CN1865992A - 水溶性多壁碳纳米管作基质在maldi－ms中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及MALDI的基体材料，具体地说是水溶性多壁碳纳米管作为MALDI基体在MALDI－MS中的应用。本发明推动了MALDI－MS技术对小分子化合物分析的发展。本发明采用水溶性的多壁碳纳米管作为MALDI－MS的基体，成功解决了多壁碳纳米管自身作为基体的不足，发展了一种操作简便，通用性强的MALDI－MS基体，实现了MALDI－MS对小分子化合物的快速、准确地定性和定量分析。

Description

水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用

技术领域

本发明涉及MALDI的基体材料，具体地说是水溶性多壁碳纳米管作为MALDI基体在MALDI-MS中的应用。

背景技术

1988年，Tanaka和Hillenkamp各自独立地提出了通过基体吸收激光能量辅助分析物解吸离子化的技术，称之为Matrix Assisted LaserDesorption/Ionization(MALDI)。这一技术与飞行时间质谱联用，成为生物技术中强有力的工具，已成功应用于蛋白质、DNA/RNA、多糖等生物大分子的检测，并获得了2002年的诺贝尔化学奖。但是基体的引入在低分子量范围内带来大量基体峰，产生严重的背景干扰，因此限制了该方法在小分子分析中的应用。此外，基体种类的选择，浓度的大小，分析物和基体混合比例的大小等因素使样品制备比较复杂，对操作者提出了较高的要求，难以实现对小分子化合物快速、准确的分析。

2003年，邹汉法等人首次提出使用多壁碳纳米管作为MALDI的基体，有效消除有机基体带来的背景干扰，并成功应用于小肽和糖类等小分子化合物的分析。但是，由于多壁碳纳米管自身具有很强的疏水性，(几乎不溶于水和一般有机溶剂)，使得其作为MALDI基体：(1)难以准确控制基体的加入量，操作的重复性较差；(2)难以形成均匀的基体层，检测信号的重复性差，难以进行定量分析；(3)基体层疏松，且与金属靶表面作用弱，容易在离子源的真空电场中飞离靶表面，污染离子源。另外，由于多壁碳纳米管的粗产品中含有催化剂、无定型碳、石墨碎片等杂质，使得其作为MALDI基体对分析物的解吸离子化效率不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用，采用操作简便，通用性强的水溶性的多壁碳纳米管作为MALDI基体，成功解决了多壁碳纳米管自身作为基体的不足，实现了MALDI-MS对小分子化合物的快速、准确地定性和定量分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用。

具体应用过程如下，

1)称取水溶性多壁碳纳米管10mg，加入5-20mL水，超声分散(超声时间为1-3min即可分散均匀)完全溶解，制得基体溶液；

2)取基体溶液(如0.5-1μL)点于金属靶表面，自然干燥后形成均匀的基体层；

3)取样品溶液(如1μL)点于基体层上，自然干燥后进行质谱分析。

所述水溶性多壁碳纳米管可按如下方法制备获得，

1)称取150-200mg多壁碳纳米管置于烧瓶内，依次缓慢加入5-15mL浓硝酸和10-50mL浓硫酸；

2)电磁搅拌，加热到120-140℃回流20-40min；

3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

4)将烧瓶中溶液转移到盛有200-300mL水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

5)将稀释后的溶液用有机膜抽滤，并用二次水冲洗至pH接近中性；

6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有50-100mL无水乙醇的烧杯中，超声后将滤膜取出；

7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集烧杯底部的固体粉末，干燥保存。

所述有机膜可为0.45μm有机膜；超声时间为1-3min即可达到要求的分散效果。

本发明具有如下优点：

1.点样操作方便。本发明制备的多壁碳纳米管的水溶性高，水中溶解度可以达到1.0mg/mL左右(参见图1)。水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS的基体，点样操作方便，便于控制基体的加入量。

2.可重复性强。水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS的基体，形成的基体层均匀而紧密(参见图2)，能有效减少离子源的污染，同时提高分析物信号的重复性，便于定量分析。

3.应用效果好。水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS的基体，能有效消除常规有机基体产生的背景干扰，并且提高了多壁碳纳米管对分析物解吸离子化效率(参见图3)。

4.通用性强。本发明解决了多壁碳纳米管自身作为基体的不足，水溶性多壁碳纳米管是一种操作简便，通用性强的MALDI-MS基体，已成功应用于中药提取液、尿液等实际复杂体系中氨基酸、小肽、寡糖、药物等小分子化合物的快速、准确地定性和定量分析(参见图4和图5)。

