方面的一个实施方案中，所述基底可以选自玻璃、硅、塑料、树脂、金属、金属合金、箔和纸。
在本发明的第一方面的一个进一步的实施方案中，将所述样品探针作为含有所述样品分子和溶剂的溶液或由所述样品分子和溶剂组成的溶液沉积在所述表面上。
在本发明的第一方面的再一实施方案中，当将所述样品分子与溶剂结合沉积在所述表面上时，在步骤（b）之前蒸发所述溶剂。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，步骤（b）中的样品探针不含所述含有UV吸收芳族单体单元的聚合物以外的UV吸收材料，特别是不含额外的UV吸收基质材料。
在本发明的第一方面的另一实施方案中，所述质量检测通过飞行时间质谱实现。
本发明的第二方面涉及含有UV吸收芳族单体单元的聚合物在激光解吸离子化质谱方法中作为UV吸收材料的用途。
所述第一方面的所有实施方案加以必要的变更都能够应用于本发明的第二方面。换句话说，涉及方法的所有实施方案都能够转用至聚合物的用途，如同特别是所有涉及所述聚合物本身的实施方案。
附图说明
图1示出了在PANI-PABA表面上的血管紧张肽II肽（Angiotensin II peptide）（M = 1045.5 Da）的质谱；
图2示出了在PANI-PABA表面上的舒缓激肽片段1-7肽（Bradykinin fragment 1-7 peptide）（M = 756.4 Da）的质谱；
图3示出了在PANI-PABA表面上的牛胰岛素蛋白（M = 5735 Da）的质谱；
图4示出了在无基质添加的PANI-PABA表面上的舒缓激肽片段1-7肽（M = 756.4 Da）的质谱；
图5示出了在使用CHCA基质的PANI-PABA表面上的舒缓激肽片段1-7肽（M = 756.4 Da）的质谱；
图6示出了在使用SPA基质的PANI-PABA表面上的舒缓激肽片段1-7肽（M = 756.4 Da）的质谱；和
图7示出了在无基质添加的未涂覆Si条上的舒缓激肽片段1-7肽（M = 756.4 Da）的质谱（参考实施例）。
具体实施方式
在下文中，描述了示例性的实施方案。应该理解，这些实施方案是示例性的实施方案，并且能够以任何可能的方式结合不同实施方案的特征。
本发明的第一方面提供了激光解吸离子化质谱方法，包括以下步骤：
（a）将含有样品分子的样品探针沉积在样品支架的表面上，所述表面包含含有UV吸收芳族单体单元的聚合物；
（b）用UV激光束照射所述样品探针和/或所述表面，从而实现所述样品分子的离子化和/或解吸；和
（c）测定离子化的样品分子的质量。
如前面早已提及的那样，本发明的一个基本思想是通过聚合材料表面的使用来消除对MALDI或SELDI技术中使用的基质材料的需要。所述聚合材料通过聚合含有至少一种UV吸收芳族单体单元的单体单元获得。UV吸收芳族单体单元的使用使得能够用UV激光解吸和离子化沉积在所述表面上的样品分子。
在常规的MALDI或SELDI方法中，基质化合物或基质材料以大过量与样品分子共结晶。当UV激光束，如脉冲UV激光束，被导向含有所述样品分子和所述基质材料的样品探针时，所述基质分子从所述激光束吸收UV光并从而实现所述样品分子的解吸和离子化。
通过含有UV吸收单体单元的聚合材料的使用，能够克服对额外的基质材料的需要。将所述样品分子直接沉积在所述聚合材料（也称为聚合物材料）上。当激光束被导向所述聚合材料时，UV光被所述聚合材料吸收并且能量被转移到所述样品分子。因此，所述样品分子被解吸和离子化以进一步通过质谱法进行研究。作为UV吸收材料的基质材料的添加不是必须的，并且因此可以省略。
不必须添加基质材料（例如为了实现共结晶）的事实，可以简化样品制备过程并且可以额外地降低后续质谱中的背景信号。如将在本发明的示例性实施方案中描述的那样，含有UV吸收单体单元的聚合材料可以用于实现这些目标。本发明的方法可以用于减少已知来自MALDI-或SELDI-MS中基质化合物的使用的背景信号。这可以为到目前为止还不可想象的质量范围（如低于2000 kDa，或甚至低于1500 kDa，或甚至低于1000 kDa的分子质量）中的较大分子例如生物分子的质谱法打开窗口。本发明的样品分子可以是具有低于2000 kDa，或低于1500 kDa，或低于1000 kDa，或低于750 kDa的质量的生物分子。
本发明的第一方面的方法可以应用于待被通过质谱研究的任何样品种类。因此，可以将任何种类的化学或生物化合物沉积在样品支架的聚合物的表面上。在本发明的第一方面的一个示例性实施方案中，所述样品分子可以选自生物分子，如肽、蛋白质、糖蛋白和核酸，或生物有机或合成有机分子。
