DE102018001873A1 - Molekulare Verfahren zur Beurteilung von Komplikationen nach einer Nierentransplantation - Google Patents

Molekulare Verfahren zur Beurteilung von Komplikationen nach einer Nierentransplantation Download PDF

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Abstract

Verfahren zum Screenen auf Expression einer RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, umfassen das Gewinnen von Vesikeln aus Urin, die Isolierung von Vesikel-assoziierter RNA und die Untersuchung von Expressionsmustern. Insbesondere werden AIF1-, BTN3A3-, CCL5-, CD48-, HAVCR1- oder SLC6A6-mRNA-Expressionsmuster untersucht.

Description

  • HINTERGRUND
  • Technisches Gebiet
  • Einige Ausführungsformen der hierin offenbarten Verfahren und Systeme betreffen die Überwachung eines Zustands nach einer Nierentransplantation. Einige Ausführungsformen betreffen die Charakterisierung von mRNA-Profilen von Exosomen und Mikrovesikeln aus Urinproben, um den Zustand der Niere zu beurteilen.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • Die Nierentransplantation ist der letzte Ausweg für Patienten mit einer Nierenerkrankung im Endstadium. Obwohl mehr als 100.000 Patienten auf Nierentransplantate warten (mittlere Wartezeit: 3,6 Jahre), wurden 2014 lediglich etwa 17.000 aufgrund der begrenzten Anzahl an Spendern durchgeführt und die Kluft zwischen Patienten und Spendern wächst immer weiter. Die Entwicklung von Immunsuppressiva verbesserte das Überleben von Transplantaten in den letzten Jahren erheblich, jedoch sind Komplikationen nach einer Transplantation einschließlich akuten und chronischen Abstoßungen nach wie vor die Hauptursachen von Verlust des Transplantats gefolgt von anderen Komplikationen.
  • Konventionelle Urin-Biomarker wie Serum-Kreatinin, Urin-Kreatinin und Urin-Protein sind nicht empfindlich und spezifisch genug, um bisher Komplikationen nach einer Transplantation vorherzusagen. Die Nierenbiopsie ist der Goldstandard, um den Status des Transplantats zu diagnostizieren und Behandlungsstrategien zu beschließen, jedoch ist sie aufgrund ihrer invasiven Beschaffenheit und finanziellen Belastung für Patienten keine ideale Lösung zur häufigen Überwachung. Insbesondere bei Patienten, denen Thrombozytenhemmer und Antikoagulantien aufgrund urämischer Thrombozytenfunktionsstörung, veränderter Gefäßstruktur und anderen Faktoren verabreicht werden, ist die Nierenbiopsie nicht anwendbar oder könnte ein Risiko darstellen. Daher sind nicht-invasive Biomarker zur Überwachung der Niere nach der Transplantation gewünscht.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • In einigen Ausführungsformen werden hierin Verfahren und Systeme zur Identifizierung solcher Biomarker und die Verwendung solcher Biomarker zur Anordnung einer spezifischen Behandlung für einen Patienten nach der Nierentransplantation bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen sind die Verfahren computerbasiert und ermöglichen eine im Wesentlichen Echtzeit-Bestimmung des Status der Niere. In einigen Ausführungsformen führen die Verfahren zu einer Bestimmung des Status der Niere, während in manchen Ausführungsformen ein spezifisches empfohlenes Behandlungsparadigma hergestellt wird (nach dem sich z.B. eine medizinische Fachperson richtet).
  • In manchen Aspekten kann unterschiedliche RNA in den Verfahren verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, das Nachweisen des Vorliegens einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in einem Individuum. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Nachweisen der Spiegel von Markern, um akute zelluläre Abstoßung erfolgreich zu diagnostizieren und die Abstoßungen vor einer invasiven Biopsie vorherzusagen (z.B. bis zu 20 Tagen bevor eine Biopsie eine Diagnose bestätigen würde). Die verwendeten Proben können Blut, Urin oder jede andere biologische Probe umfassen. In bestimmten Varianten umfasst das Verfahren die Quantifizierung der mRNA-Expression in Exosomen und Mikrovesikeln, die aus einer Urinprobe des Patienten isoliert wurden. In manchen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Nachweisen der Spiegel von ANXA1 in einer Urinprobe des Individuums, wobei ANXA1 in Urin-Exosomen und Mikrovesikeln vorliegt, und wobei der Nachweis eines erhöhten Spiegels mindestens eines Markers auf das Vorliegen einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in dem Individuum hindeutet. In manchen Ausführungsformen ist die Komplikation nach einer Nierentransplantation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus akuter Abstoßung, chronischer Abstoßung, Borderline-Abstoßung, interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophie, Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie und Calcineurin-Inhibitor (CNI)-Toxizität. In bestimmten Varianten umfasst das Verfahren des Weiteren einen Schritt, um ein Referenzgen nachzuweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ACTB und GAPDH, wobei das Referenzgen verwendet wird, um einen Spiegel des mindestens einen Markers zu normalisieren. In manchen Ausführungsformen ist ein erhöhter Spiegel im Vergleich zu dem Spiegel des Markers in einer Urinprobe eines Spenders ohne Komplikationen nach einer Nierentransplantation mehr als 2-fach erhöht.
  • In manchen Ausführungsformen wird ein Verfahren zum Screenen eines humanen Individuums auf eine Expression einer RNA offenbart, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Vergleichen einer Expression der RNA in einem Vesikel, das aus einer Urinprobe des Individuums isoliert wurde, mit einer Expression der RNA in einem Vesikel, das aus einer Urinprobe eines Spenders ohne Komplikationen nach einer Nierentransplantation isoliert wurde, umfasst, wobei die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, ANXA1 ist, wobei eine Erhöhung der Expression der RNA des Individuums im Vergleich zu der Expression der RNA des Spenders darauf hindeutet, dass das Individuum eine Komplikation nach einer Nierentransplantation aufweist, wenn die Erhöhung einen Schwellenwert eines Spiegels übersteigt, wobei das Vergleichen der Expression der RNA in dem Vesikel, das aus der Urinprobe isoliert wurde, des Weiteren umfasst: Gewinnen des Vesikels aus der Probe des Individuums durch Passieren der Probe des Individuums über einen Vesikel-zurückhaltenden Filter, Laden eines Lyse-Puffers auf den Vesikel-zurückhaltenden Filter, wodurch das Vesikel lysiert wird, um eine Vesikel-assoziierte RNA freizusetzen, Quantifizieren der Expression der RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, in der Vesikel-assoziierten RNA durch PCR. In manchen Varianten umfasst das Verfahren des Weiteren das Verwenden analytischer Software, um einen Marker-Zyklus-Schwellenwert (cycle threshold value; Ct value) für die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, zu bestimmen, unter Verwendung analytischer Software, um einen Referenz-Ct-Wert für eine Referenz-RNA zu bestimmen, und Subtrahieren des Marker-Ct-Werts von dem Referenz-Ct-Wert, um einen Marker-Delta-Ct-Wert zu erhalten. In manchen Varianten ist die Referenz-RNA aus der Gruppe bestehend aus ACTB und GAPDH ausgewählt. In manchen Ausführungsformen übersteigt die Erhöhung den Schwellenwert, wenn der Marker-Delta-Ct-Wert weniger als 6 beträgt. In manchen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Vergleichen des Marker-Delta-Ct-Werts mit einem Kontroll-Delta-Ct-Wert, wobei der Kontroll-Delta-Ct-Wert durch Subtrahieren eines Kontroll-Marker-Ct-Werts von einem Kontroll-Referenz-Ct-Wert bestimmt wird, wobei der Kontroll-Marker-Ct-Wert ein Ct-Wert der RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, in Urin-Vesikeln einer gesunden Spenderpopulation ist, wobei der Kontroll-Referenz-Ct-Wert ein Ct-Wert der Referenz-RNA in Urin-Vesikeln einer gesunden Spenderpopulation ist. In manchen Ausführungsformen übersteigt die Erhöhung den Schwellenwert, wenn der Marker-Delta-Ct-Wert mindestens 2 weniger als der Kontroll-Delta-Ct-Wert ist.
  • Die oben zusammengefassten und unten näher ausgeführten Verfahren beschreiben bestimmte Maßnahmen, die von einem praktizierenden Arzt ergriffen werden; es sollte jedoch klar sein, dass sie ebenfalls die Anweisung der Maßnahmen einer anderen Partei einschließen können. Somit können Maßnahmen wie „die Behandlung der Erkrankung oder Leiden eines Individuums“ „die Anweisung der Anwendung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens eines Individuums“ einschließen.
  • Figurenliste
  • Verschiedene Ausführungsformen sind in den zugehörigen Zeichnungen zur Veranschaulichung dargestellt und sollten nicht dahingehend interpretiert werden, als dass sie den Schutzumfang der Ausführungsformen einschränken. Des Weiteren können verschiedene Merkmale von unterschiedlichen offenbarten Ausführungsformen kombiniert werden, sodass sich zusätzliche Ausführungsformen ergeben, die Teil dieser Offenbarung sind.
    • 1A zeigt ein Diagramm der Annexin A1 (ANXA1)-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für interstitielle Fibrose (ci) dieses Individuums.
    • 1B zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für tubuläre Atrophie (ct) dieses Individuums.
    • 1C zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für gesamte interstitielle Inflammation dieses Individuums.
    • 1D zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für Tubulitis (t) dieses Individuums.
    • 1E zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für interstitielle Infiltration (i) dieses Individuums.
    • 1F zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für Intima-Arteriitis (v) dieses Individuums.
    • 1G zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für hyaline Verdickung der Arteriolen (ah) dieses Individuums.
    • 1H zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für tubuläre peritubuläre Kapillaritis (ptc) dieses Individuums.
    • 1I zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für Glomerulitis (g) dieses Individuums.
    • 1J zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für Intima-Verdickung durch vaskuläre Fibrose (cv) dieses Individuums.
    • 1K zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für alternative Bewertung hyaliner Verdickung der Arteriolen (aah) dieses Individuums.
    • 1L zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für peritubuläre Kapillaritis, wie durch das Banff-Verfahren bestimmt (ptcbm), dieses Individuums.
    • 1M zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für chronische Glomerulopathie (cg) dieses Individuums.
    • 1N zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für Komplement C4d-Färbung dieses Individuums.
    • 1O zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für eine Erhöhung der mesangialen Matrix dieses Individuums.
    • 2A zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für den Urin-Proteinspiegel dieses Individuums.
    • 2B zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für den Urin-Kreatininspiegel dieses Individuums.
    • 2C zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für den Serum-Kreatininspiegel dieses Individuums.
    • 2D zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Banff-Wertes für die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate dieses Individuums.
    • 3 zeigt ein schematisches Diagramm der Patienten- und Probenklassifikation.
    • 4 zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des Status dieses Individuums bezüglich verschiedener Arten von Zuständen nach einer Nierentransplantation. Die statistische Signifikanz wurde durch den Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bestimmt: Ein Stern (*) für p < 0,05 und vier (****) für p < 0,0001.
    • 5A zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion der Zeit ab dem Datum, an dem die Transplantatabstoßung in diesem Individuum bestätigt wurde. Die statistische Signifikanz wurde durch den Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bestimmt: zwei Sterne (**) für p < 0,01, drei (***) für p < 0,001 und vier (****) für p < 0,0001.
    • 5B zeigt eine Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Analyse für die ANXA1-mRNA-Expression vor (durchgezogene Linie), während (gestrichelte Linie) und nach (gepunktete Linie) der Bestätigung einer Transplantatabstoßung.
    • 5C zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion der Zeit ab dem Datum, an dem interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (IFTA) in diesem Individuum bestätigt wurde. Die statistische Signifikanz wurde durch den Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bestimmt: zwei Sterne (**) für p < 0,01, drei (***) für p < 0,001 und vier (****) für p < 0,0001.
    • 5D zeigt eine Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Analyse für die ANXA1-mRNA-Expression vor (durchgezogene Linie), während (gestrichelte Linie) und nach (gepunktete Linie) der Bestätigung von IFTA.
    • 5E zeigt ein Diagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion der Zeit ab dem Datum, an dem eine andere Komplikation wie Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie und Calcineurin-Inhibitor (CNI)-Toxizität in diesem Individuum bestätigt wurde. Die statistische Signifikanz wurde durch den Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bestimmt: zwei Sterne (**) für p < 0,01, drei (***) für p < 0,001 und vier (****) für p < 0,0001.
    • 5F zeigt eine Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Analyse für die ANXA1-mRNA-Expression vor (durchgezogene Linie), während (gestrichelte Linie) und nach (gepunktete Linie) der Bestätigung von Komplikationen.
    • 6A zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums, bewertet unter Verwendung von ANXA1-Real-Time-PCR-Primern.
    • 6B zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums, bewertet unter Verwendung von ANXA1.v2-Real-Time-PCR-Primern.
    • 6C zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums, bewertet unter Verwendung von ANXA1.v3-Real-Time-PCR-Primern.
    • 7 zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in Proben einer anderen Kohorte von Patienten.
    • 8 zeigt ein Streudiagramm der ANXA1-mRNA-Expression in einer Nierenbiopsieprobe.
    • 9A zeigt ein Streudiagramm der AIF1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
    • 9B zeigt ein Streudiagramm der BTN3A3-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
    • 9C zeigt ein Streudiagramm der CCL5-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
    • 9D zeigt ein Streudiagramm der CD48-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
    • 9E zeigt ein Streudiagramm der HAVCR1-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
    • 9F zeigt ein Streudiagramm der SLC6A6-mRNA-Expression in Urin-EMV eines Individuums als Funktion des CADI-Wertes.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Bestimmte Aspekte der vorliegenden Offenbarung sind im Allgemeinen auf ein minimal-invasives Verfahren gerichtet, das den Zustand eines Patienten nach einer Nierentransplantation überwacht. Jedes hierin beschriebene Merkmal und jede Kombination von zwei oder mehreren solcher Merkmale ist vom Schutzumfang der vorliegenden Offenbarung einschlossen, vorausgesetzt, dass die in einer derartigen Kombination enthaltenen Merkmale in sich schlüssig sind.