附图说明

图1为水溶性多壁碳纳米管与一般多壁碳纳米管水溶性的比较图；

图2为水溶性多壁碳纳米管与一般多壁碳纳米管形成的基体层形状的比较图；

图3为水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对4种氨基酸混合物的质谱分析结果与现有技术的比较；其中图3(a)为常规有机基体CCA，图3(b)为一般多壁碳纳米管，图3(c)为水溶性多壁碳纳米管；

图4为水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对中药黄连提取液的质谱分析结果图；

图5为本发明的又一较佳实施例，水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对中药黄连提取液中组分巴马汀(palmatine)和药根碱(jatrorrhizine)的定量分析结果图。

具体实施方式

实施例1水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对中药黄连提取液的质谱分析

水溶性多壁碳纳米管的的制备：

(1)称取200mg多壁碳纳米管置于100mL的烧瓶中，依次缓慢加入10mL浓硝酸和30mL浓硫酸；

(2)电磁搅拌，加热到120℃回流30min；

(3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

(4)将烧瓶中溶液转移到盛有300mL冷水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

(5)将稀释后的溶液用0.45μm有机膜抽滤，并用二次水冲洗至pH接近中性；

(6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有50mL无水乙醇的烧杯中，超声1min后将滤膜取出；

(7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集烧杯底部的固体粉末，干燥保存。

水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用操作过程如下：

1)称取水溶性多壁碳纳米管10mg，加入10mL水，超声3min，完全溶解，制得基体溶液；

2)取1μL基体溶液点于金属靶表面，自然干燥后形成基体薄层；

3)将15g黄连切碎后浸入150mL乙醇(30％)中过夜，加热至沸腾1.5h，过滤，滤液即为黄连提取液；

4)将黄连提取液用水稀释1000倍，取1μL点于基体层上，自然干燥后送入MALDI-MS仪器进行质谱分析；

如附图4所示，黄连提取液中已知三种组分小檗碱(berberine)、药根碱(jatrorrhizine)和巴马汀(palmatine)均以[M+H]⁺形式得到很好的检测，m/z分别为337，339and 353。其余峰为黄连提取液中未知组分。指纹谱信号较强，且没有背景干扰。

实施例2水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对中药黄连提取液中组分巴马汀(palmatine)和药根碱(jatrorrhizine)的定量分析

具体过程如下：

1)多壁碳纳米管基体溶液制备同实施例1；

2)黄连提取液制备同实施例1；

3)将黄连提取液用水稀释1,000,000倍，并分别在1mL溶液中加入0ng，5ng，10ng，15ng和20ng的巴马汀和药根碱；

4)取1μL各个浓度的样品溶液点于基体层上，自然干燥后送入MALDI-MS仪器进行质谱分析；

5)以小檗碱为内标，分别计算巴马汀和药根碱对内标的相对峰面积，每一标准加入量下分别求5个样品点的平均值，而每个样品点是10个数据点的平均值；

6)以巴马汀和药根碱对内标的相对峰面积与标准加入量作图，所得线性相关系数和线性方程如图5所示，图中各个点的相对标准偏差均小于10％；

7)根据线性方程和标准加入量，求得药根碱和巴马汀在黄连提取液中浓度分别为8.65mg/mL and 10.4mg/mL。

实施例3水溶性多壁碳纳米管与一般多壁碳纳米管水溶性的比较

如图1所示，具体过程如下：

(1)分别称取10mg水溶性多壁碳纳米管和一般多壁碳纳米管，分别加入5mL水，超声3min后静置48h；

(2)一般多壁碳纳米管的水溶性如图1中左图a所示；

(3)取水溶性多壁碳纳米管溶液，离心(5000rpm，10min)除去未溶解部分；

(4)水溶性多壁碳纳米管的水溶性如图1右图b所示，测得其溶解度约为1.0mg/mL。

本实施例所述水溶性多壁碳纳米管的的制备：

1)称取150mg多壁碳纳米管置于100mL的烧瓶中，依次缓慢加入15mL浓硝酸和50mL浓硫酸；

2)电磁搅拌，加热到140℃回流40min；

3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

4)将烧瓶中溶液转移到盛有200mL冷水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

5)将稀释后的溶液用0.45μm有机膜抽滤，并用二次水冲洗至pH接近中性；

6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有100mL无水乙醇的烧杯中，超声3min后将滤膜取出；