在本发明的第一方面的一个示例性实施方案中，可以将所述方法的步骤（a）细分为两个步骤，即
（a1）将含有UV吸收芳族单元的聚合物施加到样品支架的表面上；和
（a2）将含有样品分子的样品探针沉积到所述表面上。
在本发明的第一方面的一个示例性实施方案中，所述吸收性芳族单体单元可以选自苯胺或苯胺衍生物、或丙烯酸苯酯或丙烯酸苯酯衍生物。
在本发明的上下文中，如果没有特别地相反说明，那么只要提及“苯胺”或“丙烯酸苯酯”，则分别还包含苯胺和丙烯酸苯酯的衍生物。因此，苯胺等同于苯胺和苯胺衍生物，丙烯酸苯酯等同于丙烯酸苯酯和丙烯酸苯酯衍生物。
在一个示例性的实施方案中，可以将苯胺或苯胺衍生物的聚合物用作色谱表面。这种聚苯胺或聚苯胺衍生物表面能够用于通过在所述表面上的色谱法将感兴趣的样品分子从样品中的其它分子分离。因此能够简化所述分子的分离和样品制备。而且，可以洗涤或冲洗本发明的聚合物而无UV吸收活性的损失。不同于SEND表面，其中UV吸收基质分子被吸附到表面，本发明的UV吸收单元是聚合物的一部分并且因此即使当洗涤所述表面时仍保留在所述聚合物之内。当聚合物被用作色谱表面时，此类洗涤步骤是通常的手段，如在SELDI中。本发明的聚合物能够用作色谱表面，但是与SELDI表面相比不需要施加基质材料，并且没有损失吸附的基质分子的缺点（如在常规SEND表面中那样）。
在另一示例性实施方案中，丙烯酸苯酯或丙烯酸苯酯衍生物的聚合物可以用于结合生物配体（bioligands），如蛋白质、酶和肽。因此所述聚合物能够用作固定此类生物配体的亲和性表面。
除非上下文清楚地另外说明，否则如本说明书和附属权利要求中所使用的那样，“a”和“an”的单数形式也包括各自的复数形式。
苯胺和丙烯酸苯酯都是UV吸收分子。而且，两种分子都可以用作聚合的单体单元，或单体。这些化合物的聚合导致可以吸收UV光的聚合物。
常规MALDI或SELDI试验中离子形成的机理细节仍然是争论的话题。不受这种理论所限，本发明人假定在常规的MALDI或SELDI中，由于所述基质的电子结构（在常规基质中常常包含π-体系）基质吸收光，无辐射地将能量转移到生物分子并从基质和生物分子的共结晶的混合物中将其解吸。因此，基质和生物分子的共结晶是一个敏感的耗时的和潜在地不能再现的步骤。外部因素可能影响所述共结晶的结果，如房间中的湿度水平。因此，应该避免共结晶。可以使用本发明的聚合物而无需基质和生物分子的共结晶（co-crystallization）。
在本发明的另一示例性实施方案中，所述苯胺衍生物可以包含根据式I的化合物
（I）
其中
R1独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代的或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
x为1到4。
可以取代苯胺的苯基环以形成苯胺衍生物。所述取代可以是所述苯基环的单取代（x=1），或二取代、三取代或四取代。这些取代可以替代相对于苯基环的胺取代在邻或间位的氢原子。相对于所述胺取代对位总是未取代的。
苯胺的苯基环的取代模式可以包括任何可能的取代模式，例如在邻或间位的单取代、或在邻位的双取代、在间位的双取代、或任何其它取代模式。
当将苯胺或苯胺衍生物用作聚合期间的单体时，所述单元可以在相对于芳环的氨基基团的对位彼此结合。苯胺及其衍生物的聚合可以进一步被聚合介质的pH影响。通过改变所述聚合介质的pH，能够调节表面性质例如表面吸附性质。
用于聚合的反应混合物的酸度对苯胺的氧化可具有强烈的影响。例如，可以在强酸性介质（例如pH<2.5）中制备在本发明中有用的聚合物。通过在反应混合物中生长的导电聚合聚集体(conducting polymeric aggregates)可以促进氧化剂和单体之间的氧化还原过程。这些条件在本发明的涂层的形成中是优选的。在高于2.5的pH，聚合可能变得更困难，并且可能导致较短的链。而且，偶联的类型可能受到影响，如可能导致苯胺或苯胺衍生物邻位和对位偶联的混合物。
pH还可影响苯胺或苯胺衍生物的最终聚合物。所述聚合物可以可逆地转化。这种效果是从PANI得知的，其可以可逆地从蓝色的质子化的聚对苯亚胺(Pernigraniline)（通常对生物分子如蛋白质显示出低吸附能力）经由绿色的质子化的翠绿亚胺(Emeraldine)转化成稳定的蓝色的翠绿亚胺碱(Emeraldine base)（通常显示出高吸附能力），并且然后转化成紫色的聚对苯亚胺碱(Pernigraniline base)。