  • Exosome und Mikrovesikel (EMV) werden aus allen Bereichen der Nephrone in den Harnraum freigesetzt und kapseln cytoplasmatische Moleküle der Ursprungszelle ein. EMV werden als vielversprechende Quelle für Biomarker angesehen, da Urin-EMV-mRNA-Profile Nierenfunktionen und Nierenschädigungen widerspiegeln. Im Vergleich zu konventionellen nicht-invasiven Biomarkerquellen wie Urinzellen und Blut können Urin-EMV frühere und deutlichere Signaturen von Nierenschädigungen enthalten. Die Messenger-RNA (mRNA)-Expression von CD3E und CXCL10 (z.B. im Vergleich zu 18S rRNA-Spiegeln) wurde in aus Urin gewonnenen Zellen gemessen, wurde jedoch nicht für Urin-EMV berichtet. Des Weiteren wurde die Expression von zusätzlichen Markern (z.B. CFLAR, DUSP1, IFNGR1, ITGAX, MAPK9, NAMPT, NKTR, PSEN1, RNF130, RYBP, CEACAM4, EPOR, GZMK, RARA, RHEB, RXRA, SLC25A37 und Ähnliche) in Gesamtblut gemessen jedoch nicht Urin-EMV. Die Überwachung eines Zustands nach einer Nierentransplantation ist für das Management des langfristigen Überlebens eines Transplantats von großer Bedeutung. Urinzellen werden nach schwerwiegenden Schädigungen der Nephrone im Urin freigesetzt, jedoch werden Urin-EMV nicht nur von geschädigten Zellen, sondern auch von normalen Zellen freigesetzt. Daher können molekulare Signaturen, die mit Schädigungen in Zusammenhang stehen, aus den geschädigten Zellen erhalten werden, bevor die geschädigten Zellen in den Urin freigesetzt werden. Somit ziehen einige Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung einen Vorteil aus Urin-EMVs.
  • Das Standardverfahren zur Isolierung von Urin-EMV ist ein Differenzial-Zentrifugationsverfahren unter Verwendung von Ultrazentrifugation. Die Ultrazentrifugation mag jedoch für routinemäßige klinische Assays in standardmäßigen klinischen Laboren nicht geeignet sein. Verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung wenden einen Urin-EMV-mRNA-Assay für Biomarker und klinische Studien an, welcher ähnliche oder sogar bessere Leistungen im Vergleich zum Standardverfahren in Bezug auf Assaysensitivität, Reproduzierbarkeit und leichtere Anwendbarkeit ermöglicht. Verschiedene Ausführungsformen wenden diesen Urin-EMV-mRNA-Assay an, um auf Marker für Nierenschädigung zur Überwachung des Transplantats nach der Transplantation bevorzugt zu Zeitpunkten, die deutlich vor denen liegen, die Standarddiagnoseverfahren verwenden (z.B. Biopsie), zu screenen.
  • Wie unten näher beschrieben wird, können Urin-Exosome aus Urin durch Passieren von Urinproben durch einen Vesikel-zurückhaltenden Filter isoliert werden, was das Isolieren der EMV aus Urin erlaubt ohne Verwendung von Ultrazentrifugation. In manchen Ausführungsformen weist das Material zum Zurückhalten der Vesikel eine Porosität auf, die um Größenordnungen über dem zurückgehaltenen Vesikel liegt. Obwohl das Vesikel-zurückhaltende Material eine Porengröße aufweist, die wesentlich größer ist als die Größe der EMV, werden die EMV auf dem Vesikel-zurückhaltenden Material durch Adsorption der EMV an das Vesikel-zurückhaltende Material gewonnen. Die Porengröße und Struktur des Vesikel-zurückhaltenden Materials ist maßgeschneidert, um die EMV-Zurückhaltung und die EMV-Ausbeute auszugleichen, sodass mRNA der EMV aus dem Vesikel-zurückhaltenden Material gewonnen werden kann. In manchen Ausführungsformen ist das Vesikel-zurückhaltende Material ein mehrschichtiger Filter, der mindestens zwei Schichten umfasst, die unterschiedliche Porositäten aufweisen. In einer Ausführungsform hat die erste Schicht eine Partikel-Rückhalterate zwischen 0,6 und 2,7 µm, bevorzugt 1,5 und 1,8 µm, und die zweite Schicht hat eine Partikel-Rückhalterate zwischen 0,1 und 1,6 µm, bevorzugt 0,6 und 0,8 µm. In einer Ausführungsform ist die Partikel-Rückhalterate der ersten Schicht höher als die der zweiten Schicht, wodurch eine höhere Partikel-Ladungskapazität und schnellere Durchflussraten erhalten werden können. In manchen Ausführungsformen passiert die Urinprobe zuerst eine erste Schicht und anschließend eine zweite Schicht, wobei beide aus Glasfaser bestehen. Die erste Schicht weist eine Porengröße von 1,6 µm auf und die zweite Schicht weist eine Porengröße von 0,7 µm auf.
  • In einigen Ausführungsformen verwenden die Verfahren der vorliegenden Offenbarung einen filterbasierten EMV-mRNA-Assay, um Urinproben von Patienten nach einer Nierentransplantation zu screenen, um den Zustand der Niere zu überwachen. In manchen Ausführungsformen können die hierin offenbarten Verfahren verwendet werden, um EMV-mRNA zu screenen, die aus Vesikeln gewonnen wurde, die aus Urin durch Ultrazentrifugation isoliert wurden. In verschiedenen Ausführungsformen werden Urin-EMV auf Biomarker für Nierenschädigungen gescreent, die nachgewiesen werden können bevor eine Nierenschädigung durch die gängige Standardpraxis zur Beurteilung von Transplantatabstoßung (z.B. Nierenbiopsie) nachgewiesen werden kann.
  • Peripheres Blut ist eine ergiebige Quelle an Biomarkern für viele Erkrankungen und Organschädigungen. Signaturen der Niere, die mit Schädigungen in Zusammenhang stehen, können jedoch verdünnt und mit EMV gemischt werden, die in das periphere Blut aus anderen Organen freigesetzt werden. Von Urin-EMV-mRNAs wurde gezeigt, dass sie in manchen Fällen Folgen nach einer Transplantation vorhersagen können. Einige untersuchte Gene wie beispielsweise LCN2 (NGAL), IL18, HAVCR1 (KIM1) und CST3 (Cystatin C) wurden jedoch nicht routinemäßig mit Urin-Proteinbiomarkem oder mit Kreatininreduzierungsverhältnissen an Tag 7 in Zusammenhang gebracht. Einige Ausführungsformen der hierin offenbarten Verfahren und Systeme betreffen die Überwachung eines Zustands nach einer Nierentransplantation, was für das Management des langfristigen Überlebens eines Transplantats von Bedeutung ist.
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung verwenden ein Urin-Exosom- und Mikrovesikel (EMV)-mRNA-Assay in dem frühe Biomarker einer Nierenschädigung von Patienten gescreent werden, die sich einer Nierentransplantation unterzogen haben. Verschiedene mRNA sind bezüglich des Status einer Niere nach einer Transplantation aufschlussreich, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Annexin A1 (ANXA1). Wie unten erläutert weisen verschiedene Ausführungsformen der hierin offenbarten Verfahren darauf hin, dass der Expressionsspiegel von ANXA1 linear mit den Banff-Werten ci (interstitielle Fibrose), ct (tubuläre Atrophie) und ti (gesamte interstitielle Inflammation) der übereinstimmenden Nierenbiopsien (N=117) linear korreliert. Im Vergleich mit den Patienten mit stabiler Erholung hat sich die die Annexin A1 (ANXA1)-Expression in Urin-EMV erhöht, wenn T-Zell-vermittelte Abstoßung (TCMR, 10,2-fach), Antikörpervermittelte Abstoßung (ABMR, 14,4-fach), interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (IFTA, 22,0-fach) sowie andere Komplikationen (8,7-fach) beobachtet wurden. ANXA1 erhöhte sich mindestens 6,5 Tage vor Transplantatabstoßung, 56 Tage vor IFTA und 64 Tage vor anderen Komplikationen, und blieb nach Verschwinden der Komplikationen hoch. Die ROC-Kurvenanalyse deutete darauf hin, dass Urin-ANXA1 in der Lage war, Komplikationen nach einer Transplantation akkurat vorherzusehen und zu diagnostizieren: Transplantatabstoßung (AUC = 0,857 bis 0,946), IFTA (AUC = 0,777 bis 0,995) und andere Komplikationen (AUC = 0,698 bis 0,797). In Übereinstimmung mit einigen hierin offenbarten Ausführungsformen sind die Verfahren und die Systeme, die die Urin-EMV-ANXA1-mRNA-Analyse anwenden, somit wirksam für die frühzeitige Vorhersage von interstitieller Fibrose und tubulärer Atrophie und nützlich für das Überwachen des Transplantats nach der Transplantation.
  • Die Expressionsspiegel von Urin-EMV-ANXA1-mRNA wurden mit den übereinstimmenden Biopsiewerten von Patienten nach einer Nierentransplantation verglichen. Wie in 1A-C gezeigt ist, korrelierte der Expressionsspiegel von Urin-EMV-ANXA1 linear mit den Banff-Werten für interstitielle Fibrose („ci“, 1A), tubuläre Atrophie („ct“, 1B) und gesamte interstitielle Inflammation („ti“, 1C). Wie in den 1D-O gezeigt ist, korrelierte der Expressionsspiegel von Urin-EMV-ANXA1 nicht mit den Banff-Werten für Tubulitis („t“ D), interstitielle Infiltration („i“, 1E), Intima-Arteriitis („v“, 1F), hyaline Verdickung der Arteriolen („ah“, 1G), tubuläre peritubuläre Capillaritis („ptc“, 1H), Glomerulitis („g“, 1I), Intima-Verdickung durch vaskuläre Fibrose („cv“, 1J), alternative Bewertung hyaliner Verdickung der Arteriolen („aah“, 1K), peritubuläre Kapillaritis wie durch das Banff-Verfahren bestimmt („ptcbm“, 1L), chronische Glomerulopathie („cg“, 1M), Komplement C4d-Färbung („c4d“, 1N), und Erhöhung der mesangialen Matrix („mm“, 1O). Dementsprechend kann ANXA1-mRNA in EMV ein vielversprechender Biomarker sein, der auf interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie hinweist.
  • 2A-D zeigen, dass der Expressionsspiegel von Urin-EMV-ANXA1-mRNA keine Korrelation mit konventionellen Markern einer Komplikation nach einer Nierentransplantation und/oder Nierenabstoßung aufweist. Die Expression von Urin-EMV-ANXA1-mRNA zeigte keinen Zusammenhang mit der Urin-Proteinkonzentration (2A), Urin-Kreatininkonzentration (2B), Serum-Kreatininkonzentration (2C) und der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (2D).
  • Die Expression von ANXA1-mRNA in Urin-EMV wurde für Patienten mit verschiedenen Arten von Komplikationen nach einer Transplantation und für Patienten mit stabiler postoperativer Genesung während des Studienzeitraums gemessen. Patienten nach einer Transplantation wurden in vier Gruppen anhand der Komplikationen, die bei den Patienten während des Studienzeitraums diagnostiziert wurden, kategorisiert: stabile Genesung (stable recovery; SR), Transplantatabstoßung (transplant rejection; TR), interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (interstitial fibrosis and tubular atrophy; IFTA) und andere Komplikationen (OTH) (3, Tabelle 1). Für die TR-, IFTA- und OTH-Patientengruppen wurden Urinproben in drei Gruppen nach Probeentnahmezeit im Verhältnis zu dem Zeitpunkt, als Komplikationen beobachtet wurden, kategorisiert: Pre Cx, Cx und Post Cx (3, Tabelle 2). Die Urinproben, die gewonnen wurden, als die TR- und IFTA-Patienten andere Komplikationen wie Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie und Calcineurin-Inhibitor (CNI)-Toxizität aufwiesen, wurden ebenfalls als Cx kategorisiert. Pre-Cx-Proben waren die Proben, die vor der ersten während des Studienzeitraums beobachteten Komplikation gewonnen wurden, und Post Cx wurden nach der letzten gewonnen. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die relative Probenentnahmezeit von Pre Cx in der TR-Gruppe im Mittel 6,5 (IQR 5 - 9) Tage vor der ersten Komplikation betrug und verzerrt war verglichen mit denen der IFTA (im Mittel 56 (IQR 43 - 168) Tage davor) und OTH (im Mittel 64 (IQR 27 - 177) Tage davor). Die Cx-Proben wurde weiter durch die Art der Komplikationen kategorisiert, die während der Probenentnahme beobachtet wurden: TCMR, Borderline, ABMR, IFTA und andere Komplikationen (3). Tabelle 1. Patientenkategorien, die für jede Probenkategorie mittlere Werte und IQR-Werte am Tag nach der OP (post operation day; POD) zeigen.
    Patientengruppe Individuum Probe Mittlerer POD (IQR)
    Stabile Genesung (stable recovery; SR) 34 52 240,5 (24-793)
    Transplantatabstoßung (transplant rejection; TR) 20 50 364 (52-737)
    Interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (interstitial fibrosis and tubular atrophy; IFTA) 51 98 365 (21-1036)
    Andere Komplikationen (other complications; OTH) 50 99 94,5 (11-906)
    Gesamt 155 299 240,5(14-901)
    Tabelle 2. Probenkategorien, die für jede Probenkategorie mittlere Werte und IQR-Werte des Probenentnahmetages im Verhältnis zur dem Zeitpunkt zeigt, an dem die Komplikation beobachtet wurde.
    Patientengruppe Probengruppe Mittlerer relativer Probenentahmetag (IQR) Probe
    TR Pre Cx -6,5 (-9 bis -5) 6
    Cx 0 30
    Post Cx +288,5 (+233 bis +347) 8
    IFTA Pre Cx -56 (-168 bis -43) 33
    Cx 0 59
    Post Cx +176,5 (+54 bis +319) 4
    OTH Pre Cx -64 (-177 bis -27) 39
    Cx 0 50
    Post Cx +58 (+38 bis +75) 9
  • 4 zeigt Expressionsspiegel von Urin-EMV-ANXA1-mRNA in Patienten mit stabiler Genesung und in Patienten, die Komplikationen nach einer Transplantation zeigen. Der Expressionsspiegel von ANXA1 in Urin-EMV wurde in den Proben, die erhalten wurden, als Komplikationen nach einer Transplantation beobachtet wurden, im Vergleich zu denen der SR-Gruppe (4) analysiert. Die Erhöhung des ANXA1-Spiegels wurde in TCMR (10,2-fache Erhöhung, p = 0,017), ABMR (14,4-fache Erhöhung, p = 0,015), IFTA (22,0-fache Erhöhung, p = 4,3 × 10-16) und anderen Komplikationen (8,7-fache Erhöhung, p = 2,2 × 10-5) beobachtet. Auf der anderen Seite erhöhte sich ANXA1 um mindestens das 2,6-Fache in der Borderline-Gruppe, wobei jedoch keine statistische Signifikanz beobachtet wurde.