7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集烧杯底部的固体粉末，干燥保存。

实施例4

如图2所示，水溶性多壁碳纳米管与一般多壁碳纳米管形成的基体层形状的比较

具体过程如下：

1)取1μL基体溶液(2mg/mL)点于金属靶表面，自然干燥后形成基体薄层；

2)一般多壁碳纳米管形成的基体层如图2左图a；

3)水溶性多壁碳纳米管形成的基体层如图2右图b。

本实施例所述水溶性多壁碳纳米管的的制备：

1)称取180mg多壁碳纳米管置于烧瓶内，依次缓慢加入5mL浓硝酸和15mL浓硫酸；

2)电磁搅拌，加热到130℃回流20min；

3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

4)将烧瓶中溶液转移到盛有260mL水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

5)将稀释后的溶液用0.45μm有机膜抽滤，并用二次水冲洗至pH接近中性；

6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有80mL无水乙醇的烧杯中，超声2min后将滤膜取出；

7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集烧杯底部的固体粉末，干燥保存。

实施例5

如图3所示，水溶性多壁碳纳米管作为MALDI-MS基体对4种氨基酸混合物的质谱分析结果与现有技术的比较

具体过程如下：

1)取1μL基体溶液(0.5mg/mL)点于金属靶表面，自然干燥后形成基体薄层；

2)配制四种氨基酸(Asn，Glu，His and Phe)的混合样品溶液，其浓度均为1mM；

3)取1μL样品溶液点于基体薄层上，自然干燥后送入MALDI-MS仪器在相同条件下进行质谱分析；

4)图3(a)是使用常规有机基体CCA得到的质谱图，如图所示，四种氨基酸均以[M+H]⁺(Asn，133；Glu，148；His，156 and Phe，166)形式得到检测，但是存在严重的背景干扰；

5)图3(b)是使用一般多壁碳纳米管得到的质谱图，如图所示，只有两种氨基酸His(156，[M+H]⁺；178，[M+Na]⁺；194，[M+K]⁺)和Asn(171，[M+K]⁺)的较弱信号得到检测，而Glu和Phe却未能检测；

6)图3(c)是使用水溶性多壁碳纳米管的质谱图，如图所示，四种氨基酸Asn(155，[M+Na]⁺；171，[M+K]⁺)，Glu(186，[M+K]⁺)，His(156，[M+H]⁺；178，[M+Na]⁺；194，[M+K]⁺)and Phe(188，[M+Na]⁺；204，[M+K]⁺)均以不同形式得到很好的检测，而且没有背景干扰，信号强度比一般多壁碳纳米管有很大的提高。

本实施例所述水溶性多壁碳纳米管的的制备：

1)称取160mg多壁碳纳米管置于烧瓶内，依次缓慢加入10mL浓硝酸和40mL浓硫酸；

2)电磁搅拌，加热到125℃回流35min；

3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

4)将烧瓶中溶液转移到盛有240mL水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

5)将稀释后的溶液用0.45μm有机膜抽滤，并用二次水冲洗至pH接近中性；

6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有60mL无水乙醇的烧杯中，超声1.5min后将滤膜取出；

7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集烧杯底部的固体粉末，干燥保存。

Claims (3)

1.水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用。

2.按照权利要求1所述水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用，其特征在于：具体应用过程如下，

1)称取水溶性多壁碳纳米管10mg，加入5-20mL水，超声分散完全溶解，制得基体溶液；

2)取基体溶液点于金属靶表面，自然干燥后形成均匀的基体层；

3)取样品溶液点于基体层上，自然干燥后进行质谱分析。

3.按照权利要求1所述水溶性多壁碳纳米管作基质在MALDI-MS中的应用，其特征在于：所述水溶性多壁碳纳米管可按如下方法制备获得，

1)称取150-200mg多壁碳纳米管置于容器内，依次缓慢加入5-15mL浓硝酸和10-50mL浓硫酸；

2)电磁搅拌，加热到120-140℃回流20-40min；

3)撤去加热，搅拌冷却至室温；

4)将容器中溶液转移到盛有200-300mL水的容器中，搅拌冷却至室温；

5)将稀释后的溶液用有机膜抽滤，并用二次水冲洗至中性；

6)将滤膜及膜上滤饼转移到盛有50-100mL无水乙醇的容器中，超声1-3min后将滤膜取出，滤饼重新分散；

7)将无水乙醇加热蒸发至干，收集容器底部的固体粉末，干燥保存。

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