如上所述，由于苯胺衍生物易得、显示出高衍生度并且可容易地加工，因此可以为任何期望的应用设计本发明的苯胺聚合物。所述聚合物可以作为聚合物使用，例如作为溶液，或单体能够聚合到表面上。
在又一示例性实施方案中，所述丙烯酸苯酯衍生物可以包含式II的化合物
（II）
其中
R2独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代的或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
y为1到5。
可以取代丙烯酸苯酯的苯基环以形成丙烯酸苯酯衍生物。所述取代可以是苯基环的单取代（x = 1），或二取代、三取代、四取代或五取代。这些取代可以替代相对于苯基环的丙烯酸酯取代在邻、间或对位的氢原子。
丙烯酸苯酯的苯基环的取代模式可以包括任何可能的取代模式，例如在邻或间或对位的单取代，或者邻位的二取代、间位的二取代、在邻位和在对位的取代，或任何其它取代模式。
如果苯胺或丙烯酸苯酯的苯基环的取代是多取代的，所述取代基R1或R2各自可以相同或不同，即所述取代基R1或R2独立地选择。
所述取代基R1和R2选自羟基基团（-OH）、羧基基团（-COOH）、卤素、硝基基团（-NO2）、氨基基团（-NH2），或取代的或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基。
“卤素”或“卤元素”是指-F（氟）、-Cl（氯）、-Br（溴）或-I（碘）。
所述烷基取代可以选自（C1-C6）烷基、（C1-C4）烷基或（C1-C2）烷基。类似地，烷氧基取代可以选自（C1-C6）烷氧基、（C1-C4）烷氧基或（C1-C2）烷氧基。所述“烷氧基”取代相当于其中烷基通过桥氧基团键接的烷基取代，即式-O-烷基的基团。所有涉及“烷基”的定义因此都可以转用至其中烷氧基是桥氧取代的烷基的“烷氧基”。
“-(C1-C6)烷基”是指具有1到6个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直链-(C1-C6)烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和-正己基。代表性的支链-(C1-C6)烷基包括-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、-新戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丁基。
“-(C1-C4)烷基”是指具有1到4个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直链-(C1-C4)烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基和-正丁基。代表性的支链-(C1-C4)烷基包括-异丙基、-仲丁基、-异丁基和-叔丁基。
“-(C1-C2)烷基”是指具有1或2个碳原子的直链非环状烃。代表性的直链-(C1-C2)烷基包括-甲基和-乙基。
通过苯胺或丙烯酸苯酯上不同取代基的使用，可以将这些化合物官能化。所述单体单元的官能化导致所述聚合物的官能化，即官能化的聚合物。此类官能化的聚合物可以用于色谱分离方法中，用于蛋白质、酶或肽的固定，或用于亲和色谱中。获得的探针可以通过本发明的方法分析。
在本发明的第一方面的另一示例性实施方案中，所述UV吸收芳族单体单元选自苯胺（ANI）、3-氨基苯甲酸（3-ABA）和丙烯酸对硝基苯酯（NA）。
在本发明的第一方面的又一示例性实施方案中，所述聚合物是均聚物或共聚物。
本发明的聚合物可以是上述任何单体单元的均聚物。换句话说，用于制备所述聚合物的单体单元是单一单体单元。
如果使用多于一种的单体单元制备所述聚合物，则制备了共聚物。此类共聚物可以具有不同的单体单元，即两种或更多种不同的单体单元。使用多于一种的单体单元，可以进一步官能化所述聚合物。本领域技术人员可以使用惯常的试验以确定特定应用所需要的官能化。
在另一示例性实施方案中，所述聚合物是苯胺、3-氨基苯甲酸、或丙烯酸对硝基苯酯的均聚物，或苯胺和3-氨基苯甲酸的共聚物。
共聚物中单体的比例可以是任何可聚合的比例。本领域技术人员再次将根据官能化的需要、获得的用于涂层的聚合物的溶解性或所述聚合物的稳定性选择所述单体的比例。