  • Um voraussagende und prognostische Werte von ANXA1 bei der Überwachung von einem Transplantat nach einer Transplantation zu beurteilen, wurden die Urinproben in den TR-, IFTA- und OTH-Patienten anhand der Probenentnahmezeit kategorisiert und analysiert. Im Vergleich zu den SR-Patienten zeigten die TR-Patienten eine Erhöhung des ANXA1-Spiegels mindestens im Mittel 6,5 (IQR 5 bis 9) Tage, bevor die erste Komplikation beobachtet wurde, und blieb hoch für im Mittel 288,5 (IQR 222,5 bis 346,8) Tage nach der letzten Komplikation (4A). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte, dass der Expressionsspiegel von ANXA1 die TR-Patienten von den SR-Patienten unterscheiden kann, mit AUC = 0,946 (Pre Cx), 0,857 (Cx) und 0,940 (Post Cx) (Figur 4B, Tabelle 3).
  • Die IFTA- und OTH-Patienten zeigten ebenso wie die TR-Patienten auch eine Erhöhung von ANXA1 unabhängig von der Probenentnahmezeit. Die Erhöhung wurde jedoch viel früher oder zumindest im Mittel 56 (IQR 43 bis 168) bzw. 64 (IQR 27 bis 177) Tage vor der ersten Komplikation beobachtet (4C, 4E). Die ROC-Kurvenanalyse ließ erkennen, dass ANXA1 die IFTA-Patienten von den SR-Patienten mit vergleichbarer Sensitivität und Spezifizität wie bei den TR-Patienten unterscheiden kann: AUC 0,777 (Pre Cx), 0,906 (Cx) und 0,995 (Post Cx) (Figur 4D, Tabelle 3). Auf der anderen Seite waren die OTH-Patienten weniger sensitiv und spezifisch verglichen mit anderen Komplikationsgruppen, wobei die erhaltenen AUCs dennoch 0,698 bis 0,797 betrugen (Figur 3E, Tabelle 3). Tabelle 3. Diagnostische Leistung von Urin-EMV-ANXA1
    Patientengruppe Pre Cx (AUC) Cx (AUC) Post Cx (AUC)
    TR 0,946 0,857 0,940
    IFTA 0,777 0,906 0,995
    OTH 0,698 0,739 0,797
  • In manchen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung kann die Heraufregulierung von ANXA1 auf die Notwendigkeit hinweisen, das Nierenleiden durch eine Biopsie zu bestätigen. Obwohl ANXA1 nicht zwischen Komplikationen nach einer Transplantation unterschied, können erhöhte Spiegel von Urin-EMV-ANXA1-mRNA eine Transplantatabstoßung mindestens 6,5 Tage früher als die derzeitige Praxis erkennen und kann IFTA und andere Komplikationen mindestens 56 bzw. 64 Tage früher voraussagen. In Anbetracht der schädigenden und invasiven Eigenschaft einer Biopsie können die Verfahren der vorliegenden Offenbarung die frühzeitige Behandlung von Komplikationen nach einer Nierentransplantation unterstützen, indem die Anwendung einer Biopsie auf solche Fälle begrenzt ist, in denen eine Biopsie durch erhöhte Spiegel von ANXA1-mRNA-Expression in Urin-EMV indiziert ist.
  • Wie oben ausgeführt, sind hierin einige Ausführungsformen bereitgestellt, in denen Nucleinsäuren aus Blut- oder Urinproben ausgewertet werden, um einen Expressionsspiegel eines bestimmten Markers nachzuweisen und zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen ermöglicht die Bestimmung der Expression des Markers eine Diagnose einer Erkrankung oder eines Leidens wie z.B. einer Nierenschädigung. In einigen Ausführungsformen wird die Bestimmung verwendet, um den Schweregrad des Leidens zu messen und einen angemessenen Behandlungsplan zu entwickeln und anzuwenden. In einigen Ausführungsformen wird der nachgewiesene Biomarker anschließend verwendet, um ein passendes Behandlungsschema zu entwickeln. In einigen Ausführungsformen kann die Behandlung jedoch darin bestehen, keine weiteren Maßnahmen zu ergreifen (z.B. keine Behandlung zu beginnen), wenn ein Individuum sich beispielsweise in Remission befindet. In einigen Ausführungsformen sind die Verfahren computergesteuert (z.B. eine oder mehrere der RNA-Isolation, cDNA-Herstellung oder -Amplifizierung sind ganzheitlich oder teilweise von einem Computer gesteuert). In einigen Ausführungsformen findet der Nachweis des Biomarkers in Echtzeit statt.
  • Wie oben beschrieben sind bestimmte Aspekte der Verfahren gegebenenfalls computergestützt. Des Weiteren kann die Höhe der Expression in einigen Ausführungsformen eine Bestimmung zur Folge haben, wonach keine Behandlung zu diesem Zeitpunkt durchzuführen ist. Somit verringern in einigen Ausführungsformen die hierin offenbarten Verfahren auch unnötige Behandlungskosten und verringern die Wahrscheinlichkeit, dass Nebenwirkungen einer Behandlung auftreten, die zu dem bestimmten Zeitpunkt nicht benötigt wird.
  • In manchen Ausführungsformen werden nach Gewinnen einer biologischen Probe (z.B. einer Urinprobe) Membranpartikel, Zellen, Exosome, Exosom-artige Vesikel, Mikrovesikel und/oder andere biologische Komponenten von Interesse durch Filtern der Probe isoliert. In manchen Ausführungsformen wird das Filtern der gewonnenen Probe einen oder mehrere der Membranpartikel, Exosome, Exosom-artigen Vesikel und Mikrovesikeln auf einem Filter abfangen. In manchen Ausführungsformen fängt das Vesikel-zurückhaltende Material gewünschte Vesikel aus einer biologischen Probe auf. In manchen Ausführungsformen wird das Vesikel-zurückhaltende Material beruhend auf der Porengröße des Materials (oder anderen Durchgangsarten durch das Vesikel-zurückhaltende Material) ausgewählt. In manchen Ausführungsformen umfasst das Vesikel-zurückhaltende Material einen Filter.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst der Filter Poren. Wie hierin verwendet, ist den Begriffen „Pore“ oder „Poren“ ihre gewöhnliche Bedeutung zuzuordnen, und sie beziehen sich ebenso auf direkte oder gewundene Durchgänge durch ein Vesikel-zurückhaltendes Material. In manchen Ausführungsformen stellen die Materialien, die den Filter bilden, indirekte Durchgänge durch den Filter bereit. In manchen Ausführungsformen umfasst das Vesikel-zurückhaltende Material beispielsweise eine Vielzahl an Fasern, die den Durchgang bestimmter Stoffe durch die Lücken in der Faser ermöglichen, jedoch an sich keine Poren aufweisen. Ein Glasfaserfilter kann beispielsweise eine Netz-artige Struktur aufweisen, die so konfiguriert ist, dass Partikel, die einen Durchmesser von etwa 1,6 Mikrometer oder mehr aufweisen, zurückgehalten werden. Ein derartiger Glasfaserfilter kann hierin synonym als ein Glasfaserfilter bezeichnet werden, der eine Porengröße von 1,6 Mikrometern aufweist oder der ein Material umfasst, um Komponenten, die einen Durchmesser von etwa 1,6 Mikrometer oder mehr aufweisen, aufzufangen. Wie oben ausgeführt, haben die EMV, die vom Filter aufgefangen werden, jedoch um Größenordnungen kleiner als die Porengröße des Glasfilters. Obwohl der Filter hierin somit als Filter beschrieben werden kann, der Material zum Auffangen von Komponenten, die einen Durchmesser von etwa 1,6 Mikrometer oder mehr aufweisen, umfasst, kann ein solcher Filter Komponenten (z.B. EMV) auffangen, die einen geringeren Durchmesser aufweisen, da diese kleinen Komponenten an den Filter adsorbieren können.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst der Filter Material zum Auffangen von Komponenten, die einen Durchmesser von etwa 1,6 Mikrometern oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen wird eine Vielzahl von Filtern verwendet, um Vesikel innerhalb eines besonders bevorzugten Größenbereichs (z.B. Durchmesser) aufzufangen. Beispielsweise werden in manchen Ausführungsformen Filter zum Auffangen von Vesikeln verwendet, die einen Durchmesser von etwa 0,2 Mikrometer bis etwa 1,6 Mikrometer Durchmesser, einschließlich etwa 0,2 Mikrometer bis etwa 0,4 Mikrometer, etwa 0,4 Mikrometer bis etwa 0,6 Mikrometer, etwa 0,6 Mikrometer bis etwa 0,8 Mikrometer, etwa 0,8 Mikrometer bis etwa 1,0 Mikrometer, etwa 1,0 Mikrometer bis etwa 1,2 Mikrometer, etwa 1,2 Mikrometer bis etwa 1,4 Mikrometer, etwa 1,4 Mikrometer bis etwa 1,6 Mikrometer (und eine beliebige Größe zwischen den aufgeführten) aufweisen. In anderen Ausführungsformen fängt das Vesikel-zurückhaltende Material Exosome auf, die im Größenbereich von etwa 0,5 Mikrometer bis etwa 1,0 Mikrometer liegen.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst der Filter (oder die Filter) glasartiges Material, nicht-glasartiges Material oder eine Kombination davon. In manchen Ausführungsformen, in denen das Vesikel-zurückhaltende Material glasartige Materialien umfasst, weist das Vesikel-zurückhaltende Material eine Struktur auf, die unorganisiert oder „amorph“ auf der atomaren Skala ist, wie beispielweise Plastik oder Glas. Glasartige Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Glasperlen oder Glasfasern, Siliziumperlen (oder eine andere Anordnung), Nitrocellulose, Nylon, Polyvinylidenfluorid (PVDF) oder andere ähnliche Polymere, Metallfasern oder Nano-Metallfasern, Polystyrol, Ethylenvinylacetat oder andere Co-Polymere, natürliche Fasern (z.B. Seide), Alginatfaser, oder Kombinationen davon. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Vesikel-zurückhaltende Material gegebenenfalls eine Vielzahl von Schichten aus Vesikelzurückhaltendem Material. In anderen Ausführungsformen umfasst das Vesikel-zurückhaltende Material des Weiteren Nitrocellulose.
  • In manchen Ausführungsformen wird eine Filtervorrichtung verwendet, um biologische Komponenten von Interesse zu isolieren. In manchen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung: ein erstes Gehäuse, das einen Eingang, einen Ausgang und ein Innenvolumen zwischen dem Eingang und dem Ausgang aufweist; ein zweites Gehäuse, das einen Eingang, einen Ausgang, ein Innenvolumen zwischen dem Eingang und dem Ausgang, ein Filtermaterial, das innerhalb des Innenvolumens des zweiten Gehäuses und in Fluidverbindung mit dem ersten Gehäuse positioniert ist, aufweist; und ein Auffangbehälter, der einen Eingang, ein geschlossenes Ende gegenüber des Eingangs und einen inneren Hohlraum aufweist. In manchen Ausführungsformen sind das erste Gehäuse und das zweite Gehäuse durch eine Wechselwirkung des Eingangs des zweiten Gehäuses mit dem Ausgang des ersten Gehäuses reversibel miteinander verbunden. In manchen Ausführungsformen ist der innere Hohlraum des Auffangbehälters so dimensioniert, dass er sowohl das erste als auch das zweite Gehäuse reversibel einschließen kann und die gewonnene Probe erhalten kann, nachdem sie vom Innenvolumen des ersten Gehäuses durch das Filtermaterial, durch den inneren Hohlraum des zweiten Gehäuses und aus dem Ausgang des zweiten Gehäuses passiert wird. In manchen Ausführungsformen umfasst der Isolierungsschritt das Platzieren von mindestens einem Teil der gewonnenen Probe in eine solche Vorrichtung und das Anwenden einer Kraft auf die Vorrichtung, damit die gewonnene Probe durch die Vorrichtung zum Auffangbehälter durchgeführt wird, sowie das Auffangen der biologischen Komponente von Interesse. In manchen Ausführungsformen umfasst das Anwenden der Kraft die Zentrifugation der Vorrichtung. In anderen Ausführungsformen umfasst das Anwenden der Kraft die Anwendung von positivem Druck auf die Vorrichtung. In anderen Ausführungsformen umfasst das Anwenden der Kraft die Anwendung von Vakuumdruck auf die Vorrichtung. Beispiele solcher Filtervorrichtungen sind in der PCT-Veröffentlichung WO 2014/182330 und PCT-Veröffentlichung WO 2015/050891 offenbart, die hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind.
  • In manchen Ausführungsformen wird die gewonnene Probe durch mehrere Filter gegeben, um die biologische Komponente von Interesse zu isolieren. In anderen Ausführungsformen umfasst das Isolieren von biologischen Komponenten das Verdünnen der gewonnenen Probe. In anderen Ausführungsformen kann Zentrifugation verwendet werden, um die biologischen Komponenten von Interesse zu isolieren. In manchen Ausführungsformen können mehrere Isolationsverfahren angewandt werden (z.B. Kombinationen aus Auswahl durch Filtration und /oder Dichtezentrifugation). In manchen Ausführungsformen wird die gewonnene Probe nach dem Isolierungsschritt in eine oder mehrere Proben aufgetrennt.
  • In manchen Ausführungsformen wird RNA aus der biologischen Komponente von Interesse zur Messung freigesetzt. In manchen Ausführungsformen umfasst das Freisetzen der RNA aus der biologischen Komponente von Interesse das Lysieren der Membranpartikel, Exosome, Exosom-artigen Vesikel und/oder Mikrovesikel mit einem Lysepuffer. In anderen Ausführungsformen kann Zentrifugation angewandt werden. In manchen Ausführungsformen wird das Freisetzen durchgeführt, während die Membranpartikel, Exosome, Exosom-artigen Vesikel, Mikrovesikel und/oder anderen Komponenten von Interesse auf einem Filter immobilisiert sind. In manchen Ausführungsformen werden die Membranpartikel, Exosome, Exosom-artigen Vesikel, Mikrovesikel und/oder anderen Komponenten von Interesse isoliert oder anderweitig von anderen Komponenten der gewonnenen Probe abgetrennt (und/oder voneinander - z.B. Vesikel werden von Exosomen abgetrennt).