在一个示例性的实施方案中，两种单体的混合物的比例的范围为选自以下的范围：100:1到1:100、30:1到1:30、10:1到1:10、5:1到1:5、4:1到1:4和3:1到1:3。在一个示例性的实施方案中，所述两种单体之一是3-氨基苯甲酸。3-氨基苯甲酸的使用，特别是以较高的比例使用，可以增加获得的聚合物的水溶性。水溶性可随着反应混合物中3-氨基苯甲酸的较高含量而增加。
在本发明的第一方面的另一示例性实施方案中，所述表面包括在基底支架的基底上的聚合物的涂层，或固定在基底支架上的本体聚合物(bulk polymer)。所述表面还可以由在基底支架的基底上的聚合物涂层组成。
本发明中使用的聚合物是其上沉积样品探针的表面。所述表面可以是本体聚合物的表面，即所述基底支架可以由本体聚合物形成或可以含有本体聚合物。在另一示例性的实施方案中，所述表面是在基底上的聚合物涂层的表面。所述聚合物涂层可以施加到任何基底。
在另一示例性的实施方案中，所述基底可以选自各种材料，包括但不限于硅，例如硅片，二氧化硅，氮化硅，玻璃和熔凝硅石，石英，钠钙玻璃，硼硅酸盐玻璃，丙烯酸玻璃（acrylic glass），糖玻璃（sugar glass），isinglass或氧氮化铝（aluminium oxynitride），纸，陶瓷，聚酰亚胺，塑料，树脂和聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸类，聚乙烯，聚丙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚碳酸酯，聚苯乙烯和其它苯乙烯共聚物，聚四氟乙烯，金属和金属合金，如铝、钢、金、银、铜、钨、钼、钽、黄铜，等等。由于它们的UV透过性能，高质量的玻璃例如高熔点硼硅酸盐或熔凝硅石可能是优选的。所述基底还可以是任何柔韧材料，如纸、橡胶或箔。
在本发明的又一示例性实施方案中，可以通过任何已知的方法涂覆所述基底，也取决于所述聚合物的溶解性。可以获得可溶和不可溶的聚合物。因此，可以使用不同的技术来获得聚合物涂层，例如沉积、共聚合、聚合物溶液的浇注或聚合物在基底表面上的化学吸附。
在将聚合物涂覆到所述基底之前可以预处理所述基底。所述基底的预处理可以包括所述基底的杀菌或基底表面的改性，如所述基底的氧化，例如在硅基底上。通过加热所述基底并随后在氧化性气氛下（例如在空气或氧中）氧化所述基底可以将硅基底转化成氧化的硅基底。此外，可以用其它预涂覆材料涂覆或处理所述基底。此类预涂覆可以使得所述聚合物涂层能够更容易地施加。
在本发明的一个示例性实施方案中，所述基底可以是Si表面。可以silaminate此类Si表面以增加亲水涂层的保持，如含有PNA或3-ABA的涂层。用于silamination的一般过程可以包括Si条在沸水中的培养（incubation），接着是使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷的5%水溶液的处理。然后可以洗涤和/或干燥预涂层。在一个优选的实施方案中，所述基底是氧化的硅或SiO2。氧化的硅的表面可以通过在升高的温度例如高于500℃，在氧化性气氛如氧或空气中加热硅表面由所述硅表面制备。通过将聚合物溶液浇注在所述表面上可以用本发明的聚合物容易地涂覆氧化的硅的表面。特别地，苯胺或苯胺衍生物的聚合物能够容易地施加到氧化的硅表面并且将保持在这种表面上，而无需除氧化以外的任何特殊的表面预处理。
涂层的厚度可以选自小于1000nm、小于500nm、小于250nm或小于100nm。所述涂层还可以薄至几个单分子层（monolayers），如1到10个聚合物单分子层，或2到5个聚合物单分子层。所述聚合物的单分子层的涂层可以薄至小于100nm，或小于75nm或甚至小于50nm。通过任何上述给出的方法施加的聚合物薄涂层显示极小的或没有张力或应变，和减少的涂层分层。
可以在单一步骤中或在重复的涂覆步骤中施加涂层。因此，所述基底的涂覆可以包括涂覆所述基底并干燥所述基底上的涂层的重复步骤。
含有苯胺的表面可以结合肽和蛋白质，但可能不能结合核酸。这一特点可以用于核酸混合物和例如细胞溶胞产物的纯化。此外，聚苯胺可以是pH敏感材料。该性能可以用于根据肽和蛋白质的等电点（PI）值确定提供它们的选择性吸附的条件。此外，所述聚（苯胺）或聚（苯胺衍生物）可以是质子化的（掺杂的）形式，或是未质子化的形式。所述聚（苯胺）或聚（苯胺衍生物）的质子化可以改变聚合物表面结合生物分子的能力。