  • Gemäß unterschiedlicher Ausführungsformen werden verschiedene Verfahren zur Quantifizierung von RNA verwendet, einschließlich Northern-Blot-Analyse, RNase-Protection-Assay, PCR, RT-PCR, Real-Time-RT-PCR, anderen quantitativen PCR-Verfahren, RNA-Sequenzierung, Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation, Branched-DNA-Amplifikation, Massenspektrometrie, CHIP-Sequenzierung, DNA- oder RNA-Microarrayanalyse und/oder anderen Hybridisierungs-Microarrays. In manchen dieser Ausführungsformen oder alternativen Ausführungsformen wird amplifizierte DNA, nachdem sie hergestellt wurde, einer Sonde ausgesetzt, die komplementär zu einem Teil eines Biomarkers von Interesse ist.
  • In manchen Ausführungsformen wird ein computergestütztes Verfahren verwendet, um einen oder mehrere der Schritte abzuschließen. In manchen Ausführungsformen umfasst das computergestützte Verfahren das Aussetzen eines Reaktionsgemisches, das isolierte RNA und/oder präparierte cDNA, eine Polymerase und Gen-spezifische Primer umfasst, gegenüber einem Temperaturzyklus. In manchen Ausführungsformen wird der Temperaturzyklus durch einen Computer generiert, der konfiguriert ist, die Temperaturzeit und die Zyklusanzahl, denen das Reaktionsgemisch ausgesetzt ist, zu kontrollieren. In anderen Ausführungsformen kontrolliert der Computer für das Reaktionsgemisch nur die Zeit oder nur die Temperatur und eine oder mehrere zusätzliche Variablen werden vom Menschen kontrolliert. In manchen Ausführungsformen wird ein Computer verwendet, der konfiguriert ist, Daten aus dem Nachweisschritt zu empfangen und ein Programm auszuführen, das die Anzahl an Temperaturzyklen nachweist, die der Biomarker benötigt, um einen vorher festgelegten Amplifikationsschwellenwert zu erreichen, um zu identifizieren, ob ein Individuum an einer Nierenschädigung leidet oder eine Nierentransplantatabstoßung aufweist. In weiteren zusätzlichen Ausführungsformen ist das gesamte Untersuchungs- und Nachweisverfahren automatisiert.
  • Zum Beispiel wird RNA in manchen Ausführungsformen durch ein vollautomatisches Verfahren isoliert, z.B. durch Verfahren, die durch einen Computerprozessor und damit verbundenen automatisierten Maschinen kontrolliert werden. In einer Ausführungsform wird eine biologische Probe, wie beispielsweise eine Urinprobe, gewonnen und in ein Auffanggefäß geladen, das in eine Proben-Verarbeitungseinheit platziert wird. Ein Benutzer gibt Informationen in einen Dateneingabeempfänger ein, wobei solche Informationen die Probenidentität, die Probenquantität und/oder spezifische Patienteneigenschaften betreffen. In einigen Ausführungsformen verwendet der Benutzer eine graphische Benutzeroberfläche, um die Daten einzugeben. In anderen Ausführungsformen ist die Dateneingabe automatisiert (z.B. Eingabe durch Barcode, QR-Code oder andere graphische Identifizierungszeichen). Der Benutzer kann anschließend ein RNA-Isolierungsprotokoll ausführen, für das der Computer so konfiguriert ist, dass er Zugang zu einem Algorithmus hat und damit verbundene Funktionen zur Aufbereitung der Probe durchführen kann, um biologische Komponenten wie beispielsweise Vesikel zu isolieren und anschließend die Vesikel aufzubereiten, um RNA zu extrahieren. In weiteren Ausführungsformen kann das computergesteuerte Programm die Menge an isolierter RNA quantifizieren und/oder die Reinheit auswerten. Sollte in solchen Ausführungsformen die Menge und/oder Reinheit eine Mindestschwelle überschreiten, kann die RNA auf automatisierte Weise weiter aufbereitet werden, um komplementäre DNA (cDNA) herzustellen. Die cDNA kann dann unter Verwendung einschlägiger Verfahren wie beispielsweise der Bindung eines poly-A-RNA-Schwanzes an ein Oligo-dT-Molekül und anschließender Verlängerung unter Verwendung einer RNA-Polymerase hergestellt werden. Wenn in anderen Ausführungsformen die Menge und/oder die Reinheit keine Mindestschwelle überschreiten, kann das computergesteuerte Verfahren einen Benutzer dazu veranlassen, (eine) zusätzliche biologische Probe(n) bereitzustellen.
  • Abhängig von der Ausführungsform kann die cDNA in einzelne Teilproben unterteilt werden, von denen manche zur späteren Analyse aufbewahrt und manche sofort analysiert werden. Die Analyse umfasst in manchen Ausführungsformen das Mischen einer bekannten Menge der cDNA mit einem Salz-basierten Puffer, einer DNA-Polymerase und mindestens einem genspezifischen Primer, um ein Reaktionsgemisch herzustellen. Die cDNA kann anschließend unter Verwendung eines zuvor ausgewählten Temperaturzyklus-Programms amplifiziert werden, wobei das Computersystem für dessen Ausführung konfiguriert ist. Dieser Temperaturzyklus kann gegebenenfalls auch manuell gesteuert werden. Nach der Amplifikation (z.B. Real-Time-PCR) kann das Computersystem die Anzahl der Zyklen bewerten, die ein Gen von Interesse benötigt (z.B. Marker einer Nierenschädigung oder Nierentransplantatabstoßung), um einen bestimmten Expressionsschwellenwert zu überschreiten. Ein Prozessor zur Datenanalyse kann diese Bewertung anschließend verwenden, um die Menge des Gens von Interesse zu berechnen, die in der Originalprobe vorhanden ist, und durch Vergleich mit entweder einer anderen Patientenprobe, einer bekannten Kontrollprobe oder einer Kombination davon kann der Expressionsspiegel des Gens von Interesse berechnet werden. Ein Prozessor zur Datenausgabe kann diese Information entweder elektronisch in einem anderen zulässigen Format einem Testlabor und/oder direkt einem medizinischen Dienstleister zur Verfügung stellen. Beruhend auf dieser Bestimmung kann der medizinische Dienstleister anschließend entscheiden, ob und wie ein bestimmter Patient auf Grundlage der Bestimmung des Vorliegens einer Nierenschädigung oder Nierentransplantatabstoßung behandelt wird. In einigen Ausführungsformen werden die Expressionsdaten in Echtzeit generiert und gegebenenfalls dem medizinischen Dienstleister (oder anderem Empfänger) in Echtzeit übermittelt.
  • In einigen Ausführungsformen ermöglicht ein ganzheitlich oder teilweise automatisiertes Verfahren ein schnelleres Aufbereiten und eine schnellere Analyse der Probe als manuelle Testverfahren. In bestimmten Ausführungsformen können Maschinen oder Testvorrichtungen tragbar und/oder mobil sein, sodass ein Arzt oder ein Labortechniker den Testvorgang außerhalb eines üblichen Krankenhauses oder Labors abschließen kann. In manchen Ausführungsformen kann eine tragbare Assay-Vorrichtung mit einer tragbaren Vorrichtung kompatibel sein, die einen Computer umfasst, wie beispielsweise ein Handy oder einen Laptop, der verwendet werden kann, um die Assay-Parameter in die Assay-Vorrichtung einzugeben und/oder um die Rohergebnisse eines abgeschlossenen Tests von der Assay-Vorrichtung zur weiteren Verarbeitung zu erhalten. In manchen Ausführungsformen kann ein Patient oder ein anderer Benutzer in der Lage sein, eine Assay-Vorrichtung über eine Computerschnittstelle ohne die Unterstützung eines Labortechnikers oder Arztes zu verwenden. In diesen Fällen hätte der Patient die Option, den Test „zu Hause“ durchzuführen. In einigen dieser Ausführungsformen kann ein Computer mit spezialisierter Software oder Programmierung einen Patienten anleiten, eine Probe ordnungsgemäß in die Assay-Vorrichtung zu platzieren und Daten und Informationen betreffend die Probe in den Computer einzugeben, bevor die Tests nach Befehlseingabe durchgeführt werden. Nachdem alle Tests abgeschlossen sind, kann die Computersoftware die Testergebnisse auf Grundlage der aus der Assay-Vorrichtung erhaltenen Rohdaten automatisch berechnen. Der Computer kann zusätzliche Daten durch Verarbeitung der Ergebnisse berechnen und, in manchen Ausführungsformen, durch Vergleichen der Ergebnisse mit Kontrollinformationen aus einer gespeicherten Datenbibliothek oder anderen Quellen über das Internet oder anderen Mitteln, die dem Computer Zusatzinformationen liefern. Der Computer kann dem Patienten (und/oder dem medizinischen Dienstleiter, und/oder einem Testlabor) dann eine Datenausgabe beruhend auf diesen Ergebnissen anzeigen.
  • In manchen Ausführungsformen kann ein Mediziner zur Diagnose, Überwachung und/oder Behandlung eines Patienten Gentests benötigen. In einigen Ausführungsformen kann ein Mediziner somit einen Test anordnen und die Ergebnisse bei der Diagnose oder für den Behandlungsplan eines Patienten verwenden. Zum Beispiel kann ein Mediziner in manchen Ausführungsformen von einem Patienten eine Probe gewinnen oder den Patienten dazu veranlassen, anderweitig eine Probe (oder Proben) zur Untersuchung bereitzustellen. Der Mediziner kann die Probe dann an ein Labor oder an Dritte senden, die in der Lage sind, die Probe zu verarbeiten und zu untersuchen. Alternativ kann der Mediziner einen Teil oder die gesamte Verarbeitung/Untersuchung der Probe selbst durchführen (z.B. vor Ort). Die Untersuchung kann quantitative und/oder qualitative Informationen über die Probe bereitstellen, einschließlich Daten, die mit dem Vorliegen einer urothelialen Erkrankung in Zusammenhang stehen. Wenn diese Informationen erhalten wurden, können die Informationen in manchen Ausführungsformen mit Kontrollinformationen verglichen werden (z.B. mit einer Basispopulation oder normalen Population), um zu bestimmen, ob die Testergebnisse einen Unterschied zwischen der Probe des Patienten und der Kontrolle aufweisen. Nachdem die Informationen verglichen und analysiert wurden, werden sie an den Mediziner zur weiteren Analyse zurückgegeben. Alternativ können die aus den Untersuchungen erhaltenen Rohdaten an den Mediziner zurückgegeben werden, sodass der Mediziner oder anderes Krankenhauspersonal sämtliche geeigneten Vergleiche und Analysen durchführen kann. Auf Grundlage der Untersuchungsergebnisse und der Analyse des Mediziners kann der Mediziner entscheiden, wie der Patient zu behandeln oder zu diagnostizieren ist (oder gegebenenfalls von einer Behandlung absehen).
  • In einigen Ausführungsformen wird Filtration (alleine oder in Kombination mit der Zentrifugation) verwendet, um Vesikel verschiedener Größe aufzufangen. In manchen Ausführungsformen wird eine differentielle Gewinnung von Vesikeln auf Grundlage der Oberflächenexpression von Proteinmarkern durchgeführt. Zum Beispiel kann ein Filter so gestaltet sein, dass er mit einem bestimmten Oberflächenmarker (z.B. ein Filter, an den ein Antikörper gekoppelt ist) oder spezifischen Arten von Vesikeln oder mit Vesikeln verschiedenen Ursprungs reagiert. In einigen Ausführungsformen führt die Kombination aus Filtration und Zentrifugation zu einer höheren Ausbeute oder verbesserten Reinheit von Vesikeln.
  • In manchen Ausführungsformen sind die Marker einmalige Vesikelproteine oder Peptide. In manchen Ausführungsformen steht die Schwere einer bestimmten gynäkologischen Erkrankung oder Störung in Zusammenhang mit bestimmten Vesikel-Modifizierungen, die genutzt werden können, um die Isolierung bestimmter Vesikel zu ermöglichen. Die Modifizierung kann das Hinzufügen von Lipiden, Kohlehydraten oder anderen Molekülen wie acylierten, formylierten, lipoylierten, myristolyierten, palmitoylierten, alkylierten, methylierten, isoprenylierten, prenylierten, amidierten, glycosylierten, hydroxylierten, iodierten, adenylierten, phosphorylierten, sulfatierten und selenoylierten, ubiquitinierten Molekülen einschließen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. In manchen Ausführungsformen umfassen die Vesikel-Marker nicht-Proteine wie Lipide, Kohlehydrate, Nucleinsäuren, RNA, DNA, etc.
  • In einigen Ausführungsformen ermöglicht das spezifische Abfangen von Vesikeln auf Grundlage ihrer Oberflächenmarker auch ein „Dipstick“-Format, wobei jede unterschiedliche Vesikelart durch das Tauchen von Sonden, die mit unterschiedlichen Fängermolekülen (z.B. Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten) beschichtet sind, in eine Patientenprobe isoliert wird.
  • Freie extrazelluläre RNA wird von Nucleasen schnell abgebaut, was sie zu einem potentiell schlechten diagnostischen Marker macht. Wie oben beschrieben, ist manche extrazelluläre RNA mit Partikeln oder Vesikeln assoziiert, die in verschiedenen biologischen Proben wie Urin gefunden werden können. Diese Vesikel-assoziierte RNA, die mRNA umfasst, ist vor den Abbauprozessen geschützt. Mikrovesikel werden von den meisten Zelltypen freigesetzt und bestehen aus Plasmamembran-Fragmenten. Mikrovesikel enthalten RNA, mRNA, microRNA und Proteine und spiegeln die Zusammensetzung der Zelle, aus der sie freigesetzt wurden, wider. Exosome sind kleine Mikrovesikel, die von einer Vielzahl von Säugerzellen sezerniert werden und unter normalen und pathologischen Bedingungen sezerniert werden. Diese Vesikel enthalten bestimmte Proteine und RNA einschließlich mRNA und microRNA. Verschiedene Ausführungsformen bewerten unter anderem Nucleinsäuren wie small interfering RNA (siRNA), tRNA und small activating RNA (saRNA).
  • In einigen Ausführungsformen wird die RNA, die aus Vesikeln aus Urin eines Patienten isoliert wurde, als Matrize verwendet, um komplementäre DNA (cDNA) beispielsweise durch Verwendung einer Reversen Transkriptase herzustellen. In einigen Ausführungsformen wird cDNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. In anderen Ausführungsformen kann die Amplifikation von Nucleinsäuren und RNA auch durch ein beliebiges geeignetes Amplifikationsverfahren wie der Nucleinsäure-basierten Amplifikation (NASBA) oder der Primer-abhängigen kontinuierlichen Amplifikation von Nucleinsäuren oder der Ligasekettenreaktion erreicht werden. Es können auch andere Verfahren zur Quantifizierung der Nucleinsäuren verwendet werden wie beispielsweise einschließlich der Northern-Blot-Analyse, RNAse-Protection-Assay, RNA-Sequenzierung, RT-PCR, Real-Time-RT-PCR, Nucleinsäuresequenz-basierter Amplifikation, Branched-DNA-Amplifikation, ELISA, Massenspektrometrie, CHIP-Sequenzierung und DNA oder RNA-Microarrayanalyse.
  • In einigen Ausführungsformen wird mRNA durch ein Verfahren quantifiziert, das die cDNA-Synthese aus mRNA und die Amplifikation von cDNA unter Verwendung von PCR beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Multi-Well-Filterplatte mit einem Lysepuffer und einem Waschpuffer gewaschen. Ein cDNA-Synthesepuffer wird der Multi-Well-Filterplatte anschließend hinzugefügt. Die Multi-Well-Filterplatte kann zentrifugiert werden. PCR-Primer werden auf eine PCR-Platte gegeben, und die cDNA wird von der Multi-Well-Filterplatte auf die PCR-Platte übertragen. Die PCR-Platte wird zentrifugiert und Real-Time-PCR wird begonnen.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst die Anwendung spezifischer Antisense-Primer während der mRNA-Hybridisierung oder während der cDNA-Synthese. Es ist bevorzugt, dass die Primer während der mRNA-Hybridisierung hinzugefügt werden, sodass überschüssige Antisense-Primer vor der cDNA-Synthese entfernt werden können, um Übertragungseffekte zu vermeiden. Der Oligo(dT)-Primer und der spezifische Primer (NNNN) primen gleichzeitig die cDNA-Synthese an verschiedenen Orten auf der Poly-A-RNA. Die spezifischen Primer (NNNN) und Oligo(dT) verursachen die Bildung von während der Amplifikation. Selbst wenn die spezifische Primer-abgeleitete cDNA aus der GenePlate durch Erhitzen jedes Wells entfernt wird, ist die Menge an spezifischer cDNA, die durch das Hitzedenaturierungsverfahren erhalten wird (beispielsweise unter Verwendung der TaqMan quantitativen PCR), ähnlich zu der Menge, die aus einer nicht-erhitzten Negativkontrolle erhalten wird. Dadurch kann das Hitzedenaturierungsverfahren komplett umgangen werden. Des Weiteren können durch das Hinzufügen von mehreren Antisense-Primern für verschiedene Targets mehrere Gene von dem Aliquot der amplifiziert werden und Oligo(dT)-abgeleitete cDNA in der GenePlate kann zur künftigen Verwendung gelagert werden.
  • Eine weitere alternative Ausführungsform umfasst eine Vorrichtung zur Hochdurchsatz-Quantifizierung von mRNA aus Urin (oder anderen Flüssigkeiten). Die Vorrichtung umfasst eine Multi-Well-Filterplatte, die enthält: mehrere Wells zur Probenaufnahme, einen Filter zum Gewinnen von Exosomen (oder einen Filter, der auf eine andere biologische Komponente von Interesse gerichtet ist) unter den Wells zur Probenaufnahme und einen Auffangbereich für mRNA unter dem Filter, der immobilisierte Oligo(dT) in den Wells des Auffangbereichs für mRNA enthält. Um die Effizienz der Gewinnung von Exosomen zu erhöhen, können verschiedene Filtrationsmembranen übereinandergeschichtet werden.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst die Amplifikation das Durchführen einer Real-Time quantitativen PCR (TaqMan) mit Exosom-abgeleiteter RNA und Kontroll-RNA. In manchen Ausführungsformen wird ein Taqman-Assay durchgeführt. Die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase wird in einem Nachweissystem für Polymerase-Kettenreaktionsprodukte verwendet, um ein spezifisches nachweisbares Signal gleichzeitig mit der Amplifikation zu erzeugen. Eine Oligonucleotid-Sonde, die am 3'-Ende nicht verlängerbar ist, am 5'-Ende markiert ist und so konstruiert ist, dass sie innerhalb der Zielsequenz hybridisiert, wird in den Polymerase-Kettenreaktionsassay eingeführt. Das Anlagern der Sonde an einen der Stränge des Polymerase-Kettenreaktionsprodukts während der Amplifikation erzeugt ein Substrat, das für die Exonuclease-Aktivität geeignet ist. Während der Amplifikation baut die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase die Sonde in kleinere Fragmente ab, die von einer nicht-abgebauten Sonde unterschieden werden können. In zusätzlichen Ausführungsformen umfasst das Verfahren: (a) Bereitstellen für einen PCR-Assay, der eine Probe enthält, mindestens eines markierten Oligonucleotids, das eine Sequenz enthält, die zu einer Region der Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei das markierte Oligonucleotid innerhalb der Zielnucleinsäuresequenz anlagert, die durch die Oligonucleotid-Primer aus Schritt (b) gebunden wird; (b) Bereitstellen eines Oligonucleotid-Primersets, wobei ein erster Primer eine Sequenz enthält, die zu einer Region in einem Strang der Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist und als Primer für die Synthese eines komplementären DNA-Stranges dient, und ein zweiter Primer eine Sequenz enthält, die zu einer Region in einem zweiten Strang der Zielnucleinsäuresequenz komplementär ist und als Primer für die Synthese eines komplementären DNA-Stranges dient; und wobei jeder Oligonucleotidprimer ausgewählt ist, um sich an seine komplementäre Matrize stromaufwärts eines beliebigen markierten Oligonucleotids, das an denselben Nucleinsäurestrang angelagert ist, anzulagern; (c) Amplifizieren der Zielnucleinsäuresequenz unter Verwendung einer Nucleinsäurepolymerase, die 5'-3'-Nucleaseaktivität aufweist, als Matrizen-abhängiges polymerisierendes Agens unter Bedingungen, die die folgenden PCR-Zyklus-Schritte ermöglichen: (i) Anlagern von Primern und markiertem Oligonucleotid an eine Matrizen-Nucleinsäuresequenz, die innerhalb der Zielregion enthalten ist, und (ii) Extension des Primers, wobei die Nucleinsäurepolymerase ein Primerextensionsprodukt synthetisiert, wobei die 5'-3'-Nuclease-Aktivität der Nucleinsäurepolymerase gleichzeitig markierte Fragmente aus den angelagerten Duplexen freisetzt, die ein markiertes Oligonucleotid und seine komplementären Matrizen-Nucleinsäuresequenzen umfasst, wodurch nachweisbare markierte Fragmente erzeugt werden; und (d) Nachweisen und/oder Messen der Freisetzung markierter Fragmente, um das Vorliegen oder die Abwesenheit der Zielsequenz in der Probe zu bestimmen.
  • In zusätzlichen Ausführungsformen wird ein Taqman-Assay verwendet, der eine Reaktion bereitstellt, die zur Spaltung einzelsträngiger Oligonucleotid-Sonden führt, die mit einem lichtemittierenden Marker markiert sind, wobei die Reaktion in Anwesenheit einer DNA-bindenden Verbindung, die mit dem Marker wechselwirkt, um die Lichtemission des Markers zu modifizieren, durchgeführt wird. Das Verfahren verwendet die Veränderung der Lichtemission der markierten Sonde, die sich aus dem Abbau der Sonde ergibt. Die Verfahren sind im Allgemeinen auf Assays anwendbar, die eine Reaktion verwenden, die zu einer Spaltung von Oligonucleotid-Sonden führt, und insbesondere auf homogene Amplifizierungs-/Nachweis-Assays, in denen die hybridisierte Sonde gleichzeitig mit der Primerextension gespalten wird. Ein homogener Amplifikations-/Nachweis-Assay wird bereitgestellt, der den gleichzeitigen Nachweis des angereicherten amplifizierten Targets und den Sequenz-spezifischen Nachweis der Zielsequenz ermöglicht.
  • In zusätzlichen Ausführungsformen können auch Real-Time-PCR-Formate verwendet werden. Ein Format verwendet einen interkalierenden Farbstoff, wie SYBR Grün. Dieser Farbstoff stellt ein starkes Fluoreszenzsignal für die Bindung doppelsträngiger DNA bereit; dieses Signal ermöglicht die Quantifizierung der amplifizierten DNA. Obwohl dieses Format das sequenzspezifische Überwachen der Amplifikation nicht zulässt, ermöglicht es die direkte Quantifizierung amplifizierter DNA ohne jegliche markierte Sonden. Weitere Fluoreszenzfarbstoffe dieser Art, die ebenfalls verwendet werden können, sind SYBR Gold, YO-PRO-Farbstoffe und Yo Yo-Farbstoffe.
  • Ein anderes Real-Time-PCR-Format, das angewandt werden kann, verwendet Reportersonden, die an Amplicons hybridisieren, um ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Entweder trennen die Hybridisierungsvorgänge die Reporter- und Quenchergruppen auf den Sonden oder bringen sie näher zueinander. Die Sonden selbst werden nicht abgebaut und das Reporter-Fluoreszenzsignal selbst wird nicht in der Reaktion angereichert. Die Anreicherung von Produkten während der PCR wird durch einen Anstieg des Reporter-Fluoreszenzsignals während der Hybridisierung der Sonden an die Amplicons beobachtet. Formate in dieser Kategorie umfassen molekulare Beacons, Doppel-HybProbes, Sunrise oder Amplifuor und Scorpion Real-Time-PCR-Assays.
  • Ein weiteres Real-Time-PCR-Format, das ebenfalls angewandt werden kann, ist das sogenannte „Policeman“-System. In diesem System umfasst der Primer eine Fluoreszenz-Gruppe wie beispielsweise FAM und eine Quencher-Gruppe, die in der Lage ist, die Fluoreszenz auf der Fluoreszenz-Gruppe zu unterdrücken, wie beispielsweise TAMRA, die an mindestens eine Nucleotidbase am 3'-Ende des Primers kovalent gebunden ist. Am 3'-Ende weist der Primer mindestens eine nicht übereinstimmende Base auf und komplementiert daher die Nucleinsäureprobe an dieser Base oder an diesen Basen nicht. Die Matrizen-Nucleinsäuresequenz wird durch PCR mit einer Polymerase amplifiziert, die 3'-5'-Exonuclease-Aktivität aufweist, wie beispielsweise das Pfu-Enzym, um ein PCR-Produkt herzustellen. Die nicht übereinstimmende(n) Base(n), die an die Quencher-Gruppe gebunden ist/sind, werden von dem 3'-Ende des PCR-Produkts durch die 3'-5'-Exonuclease-Aktivität abgespalten. Die Fluoreszenz, die entsteht, wenn die nicht übereinstimmende Base mit der kovalent gebundenen Quencher-Gruppe von der Polymerase abgespalten wird und somit die unterdrückende Wirkung auf die Fluoreszenz-Gruppe entfernt, wird zu mindestens einem Zeitpunkt während der PCR nachgewiesen und/oder quantifiziert. Fluoreszenz über dem Hintergrund weist auf das Vorliegen der synthetisierten Nucleinsäureprobe hin.
  • Eine weitere alternative Ausführungsform beinhaltet ein vollautomatisches System zur Durchführung von Hochdurchsatzquantifizierung von mRNA in einer biologischen Flüssigkeit wie beispielsweise Urin, umfassend: Roboter zum Aufbringen von Urinproben, hypotonem Puffer und Lyse-Puffer auf die Vorrichtung; einen automatisierten Vakuumansauger und eine Zentrifuge und automatisierte PCR-Maschinen.
  • Das offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Nierenerkrankung oder eines Nierenleidens nach Transplantation kann auch andere als die oben beschriebenen Verfahren der mRNA-Messung verwenden. Andere Verfahren, die angewendet werden können, umfassen zum Beispiel Northern-Blot-Analyse, Rnase-Protection-Assay, Lösung-Hybridisierungsverfahren, Semiquantitative RT-PCR und in situ-Hybridisierung.
  • Um die Menge an mRNA genau zu quantifizieren, wird die Quantifizierung in manchen Ausführungsformen durch Vergleichen der Menge an mRNA, die einen Marker einer Erkrankung oder eines Leidens codiert, mit einem Referenzwert berechnet. In manchen Ausführungsformen wird der Referenzwert die Menge an mRNA sein, die in gesunden nicht erkrankten Patienten nachgewiesen wurde. In anderen Ausführungsformen ist der Referenzwert der Expressionsspiegel eines Housekeeping-Gens. In bestimmten solcher Ausführungsformen wird Beta-Actin oder ein anderes passendes Housekeeping-Gen als Referenzwert verwendet. Zahlreiche andere Housekeeping-Gene, die im Stand der Technik etabliert sind, können ebenfalls als Referenzwert verwendet werden. In anderen Ausführungsformen wird ein Housekeeping-Gen als Korrekturfaktor verwendet, sodass der finale Vergleich der Expressionsspiegel eines Markers eines erkrankten Patienten im Vergleich zu demselben Marker einer nicht erkrankten (Kontroll-)Probe ist. In einigen Ausführungsformen ist das Housekeeping-Gen ein gewebespezifisches Gen oder ein gewebespezifischer Marker, wie die oben beschriebenen. In weiteren anderen Ausführungsformen ist der Referenzwert Null, sodass die Quantifizierung der Marker von einer absoluten Zahl dargestellt wird. In einigen Ausführungsformen wird ein Verhältnis, das die Expression von einem oder mehreren Markern eines erkrankten Patienten mit einem oder mehreren anderen Markern einer nicht erkrankten Person vergleicht, aufgestellt. In einigen Ausführungsformen wird der Vergleich zum Referenzwert in Echtzeit durchgeführt, sodass es möglich ist, einen Entschluss bezüglich der Probe zu einem frühen Zeitpunkt in der Expressionsanalyse zu treffen. Wenn eine Probe beispielsweise in Echtzeit aufbereitet und mit einem Referenzwert verglichen wird, kann bestimmt werden, dass die Expression des Markers den Referenzwert nach nur wenigen Amplifikationszyklen übersteigt und daher keine vollständige Analyse benötigt. In einigen Ausführungsformen ist dieser frühe Vergleich besonders wertvoll, zum Beispiel, wenn eine sofortige Diagnose und ein Behandlungsplan benötigt werden (z.B. um stark geschädigte oder nicht funktionierende Nieren vor einem Nierenversagen oder einer Transplantatabstoßung zu behandeln).