在本发明的第一方面的一个进一步的示例性实施方案中，将所述样品探针作为含有所述样品分子和溶剂的溶液沉积在所述表面上。因此，所述样品探针可以包含所述样品分子、溶剂和进一步的化合物。用于沉积样品探针的溶剂可以由本领域技术人员通过常规试验进行选择，例如根据所述样品探针在所述溶剂中的溶解性。
在本发明的第一方面的一个示例性实施方案中，将所述样品探针作为由所述样品分子和溶剂组成的溶液沉积在所述表面上。因此，所述样品探针可以仅由所述样品分子和所述溶剂组成，并且在所述溶剂的任选的蒸发或除去之后，所述样品探针可以仅由所述样品分子组成。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，当所述样品分子结合溶剂沉积在所述表面上时，在步骤（b）之前蒸发所述溶剂。所述蒸发可以通过已知的方法实现，如升高的温度和/或减压。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，步骤（b）中的样品探针不含除了包含UV吸收芳族单体单元的所述聚合物以外的UV吸收材料，特别是不含额外的UV吸收基质材料。
在包含UV吸收芳族单体单元的聚合物的表面上的样品分子能够使用UV激光束解吸和离子化。UV辐射可以被所述聚合物吸收并且吸收的能量被转移到所述样品分子。在激光照射步骤期间，可能加热所述表面。但是，本发明的聚合物甚至在这种条件下也显示出良好的热和氧化稳定性。因此，本发明的聚合物可以充当样品分子解吸和离子化过程中UV激光束的靶。
在本发明的第一方面的另一实施方案中，所述质量检测通过飞行时间质谱法实现。但是，也可以采用其它的质谱方法，如扇形场分析器（sector field analyser）、四极质量分析器（quadrupole mass analyser）、四极离子阱（quadrupole ion trap）、线性四极离子阱、通过傅立叶变换离子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance）或任何其它质量分析器。
本发明的第二方面涉及含有UV吸收芳族单体单元的聚合物在激光解吸离子化质谱方法中作为UV吸收材料的用途。以上所有对于本发明的第一方面详细描述的示例性实施方案加以必要的变更也可以用于本发明的第二方面。
如上所述并且如将从以下实施例变得显而易见的那样，本发明的聚合物的使用具有优于使用额外的基质材料的现有技术的优点。所述聚合物能够以低成本制备，并且对于使用UV激光的用途是稳定的。进一步地，在使用本发明的聚合物作为UV激光的靶的质谱试验中可以获得可重现的结果。
实施例
在下文中，通过实施例的方式对本发明进行说明。但是这些实施例不应以任何方式理解为对本发明的限制。
实施例1
ANI-3-ABA共聚物（Poly-ANI-co-3-ABA）的制备
通过苯胺（ANI）与3-氨基苯甲酸（3-ABA）在1M HCl中在搅拌下在55℃氧化共聚合20分钟获得了ANI-3-ABA共聚物（过硫酸铵作为氧化剂，摩尔比共聚单体:酸:氧化剂=1:8:1）。随后，将混合物加入5倍体积的冰水中。过滤获得的产物，用1M HCl和水洗涤至pH 7并在真空中干燥。将聚合物从96% H2SO4沉淀，用水洗涤至pH7并在真空下干燥。测定产物产率约为40-60%。制备了苯胺/3-ABA比值为3:1、1:1和1:3的含苯胺的聚合物改性剂。使用元素分析测定了组成。
实施例2
硅条的制备
将70 mm × 8 mm × 0.5 mm的氧化的和未氧化的硅条（Si条）用作待被以其表面改性的、聚合物涂覆的形式使用的基底。通过将Si条加热到1000℃并随后在空气或氧中处理4h制备了氧化的Si条。
实施例3
Si条的改性
用从实施例1获得的共聚物涂覆氧化的和未氧化的Si条。将实施例1的共聚物分别悬浮或溶解在四氢呋喃（THF）中。对于具有1:1的苯胺/3-ABA比值的共聚物获得了溶液，对于具有3:1的苯胺/3-ABA比值的共聚物获得了悬浮液（25 mg/ml）。在THF中制备了具有3:1的苯胺/3-ABA比值的共聚物的5%溶液。所有涂层都通过浇注制备，如果需要为数层。在热空气中干燥改性的片。
在将过硫酸铵的水溶液与单体溶液在HCl水溶液中以摩尔比苯胺:酸:氧化剂=1:3:1混合0.5h后，通过苯胺在Si条上在室温的沉淀性氧化聚合实施了使用苯胺均聚物（PANI）的Si条的改性。用水、甲醇洗涤改性的Si条并在热空气中干燥。