  • In alternativen Ausführungsformen ergibt sich die Fähigkeit, den Gesamtwirkungsgrad einer vorliegenden Probe durch Verwendung bekannter Mengen an gespikter Standard-RNA zu bestimmen, aus Ausführungsformen, die Dosis-unabhängig und Sequenz-unabhängig sind. Die Verwendung bekannter Mengen an Kontroll-RNA ermöglicht es, dass PCR-Messungen in die Menge an Ziel-mRNAs in den ursprünglichen Proben umgewandelt werden.
  • In manchen Ausführungsformen wird ein Kit zum Extrahieren von Ziel-Komponenten (z.B. EMV) aus der Flüssigkeitsprobe wie Urin bereitgestellt. In manchen Ausführungsformen umfasst ein Kit eine Auffang-Vorrichtung und zusätzliche Elemente, die nützlich sind, um die hierin offenbarten Verfahren durchzuführen. In manchen Ausführungsformen umfasst ein Kit ein oder mehrere Reagenzien, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Lyse-Puffern, chaotropen Reagenzien, Waschpuffern, Alkohol, Detergens oder Kombinationen davon. In manchen Ausführungsformen werden Kit-Reagenzien einzeln oder in Lagerbehältern bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen werden Kit-Reagenzien gebrauchsfertig bereitgestellt. In manchen Ausführungsformen werden Kit-Reagenzien in Form von Stammlösungen bereitgestellt, die vor der Verwendung verdünnt werden. In manchen Ausführungsformen umfasst ein Kit Plastikteile (gegebenenfalls sterilisiert oder sterilisierbar), die nützlich sind, um hierin offenbarte Verfahren durchzuführen. In manchen Ausführungsformen umfasst ein Kit Plastikteile, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gestellen, Zentrifugenröhrchen, Vakuumsammelleitungen und Multi-Well-Platten. Eine Gebrauchsanleitung wird ebenfalls in einigen Ausführungsformen bereitgestellt.
  • In einigen Ausführungsformen sind die hierin beschriebenen Analysen auf humane Patienten anwendbar, während die Verfahren in manchen Verfahren auf Tiere anwendbar sind (z.B. tiermedizinische Diagnosen).
  • In einigen Ausführungsformen induziert das Vorliegen eines Nierenleidens oder einer Nierenerkrankung nach einer Transplantation die veränderte Expression eines oder mehrerer Marker. In einigen Ausführungsformen wird die erhöhte oder verringerte Expression durch die Menge an mRNA gemessen, die die Marker codiert (in anderen Ausführungsformen werden DNA oder Proteine verwendet, um Expressionsspiegel zu messen). In manchen Ausführungsformen wird Urin von einem Patienten gewonnen und umgehend untersucht. In manchen Ausführungsformen werden Vesikel zum Beispiel durch Verwendung von Filtration oder Zentrifugation konzentriert. Die isolierten Vesikel werden dann mit einem Lyse-Puffer inkubiert, um die RNA aus den Vesikeln freizusetzen, wobei die RNA dann als eine Matrize für cDNA dient, die mit Verfahren wie der quantitativen PCR (oder anderen geeigneten Amplifikations- oder Quantifizierungsverfahren) quantifiziert wird. In einigen Ausführungsformen wird der Spiegel der spezifischen Marker-RNA aus Vesikeln der Patienten mit einer gewünschten Kontrolle wie beispielsweise RNA-Spiegeln einer gesunden Patientenpopulation oder dem RNA-Spiegel eines früheren Zeitpunkts desselben Patienten oder einem Kontrollgen desselben Patienten verglichen.
  • Durchführungsmechanismen
  • Gemäß mancher Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Verfahren durch ein oder mehrere Spezial-Datenverarbeitungsgeräte durchgeführt werden. Die Spezial-Datenverarbeitungsgeräte können festverdrahtet sein, um die Verfahren durchzuführen oder können digitale elektronische Geräte umfassen, wie eine oder mehrere anwendungsspezifische integrierte Schaltung(en) (applicationspecific intergrated circuits; ASICs) oder Universalschaltkreise (field programmable gate arrays; FPGAs), die persistent programmiert sind, um die Verfahren durchzuführen, oder können einen oder mehrere Universal-Hardwarprozessoren umfassen, die programmiert sind, die Verfahren nach Programmbefehlen in Firmware, Speicher, anderen Speichern oder einer Kombination davon durchzuführen. Derartige Spezial- Datenverarbeitungsgeräte können benutzerdefinierte festverdrahtete Logik, ASICs oder FPGAs mit einer benutzerdefinierte Programmierung verknüpfen, um die Verfahren durchzuführen. Die Spezial-Datenverarbeitungsgeräte können Desktop-Computersysteme Server-Computersysteme, tragbare Computersysteme, Handgeräte, Netzwerkgeräte oder ein beliebiges Gerät oder eine Kombination aus Geräten sein, die festverdrahtete und/oder programmierbare Logik zur Durchführung der Verfahren eingebaut haben.
  • (Ein) Datenverarbeitungsgerät(e) wird/werden im Allgemeinen durch Betriebssystemsoftware gesteuert und koordiniert, wie beispielsweise iOS, Android, Chrome OS, Windows XP, Windows Vista, Windows 7, Windows 8, Windows Server, Windows CE, Unix, Linux, SunOS, Solaris, iOS, Blackberry OS, VxWorks oder anderen kompatiblen Betriebssystemen. In anderen Ausführungsformen kann das Computergerät von einem proprietären Betriebssystem gesteuert werden. Unter anderem steuern konventionelle Betriebssysteme die Ausführung von Computerprozessen und legen diese fest, führen Speicherverwaltung aus, stellen ein Dateisystem, Networking und I/O-Services bereit und bieten eine Benutzeroberfläche mit Funktionen, wie beispielsweise eine graphische Benutzeroberfläche (graphical user interface; „GUI“).
  • In manchen Ausführungsformen umfasst das Computersystem einen Bus oder einen anderen Kommunikationsmechanismus zum Übermitteln von Informationen, sowie einen Hardwareprozessor oder multiple Prozessoren, die mit dem Bus zur Informationsverarbeitung verbunden sind. (Ein) Hardwareprozessor(en) kann/können zum Beispiel ein oder mehrere Universal-Mikroprozessoren sein.
  • In manchen Ausführungsformen kann das Computersystem auch einen Hauptspeicher wie einen Arbeitsspeicher (random access memory; RAM), Cachespeicher und/oder andere dynamischen Speicher umfassen, die mit einem Bus zum Speichern von Informationen und zum Ausführen von Befehlen durch einen Prozessor verbunden sind. Der Hauptspeicher kann auch zum Speichern von temporären Variablen oder anderen Zwischeninformationen während der Ausführung von durch den Prozessor auszuführenden Befehlen verwendet werden. Wenn solche Befehle in dem Prozessor zugänglichen Speichermedien gespeichert sind, wird das Computersystem durch sie zu einer Spezial-Maschine, die angepasst ist, um die in den Befehlen spezifizierten Vorgänge auszuführen.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst das Computersystem des Weiteren einen Festwertspeicher (read only memory; ROM) oder andere statische Speichergeräte, die mit dem Bus zum Speichern statischer Informationen und Befehle für den Prozessor verbunden sind. Ein Speichergerät wie beispielsweise eine Magnetdiskette, eine optische Speicherplatte oder ein USB-Stick (Flash-Laufwerk), etc. kann bereitgestellt und mit dem Bus zum Speichern von Informationen und Befehlen verbunden werden.
  • In manchen Ausführungsformen kann das Computersystem über einen Bus mit einem Display wie beispielsweise einer Kathodenstrahlröhre (cathode ray tube; CRT) oder einem LCD-Display (oder Touchscreen) zum Anzeigen von Informationen für einen Computerbenutzer verbunden sein. Eine Eingabevorrichtung umfassend die alphanumerische Tastatur und andere, ist mit dem Bus zur Übertragung von Informationen und Befehlsauswahlen an den Prozessor verbunden. Eine andere Art von Eingabevorrichtung für Benutzer ist die Cursorsteuerung, wie eine Maus, einen Trackball oder Richtungstasten zur Übertragung von Richtungsinformationen und Befehlsauswahlen an den Prozessor und zum Steuern der Cursorbewegungen auf dem Display. Diese Eingabevorrichtung hat typischerweise zwei Freiheitsgrade in zwei Achsen, einer ersten Achse (z.B. x) und einer zweiten Achse (z.B. y), die der Vorrichtung ermöglichen, Positionen auf einer Ebene zu spezifizieren. In manchen Ausführungsformen können dieselben Richtungsinformationen und Befehlsauswahlen wie durch die Cursorsteuerung auch durch das Empfangen von Berührungen über einen Touchscreen ohne Cursor ausgeführt werden.
  • In manchen Ausführungsformen kann das Computersystem ein Benutzeroberflächenmodul umfassen, um eine GUI auszuführen, die in einer Massenspeichervorrichtung als ausführbare Softwarecodes gespeichert sein kann, die von dem/den Computergerät(en) ausgeführt werden. Dieses und andere Module können zum Beispiel Komponenten wie Softwarekomponenten, objektorientierte Softwarekomponenten, Klassenkomponenten und Taskkomponenten, Prozesse, Funktionen, Attribute, Prozeduren, Subroutinen, Programmcodesegmente, Treiber, Firmware, Microcode, Schaltkreise, Daten, Datenbanken, Datenstrukturen, Tabellen, Anordnungen und Variablen umfassen.
  • Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff „Modul“ wie hierin beschrieben auf Logik, die in Hardware oder Firmware enthalten ist, oder auf eine Sammlung an Softwarebefehlen, die möglicherweise Eintritts- und Austrittspunkte hat und in einer Programmiersprache wie beispielsweise Java, Lua, C oder C++ geschrieben ist. Ein Softwaremodul kann kompiliert und in ein ausführbares Programm eingebunden werden, in einer dynamischen Programmbibliothek installiert werden oder in einer interpretierten Programmiersprache wie zum Beispiel BASIC, Perl oder Python geschrieben werden. Es wird darauf hingewiesen, dass Softwaremodule von anderen Modulen oder von sich aus aufrufbar sind und als Reaktion auf erkannte Ereignisse oder Unterbrechungen aufgerufen werden können. Softwaremodule, die zur Ausführung auf Computern konfiguriert sind, können auf einem computerlesbaren Medium, wie einer CD, einer DVD, einem USB-Stick, Magnetdiskette oder jedem anderen materiellen Träger, oder als digitaler Download bereitgestellt werden (und können ursprünglich in einem komprimierten oder installierbaren Format gespeichert werden, das vor Ausführung installiert, dekomprimiert oder entschlüsselt werden muss). Ein solcher Softwarecode kann teilweise oder ganz auf einem Speichermedium des ausführenden Computergeräts zur Ausführung durch das Computergerät gespeichert werden. Softwarebefehle können in Firmware wie einem EPROM enthalten sein. Es wird des Weiteren darauf hingewiesen, dass Hardwaremodule aus verbundenen Logik-Einheiten wie beispielsweise Gates und Flipflops bestehen, und/oder aus programmierbaren Einheiten wie programmierbaren Gate-Arrays oder Prozessoren bestehen. Die hierin beschriebenen Module oder Funktionalität des Computergeräts werden bevorzugt als Softwaremodule ausgeführt, können aber auch in Hardware oder Firmware enthalten sein. Im Allgemeinen beziehen sich die hierin beschriebenen Module auf Logikmodule, die mit anderen Modulen kombiniert oder trotz ihres physischen Aufbaus oder ihrer physischen Speicherung in Untermodule unterteilt werden können.
  • In manchen Ausführungsformen kann ein Computersystem die hierin beschriebenen Verfahren unter Verwendung von maßgeschneiderter festverdrahteter Logik, einer oder mehrerer ASICs oder FPGAs, Firmware und/oder Programm-Logik ausführen, die in Kombination mit dem Computersystem dazu führt oder das Computersystem so programmiert, dass es zu einem Spezialgerät wird. Gemäß einer Ausführungsform werden die hierin beschriebenen Verfahren von dem Computersystem als Reaktion auf das Ausführen durch (einen) Hardwareprozessor(en) von einer oder mehreren Befehlsfolgen von einem oder mehreren Befehlen, die in dem Hauptspeicher enthalten sind, durchgeführt. Solche Befehle können von einem anderen Speichermedium wie einem Speichergerät in den Hauptspeicher eingelesen werden. Die Ausführung der Befehlsfolgen, die in dem Hauptspeicher enthalten sind, führt dazu, dass (ein) Prozessor(en) die hierin beschriebenen Verfahrensschritte durchführt/durchführen. In alternativen Ausführungsformen können festverdrahtete Schaltkreise anstelle von oder in Kombination mit Softwarebefehlen verwendet werden.
  • Der Begriff „nichttransitorisches Medium“ und ähnliche wie hierin verwendete Begriffe beziehen sich auf beliebige Medien, die Daten und/oder Befehle speichern, die ein Gerät dazu veranlassen, auf eine bestimmte Art zu arbeiten. Solche nichttransitorischen Medien können nichtflüchtige Medien und/oder flüchtige Medien umfassen. Nichtflüchtige Medien umfassen zum Beispiel optische Disketten oder Magnetdisketten oder andere Arten von Speichergeräten. Flüchtige Medien umfassen dynamische Speicher wie einen Hauptspeicher. Gebräuchliche Formen nichttransitorischer Medien umfassen zum Beispiel eine Diskette, eine Floppy-Disk, eine Festplatte, einen Solid-State-Drive, ein Magnetband oder ein beliebiges anderes Magnetdaten-Speichermedium, eine CD-ROM, ein beliebiges anderes optisches Datenspeichermedium, beliebige physikalische Medien mit Lochmustern, einen RAM, einen PROM und EPROM, einen FLASH-EPROM, NVRAM, einen beliebigen anderen Speicherchip oder Speicherkarte und vernetzte Versionen derselben.
  • Nichttransitorische Medien unterscheiden sich von den Übertragungsmedien, können jedoch in Verbindung mit ihnen verwendet werden. Übertragungsmedien sind an der Übertragung von Informationen zwischen nichttransitorischen Medien beteiligt. Übertragungsmedien umfassen zum Beispiel Koaxialkabel, Kupferdrähte und Glasfaserkabel, einschließlich der Kabel, die einen Bus umfassen. Übertragungsmedien können auch die Form von Akustik- oder Lichtwellen annehmen, wie die, die während Radiowellen- und Infrarotdatenübertragungen erzeugt werden.
  • Verschiedene Medienformen können daran beteiligt sein, ein oder mehrere Befehlsfolgen von ein oder mehreren Befehlen an einen Prozessor zur Ausführung zu übertragen. Die Befehle können zum Beispiel zuerst auf eine Magnetdiskette oder einen Solid-State-Drive eines Remotecomputers übertragen werden. Der Remotecomputer kann die Befehle in seinen dynamischen Speicher laden und die Befehle über eine Telefonleitung unter Verwendung eines Modems oder einer anderen Netzwerkschnittstelle, wie einer WAN- oder LAN-Schnittstelle, senden. Ein Modem, das mit dem Computersystem verknüpft ist, kann die Daten in der Telefonleitung empfangen und einen Infrarotsender verwenden, um die Daten in ein Infrarotsignal zu konvertieren. Ein Infrarotdetektor kann die in dem Infrarotsignal beförderten Daten erhalten und geeignete Schaltkreise können die Daten auf einen Bus übertragen. Der Bus überträgt die Daten auf den Hauptspeicher, von wo aus der Prozessor die Befehle abruft und ausführt. Die von dem Hauptspeicher erhaltenen Befehle können die Befehle abrufen und ausführen. Die von dem Hauptspeicher erhaltenen Befehle können entweder vor oder nach Ausführung durch den Prozessor gegebenenfalls auf einem Speichergerät gespeichert werden.
  • In manchen Ausführungsformen kann das Computersystem auch eine mit einem Bus verbundene Kommunikationsschnittstelle umfassen. Die Kommunikationsschnittstelle kann eine bidirektionale Datenkommunikationskopplung an eine Netzwerkverbindung bereitstellen, die mit einem lokalen Netzwerk verbunden ist. Eine Kommunikationsschnittstelle kann zum Beispiel eine Karte eines integrierten Sprach- und Datennetzes (integrated services digital network; ISDN), ein Kabelmodem, ein Satellitenmodem oder ein Modem zur Bereitstellung einer Datenübertragungsverbindung mit einer entsprechenden Art der Telefonleitung sein. Als weiteres Beispiel kann eine Kommunikationsschnittstelle eine Netzwerkkarte eines lokalen Netzes (local area network; LAN) sein, um eine Datenübertragungsverbindung zu einem kompatiblen LAN bereitzustellen (oder eine WAN-Komponente, um mit einem WAN zu kommunizieren). Kabellose Verbindungen können ebenso hergestellt werden. In allen solchen Ausführungen sendet und empfängt eine Kommunikationsschnittstelle elektrische, elektromagnetische oder optische Signale, die digitale Datenströme übertragen, die verschiedene Arten von Informationen darstellen.
  • Üblicherweise kann eine Netzwerkverbindung eine Datenübertragung über ein oder mehrere Netzwerke auf andere Datenträger bereitstellen. Eine Netzwerkverbindung kann zum Beispiel eine Verbindung über ein lokales Netzwerk zu einem zentralen Rechner oder zu Datenvorrichtungen herstellen, die von einem Internetanbieter (Internet Service Provider; ISP) betrieben werden. Der ISP stellt wiederum Datenübertragungsdienste über das weltweite Datenübertragungsnetzwerk, das nun üblicherweise als das „Internet“ bezeichnet wird, bereit. Sowohl das lokale Netzwerk als auch das Internet verwenden elektrische, elektromagnetische oder optische Signale, die digitale Datenströme übertragen. Die Signale über die verschiedenen Netzwerke und die Signale über die Netzwerkverbindung und eine Kommunikationsschnittstelle, die die digitalen Daten zu und aus dem Computersystem übertragen, sind Beispiele von Übertragungsmedien.
  • In manchen Ausführungsformen kann das Computersystem Nachrichten senden und Daten, einschließlich des Programmcodes, über das/die Netzwerk(e), die Netzwerkverbindung und die Kommunikationsschnittstelle empfangen. Im Beispiel des Internets kann ein Server einen für ein Anwendungsprogramm benötigten Code über das Internet, den ISP, das lokale Netzwerk und die Kommunikationsschnittstelle übertragen.
  • Der erhaltene Code kann von einem Prozessor wie empfangen ausgeführt werden und/oder in einem Speichergerät oder anderem nichtflüchtigen Speicher zur späteren Ausführung gespeichert werden.
  • Der erhaltene Code kann von einem Prozessor wie empfangen ausgeführt werden und/oder in einem Speichergerät oder anderem nichtflüchtigen Speicher zur späteren Ausführung gespeichert werden.
  • BEISPIELE
  • Bestimmte Ausführungsformen werden in Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die als veranschaulichend und nicht als einschränkend betrachtet werden sollten.
  • Patienten und Proben
  • Diese Studie wurde von der Ethikkommission im Sapporo City General Hospital geprüft und genehmigt. Patienten mit einem Nierentransplantat (N=205) wurden aus den Patienten rekrutiert, die sich in unserer Einrichtung einer Nierentransplantation unterzogen haben. Während des Krankenhausaufenthalts und der postoperativen Nachuntersuchung wurden bis zu 15 ml Spontanurinproben (N=437) mit Einwilligungserklärung gewonnen. Die Urinproben wurden bei Raumtemperatur bis zu 3 Stunden und bei -80°C bis zur Analyse gelagert. Komplikationen nach einer Transplantation wurden auf der Grundlage von eGFR, Urin-Protein und Nierenbiopsie gemäß den Banff-Kriterien 2011 diagnostiziert (Ergänzende Tabelle 1).
  • Urin-EMV-mRNA-Analyse
  • Ein EMV-mRNA-Assay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Gefrorene Urinproben wurden in einem 37°C Wasserbad getaut und bei 800 × g 15 Minuten lang zentrifugiert, um große Partikel wie Urinzellen und Harnzylinder zu entfernen. Zehn ml Überstand umfassend EMV wurden mittels Exosome Isolation Tube (Hitachi Chemical Diagnostics, Inc. (HCD)) aufbereitet, worauf die EMV-Lyse, mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese unter Verwendung einer Oligo(dT)-immobilisierten Mikroplatte (HCD) folgte. Vierundsechzig mRNAs wurden durch Real-Time-PCR unter Verwendung des ViiA7 Real-Time PCR Systems (Life Technologies) quantifiziert. Diese Biomarkerkandidaten wurden aus denen ausgewählt, die bei Nierenabstoßungen und den entsprechenden Expressionsspiegeln in Urin-EMV eines gesunden Individuums differentiell exprimiert wurden (unveröffentlichte RNA-seq-Daten). Als Referenzgene wurden GAPDH und ACTB analysiert. Von diesen wurde ANXA1 in dieser Studie ausgewählt. Die Primersequenzen für ANXA1, GAPDH und ACTB sind in Tabelle 4 unten verfügbar. Der Expressionsspiegel von ANXA1 wurde mit dem Spiegel von GAPDH unter Verwendung des Delta-Ct-Verfahrens mit einem Cut-Off-Wert von 6 normalisiert. In dem Delta-Ct-Verfahren wird der ANXA1-Zyklus-Schwellenwert (Ct)-Wert einer Probe von dem Ct-Wert eines Housekeeping-Gens (z.B. ACTB, GAPDH) für dieselbe Probe subtrahiert. Je niedriger der Delta-Ct-Wert, desto höher ist somit die ANXA1-Genexpression. Wie in 3 gezeigt, lag der Delta-Ct-Wert bei stabilen Patienten in Genesung zwischen 5 und 6, während der Delta-Ct-Wert bei ABMR-Patienten bei etwa 2 lag. Dies deutet darauf hin, dass sich der Delta-Ct-Wert bei ABMR-Patienten zwischen 3 und 4 verringerte, was der ungefähr 14-fachen Erhöhung entspricht, die oben berichtet wurde. Die statistische Signifikanz wurde durch den Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bei einem p-Wert bestimmt, der weniger als 1% oder 5% betrug. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung von R (R Foundation, Version 3.2.0) durchgeführt und die AUC-Berechnung wurde mit dem „ROCR“-Package durchgeführt. Die für die PCR-Analyse verwendeten Sense- und Antisense-Primer sind unten in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4. In der quantitativen Real-Time-PCR-Analyse verwendete Primersequenzen
    Gen Sense-Primer Anti-Sense-Primer
    Annexin A1 (ΛNXΛ1) AAAGGTGGTCCCGGATCAG TTATGCAAGGCAGCGACATC
    Glyceraldehyd-3-phospat dehydrogenase (GAPDH), CCCACTCCTCCACCTTTGAC CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA
    Actin, Beta (ACTB) TTTTTCCTGGCACCCAGCACAAT TTTTTGCCGATCCACACGGAGTACT
  • Analyse des Schadensindex für chronische Transplantatschädigung (Chronic Allograft Damage Index; CADI)
  • Extrazelluläre Vesikel-mRNA-Marker aus Urin zur Überwachung des Transplantats nach einer Transplantation wurden unter Verwendung des Schadensindex für chronische Transplantatschädigung untersucht, wie unten näher beschrieben wird. Der Schadensindex für chronische Transplantatschädigung (Chronic Allograft Damage Index; CADI) wurde Anfang der 90er Jahre eingeführt, um die Nierenbiopsie numerisch zu kategorisieren. Der CADI ist ein Summenwert aus sechs Banff-Werten, die vaskuläre Intima-Sklerose (cv), tubuläre Atrophie (ct), interstitielle Fibrose (ci), interstitielle Inflammation (i), Erhöhung der mesangialen Matrix (mm) und Glomerusklerose (g) umfassen. Es wurde gezeigt, dass eine 2 Jahre lang protokollierte Biopsie, die mit dem CADI-Wert quantifiziert wurde, Patienten identifizieren kann, die nach 4 Jahren an chronischer Abstoßung leiden werden. Yilmaz et al zeigten, dass CADI-Werte von 4 und höher das Risiko eines Patienten und für das Überleben des Transplantats nach 3 Jahren erhöhen, verglichen mit niedrigeren CADI-Werten, wie unten in der Tabelle gezeigt ist (siehe Yilmaz S. et al. Protocol Core Needle Biopsy and Histologic Chronic Allograft Damage Index (CADI) as Surrogate End Point for Long-Term Graft Survival in Multicenter Studies. J. Am. Soc. Nephrol. 14, 773-779 (2003)). Daher ist es nützlich, den CADI-Wert für das Überwachen eines Transplantats nach einer Transplantation zu untersuchen. Der CADI-Wert kann jedoch nur durch invasive Nierenbiopsie mit anschließender manueller Bewertung durch einen Pathologen berechnet werden. O'Connell et al. haben kürzlich 13 mRNA-Marker (CHCHD10, KLHL13, FJX1, MET, SERINC5, RNF149, SPRY4, TGIF1, KAAG1, ST5, WNT9A, ASB15 und RXRA) bei Nierenbiopsien nach 3 Monaten identifiziert, die mit dem CADI-Wert nach 12 Monaten korrelieren, wobei es jedoch weiterhin nötig ist, eine Nierenbiopsie durchzuführen, um mRNA aus der Niere zu erhalten (vgl. O'Connell, P. J. et al. Biopsy transcriptome expression profiling to identify kidney transplants at risk of chronic injury: a multicentre, prospective study. The Lancet 388, 983-993 (2016)). Es ist nützlich, den CADI-Wert ohne eine Nierenbiopsie auf nicht-invasive Weise vorherzusagen, weshalb vorliegend eine Suche nach Markern für extrazelluläre Vesikel (EV)-mRNA aus Urin durchgeführt wurde, die mit dem CADI-Wert korrelieren.
  • Bis zu 400 Urinproben wurden von Patienten nach einer Transplantation im Sapporo City General Hospital im Zeitraum von Januar 2013 bis Juni 2015 erhalten. Ein Assay mit extrazellulärer Vesikel-mRNA aus Urin wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung von 10 µM Random Hexamer bei der cDNA-Synthese (vgl. Murakami, T. et al. Development of Glomerulus-, Tubule-, and Collecting Duct-Specific mRNA Assay in Human Urinary Exosomes and Microvesicles. PLoS ONE 9, e109074 (2014)). Die Primersequenzen der untersuchten Gene liegen in der folgenden Tabelle vor. Die Normalisierung des Genexpressionsspiegels wurde durch das Delta-Ct (dCt)-Verfahren unter Verwendung von GAPDH als Referenzgen oder Subtrahieren des Ct-Wertes von GAPDH vom Gen von Interesse durchgeführt. Ein dCt höher als 6 wurde als nicht nachgewiesen angesehen und auf 6 festgelegt. Die statistische Signifikanz wurde durch den U-Test von Mann-Whitney oder durch den t-Test von Welch mit einem p-Wert von weniger als 5% erhalten. Tabelle 5. Primersequenz (5'-3')
    Gen Sense Antisense
    ANXA1 aaaggtggtcccggatcag ttatgcaaggcagcgacatc
    ANXA1.v2 atgtcgctgccttgcataag tgacgctgtgcattgtttcg
    ANXA1.v3 acaatgcacagcgtcaacag tgcgctggagtttttagcag
    AIF1 tgtccctgaaacgaatgctg agaaagtcagggtagctgaacg
    BTN3A3 aacgccatcctccttgtttc tttcacagccaaggacacag
    CCL5 agtcgtctttgtcacccgaaa agctcatctccaaagagttgatgtac
    CD48 tggcgagtctgtaaactacacc tgtggcataagggtggtttc
    HAVCR1 attgttgccgtgttgagcac acggttggaacagttgtgac
    SLC6A6 tgggccacatactacctgttc ttgttcttgcgcatggtgtc
  • Die rekrutierten Patienten wurden in vier Patientengruppen nach ihren Prognose-Ereignissen während des Studienzeitraums eingeteilt: stabile Erholung (stable recovery; SR), Transplantatabstoßung (transplant rejection; TR), interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (interstitial fibrosis and tubular atrophy; IFTA) und andere Komplikationen (other complication; OTH). Urinproben, die von den Patienten mit Komplikationen nach einer Transplantation erhalten wurden, wurden des Weiteren nach Probenentnahmezeit im Verhältnis zu dem Zeitpunkt, an dem die Komplikation beobachtet wurde, kategorisiert: Pre Cx, Cx und Post Cx. Die Proben, die gewonnen wurden als Komplikationen beobachtet wurden, wurden des Weiteren nach Art der Komplikation kategorisiert: TCMR, Borderline, ABMR, IFTA und Andere Cx. Die Patienten und die Urinproben-Gruppen sind in Kästchen bzw. Kreisen angegeben. Die klinische Zusammenfassung jeder Kategorie ist in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6. Patientenkategorisierung
    Patientengruppe Probengruppe Nr. Probe Nr. Individuum POD Relativer Probenentnahmetag eGFR Urin-Protein
    SR SR 80 55 395 - 49,6 9.0
    (43-1321) (40,9-58,8) (5,0-21,0)
    TR Pre Cx 6 4 2 -8 40.5 32.5
    (1-7) (-11--6) (30,1-46,0) (17,2-53,0)
    Cx 54 22 16 39,2 19,0
    (8-214) (29,6-47,1) (9,0-46,0)
    Post Cx 6 3 12 8 37,5 70,0
    (9-71) (5-50) (25,9-41,9) (35,5-179,5)
    IFTA Pre Cx 8 4 12 -40 50,4 4,0
    (7-185) (-176--34) (48,3-59,2) (3,8-8,0)
    Cx 54 43 812 40,3 9,5
    (205-1319) (32,3-51,7) (4,2-31,0)
    Post Cx 3 3 1717 74 30,0 23,0
    (966-2124) (54-93) (28,8-42,6) (14,0-27,5)
    OTH Pre Cx 15 6 7 -25 28,3 14,0
    (4-12) (-48--16) (23,9-50,4) (3,0-17,0)
    Cx 83 68 400 47,7 12,0
    (35-1906) (33,1-55,0) (6,0-33,0)
    Post Cx 35 18 27 26 44,8 11,0
    (10-112) (7-62) (34,6-55,2) (4,0-27,0)
    POD: Tag nach der OP. Relativer Probenentnahmetaq: die Tage vor der ersten
  • Die 400 Urinproben wurden verarbeitet und Urin-EV-ANXA1 wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Arten von Real-Time-PCR untersucht (ANXA1, ANXA1.v2 und ANXA1.v3). Die ANXA1-Expression erhöhte sich deutlich in den Proben mit CADI-Werten von 4 und höher im Vergleich zu denen mit Werten niedriger als 3 (6A-C). In einer anderen Kohorte wurde die Erhöhung der ANXA1-Expression bestätigt und es wurde des Weiteren eine ANXA1-Erhöhung selbst in den Proben mit niedrigen CADI-Werten (1 bis 3) im Vergleich zu denen mit einem CADI-Wert von Null beobachtet (7). Die Heraufregulierung der ANXA1-Expression wurde des Weiteren in von NIH (GSE25902, 8) erhaltenen Nierenbiopsiedaten bestätigt. Daher korreliert der CADI-Wert mit den ANXA1-Expressionsspiegeln nicht nur in Urin-EV, sondern korreliert ebenfalls mit denen der Niere, was darauf hindeutet, dass ANXA1 ein Marker für eine chronische Nierenschädigung ist.