通过浇注在THF中的5%共聚物溶液（两层）接着在热空气中干燥制备了用3-氨基苯甲酸的均聚物（PABA）改性的Si条。
基底表面通过silamination改性。使用了不同的silamination模式以提供化学吸附的PNA的均匀涂层的形成。
在一般的silamination过程中，将未氧化的Si条在沸水中培养16小时，然后放入3-氨基丙基三乙氧基硅烷的5%水溶液中30 min，接着用水洗涤至中性pH滤液并在热空气流中干燥。
实施例4
聚合物和涂层的分析
使用元素分析和IR吸收光谱测定了获得的实施例1的共聚物的组成。
元素分析（基于C、N和H含量的测定和基于O含量的计算）显示单体单元被插入大分子中（见表1）。
表1：使用元素分析在获得的均聚物和苯胺与3-ABA的共聚物中的测定元素含量与理论元素含量的对比。
表1的数据表明所述共聚合导致3-ABA单元插入大分子中。因此，所述共聚物富含3-ABA单元。这也被溶解性测试证实。共聚物在THF中可溶并且苯胺与3-ABA的共聚物在pH ≥ 9.0的含水介质中可溶，而苯胺均聚物以及摩尔比为3:1的共聚物PANI-3-ABA在水和有机溶剂中不溶。
获得并分析了所述PANI以及苯胺与3-ABA的共聚物（以摩尔比3:1和1:1）和聚3-ABA均聚物的IR光谱。将聚合物悬浮（PANI和PANI-3-ABA，3:1）或溶解（PABA和PANI-3-ABA，1:1）在THF中并通过溶剂蒸发沉积在KBr片上。对应于3-ABA含量（通过元素分析测定）的增加，在ν 
1700 cm-1处的最大吸收（羧基基团）增加。
在不同的溶液中测定了基于苯胺与3-ABA的共聚物的涂层的稳定性。结果显示在水介质中在pH范围2-9培养大于1h涂层是稳定的。
实施例5
蛋白质和肽的结合
使用光谱相位干涉（Spectral Phase Interference）研究了含苯胺的涂层结合各种蛋白质的能力。
使用用PANI涂层改性的薄载玻片（90-120μm）使得能够研究蛋白质和肽到聚合物表面的pH依赖性结合的动力学和有效性。结果显示，取决于pH能够实现不同的蛋白质在聚苯胺改性的玻璃表面上的可逆吸附。
细胞色素C在pH 7.2显示出对所述表面的可逆吸附并在pH 2解吸。
结果还显示，细胞色素C（M 12 000）、酪蛋白（M 20 000）、肌红蛋白（Myoglobine）（M 17 800）、IgG（M 125 000）和聚-L-赖氨酸（M 150 000）能够在pH 7.2结合到经涂覆的Si条的表面。小牛胸腺DNA和聚尿苷酸钾盐（Poly-uridine acid Potassium Salt）（Sw 3.4-6.0）在相同的条件不结合到所述表面。
因此，具有含苯胺的聚合物膜的Si条适合于保持特定的生物实体（entities）。
实施例6
具有不同pI值的蛋白质的结合
使用10μl相应的蛋白质溶液研究了用含苯胺的涂层改性的Si条保持具有不同pI值的模型蛋白（即pI为4.8的牛血清白蛋白（BSA）、pI为10.5的溶菌酶和pI为2.8的胃液素（pepsine））的能力。使用了三种类型的改性的硅条。
a）通过沉淀聚合用PANI改性的Si条。
b）通过从THF溶液物理吸附和随后在室温干燥用PABA改性的Si条。
c）通过化学吸附用PABA改性的Si条。
a）和b）的Si条根据实施例3制备。
如下实施PABA在Si条表面上的化学吸附：
将两个初步silaminated的Si条在0±1℃在搅拌下浸入10 ml含有二环己基碳二亚胺（123 mg）的PABA在N,N-二甲基甲酰胺（DMFA）中的溶液（20 mg/ml）中30分钟。然后将2 ml N-琥珀酰亚胺（83 mg）在DMFA中的溶液加入所述聚合物溶液并在室温培养所述体系4 h。用DMFA、甲醇和水洗涤聚合物涂覆的基底，然后在空气中干燥。
通过在蛋白质溶液中培养，用10 μl不同pH的溶液（pH为9的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）HCl缓冲溶液、pH为6的HCl水溶液和pH为3的HCl水溶液）洗涤改性的基底，和随后在λ= 280 nm处进行光学UV吸收测试表征了蛋白质保持（表4-6）。
表2：在不同pH值BSA在不同聚合物上的保持
表3：在不同pH值溶菌酶在不同聚合物上的保持
表4：在不同pH值胃液素在不同聚合物上的保持。
该实施例显示，用3-ABA单元取代聚合物中的苯胺单元导致所述涂层吸附性能的改变。基于化学吸附的PABA的涂层（表4）不像物理吸附的PABA那样好得保持蛋白质，可能是由于Si条表面上存在残留的氨基基团。
实施例7
通过沉淀聚合的共聚物的涂层
在将过硫酸铵的水溶液与共聚单体溶液在1M HCl水溶液中混合（摩尔比单体:酸:氧化剂=1:10:1）1.5h 之后，通过在Si条的存在下在低温（12-15℃）的氧化沉淀共聚形成了苯胺与3-ABA的共聚物的涂层。用1M HCl、水洗涤改性的Si条，并在热空气中干燥。
为了可视化在改性的PANI-ABA Si条上的蛋白质保持，用发光（在546和581发射）半导体（CdSe）ZnS纳米晶体标记了具有不同pI的模型蛋白质。将蛋白质溶液滴放置在所述改性的表面上（10 μl溶液，0.5 mg蛋白质/ml）并在环境温度培养5 min。除去多余的并光学可视化吸附。结果在表5中给出。它们与表2和3中给出的数据具有良好的相关性。
| 细胞色素 C | 肌红蛋白 | |
| 洗涤前 | + | + |
| pH 3 | + | +/- |
| pH 6 | + | + |
| pH 9 | + | - |
表5:细胞色素C和肌红蛋白在通过沉淀聚合涂覆的Si条上的保持。（+）表示良好的UV激发观察，（+/-）表示一些UV激发观察，和（-）表示无UV激发观察。
实施例6和7的结果显示，PANI-ABA表面可以用于根据它们的pI值分离蛋白质。酸和碱蛋白质/肽的分离可以直接在所述Si条表面上使用tris·HCl缓冲液或其它适合的溶液实施。
实施例8
肽的质谱分析
为了测试固有的基质活性，在PS 4000 Enterprise Edition SELDI-MS系统（Bio-Rad）上分析了用三层苯胺:3-ABA摩尔比为3:1的PANI-PABA涂覆的Si条。使用肽标准物（ProteoMass MALDI-MS标准物，来自Sigma-Aldrich）分析了阵列（arrays）。在MS试验之前，用4μL水洗涤聚合物表面三次并空气干燥。然后，向所述表面添加4μL肽溶液（100 pmol/μL，溶解在水中）并干燥。通过无任何基质添加的SELDI-MS分析了所述点。
图5示出了在涂覆了聚苯胺（具有3:1的苯胺:3-ABA摩尔比的PANI-PABA）的Si条上各种肽标准物的MS谱图。结果说明所述聚合物涂层确实呈现固有的MALDI基质活性。所述阵列随着强质子化分子离子（[M+H]+）的形成显示出良好的基质活性。在所述谱图中没有观察到背景峰。
实施例9
使用和未使用基质材料的MS谱图的对比
为了比较常规样品制备技术用于低质量区域中化合物分析的效率，使用和不使用基质添加分析了PANI-PABA涂覆的Si条。在试验中，使用了两种最常见的基质类型：α-氰基-肉桂酸（CHCA）和芥子酸（sinapinic acid，SPA）（Bio-Rad）。两种化合物都作为在含有0.5%三氟乙酸的乙腈:水（1:1，V/V）混合物中的饱和溶液使用。使用舒缓激肽1-7片段肽标准物(ProteoMass MALDI-MS标准物，来自Sigma-Aldrich)分析了阵列。在MS试验之前，用4μL水洗涤所述聚合物表面三次并空气干燥。随后，向所述表面添加4μL肽溶液（100 pmol/μL，溶解在水中）并干燥。向所述表面添加1μL基质溶液并干燥。重复所述基质添加步骤。在相同的试验条件（激光能量: 1800, 焦点质量: 760 Da, Matrix deflection: 0 Da）下获得了谱图。
结果显示，不添加额外的基质，从所述PANI-PABA涂覆的阵列就观察不到背景峰（见图4）。但是，所述标准基质的添加引起低质量范围内高强度背景离子的出现，这妨碍了低分子量化合物的分析（见图5和6）。
对比实施例10
使用无PANI-PABA涂层的基质添加
为了验证固有的基质活性源自所述聚合物表面，同样用未涂覆的Si条实施了试验。在这些试验中，使用舒缓激肽1-7片段肽标准物 (ProteoMass MALDI-MS标准物，来自Sigma-Aldrich)分析了未改性的Si条。在MS试验之前，用4μL水洗涤所述表面三次并空气干燥。随后，向所述表面添加4μL肽溶液（100 pmol/μL，溶解在水中）并干燥。不向所述表面添加基质。
结果显示，也能从未改性的硅表面检测到所述肽，但是相对于使用聚合物涂层的阵列，强度非常低。此外，激光照射引起被分析物的强烈破碎。在谱图中低分子量碎片离子是优势的，并且由于强烈的峰变宽，导致所述被分析物的分子质量测定是不可能的（见图7）。
实施例11
聚（丙烯酸对硝基苯酯）（PNA）的合成