  • Um weitere Marker zu finden, die mit dem CADI-Wert korrelieren, wurden Genkandidaten durch eine Untersuchung von Nierenbiopsiedaten (NIH, GSE25902) ausgewählt. Neue Kandidaten wurden durch eine Spearman-Korrelation mit CADI-Werten (Korrelation, p-Wert, Steigung) und durch die ROC-Kurvenanalyse ausgewählt, um einen CADI-Wert von 1 und höher (auc1) und von 4 und höher (auc2) nachzuweisen. Die Expressionsspiegel in Nieren- und Urin-EMV wurden ebenfalls für eine Genselektion in Betracht gezogen. Tabelle 7. Genexpression bei der Nierenbiopsie vs. CADI-Wert (GSE25902)
    Gen ID REF Cor p-Wert Steigung auc1 auc2
    AIF1 207823_s_at 0,274 2,5E-03 0,0611 0,6145 0,6803
    AIF1 209901_x_at 0,4158 2,3E-06 0,1363 0,6773 0,7835
    AIF1 213095_x_at 0,3979 6,8E-06 0,1323 0,6741 0,7732
    AIF1 215051_x_at 0,3651 4,1E-05 0,1256 0,6511 0,7417
    ANXA1 201012_at 0,4908 1,3E-08 0,1471 0,7391 0,8406
    BTN3A3 204821_at 0,6063 2,2E-13 0,1459 0,8604 0,9088
    CCL5 1405_i_at 0,6676 8,3E-17 0,4174 0,8456 0,9488
    HAVCR1 207052_at -0,158 8,5E-02 -0,051 0,673 0,6752
  • Die Markerkandidaten wurden unter Verwendung der 400 Urinproben von Patienten nach einer Transplantation untersucht und die Induktion dieser Gene wurde wie in 9A-F gezeigt bestätigt. Es zeigte sich eine deutliche Erhöhung bei den Genen in den Proben mit einem CADI-Wert von 1 und höher.
  • Die ROC-Kurvenanalyse wurde durchgeführt, um die diagnostische Leistung der Markerkandidaten zu beurteilen, um Proben mit einem hohen CADI nachzuweisen. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist, übertraf ANXA1 konventionelle Nierenmarker wie beispielsweise eGFR, Serum- und Urin-Kreatinin und Urin-Protein. Tabelle 8. ROC-Kurvenanalyse (AUCs sind in der Tabelle gezeigt)
    Marker CADI 1+ CADI 2+ CADI 3+ CADI 4+ CADI 5+
    eGFR 0,639 0,704 0,721 0,702 0,769
    Serum-Kreatinin 0,574 0,616 0,589 0,591 0,623
    Urin-Kreatinin 0,544 0,514 0,521 0,503 0,537
    Urin-Protein 0,587 0,628 0,666 0,609 0,696
    ANXA1 0,541 0,563 0,642 0,718 0,767
    ANXA1.v2 0,549 0,543 0,646 0,740 0,748
    ANXA1.v3 0,519 0,512 0,581 0,715 0,622
    AIF1 0,600 0,583 0,557 0,583 0,628
    BTN3A3 0,550 0,557 0,588 0,507 0,509
    CCL5 0,539 0,545 0,577 0,548 0,562
    CD48 0,552 0,581 04627 0,575 0,551
    HAVCR1 0,515 0,521 0,500 0,500 0,500
    SLC6A6 0,581 0,585 0,590 0,597 0,573
  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassend wird hierin eine innovative Strategie offenbart, die sicher und effektiv für die Überwachung des Zustands eines Patienten nach einer Nierentransplantation ist. Die Verfahren der vorliegenden Anmeldung können eine vielversprechende diagnostische und prognostische Untersuchung bereitstellen, die nicht-invasiv ist und die eine Nierentransplantatabstoßung und andere Komplikationen schon vor Einsatz der derzeitigen Standardpraxis (z.B. Biopsie) aufdeckt. Die Verfahren decken auch gezielter als die derzeitige Standardpraxis auf, wann genau eine Biopsie durchgeführt werden sollte.
  • Es wird erwogen, dass verschiedene Kombinationen oder Unter-Kombinationen der spezifischen Merkmale und Aspekte der oben offenbarten Ausführungsformen zulässig sind und noch zu einer oder mehreren der Erfindungen gehören. Des Weiteren kann die Offenbarung eines beliebigen Merkmals, Aspekts, Verfahrens, einer beliebigen Beschaffenheit, Eigenschaft, Qualität, eines beliebigen Kennzeichens, Elements oder Ähnlichem hierin in Verbindung mit einer Ausführungsform in allen anderen hierin dargelegten Ausführungsformen verwendet werden. Dementsprechend soll darauf hingewiesen werden, dass verschiedene Merkmale und Aspekte der offenbarten Ausführungsformen mit anderen kombiniert oder untereinander ausgetauscht werden können, um variierende Formen der offenbarten Erfindungen zu schaffen. Somit wird beabsichtigt, dass der Schutzumfang der hierin offenbarten vorliegenden Erfindungen nicht durch die bestimmten oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt sein soll. Während die Erfindung des Weiteren Gegenstand verschiedener Änderungen und alternativen Formen sein kann, sind spezifische Beispiele davon in den Zeichnungen dargestellt und hierin detailliert beschrieben. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Erfindung nicht auf die bestimmten offenbarten Formen oder Verfahren zu beschränken ist, sondern im Gegenteil, dass die Erfindung alle Modifikationen, Äquivalente und Alternativen abzudecken hat, die in den Sinn und den Schutzumfang verschiedener beschriebener Ausführungsformen und der angefügten Patentansprüche fällt. Beliebige hierin offenbarte Verfahren müssen nicht in der zitierten Reihenfolge durchgeführt werden. Die hierin offenbarten Verfahren umfassen bestimmte von einem Mediziner ergriffene Maßnahmen; sie können jedoch auch beliebige Anweisungen dieser Maßnahmen durch Dritte, entweder ausdrücklich oder indirekt, umfassen. Maßnahmen wie zum Beispiel die „Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens eines Individuums“ umfassen die „Anweisung der Verabreichung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens eines Individuums“.
  • Konditionale Formulierungen wie unter anderem „kann“, „könnte“, „dürfte“ oder „kann möglicherweise“, sollen, insofern diese nicht anderweitig genannt oder anderweitig im verwendeten Zusammenhang verstanden werden, im Allgemeinen wiedergeben, dass bestimmte Ausführungsformen bestimmte Merkmale, Elemente und/oder Schritte umfassen, während andere Ausführungsformen diese nicht umfassen. Somit sollen derartige konditionale Formulierungen im Allgemeinen nicht implizieren, dass Merkmale, Elemente und/oder Schritte in irgendeiner Form für eine oder mehrere Ausführungsformen erforderlich sind.
  • Begriffe wie „erste(r)“, „zweite(r)“, „dritte(r)“, „vierte(r)“, „fünfte(r)“, „sechste(r)“, „siebte(r)“, „achte(r)“, „neunte(r)“, „zehnte(r)“ oder „elfte(r)“ und mehr sollen sich, insofern diese nicht anderweitig genannt oder anderweitig im verwendeten Zusammenhang verstanden werden, im Allgemeinen auf eine beliebige Reihenfolge beziehen, und nicht notwendigerweise auf eine Reihenfolge, die auf der bloßen Bedeutung der entsprechenden Ordnungszahl beruht. Daher können Begriffe, die Ordnungszahlen verwenden, nur einzelne Individuen angeben und sich nicht notwendigerweise auf die Reihenfolge zwischen ihnen beziehen. Demgemäß könnte zum Beispiel die Verwendung von ersten und zweiten Biomarkern in dieser Anmeldung bedeuten, dass lediglich zwei Sets von Biomarkern vorliegen. Mit anderen Worten muss nicht notwendigerweise eine Reihenfolge zwischen den „ersten“ und „zweiten“ Datensätzen in jeglichen Aspekten beabsichtigt sein.
  • Die hierin offenbarten Bereiche umfassen auch alle sich überlappenden Bereiche, Unterbereiche und Kombinationen davon. Formulierungen wie „bis zu“, „mindestens“, „mehr als“, „weniger als“, „zwischen“ und dergleichen umfassen die genannte Zahl. Zahlen, denen ein Begriff wie „etwa“ oder „ungefähr“ vorangeht, umfassen die genannten Zahlen. Zum Beispiel umfassen „etwa 10 Nanometer“ „10 Nanometer“.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2014/182330 [0029]
    • WO 2015/050891 [0029]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Murakami, T. et al. Development of Glomerulus-, Tubule-, and Collecting Duct-Specific mRNA Assay in Human Urinary Exosomes and Microvesicles. PLoS ONE 9, e109074 (2014) [0079]

Claims (7)

  1. Verfahren zum Screenen eines menschlichen Individuums auf eine Expression einer RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Vergleichen einer Expression der RNA in einem Vesikel, das aus einer Urinprobe des Individuums isoliert wurde, mit einer Expression der RNA in einem Vesikel, das aus einer Urinprobe eines Spenders ohne Komplikationen nach einer Nierentransplantation isoliert wurde, umfasst, wobei die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AIF1, BTN3A3, CCL5, CD48, HAVCR1 und SLC6A6, wobei eine Erhöhung der Expression der RNA des Individuums im Vergleich zu der Expression der RNA des Spenders darauf hindeutet, dass das Individuum eine Komplikation nach einer Nierentransplantation aufweist, wenn die Erhöhung einen Schwellenwert übersteigt, wobei das Vergleichen der Expression der RNA in dem Vesikel, das aus der Urinprobe isoliert wurde, des Weiteren umfasst: (a) Gewinnen des Vesikels aus der Probe des Individuums durch Passieren der Probe des Individuums über einen Vesikel-zurückhaltenden Filter, (b) Laden eines Lyse-Puffers auf den Vesikel-zurückhaltenden Filter, wodurch das Vesikel lysiert wird, um eine Vesikel-assoziierte RNA freizusetzen, (c) Quantifizieren der Expression der RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, in der Vesikel-assoziierten RNA durch PCR.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Quantifizierung der Expression der RNA durch PCR umfasst: Inkontaktbringen der Vesikel-assoziierten RNA mit einer Reversen Transkriptase, um komplementäre DNA (cDNA) herzustellen; Inkontaktbringen der cDNA mit Sense- und Antisense-Primern, die für die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, spezifisch sind, und mit einer DNA-Polymerase, um amplifizierte DNA herzustellen; Inkontaktbringen der cDNA mit Sense- und Antisense-Primern, die für eine Referenz-RNA spezifisch sind, und mit der DNA-Polymerase, um amplifizierte DNA herzustellen; und Bestimmen eines Expressionsspiegels oder einer Quantität oder eine Menge für die RNA.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bestimmen eines Expressionsspiegels oder einer Quantität oder einer Menge für die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, umfasst: Bestimmen eines Marker-Zyklus-Schwellenwerts (cycle threshold value; Ct value) für die RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht; Bestimmen eines Referenz-Ct-Werts für eine Referenz-RNA; und Subtrahieren des Marker-Ct-Werts von dem Referenz-Ct-Wert, um einen Marker-Delta-Ct-Wert zu erhalten.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Referenz-RNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ACTB und GAPDH.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erhöhung den Schwellenwert übersteigt, wenn der Marker-Delta-Ct-Wert weniger als 1 beträgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, des Weiteren umfassend das Vergleichen des Marker-Delta-Ct-Werts mit einem Kontroll-Delta-Ct-Wert, wobei der Kontroll-Delta-Ct-Wert durch Subtrahieren eines Kontroll-Marker-Ct-Werts von einem Kontroll-Referenz-Ct-Wert bestimmt wird, wobei der Kontroll-Marker-Ct-Wert ein Ct-Wert der RNA, die mit einer Komplikation nach einer Nierentransplantation in Zusammenhang steht, in Urin-Vesikeln einer gesunden Spenderpopulation ist, wobei der Kontroll-Referenz-Ct-Wert ein Ct-Wert der Referenz-RNA in Urin-Vesikeln einer gesunden Spenderpopulation ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Erhöhung den Schwellenwert übersteigt, wenn der Marker-Delta-Ct-Wert mindestens 2 weniger als der Kontroll-Delta-Ct-Wert ist.
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