在氮气流下将对应于单体的3%（w/w）的N,N-偶氮二异丁腈（AIBN）加入丙烯酸对硝基苯酯在干燥的苯中的1M溶液中，并在70℃保持50 h。倾析所述苯溶液，并将烧瓶壁上的粘稠棕色残余物溶解在DMFA中以获得1-2%溶液。用五体积的甲醇重新沉淀所述聚合物。重复沉淀并用甲醇洗涤干净的白色残余物并干燥。根据TLC（EtOH-Et2O，体积比 2:1 ）所述聚合物不含残余的单体、短低聚物或AIBN。
实施例12
Si条上的PNA涂层
将Si条在沸水中培养20 h并在120℃干燥。然后，按以下将所述Si条氨基甲硅烷基化
（1）在大气压力在室温5%（w/w）γ-氨基丙基三乙氧基硅烷在50%甲醇中的溶液0.5 h（在温和混合下）。改性的Si条在120℃干燥1h；或
（2）在大气压力在室温5%（w/w）γ-氨基丙基三乙氧基硅烷在水中的溶液0.5 h（在温和混合下）。改性的Si条在120℃干燥1h；或
（3）5%（w/w）γ-氨基丙基三乙氧基硅烷在沸腾甲苯中的溶液36 h。随后，用甲苯、二乙基醚、甲醇洗涤所述Si条并在120℃干燥1 h。
如下实施获得的PNA在氨基甲硅烷基化的Si条上的化学吸附：
氨基甲硅烷基化的Si条在1%的在DMF中的聚合物溶液中在25℃培养3h，之后在用氨水氨解之后测定表面酯基团的浓度，接着光谱测定溶液中的对硝基苯酚（ε = 11000 L/mol×cm, λ = 325 nm）。
通过经由在50℃在24 h期间在1,6-己二胺（HMDA）溶液中培养与HMDA反应，将获得的PNA涂覆的Si条转化成氨基烷基涂覆的Si条。然后，用DMF、丙酮、水洗涤所述Si条并在真空中干燥。
为了在如此改性的Si条表面上获得羧基基团，另外用碘乙酸处理了所述Si条的表面。
Claims (13)
1. 用于激光解吸离子化质谱的方法，其包含以下步骤：
（a）将包含样品分子的样品探针沉积在样品支架的表面上，该表面包含含有作为UV吸收芳族单体单元的苯胺或苯胺衍生物、或丙烯酸苯酯或丙烯酸苯酯衍生物的聚合物；
（b）用UV激光束照射所述样品探针和/或所述表面，从而实现所述样品分子的离子化和/或解吸；和
（c）测定离子化的样品分子的质量。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述苯胺衍生物包括根据式I的化合物
（I）
其中
R1独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
x为1到4。
3. 根据权利要求1的方法，其中所述丙烯酸苯酯衍生物包括式II的化合物
（II）
其中
R2独立地选自OH，COOH，卤素，NO2，NH2，取代的或未取代的、直链或支链的烷基或烷氧基；和
y为1到5。
4. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中所述UV吸收芳族单体单元选自苯胺、3-氨基苯甲酸和丙烯酸对硝基苯酯。
5. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中所述聚合物是均聚物或共聚物。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述聚合物是苯胺、3-氨基苯甲酸或丙烯酸对硝基苯酯的均聚物，或苯胺和3-氨基苯甲酸的共聚物。
7. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中所述表面是基底支架的基底上的聚合物涂层，或固定在基底支架上的本体聚合物。
8. 根据权利要求6的方法，其中所述表面是具有小于500nm的层厚度的涂层。
9. 根据权利要求7或8的方法，其中所述基底选自玻璃、硅、塑料、树脂、金属、金属合金、箔和纸。
10. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中将所述样品探针作为含有所述样品分子和溶剂的溶液沉积在所述表面上。
11. 根据权利要求10的方法，其中在步骤（b）之前蒸发所述溶剂。
12. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中步骤（b）中的所述样品探针不包含除所述含有UV吸收芳族单体单元的聚合物以外的UV吸收材料，特别是不包含额外的UV吸收基质材料。
13. 根据上述权利要求任意一项的方法，其中所述质量检测通过飞行时间质谱实现。
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